Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق

Published: August 11, 2016 doi: 10.3791/54186

Abstract

الوصل العصبي العضلي (NMJ) يخضع لتغيرات هيكلية ووظيفية الضارة نتيجة للتقدم في السن والإصابات والأمراض. وبالتالي، لا بد من فهم التغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في صيانة وإصلاح لل NMJs. لهذا الغرض، قمنا بتطوير طريقة وبشكل متواصل لدراسة تجديد لل NMJs في الفئران. هذه الطريقة إصابة العصب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنه يمر فوق الرأس الوحشي من وتر عضلة الساق بالقرب من الركبة. استخدام 70 يوم إناث الفئران القديمة، علينا أن نبرهن على المحاور الحركية تبدأ reinnervate الأهداف بعد المشبكي السابقة خلال 7 أيام بعد سحق. انهم إعادة احتلال المناطق تماما متشابك السابقة من قبل 12 يوما. لتحديد موثوقية هذه الطريقة الإصابة، قارنا معدلات عودة التعصيب بين الأفراد 70 يوم إناث الفئران القديمة. وجدنا أن عدد المواقع بعد المشبكي reinnervated مماثل بين الفئران في 7 و 9 و 12 يوما بعد سحق. لتحديد ما إذا كانويمكن أيضا أن هذا الاختبار إصابة استخدامها لمقارنة التغيرات الجزيئية في العضلات، درسنا مستويات غاما فرعية من مستقبلات العضلات النيكوتينيك (غاما الاستشاري لحقوق الإنسان) وكيناز العضلات محددة (المسك). الوحيدات غاما الاستشاري لحقوق الإنسان والمسك لوupregulated للغاية إزالة التعصيب التالية والعودة إلى مستويات طبيعية بعد عودة التعصيب من لل NMJs. لقد وجدنا علاقة وثيقة بين مستويات النص لهذه الجينات ووضع تعصيب العضلات. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سيعجل فهمنا للتغيرات الخلوية والجزيئية تشارك في إصلاح NMJ ونقاط الاشتباك العصبي الأخرى.

Protocol

أجريت جميع التجارب تحت المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة والبروتوكولات الحيوانية التي وافقت عليها لجنة جامعة فرجينيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام.

1. الحيوانات التحضير لجراحة

  1. تخدير الفئران مع خليط من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مع معقمة 1 مل حقنة الأنسولين. يحتوي الحل الناقل خليط من المياه المالحة 0.9٪ و 17.4 ملغ / مل الكيتامين و 2.6 ملغ / مل زيلازين. وضع الحيوانات مرة أخرى في أقفاص في انتظار الدواء إلى حيز التنفيذ.
    ملاحظة: إذا لم جرعة التحميل توفر التخدير كافية لمدة الإجراء، قد يتم حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل.
  2. الحيوانات رصد وظيفة في حقن للتحقق من وتيرة التنفس ثابتة والاكتئاب المناسب من مستويات الإثارة. التحقق من مستوى الإثارة مع قليل القدم الخلفية، والتي ينبغي أن تثير أي رد عندما تخدير بما فيه الكفاية.
    ملاحظة: هذه عادة ما يستغرق 3-5دقيقة لالماوس الشباب البالغين بمعدل 25 إلى 30 غراما. إذا كان هذا الحيوان لا يزال استجابة بعد 10 دقيقة بعد الحقن، ويمكن حقن إضافية 25٪ من جرعة التحميل التخدير.
  3. تطبيق الفازلين والزيوت المعدنية الخفيفة مرهم للعين للعيون الحيوان لمنع جفاف. إزالة الحيوانات من القفص ومكان على سطح نظيف ومستو. حلق أطرافهم هند المطلوب من القدم إلى الحوض باستخدام الانتهازي الشعر الكهربائي، وفضح فقط الجانب الوحشي من أطرافهم.
  4. تطبيق مزيل الشعر الكيميائية إلى الموقع حلق لمدة 1 دقيقة. يدويا إزالة الشعر باستخدام مناديل المختبر. نظيفة منطقة نزعه مع مختبر محو غارقة في الايثانول.

