Abstract
Doku mühendisliği ve hücre tedavisi klinik büyük umutlar tutun. Bu bağlamda, bu tür mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), multipotent hücreler, hasar görmüş organ fonksiyonu geri yakın gelecekte tedavi edici kullanılabilir. Bununla birlikte, MKH'lerin ve amplifikasyon çevreleyen verimsizlik izole oldukça invaziv prosedürü dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar, şu anda bu tedavi yöntemlerinin potansiyel klinik kullanımını engellemektedir. Burada, dediferansiye yağ hücreleri (DFAT), MSC-benzeri hücrelerin oluşumu için son derece etkili bir yöntem getirmektedir. İlginç bir şekilde, DFAT hücreleri adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir. diğer gruplar, daha önce olgun adipoz dokudan DFAT hücrelerini oluşturmak için çeşitli yöntemler sunulmuştur olmasına rağmen, bizim yöntem daha etkili DFAT hücreleri üretmek için izin verir. Bu bağlamda, ortaya DFAT kültür ortamı (DCM), FBS% 20 ile desteklenen,% 20 FBS ile takviye edilmiş DMEM den DFAT hücreleri üreten daha etkilidir. Ayrıca, hücre kültürü yöntemi ile üretilen DFAT hücreleri çeşitli doku tiplerine redifferentiated edilebilir. Bu nedenle, doku, farklılaşmadan çalışmaları için çok ilginç ve faydalı model sunulmuştur.
Introduction
Hücre tedavisi ve doku mühendisliği rejeneratif tıp 1-5 alanında sıcak konulardır. Bu tedavi yöntemleri çok ümit vericidir ederken, çeşitli teknik sorunlar şu anda bunların klinik kullanımını engelleyebilir. Bu bağlamda, iPS hücrelerinin üretiminde olduğu gibi, tüm doku mühendisliği tedavileri hasta güvenliğini korumak için dış gen iletiminin serbest hücreler üretmek gerekir. Buna göre, başarılı insan DFAT hücrelerini 6 üretmek için ilk grup oldu. Birçok diğer araştırma grupları beri daha da modelin yararlılığını vurgulayarak, memeli kökenli 7-9 DFAT hücrelerini oluşturmak için bir yöntem benimsemiştir.
Birkaç çalışma boyunca, hücre kültürü ortamının kalitesi hücre orta içeriğini ayarlayarak değiştirilebilir olduğunu bulduk. Bu bulgu DFAT hücresi üretiminin başarı oranında bir artışa yol açtı ve hücre kalitesini geliştirdi; Her iki kritik faktörlerverimli gelecekte yapılacak klinik araştırmalara üreten hücreleri. Bu bağlamda ve DFAT hücresi üretimi için bir usul (benzer bir orta hücre rekombinant insan insülini, serum albümini, L-glutamik asit, çok yağ asitleri içerir orta, ve kolesterol kök mezenkimal için DCM) geliştirilmiş bir DFAT kültür ortamı içinde ve çoğalma (DKM içeriği hakkında daha fazla bilgi istek üzerine mevcuttur) geliştirildi. Kullanılan bu yöntem, yüksek kaliteli DFAT hücreleri adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin ayırt yeteneği ile üretilmiştir. Toplamda, bu valide hücre kültürü protokolü DFAT hücrelerinin kalitesini artırır ve hücre terapisi ve doku mühendisliği klinik uygulamaları geliştirmek için oldukça yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
insan deri altı yağ numuneleri Plastik Cerrahi, Üroloji, Çocuk Cerrahisi ve Nihon Üniversitesi Itabashi Hastanesi (Tokyo, Japonya) Ortopedik Cerrahi Anabilim ameliyat geçiren hastalarda elde edildi. Hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ve Tıp Nihon Üniversitesi Etik Komitesi çalışmayı onayladı.
1. Doku Hazırlanması
- laboratuvara ameliyathaneye gelen doku örneği getir.
- (-) 5 ml PBS ile adipoz doku Yıkama 1-2 g ve 50 ml bir tüp içinde bir kez oda sıcaklığında (RT) ve 10 cm plastik tabak numuneyi.
2. kollajenaz sindirimi
- (-) PBS numune kaldır, steril% 0.1 10 ml, ardından (a / h) bir doku örneği içeren çanak kolajenaz çözeltisi (kollajenaz tip II).
- Bu oluşan bir püre ulaşana kadar, yaklaşık olarak 15 dakika süre ile, cerrahi makas ile Doku kıymaEnsi.
- Daha sonra,% 0.1 kıyılmış doku bir karıştırıcıda yavaşça sallanarak 50 ml'lik bir tüp içinde 30 dakika boyunca (60 rpm) 37 ° C'de (ağırlık / hacim) kolagenaz çözelti sindirimi.
