Abstract
Tissue engineering och cellterapi är mycket lovande kliniskt. I detta avseende kan multipotenta celler, såsom mesenkymala stamceller (MSC), användas terapeutiskt, i en nära framtid, för att återställa funktionen i skadade organ. Ändå flera tekniska frågor, bland annat den mycket invasiva förfarandet för att isolera MSC och ineffektivitet kring sin förstärkning, för närvarande hindrar den potentiella kliniska användningen av dessa terapeutiska modaliteter. Häri presenterar vi en mycket effektiv metod för generering av avdifferentierade fettceller (DFAT), MSC-liknande celler. Intressant nog kan DFAT celler differentieras i flera celltyper inklusive adipogena, osteogena och kondrogena celler. Även andra grupper har tidigare presenterat olika metoder för att generera DFAT celler från mogna fettvävnad, gör att vår metod för oss att producera DFAT celler mer effektivt. I detta hänseende, visar vi att DFAT odlingsmedium (DCM), kompletterat med 20% FBS,är mer effektiv i att generera DFAT celler än DMEM, kompletterat med 20% FBS. Dessutom kan DFAT celler som produceras av vår cellodlingsmetod redifferentiated i flera vävnadstyper. Som sådan, är en mycket intressant och användbar modell för studier av vävnads dedifferentiering presenteras.
Introduction
Cellterapi och vävnadsteknik är heta ämnen inom området regenerativ medicin 1-5. Även om dessa terapeutiska modaliteter är mycket lovande, flera tekniska frågor som för närvarande hindrar deras kliniska användning. I detta avseende, som i genereringen av iPS-celler måste alla vävnadstekniska terapier producera celler fria från externa gen transduktioner för att upprätthålla patientsäkerheten. Följaktligen var vi den första gruppen att framgångsrikt producera humana DFAT celler 6. Flera andra forskargrupper har sedan antagit vår metod för att generera DFAT celler av däggdjursursprung 7-9, ytterligare lyfta fram nyttan av vår modell.
Under loppet av flera studier har vi funnit att kvaliteten hos cellodlingsmiljön kan modifieras genom justering av innehållet i cellmediet. Denna upptäckt har lett till en ökning av andelen framgångsrika DFAT cellproduktion och förbättrad cellkvalitet; båda kritiska faktorer ieffektivt generera celler för framtida kliniska prövningar. I detta avseende, en förbättrad DFAT odlingsmedium (DCM, en substans liknande mesenkymal stamcell medium, som innehåller rekombinant humant insulin, serumalbumin, L-glutaminsyra, flera fettsyror och kolesterol) och en metod för DFAT cellgenerering och spridning utvecklades (mer information om innehållet i DCM finns tillgänglig på begäran). Användning av denna metod högkvalitativa DFAT celler genererades med förmågan att differentiera till flera celltyper, inklusive adipogena, osteogena och kondrogena celler. Sammantaget ökar detta validerade cellodlings protokoll kvaliteten på DFAT celler och kan vara mycket användbar för att förbättra kliniska tillämpningar av cellterapi och vävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prover av human underhudsfett erhölls från patienter som genomgår kirurgi i departementen plastikkirurgi, urologi, Pediatric Surgery och ortopedisk kirurgi i Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Patienterna gav skriftligt informerat samtycke, och etikkommittén av Nihon University School of Medicine godkände studien.
1. Vävnadsberedning
- Frammatning av provet vävnad från operationsrummet till laboratoriet.
- Tvätta 1-2 g fettvävnad med 5 ml PBS (-) vid rumstemperatur (RT) en gång, i ett 50 ml rör och placera provet i en 10 cm plastskål.
2. Kollagenas Digestion
- Ta bort provet från PBS (-), tillsätt sedan 10 ml steril 0,1% (w / v) kollagenas lösning (kollagenas typ II) till skålen som innehåller vävnadsprovet.
- Mala vävnaden med kirurgiska saxar för cirka 15 minuter, tills den når en mosad beståency.
- Därefter smälta den malda vävnaden i 0,1% (vikt / volym) kollagenas-lösning vid 37 ° C under 30 min (60 rpm) i ett 50 ml rör med försiktig omrörning i en skakapparat.
- Filtrera det kokade provet genom ett 100 pm filter in i ett 50 ml rör. Nästa, passera 10 ml av DCM (se tabell of Materials) kompletterat med 2% FBS genom filtret.
3. Cell Isolering
- Centrifugera de filtrerade cellerna vid 100 xg under 1 min vid RT.
- Vid denna punkt, förbereda 5 ml DCM kompletterat med 2% FBS i en 50 ml tub.
- Därefter upprätta flytande fettceller med hjälp av en 1000 l pipett och lägga till cellerna till en 50 ml rör innehållande medium.
- Därefter skaka 50 ml rör försiktigt för att blanda DCM medium med cellerna.
- Därefter centrifugera röret vid 100 xg i 1 min vid RT.
- Kassera mediet vid botten av röret med hjälp av en 18 G nål och en 20 ml spruta.
- Därefter tillsätt 10 ml DCM supplemented med 2% FBS till de uppsamlade cellerna.
- Blanda DCM med cellerna genom att skaka 50 ml rör försiktigt.
- Centrifugera röret vid 100 xg i 1 min vid RT.
4. utstrykning av celler
- Lägg 41 ml DCM eller DMEM kompletterat med 20% FBS till en 12,5 cm kolv.
- Nästa, med användning av en 200 | j, l pipett tillsätt 40 pl av fettceller till kolven.
- Fyll sedan upp kolven med DCM eller DMEM kompletterat med 20% FBS. Kritiskt steg: Vid denna punkt, se till att cellerna är spridda över hela mediet. Kontrollera visuellt de lösgjorda cellerna och därefter hålla kolven på locket till en rund petriskål för att hålla den platt.