2. إجراء العمليات الجراحية

  1. تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم أو غيرها من طريقة المناسب. تنظيف الموقع الجراحي ومجلس الجراحي مع 80٪ من الإيثانول / H 2 0. تطهير موقع الجراحية مع proviodine. ضع الماوس على متن الجراحية وتتماشى مع القيود أطرافهم. احتفظعلى أطرافه الخلفية الهدف في وضع الطبيعي تشريحيا مع مفصل الركبة تمديد قليلا دون دوران داخلي أو خارجي.
  2. وضع الحيوان ومجلس تحت المجهر الجراحي. توجيه إلى موقع شق السليم عن طريق الجس من المعالم السطحية، وتحديدا في مفصل الركبة عظمي والتلال بين الأمامية الظنبوبي وعضلات الساق.
  3. إجراء شق حوالي 3 سم من خلال الجلد باستخدام مشرط أو الربيع مقص أثناء استخدام ملقط العامة التي تجتاح. جعل شق عمودي على مسار الكامنة وراء العصب الشظوي المشترك.
  4. مواصلة شق طريق اللفافة السطحية، وفضح الفخذية ذات الرأسين والعضلة المتسعة الوحشية العضلات. فصل هذه العضلات من خلال قطع اللفافة العميقة التي تربط. وينبغي أن يكون قطع 1-2 سم كافية.
  5. التراجع عن الفخذية ذات الرأسين العضلات caudally باستخدام الكامشات الميكانيكية، وكشف عن العصب الشظوي المشترك.
  6. تتبع العصب قريب حتى بين لتم العثور على القسم مع وتر الرأس الوحشي للعضلة الساق. ملاحظة: التعرض قد يتطلب معالجة إضافية من الجلد تراجع والعضلات. يستخدم هذا التقاطع باعتبارها معلما مستقر للإصابة العصب.
  7. فهم العصب مع ملقط غرامة، والتوفيق بين النصائح بطريقة موازية للالحدود الجانبية للوتر الساق. سحق العصب الشظوي المشترك من خلال تطبيق ثابت والضغط الجاد لمدة 5 ثوان.
  8. تأكيد سحق الكامل للعصب عن طريق التفتيش البصري من خلال نطاق العمليات الجراحية. وسوف تظهر شفافة في موقع الإصابة. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، ومضان تختفي من موقع الإصابة.
  9. إزالة مبعدات وإعادة ترتيب العضلات في مواقعها التشريحية. إغلاق موقع شق مع 6-0 خيوط الحرير. 1-3 خيوط متقطعة بسيطة كافية. وضع يتعافى الماوس على وسادة التدفئة في قفص نظيفة.
  10. رصد جميع الحيوانات لمدة 2 ساعة بعد الأوبرانشوئها للتحقق من التنفس وأي ردود فعل سلبية على التخدير. إدارة جرعة أولية من البوبرينورفين 0،05-0،10 ملغ / كغ عن طريق الحقن تحت الجلد الإربي مباشرة بعد التعافي من الجراحة. منح 3 جرعات إضافية كل 12 ساعة على مدى ساعة 48 القادمة. بعد الشفاء التام، والعودة الفئران إلى مرفق للرعاية الحيوان.

3. عزل وتلون باسطة إبهام اليد العضلات (مؤسسة كهرباء لبنان)

  1. تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين. الاستغناء عن 0.5 مل الأيزوفلورين السائل في أنبوب 50 مل محملة labwipes ماصة. وضع أنبوب لم يسبق لهم اللعب مع الحيوان في مختومة 2500 سم 3 غرفة. لا يقل عن 4 دقائق من التعرض كافية. اختبار لفقدان جفني الثنائي، إصبع القدم قرصة، وردود الفعل ذيل قرصة لضمان أن كل حيوان فاقد الوعي قبل الشروع في الارواء.
  2. يروي Transcardially 16 الحيوانات لأول مرة مع 10 مل 0.1M برنامج تلفزيوني، ثم 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق في 0.1M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). الهيبارين (30 وحدة / 20غرام من وزن الحيوان) ويمكن إضافة مع برنامج تلفزيوني (10 وحدة / مل) لمنع تخثر الدم في سرير الشعرية الصغيرة، وتحسين النتائج الارواء.
  3. إزالة الجلد الذي يغطي أطرافه الخلفية باستخدام مقص لقطع عرضيا خلال الجلد حول محيط البطن. قشر أسفل الجلد الماضي أطرافه الخلفية والقدمين باستخدام ملقط.
  4. إزالة اللفافة السطحية من الأطراف الخلفية من خلال استيعاب وتقشير بالملقط. إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية، بعد إصلاح الفئران كله بين عشية وضحاها في PFA 4٪ في 50 مل أنابيب. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الثابتة الفئران يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. إذا لم يكن كذلك، تخطي هذه الخطوة وانتقل إلى الخطوة 3.6 بدون حيوانات تحديد بعد.
  5. تشريح خارج العضلات مؤسسة كهرباء لبنان 18 من الماوس أطرافه الخلفية، ويجري التأكد من الحفاظ القريبة والبعيدة الأوتار سليمة قدر الإمكان.
  6. احتضان العضلات مؤسسة كهرباء لبنان في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100، 3٪ BSA و 5٪ مصل الماعز) لمدة 1 ساعة على الأقل.
  7. وصمة عار على الجانب المقابل لم يصب بأذى مؤسسة كهرباء لبنان كعنصر تحكم إيجابية لكامل تعصيب NMJ. وينبغي أن يتضمن ضوابط السلبية على مؤسسة كهرباء لبنان التي تم الحصول عليها في 4 أيام بعد الإصابة، نقطة زمنية حيث NMJ غير المزالة التعصيب تماما، فضلا عن مؤسسة كهرباء لبنان الملون مع الأجسام المضادة الثانوية فقط.
  8. احتضان العضلات مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة fluorescently المناسبة للكشف عن خيط عصبي وsynaptotagmin-2 لمدة 1 يوم. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة. ملاحظة: يمكن أن تنفذ هذه الخطوة مع الخطوة 3.10. تخطي هذه الخطوة إذا باستخدام الفئران معربا عن البروتينات الفلورية في المحاور الطرفية.
  9. لتصور postsyالمنطقة naptic من NMJ، احتضان العضلات مع 5 ميكروغرام / مل اليكسا 555 مترافق ألفا بنغاروتوكسين المخفف في عرقلة العازلة لا يقل عن 2 ساعة. غسل العضلات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X و 10 دقيقة في كل مرة.
  10. لتركيب العضلات كلها على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة، ووضع العضلات مباشرة على الشريحة، إضافة بضع قطرات من الجلسرين المتوسطة القائمة على الشريحة المتزايدة، وتغطي مع ساترة. اضغط على ساترة ضد الشريحة لشد العضلات. نقع قبالة سائل الإعلام متزايدة من محيط الشريحة وساترة باستخدام مناديل المختبر. تطبيق طلاء الأظافر لختم حواف بين ساترة والشريحة.