- 50 ml'lik bir tüp içine, 100 um'lik bir filtreden dijeste örnek filtre. Daha sonra, filtre ile% 2 FBS ile takviye edilmiş 10 ml DCM (Malzeme Tablo) geçmektedir.
3. Hücre İzolasyonu
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de filtre hücreleri santrifüjleyin.
- DCM, bir 50 ml tüp içinde% 2 FBS ile takviye edilmiş, bu noktada, 5 ml hazırlanması.
- Sonra, 1000 ul pipet kullanarak yüzen yağ hücrelerini hazırlamak ve 50 ml'lik bir tüp içeren ortama hücreleri ekleyin.
- Daha sonra, hücreleri ile DCM orta karıştırmak için hafifçe 50 ml tüp sallayın.
- Daha sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj tüpü.
- 18 G iğne ve 20 ml'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibinde orta atın.
- Sonraki DCM s 10 ml ekleyinToplanan hücreler% 2 FBS ile upplemented.
- yavaşça 50 ml tüp sallayarak hücreleri ile DCM karıştırın.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de tüp santrifüjleyin.
4. Kaplama Hücreler
- 12.5 cm şişeye% 20 FBS ile takviye edilmiş, DCM ya da DMEM 41 ml ilave edilir.
- Daha sonra, 200 ul pipet şişeye yağ hücrelerinin 40 ul kullanılmıştır.
- Ardından,% 20 FBS ile takviye DCM veya DMEM ile şişeyi doldurmak. KRİTİK ADIM: Bu noktada, hücreler ortam boyunca yayılmasının sağlanması. Görme müstakil hücreleri kontrol ve sonradan düz tutmak için bir yuvarlak petri kapağına balon tutun.
- Son olarak, inkübatör içinde balon koyun ve 7 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörü içinde rahatsız bırakın.
- inkübasyon bir hafta sonra, şişeyi ters ve DFAT hücreleri kontrol edin. Bu nokta fibrobl başlangıcı 10 tarif edildiği gibi, DFAT hücre üretimi yeterliliğini değerlendirmekAST-benzeri hücreler (DFAT hücreleri) yağ hücrelerinden farklı bölgelerde yer almaktadır.
- DCM veya DMEM ekleme 5 mi önceki hücre kültür ortamının çıkarılmasını takiben şişeye% 20 FBS ile takviye edilmiştir. DFAT hücreleri orta değiştirdikten sonra başka bir hafta boyunca büyümeye izin verin.
- Bir hücre sayacını kullanarak, çeşitli hücre kültürü koşulları (DMEM vs DCM) kapsamında oluşturulan DFAT hücrelerinin sayısını saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, DFAT hücre üretme yöntemi ve araç takımı (Şekil 1) geliştirilmiştir. Bizim yöntem bize DCM ve% 20 FBS (Şekil 2A) ihtiva eden DMEM ortamı her ikisini de kullanarak DFAT hücreleri oluşturmasına olanak sağlar. Bu nedenle, biz DFAT hücrelerini üreten DCM ve DMEM verimliliğini karşılaştırıldı. Bağımsız olarak, adipositlerin sayısına (Şekil 2A ve B), DMEM karşılaştırıldığında, bu bağlamda, DCM, üç kat DFAT hücre proliferasyonunu geliştirilmiş. % 10 FBS (veriler gösterilmemiştir) ile iletişim kuralları ile karşılaştırıldığında% 20 kullanılarak FBS hücre büyümesini geliştirir. Biz daha DCM kullanılarak üretilen DFAT hücreleri (Şekil 3) adipositlere redifferentiate ve osteoblast içine ayırt etmek yeteneğine sahip olduğunu doğruladı. Deneyleri için bir yöntem daha önceki çalışmamızda 6'da tarif edilmektedir.
7 / 54177fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Izolasyonu, farklılaşma bozukluğunun tasvir eden bir şemadır ve olgun adipositlerin kültürü, yağ dokusunun küçük bir parça% 0.1 kollajenaz ile sindirilmiştir. Santrifüj işleminden sonra, uniloküler adipositler kayan katman izole edilmiştir. izole edilen hücreler ortam 7 gün boyunca% 20 FBS ihtiva eden dolu şişelerinde kültürlendi. DFAT hücrelerine dönüştürüldü, sonra kültür sırasında, hücreler eklenmiş ve şişe üst yüzeyine basık ve. Sonraki, şişeler ters ve DFAT hücreleri geleneksel yöntemler kullanılarak kültüre edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: DCM DFAT hücre oluşumunu artırır. (
Şekil 3:. DCM kullanılarak oluşturulan DFAT hücrelerinin multilineage potansiyel insan DFAT hücreleri DFAT hücrelerinin redifferentiation ve farklılaşma özellikler değerlendirmek için uygun bir indüksiyon ortamı 3 hafta kültürlendi. carşın osteojenik (ALP ve alizarin kırmızısı S), adipogenic (Oil red O) kapasitesi analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
, In vitro dediferansiyasyon tavan kültürü olarak bilinen bir süreç geçmesi Olgun adipositler, daha ilkel bir fenotip dönmek ve proliferatif yetenekleri kazanmak olabilir. Bu hücreler dediferansiye yağ (DFAT) hücreleri de ifade edilmektedir. DFAT hücrelerinin multilinaj farklılaşması potansiyeli değerlendirildi. Analiz ve gen ekspresyon analizi DFAT hücreleri TSK 6 ile karşılaştırıldığında oldukça homojen olduğu saptanmıştır akım sitometrisi. Aslında, DFAT hücrelerinin hücre yüzeyi antijeni profili TSK 6'da bulunanlara çok benzer. Buna göre, DFAT hücreleri MSC benzer işlev görebilir.