- Slutligen, placera kolven inuti inkubatorn och lämna den ostörd i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under 7 dagar.
- Efter en vecka av inkubation, invertera kolven och kontrollera om DFAT celler. Nästa bedöma DFAT cell generation kunskaper som beskrivs 10 eftersom vid denna punkt fibroblast-liknande celler (DFAT celler) är belägna i områden som skiljer sig från fettceller.
- Tillsätt 5 ml DCM eller DMEM kompletterat med 20% FBS till kolven efter avlägsnande av den tidigare cellodlingsmediet. Tillåta DFAT cellerna att växa under ytterligare en vecka efter att ha bytt medium.
- Med hjälp av en cellräknare, räkna antalet DFAT celler som erhållits under olika cellodlingsbetingelser (DCM vs DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie var metoden och verktyg för DFAT cell generation förbättras (Figur 1). Vår metod ger oss möjlighet att generera DFAT celler med användning av både DCM och DMEM-medium innehållande 20% FBS (Figur 2A). Som sådan, jämförde vi effektiviteten i DCM och DMEM vid generering DFAT celler. I detta avseende förbättrad DCM DFAT cellproliferation genom tre gånger jämfört med DMEM, oberoende av antalet adipocyter (Figur 2A och B). Med användning av 20% FBS förbättrar också celltillväxt i jämförelse med protokollen genom att använda 10% FBS (data visas ej). Vi bekräftade vidare att DFAT celler producerade med användning av DCM har förmågan att redifferentiate till adipocyter och differentiera till osteoblaster (Figur 3). Metoden för analyserna beskrivs i vår tidigare studie 6.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Figur 1:. En schematisk visar isolering, dedifferentiering, och kultur av mogna adipocyter En liten bit av fettvävnad digererades med 0,1% kollagenas. Efter centrifugering var unilocular adipocyter isolerade från den flytande skiktet. De isolerade cellerna odlades i kolvar fyllda med medium innehållande 20% FBS under 7 dagar. Under odling, cellerna fästa och tillplattas till den övre ytan av kolvarna och sedan omvandlades till DFAT celler. Därefter tillsattes kolvarna inverterad och DFAT celler odlades med konventionella metoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DCM förstärker DFAT cell generation. (
Figur 3:. Multilineage potential DFAT celler Mänskliga DFAT celler alstrade med användning av DCM odlades under 3 veckor i de lämpliga induktionsmedier för att utvärdera återdifferentiering och differentierings förmåga DFAT celler. calnar analyserades med avseende osteogena (ALP och alizarin red S), adipogena (Olja röd-O) kapacitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mogna adipocyter som genomgår in vitro dedifferentiering, en process som kallas tak kultur, kan återgå till en mer primitiv fenotyp och få proliferativa förmågor. Dessa celler benämns dedifferentierade fett (DFAT) celler. utvärderades den multilineage differentieringspotential DFAT celler. Flödescytometrianalys och genuttryck analys visade att DFAT celler var mycket homogena i jämförelse med DSK: er 6. I själva verket är det cellyteantigen profil DFAT celler som liknar dem som finns i DSK 6. Följaktligen kan DFAT celler fungerar på liknande sätt som MSC: er.
Den andra gruppen som framgångsrikt har genererat DFAT celler som används en DMEM F12 cellodlingsmedium kompletterat med 20% kalvserum 7-8. Även om vi försökt att framställa DFAT celler med användning av ett cellodlingsmedium kompletterat med 10% FBS, antalet DFAT celler producerade med detta protokoll var betydligt lägre än whöna kompletterat med 20% FBS (data ej visade). Därför är viktigt för antingen dedifferentiering av DFAT celler och / eller proliferation av DFAT celler FBS koncentration och / eller dess innehåll. Som en del av en framtida studie, kommer vi att försöka att ytterligare belysa den mekanism genom vilken innehåll serum styr DFAT cellgenerering och spridning. Å andra sidan, DCM innehåller mindre glukos, fettsyror och andra kemikalier än den DMEM används i vår studie. Denna variabilitet i cellkulturmedium beståndsdelar kan modulera effektiviteten hos både DFAT cellgenerering och tillväxt. I själva verket låg glukoskoncentration något förbättrar effektiviteten i DFAT cellgeneration vid användning av DMEM (data ej visade). Även om de exakta mekanismerna bakom DCM effekt på DFAT cellbildning och tillväxt är okända, postulerar vi här att koncentrationen av vissa medel beståndsdelar driver dessa cellulära händelser. Ytterligare studier behövs för att klargöra denna punkt. Eftersom vi har testat en limited antalet DMEM formuleringar är ytterligare experiment som krävs för att jämföra effektiviteten av andra DMEM variationer (t.ex. DMEM innehållande L-glutamin eller pyridoxin) att producera DFAT celler.
Även om vi kan producera DFAT celler, är fortfarande oklart de molekylära mekanismer som styr DFAT cellgeneration. Liknande frågor omger produktionen av iPS-celler 11. Som sådan klinisk användning av dessa terapeutiska modaliteter kommer att kräva ytterligare utforskning av cell statliga regleringsmekanismer. Följaktligen starkt tror vi att DFAT celler ger en modell för att klargöra hur celler återgår till en stamcellsliknande tillstånd, utan externa gen transduktioner. DFAT cellproduktionsprotokoll är därför optimeras för närvarande för användning i framtida kliniska prövningar.
Att se till att kollagenas behandling och fettcellernas isolering båda utförs på rätt sätt är en viktig faktor i framgångsrikt genererar DFAT celler med användning av detta protokoll. ca.opriate användning av fina saxar och avlägsnande av bubblor under odling stöd också för att förbättra DFAT cellproliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