4. التصوير وتحليل البيانات

  1. لتحليل بنية لل NMJs، صورة العضلات مؤسسة كهرباء لبنان باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مجهزة لإثارة 488، 555 و 633 نانومتر الخفيفة والتقاط الضوء المنبعث مع 20X 40X والأهداف.
  2. تصور كامل لل NMJs، وخلق أقصى قدر من الصور كثافة إسقاط ثانية البصريمتباعدة ستعقد 1-2 ميكرون تمتد بعيدا من أدنى إلى أعلى المناطق مرئية من NMJ. خلق توقعات كثافة القصوى باستخدام التصوير البرمجيات المتاحة تجاريا.
  3. لتحديد معدلات عودة التعصيب، تصنيف لل NMJs على النحو التالي: 1) المزالة التعصيب تماما = الموقع بعد المشبكي يخلو تماما من الاتصال مع المحور، أقل من 5٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. 2) معصب جزئيا = محور عصبي تتداخل جزئيا postsynapse، colocalization 5-95٪ بين محور عصبي وACHRS. 3) تعصيب كامل = تقريبا بدل المثالي بين قبل وبعد المشبك، أكبر من 95٪ colocalization بين محور عصبي وACHRS. استبعاد لل NMJs التي تقع عموديا على مستوى التصوير أو لا تصور بشكل كامل في الصورة. ملاحظة: في كل هذه التجارب، تم فحص لا يقل عن 3 الحيوانات و 50 لل NMJs لكل حيوان. واعتبرت نتائج هامة باستخدام الطالب اختبار t مع قيمة P أقل من 0.05.
  4. للتشويش على المشغل، يمكن للأفراد منفصل أداءالجراحة وصورة التحليل. دون معرفة مجموعات العلاج، يمكن للمحلل أن يكون موضوعيا مع NMJ التهديف. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون الصور العشوائية وعرضها على مشغل للتحليل دون معرفة المصدر الحيواني.

5. الكمي PCR

  1. تضحية الحيوانات باستخدام الأيزوفلورين وخلع عنق الرحم. إزالة الجلد واللفافة السطحية التي تغطي عضلات الساق وفقا لخطوة 3.3. تشريح الأمامية الظنبوبي والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان وفقا لخطوة 3.4.
  2. فلاش تجميد الأمامية الظنبوبي كامل والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان في أنبوب 1.5 مل على النيتروجين السائل. إزالة أنسجة من أنبوب وضعها في هاون قبل المبردة المغمورة جزئيا في النيتروجين السائل. طحن العضلات المجمدة الى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة.
  3. حل مسحوق العضلات المجمدة إلى المتاحة تجاريا كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وتنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وإزالة الحمض النووي الجيني مع مجموعة المتاحة تجاريا وفقا لط الشركة المصنعةnstructions.
  4. أداء النسخ العكسي مع مزيج الناسخ العكسي المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. أداء QPCR استخدام عدة متاحة تجاريا باستخدام الجينات التدبير المنزلي المناسبة (انظر الجدول المواد). استخدام الكمي PCR cycler الحرارية المتاحة تجاريا لتنفيذ PCR (انظر الجدول المواد).
  6. ضبط درجة الحرارة الصلب إلى 58 درجة مئوية. ضبط المعلمات الدراجات إضافية لمواصفات الشركة المصنعة من مزيج الأخضر طق البلمرة / SYBR. تشمل خطوة منحنى ذوبان النهائية في برنامج cycler الحرارية التي تتكون من 0.5 درجة مئوية الزيادات الإضافية من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لاختبار خصوصية التمهيدي والتمهيدي تشكيل ديمر.
  7. تحديد مستويات التعبير مرنا النسبية عن طريق 2 - طريقة ΔΔCT 21 باستخدام 18S RNA كما الجين السيطرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العصب الشظوي المشترك، وتسمى أيضا العصب الشظوي المشترك، ينشأ من العصب الوركي فوق المبأبضية، حيث يتأرجح حول رأس الشظية على الجانب الأمامي للساق (الشكل 1A). هناك فروع لها في الأعصاب الشظوية سطحية وعميقة، جنبا إلى جنب تزويد dorsiflexors القدم وأصابع القدم (الأمامية الظنبوبي، باسطة إبهام اليد وخنصر اليد، وأباهيم قدمية الباسطة العضلات إبهام اليد)، وeverters القدم (عضلات الشظوية). كما يحمل هذا العصب الألياف الحسية التي توقع على ظهر القدم والجانب الوحشي من النصف السفلي من الساق. وهو هيكل رقيقة نسبيا تتكون من محرك ومحاور عصبية حسية. هذا الفرع العصب يتبع دورة التشريحية يمكن التنبؤ به. الجانبي للركبة، والعصبية هي في معظمها سطحية لأنه يعمل على وتر الرأس الوحشي للعضلة الساق (الشكل 1 والشكل 2). عشرهو يخدم موقع كمعلم مستقر التي يمكن الوصول إليها بسهولة مع شق صغير، والحد من الضرر للجلد، ورباط (الشكل 1A). قطر أصغر من هذه العصبية، بالمقارنة مع الوركي والأعصاب عظام الساق، يجعل من الممكن لسحق جميع المحاور باستخدام أقل قوة، مما يقلل من احتمال قطع تماما المحاور أكثر سطحية.