Başarılı bir şekilde% 20 dana serumu ile takviye edilmiş 7-8 DMEM F12 hücre kültür ortamı kullanılmıştır DFAT hücreleri üretti diğer grup. Biz% 10 FBS ile desteklenmiş bir hücre kültür ortamı kullanılarak DFAT hücreleri üretmek için çalıştı rağmen, bu protokol ile üretilen DFAT hücrelerin sayısı w daha düşüktüTavuk% 20 FBS (veriler gösterilmemiştir) ile takviye edilmiştir. Bu nedenle, FBS konsantrasyonu ve / veya içeriği DFAT hücrelerdeki farklılaşma bozukluğunun ve / veya DFAT hücrelerinin çoğalması ya da önemlidir. gelecekteki çalışmanın bir parçası olarak, biz daha fazla serum içeriği DFAT hücre oluşumunu ve çoğalmasını yöneten olduğunu aydınlatmaya çalışacaktır. Öte yandan, DCM, DMEM Çalışmada kullanılan daha az glukoz, yağ asitleri ve diğer kimyasalları içerir. Hücre kültüründe bu değişkenlik, orta bileşenler DFAT hücresi üretimi ve büyüme hem etkinliğini modüle edebilir. Aslında, düşük glukoz konsantrasyonu biraz DMEM kullanılarak DFAT hücresi üretiminin verimini artırır (veriler gösterilmemiştir). DFAT hücre üretimi ve büyüme üzerindeki DCM'nin etkisi altında yatan kesin mekanizmalar bilinmemektedir rağmen, bazı orta bileşenlerin konsantrasyonu bu hücresel olayları sürücüler burada önerme. Daha ileri çalışmalar bu konuyu açıklığa kavuşturmak için ihtiyaç vardır. Ayrıca, biz bir limite test ettik beriDMEM formülasyonları d sayısı, daha fazla deneyler DFAT hücreleri üreten diğer DMEM varyasyonları (örneğin, DMEM içeren L-glutamin veya piridoksin) etkinliğini karşılaştırmak için gereklidir.
Biz DFAT hücreleri üretmek mümkün olmakla birlikte, DFAT hücre üretimini düzenleyen moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. Benzer sorular iPS hücrelerinin 11 üretimini kuşatır. Bu tedavi yöntemlerinin gibi klinik kullanımı gibi hücre devlet düzenleyici mekanizmaların daha fazla araştırılmasını gerektirmektedir. Buna göre, biz güçlü hücreler, kök hücre gibi devlet harici gen transdüksiyon ücretsiz iade nasıl DFAT hücreleri ortaya çıkması için bir model oluşturduğuna inanıyoruz. DFAT hücre üretimi protokolleri, bu nedenle gelecekte klinik çalışmalarda kullanılmak üzere şu anda optimize edilir.
Her iki düzgün yerine getirilmesini kollajenaz tedavi ve yağ hücresi izolasyonu sağlanması başarıyla bu protokolü kullanarak DFAT hücrelerini üreten önemli bir faktördür. Yaklaşıkkültür sırasında ince makas ve kabarcıkların çıkarılması opriate kullanımı da DFAT hücresi çoğalmasını artırmada yardımcı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSTI303-MSC medium | CSTI | 87-671 | This medium is defined as DCM in the text |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | It does not contain Mg2+ and Ca2+ |
| DMEM medium | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012 | |
| Collagenase type II | Sigma | C-6885 | |
| Scissors | Takasago Medical Industry Co., Ltd | TKZ-F2194-1 | |
| Shaker | TAITEC | Bioshaker V.BR-36 | |
| Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow | CORNING LIFE SCIENCES | DL 352360 | |
| Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap | CORNING LIFE SCIENCES | 353107 | |
| 18 G needle | NIPRO | 02-002 | |
| 20 ml Syringe | NIPRO | 08-753 | |
| Z Series Coulter Counter | BECKMAN COULTER | 383550 |
References
- Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
- de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
- Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
- Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
- Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
- Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