واستخدمت الفئران التعبير عن بروتين مضان أصفر (YFP) فقط في الخلايا العصبية 17 إلى تحسين إجراءات سحق على العصب الشظوي المشترك وبشكل لا لبس فيه تصور محاور تجديد. تم سحق العصبية على حافة وتر الساق معظم الداني إلى العضلات المستهدفة لأن هذا الموقع هو للوصول من مكان الجرح. ويقدم الموقع أيضا كمعلم التشريحية يمكن الاعتماد عليها، مما يجعل من الممكن مقارنة تجديد لل NMJs بين الحيوانات من نفس العمر والجنس. ضغط العصب لمدة 5 ثانية باستخدام ملقط غرامة الدقةults في اختفاء YFP من موقع الإصابة (الشكل 2B). ومع ذلك، فإن الأنسجة الضامة والخلايا المقيمين في غلاف لا تزال متواصلة، بمثابة قناة للتجديد السريع والدقيق لمحاور لأهداف الأصلية (الشكل 2B). في إناث الفئران 70 يوما القديمة، هذه الاصابة هي كافية للتسبب انحطاط جميع قطاعات محور عصبي البعيدة من سوما الخلايا العصبية (الشكل 4B).

لتحديد موثوقية واستنساخ هذه الطريقة الإصابة، تم فحص عودة التعصيب عضلة باسطة إبهام اليد (مؤسسة كهرباء لبنان). وقد تم اختيار هذه العضلات لعدة أسباب: 1) وهو القريب بعد فصل جسديا من مواقع الإصابة شق والعصبية (الشكل 3A). وبالتالي، يتم تبديل عضلة فقط من انحطاط من المحاور التعصيب قطعت. قربها من موقع سحق يقلل من الوقت اللازم لذلك أن reinnervated وatroph العضلاتذ. 2) انها تتكون أساسا من نوع سريع ألياف العضلات الهيكلية، والتي هي أكثر عرضة للشيخوخة والأمراض. 3) لل NMJs منه الخضوع لتغييرات هيكلية كبيرة خلال تطور الأمراض والشيخوخة التي يمكن أن تكون مخففة من ممارسة الرياضة والحد من السعرات الحرارية. 4) ويمكن الوصول إليها بسهولة عن التصوير الحي والتلاعب الجزيئي (الشكل 3D). 5) ويمكن فصلها بسهولة إلى مكونات السلامي الأربعة التي يمكن أن تكون كلها محمولة مما يجعل من الممكن تماما صورة كل من المحاور التعصيب والاتصالات الخاصة بهم باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 3B).

تم تقييم عودة التعصيب من المواقع بعد متشابك إخلاؤها سابقا بعد سحق العصب الشظية في ساقه اليمنى في ثلاث إناث الفئران 70 يوما القديمة معربا عن YFP في المحاور الحركية. مواقع مشاركة متشابك وتصور باستخدام الموسومة fluorescently ألفا بنغاروتوكسين (BTX)، الذي يربط بشكل انتقائي ومع قابلية عالية للعضلات بريداساعة. اعتبرت العضلات لتكون مزالة العصب، جزئيا أو كليا reinnervated اتباع هذه المعايير: 1) في الألياف العضلية مزالة العصب، المحاور الحركية في عداد المفقودين تماما من مواقع مشاركة متشابك وأقل من 5٪ colocalization بين محور عصبي ولوحظ ACHRS. 2) وصنفت ألياف العضلات معصب جزئيا من قبل بعض ولكن بدل ناقصة من المحاور الحركية مع مواقع مشاركة متشابك و5-95٪ colocalization بين محور عصبي ولوحظ ACHRS. 3) في الألياف العضلية معصب تماما، كان هناك بدل ما يقرب من الكمال بين النهايات العصبية الحركية والمواقع بعد متشابك وأكبر من 95٪ colocalization بين محور عصبي ولوحظ ACHRS. استبعدت لل NMJs الفردية من التهم إذا الصفائح الطرفية التي تقع عموديا على مستوى التصوير أو لكامل NMJ لم تصور. باستخدام هذه المعايير، لوحظ والتوافق ارتفاع في معدل ودرجة عودة التعصيب بين جميع الفئران التي تم فحصها. في 4 أيام بعد سحق، تم العثور على العضلات المزالة التعصيب تماما في كل إكساء الحيواناتالملغومة (الشكل 4B). وتبين هذه النتيجة أن سحق العصب الشظوي المشترك لمدة 5 ثوان، كما هو موضح أعلاه، يكفي لقطع جميع المحاور. قبل 7 أيام بعد سحق، وكانت النهايات العصبية في عملية إعادة احتلال إخلاؤها من قبل مواقع مشاركة متشابك (الشكل 4C، 4E-F). ومع ذلك، كانت لا تزال موجودة معصب إلا جزئيا معظم الألياف العضلية. مع أيام إضافية بعد سحق، واصلت النهايات العصبية على التمايز إلى المواقع ولل NMJs قبل المشبكي عثر reinnervated بالكامل من قبل 12 يوما (الشكل 4D، 4E-F). الأهم من ذلك، كان هناك تفاوت كبير بين الفئران مزالة العصب لنفس المدة الزمنية (الشكل 4E-F)، مما يدل على أن سحق العصب الشظية يمكن استخدامها في مقايسة لمقارنة عودة التعصيب للعضلات بين الحيوانات من نفس العمر والجنس.

القدرة على المقارنة بين بأمانة لل NMJs تجديد بين الحيوانات وتوفر فرصلفهم ميزات الخلوية المرتبطة بكل خطوة لازمة لإصلاح تماما هذا المشبك. لدراسة بنية لل NMJs مزالة العصب وتجديد من 70 يوما الفئران القديمة المستخدمة أعلاه لمقارنة معدلات عودة التعصيب، تم الحصول على صور عالية الدقة متحد البؤر المجهري لل NMJs. وكما كان متوقعا، فقد بينت الدراسة عددا من التغييرات التي تحدث في α الحركية النهايات العصبية محور عصبي لأنها reinnervate الألياف العضلية (الشكل 4G-I). تظهر المخاريط نمو محور عصبي لتوسيع والبدء في تتفرع كما اتصل المواقع بعد المشبكي (الشكل 4G). هذه الفروع محور عصبي ثم تنمو على مناطق معينة من postsynapse، وبلغت ذروتها في تجاور شبه الكامل للعصب محور عصبي تنتهي مع الموقع بعد المشبكي (الشكل 4H-I). السمات الهيكلية إضافية في تجديد النهايات العصبية الحركية التي تشبه إلى حد كبير تلك التي وجدت خلال تطوير لوحظت، بما في ذلك محاور متعددة تتنافس على الصورةالهدف AME (الشكل 4H)، وبلغت ذروتها في محور عصبي واحد فقط التعصيب الألياف العضلية واحد بنسبة 12 أيام بعد سحق. بالإضافة إلى ذلك، فروع محور عصبي يمتد إلى أبعد من مواقع مشاركة متشابك، ويشار هنا كما براعم، في جميع مراحل لوحظت بعد الإصابة (الشكل 4I). وكانت هذه براعم سائدة للغاية، حتى في لل NMJs معصب تماما مما يدل على أن المرحلة النهائية من إصلاح المحاور تشمل تراجع من فروع محور عصبي extrajunctional. وعلى الرغم من هذه التغييرات واضحة في النهايات العصبية، وظلت المواقع بعد متشابك في الغالب لا يمكن تمييزها في جميع مراحل ما بعد الإصابة مقارنة مع تلك الموجودة في العضلات لم يصب، بما في ذلك في 4 أيام بعد سحق عندما يتم العثور على الألياف العضلية مزالة العصب تماما. لم يكن هناك إشارة واضحة للتجزئة أو خسارة كبيرة واعادة توزيعها على المناطق الخارجة عن متشابك من ACHRS. وتشير هذه النتائج بقوة إلى أن طريقة الشظية العصبية سحق يمكن أن تستخدم بمثابة الاختبار لتحديد واختبار تدخلات الجزيئية، الدوائية ونمط الحياة رقبعة تعزيز إصلاح من النهايات العصبية في نقاط الاشتباك العصبي، بما في ذلك NMJ.

وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تم إحراز تقدم ضئيل جدا في تحديد العوامل مأخوذة من العضلات اللازمة والكافية لصيانة وإصلاح NMJ. لذا سألنا إذا كان يمكن استخدام الشظية طريقة إصابة العصب مشترك لتحديد جزيئات تغيير في مراحل معينة من عملية عودة التعصيب ومع الأدوار المحتملة في إصلاح NMJ. كدليل على مدير المدرسة، تحليل التعبير من اثنين من الجينات المرتبطة NMJ، غاما فرعية الاستشاري لحقوق الإنسان وكيناز العضلات محددة، تم إجراء المسك 18. كما هو موضح مع PCR الكمي، وزادت هذه الجينات التالية إزالة التعصيب وانخفض كما هي reinnervated لل NMJs (الشكل 5A-ب). وupregulated هذه الجينات في 4 أيام بعد سحق، كما ذكرت سابقا باستخدام عضلات مزالة العصب تماما 19. كما ألياف العضلات أعصاب reinnervate، ومستويات هذه الجينات انخفاض وRAPIالعودة DLY الى الاساس. ومن بين الحيوانات التي درسها، نمط من التعبير عن كل من جينات متطابقة تقريبا، مما يدل على وجود علاقة وثيقة بين التغيرات الجزيئية والخلوية في تجديد لل NMJs. وبالتالي يوفر هذا الأسلوب فرصا فريدة للتعرف على التغيرات الجزيئية المرتبطة مراحل مختلفة من NMJ تجديد.

شكل 1
الشكل 1: الشظية المشتركة تشريح الأعصاب (A) تخطيطي تفاصيل مسار العصب الوركي وفروعها النهائية فيما يتعلق المعالم السطحية والعظمية. العقدة = العصب الوركي، TN = قصبي العصب، صرن = العصب الربلي، الحزب الشيوعي النيبالي = الشظية المشتركة العصب، SPN = سطحي الشظية العصب، DPN = ديب الشظية العصب. وأشار موقع شق المطلوب. (ب) رسم تخطيطي لموقع مشترك العصبية الشظية فيما يتعلق العضلات المحيطة بها مع الجلد إزالتها.ويظهر موقع شق النسبي المغطي اللفافة الاستثمار. TA = قصبة الساق الأمامية العضلات مؤسسة كهرباء لبنان = باسطة إبهام اليد العضلات. (C) الوركي مكشوف والعصب الشظوي المشترك. الحزب الشيوعي النيبالي الصلبان على وتر عضلة الساق (تك) على مستوى الركبة. موقع سحق النسبي لوتر مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الشظية المشتركة العصب سحق جراحة (A) شق الأولي من الضروري أن تكون سوى عدد قليل من سم في الطول. بعد اختراق من خلال الجلد واللفافة السطحية، ويجب مواصلة شق طريق الاستثمار / اللفافة العميقة الواقعة بين الفخذية ذات الرأسين وعضلات TA. هو تصور (A1) العصب الشظوي المشترك بسهولة دون المجهر رhrough شق (تك = عضلة الساق). (A2) وتقاطع الشظية الأعصاب والساق وتر مشترك يمكن تصور بسهولة إذا تم توسيع شق (ضروري فقط لأغراض التصوير). يجب وضع سحق في الموقع والتي تمثلت في خط أحمر عمودي على الأعصاب وبالتوازي مع وتر تك. (ب) هو تصور الحزب الشيوعي النيبالي حتى بسهولة أكثر مع YFP الفئران المعدلة وراثيا تحت نطاق الفلورسنت تشريح. (B1) العصب يفقد مضان في موقع سحق، مما يسمح للتأكيد اصابة سحق كامل. (B2) وسحق الحزب الشيوعي النيبالي الكامل لا يزال من الممكن تصور بالعين المجردة وغرفة الإضاءة. والعصب تصبح شفافة. هذه الصورة تبرز حقيقة أن غلاف والبنية الفوقية من الحزب الشيوعي النيبالي تبقى سليمة مع الحد في وقت واحد تلف الأنسجة والأوعية الدموية القريبة.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: تشريح العضلات الباسطة الطويلة للأصابع (EDL) (A) 3 صورة ثلاثية الأبعاد للمؤسسة كهرباء لبنان في ما يتعلق عظام أطرافهم هند ماوس. تم إنشاؤها باستخدام JAtlasView (ب) تشريح جزئيا مؤسسة كهرباء لبنان العضلات تقسيمها إلى أقسام السلامي الأربعة ووضع علامات الأرقام التي يسيطر عليها كل شعبة. (C) YFP المسمى فرع من العصب الشظوي العميق كما يعصب الفرقة نهاية لوحة لتقسيم مؤسسة كهرباء لبنان السيطرة على الرقم الثاني. (D) فروع محور عصبي ومواقع الاتصال بهم يمكن التعرف بسهولة، مما يسمح للفحص ثابت من لل NMJs المحدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر سو هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): أسعار مماثلة عودة التعصيب بين الحيوانات من نفس العمر والجنس تحليل لل NMJs في العضلات مؤسسة كهرباء لبنان بعد سحق العصب الشظية. واحتلت مواقع (A) بعد متشابك تماما من المحاور في الفئران لم يصب. (ب) في 4 أيام بعد سحق، تم العثور على العضلات المزالة التعصيب تماما. (C) محاور عصبية تبدأ reinnervate عضلات 7 أيام بعد سحق و (د) إعادة احتلال تماما المواقع بعد المشبكي من 12 يوما. (E - F) معدل NMJ إعادة الإشغال لا يمكن تمييزه تقريبا بين الحيوانات مزالة العصب لنفس المدة الزمنية. (G - I) صور الممثل-التفريق إعادة النهايات العصبية محور عصبي في المواقع قبل المشبكي نضجت. إعادة احتلال المواقع بعد المشبكي يتبعنمط يمكن التنبؤ به، بدءا من مخروط النمو تطوير الفروع التي تحتل في نهاية المطاف تماما المواقع بعد المشبكي دون أن تمتد إلى ما بعد NMJ region.Similar في التنمية، معصب المواقع بعد المشبكي في البداية من قبل عدة لزراعة إعادة محاور ولكن لا تزال محور عصبي واحد مرة واحدة فقط في NMJ جددت تماما. (H) أمثلة تنتشر المحاور مندفعا، تعصيب الجزئي دون تداخل الكامل بين ما قبل وبعد المشبكي الأجهزة، وتعصيب بواسطة محاور متعددة المشار إليها. تم فحص 70 إناث الفئران بعمر يوم واحد. مقياس بار = 50 ميكرون (م)، 20 ميكرون (GI). شريط خطأ = SEM. N = 3 الفئران. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل (5): العصب الشظية سحق الأسلوب باعتبارهن الفحص لتحديد الجينات المرشح تشارك في إصلاح NMJ (A - B). إن مستوى مرنا من اثنين من الجينات المرتبطة NMJ، غاما فرعية الاستشاري لحقوق الإنسان والمسك، يتم تغيير مماثل في عضلة TA من الفئران مزالة العصب لنفس المدة الزمنية . مع زيادة الوقت المحتسب بدل الضائع بعد الأعصاب، ومستويات كل من النصوص انخفاض، والعودة إلى خط الأساس، مؤيدة التحليل النسيجي تبين عودة التعصيب التدريجي لل NMJs. يمثل كل سطر ماوس الفردية. شريط خطأ = الخطأ المعياري للمتوسط ​​مكررات التقنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة في هذه المخطوطة يوفر فرصا فريدة لتحديد الآليات التي تشارك في إصلاح الوصلات العصبية والعضلية (NMJ). هذا الأسلوب ينطوي على سحق العصب الشظوي المشترك لأنها تمر على وتر الساق بالقرب من الركبة. وتبين لنا أنه بعد ثانية فقط 5 من ضغط العصب مع ملقط، يلاحظ انحطاط كامل من قبل 4 أيام بعد الإصابة. في الفئران الشباب البالغين، تبدأ محاور ألفا الحركية إلى reinnervate مواقع متشابك السابقة في عضلة باسطة إبهام اليد (مؤسسة كهرباء لبنان) في 7 أيام بعد الإصابة، وبلغت ذروتها في الاصلاح من المواقع قبل المشبكي التي لا يمكن تمييزها عن تلك التي في الفئران لم يصب من قبل 12 يوما. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على مستويات مختارة الجزيئات المرتبطة NMJ-ترتبط بشكل وثيق مع مركز تعصيب من NMJ. الأهم من ذلك، هذه التغيرات الخلوية والجزيئية هي تكرار للغاية بين الحيوانات من نفس الجنس والعمر (الشكل 5A-ب)، وتوفير الفرص لتحديد وقسم التدريب والامتحاناتالعوامل تي التي تعمل على إصلاح NMJ. من حيث العمليات الجراحية، وفرع العصب الشظوي المشترك هو الوصول للغاية لأنها تمر على وتر الساق، لا تتطلب سوى شق صغير أن يؤدي إلى أضرار طفيفة في العضلات المحيطة بها والأوعية الدموية.

وهناك عدد من مزايا استخدام العصب الشظية مشترك لدراسة التغيرات الخلوية والجزيئية المرتبطة لل NMJs تجديد. يقدم وتر الساق كمعلم التشريحية مستقر تجرح باستمرار العصب الشظوي المشترك في نفس المكان والمسافة من العضلات المستهدفة. وهذا يجعل من الممكن مقارنة موثوق معدل تجديد من المحاور وعودة التعصيب للعضلات بين الحيوانات من نفس العمر والجنس. وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا النجاح ضمان أن موقع الإصابة يتسق بين العمليات الجراحية، ويتم الحصول على سحق العصبية الكامل في كل حيوان، ويستمر الحد الأدنى من الأضرار التي لحقت الهياكل المحيطة بها. بين العضلات التي يغذيها جommon العصبية الشظية، الأمامية الظنبوبي (TA) وباسطة إبهام اليد (EDL) العضلات أهدافا ممتازة لتقييم إصلاح NMJ. وتتألف هذه العضلات اثنين في المقام الأول من ألياف العضلات نوع السريعة التي تتأثر بشدة من جراء الإصابة، والشيخوخة والأمراض 5. لتحليل NMJ، والعضلات مؤسسة كهرباء لبنان جذابة بشكل خاص لأنه يمكن أن يكون كامل لنصرة صورة كل لل NMJs دون تشوهات. كما أنه يجعل من الممكن ربط التعديلات على لل NMJs مع التغيرات في أي مكان آخر في الألياف العضلية، المحاور الحركية والخلايا المحيطة بها.

وقد استخدمت عضلات TA ومؤسسة كهرباء لبنان على نطاق واسع لتقييم تأثير مختلف التدخلات الجزيئية ونمط الحياة على العضلات وإصلاح NMJ بسبب موقعها التشريحي من 20. ومع ذلك، إزالة التعصيب على المدى الطويل يغير التعبير عن الجينات مع وظيفة حاسمة في الضمور ألياف العضلات، وخلايا المناعة المنشط والخلايا الأقمار الصناعية 12-14، مما يجعل الأمر أكثر صعوبة لتقييم الفصل الخلوية والجزيئيةفي نفس الفئة المطلوبة لتعزيز تحديدا تجديد لل NMJs. في الطريقة الموصوفة هنا هو سحق العصب الشظوي على مقربة من العضلات TA ومؤسسة كهرباء لبنان، والسماح للالعصبية للوصول في غضون 7 أيام بعد سحق في الفئران الشباب البالغين. وبالتالي، ينبغي لهذه الطريقة تقليل فقدان كتلة العضلات والتغيرات الجزيئية المرتبطة الضمور الألياف العضلية في العضلات TA ومؤسسة كهرباء لبنان.

بروتوكول سحق الشظية العصبية يمكن تعديلها في الموضات متميزة متعددة. يمكن بسهولة أن تكون بديلا العصبية خفض الإصابة لسحق، والسماح لأفضل الوقت الحقيقي في التصوير المجراة من تجديد الأعصاب الطرفية. وهناك قطع يزيل المواد محور عصبي الميتة عائقا لنمو ويضمن الضرر متجانس من كل محور عصبي داخل أنبوب غمد الليف العصبي.

عندما يقوم بشكل صحيح سحق العصب الشظوي له مضاعفات قليلة المرتبطة بها. مشكلة واحدة يمكن أن يكون واجه هو فشل العصب لreinnervate أهداف NMJ الأصلية. يمكن أن يكون سبب ذلك عن طريق لجنة التنسيق الإداريةقطع idental إصابة العصب أثناء الجراحة. مما لا شك فيه للتحقق من ملقط سحق يميل غرامة لأي حواف حادة. إذا في أي لحظة خلال عملية جراحية نوعية لسحق العصبية أمر مشكوك فيه، شق الأصلي يمكن اتسعت لتصور أفضل العصب. في حين أن هذا يزيد من حجم الجرح ويمكن أن تلحق الضرر هياكل إضافية، يمكن أن تساعد في تحديد بشكل صحيح العصب الشظية وتقييم ما إذا كانت أو لم يتحقق سحق الكامل.

تقنية الموضحة هنا هل لدى عدد قليل من القيود. أولا، من المفيد بشكل رئيسي في الفئران الكبار مثل الهياكل في هذه الحيوانات هي كبيرة بما يكفي للتلاعب. الأطفال حديثي الولادة والفئران المراهقين هم أصغر من ذلك بكثير، زيادة كبيرة في صعوبة عملية جراحية. ثانيا، العصب الشظوي يحتوي على محاور الحسية والحركية، مما أدى إلى إزالة التعصيب من الأنسجة المستهدفة التي قد تؤثر على معدلات NMJ تجديد.

يتم التعرف على NMJ كموقع البؤري علم الأمراض في الضمور العضلي اللاتالتصلب األطراف (ALS) والشيخوخة. كما أن لديها إلى إصلاح بعد إصابة الأعصاب الطرفية لتجنب المساس المهارات الحركية وفقدان كتلة العضلات. يجب أن تساعد في طريقة سحق الشظية العصبية في تحديد واختبار الجزيئات مع أدوارا هامة في إصلاح NMJ. في نهج واحد، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لمحة مرنا والرنا الميكروي مع الأدوار الرئيسية في مراحل مختلفة من NMJ تجديد باستخدام تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن تطبق على تحديد بشكل انتقائي وظيفة الجينات مرشح قدم وحذفها من العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يفسح المجال بشكل جيد لاختبار قدرة جزيئات الخارجية لتسريع الأعصاب وNMJ تجديد باستخدام التصوير ثابتة وحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VetOne 501072
Xylazine Lloyd Inc.  003437 
Buprenorphine  Zoopharm 1Z-73000-150910 
Nair Nair
Kim-wipes Kimtech 34155
Electric Razor Braintree Scientific CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors Vannas 91500-09
No. 15 scalpel Braintree Scientific SSS 15
#5 Forceps Dumont 11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle  Suture Express 752B 
Rodent Heating Pad Braintree Scientific AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX Molecular Probes B35451
Vectashield Vector Labs H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope Olympus 562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump Fisher Scientific 13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix Bio-Rad 1708840
SsoFast Evagreen Supermix Bio-Rad 1725200
Bio-Rad CFX96 Bio-Rad 1855196
Puralube Vet ointment Puralube 1621
Synaptotagmin-2 antibody Antibodies-Online ABIN401605
Neurofilament antibody Antibodies-Online ABIN2475842

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
  2. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
  3. Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
  4. Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
  5. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
  6. Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
  7. Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
  9. Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
  10. Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  11. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  12. Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
  13. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
  14. Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
  15. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  17. Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  19. Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
  20. Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).

Tags

علم الأعصاب، العدد 114، NNJ، المشبك، إصلاح وإصابة العصب، العصب التجديد، إنحلال، الشظية العصب، peroneal العصبية، مؤسسة كهرباء لبنان
العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. More

Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (114), e54186, doi:10.3791/54186 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter