Den fibular nerveskade Metode: En pålidelig analyse til at identificere og Test faktorer, Reparation neuromuskulære forbindelse

Abstract

Den neuromuskulære junction (NMJ) undergår skadelige strukturelle og funktionelle ændringer som følge af ældning, skader og sygdom. Således er det absolut nødvendigt at forstå de cellulære og molekylære ændringer, der er involveret i vedligeholdelse og reparation NMJs. Til dette formål har vi udviklet en metode til pålideligt og konsekvent undersøge regenererende NMJs i mus. Denne nerveskade fremgangsmåde involverer knuse fælles fibular nerve som det passerer over den laterale hoved musculus gastrocnemius senen nær knæet. Anvendelse af 70 dage gamle hunmus, viser vi, at motoriske axoner begynder at reinnervate tidligere postsynaptiske mål inden for 7 dage efter crush. De helt genbesætte deres tidligere synaptiske områder ved 12 dage. For at bestemme pålideligheden af ​​denne skade metode, vi sammenlignet reinnervation satserne mellem de enkelte 70 dage gamle hunmus. Vi fandt, at antallet af reinnervated postsynaptiske steder var ens mellem mus ved 7, 9, og 12 dage efter crush. For at bestemme omdenne skade assay kan også anvendes til at sammenligne molekylære ændringer i musklerne, undersøgte vi niveauer af gamma-underenheden af ​​musklen nicotinreceptor (gamma-AChR) og muskel-specifikke kinase (Musk). Gamma-AChR subunit og moskus til er stærkt opreguleret efter denervering og vende tilbage til normale niveauer efter reinnervation af NMJs. Vi fandt en tæt sammenhæng mellem transkriptniveauer for disse gener og innervation status af muskler. Vi mener, at denne metode vil fremskynde vores forståelse af de cellulære og molekylære forandringer, der er involveret i reparation af NMJ og andre synapser.

Protocol

Alle forsøg blev udført under NIH retningslinjer og animalske protokoller godkendt af Virginia Tech Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Forberedelse Dyr til Kirurgi

1. Anesthetize mus med en blanding af ketamin (90 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via subkutan injektion lyske- med en steril 1 ml insulinsprøjte. Bæreropløsning indeholder en blanding af 0,9% saltvand, 17,4 mg / ml ketamin, og 2,6 mg / ml xylazin. Placer dyr tilbage i bure mens man venter på medicin til at træde i kraft.
   BEMÆRK: Hvis startdosis ikke giver tilstrækkelige bedøvelse under hele proceduren, kan yderligere 25% af bolusdosis injiceres.
2. Monitor dyr efter injektion for at kontrollere for stabile respiratoriske satser og passende depression af ophidselse niveauer. Check ophidselse niveau med en bagben pinch, som skulle fremkalde nogen reaktion, når tilstrækkeligt bedøvet.
   BEMÆRK: Det tager normalt 3-5min for en ung voksen mus gennemsnit 25 til 30 g. Hvis dyret stadig reagerer efter 10 min efter injektion, kan yderligere 25% af bedøvelsesmidlet bolusdosis injiceres.
3. Påfør vaseline og let mineralolie oftalmisk salve til dyrets øjne at forhindre tørhed. Fjern dyr fra bur og sted på en ren, flad overflade. Barbere den ønskede bagbenet fra fod til bækken anvendelse af en elektrisk hår trimmer, udsætter kun den laterale side af lemmet.
4. Anvende en kemisk hår remover til det barberede site for 1 min. Fjern manuelt hår ved hjælp laboratorium klude. Rengør afhåret område med laboratorium Udvisk dyppet i ethanol.

2. Kirurgisk procedure

1. Sterilisere kirurgiske instrumenter via autoklave eller anden egnet metode. Rens det kirurgiske sted og kirurgisk bord med 80% ethanol / H ₂ 0. Desinficer operationsstedet med proviodine. Placer musen på kirurgisk bord og tilpasse med lemmer begrænsninger. Holdemålet Baglemmets i en anatomisk naturlige stilling med knæleddet udvides lidt uden intern eller ekstern rotation.
2. Placer dyr og bord under den kirurgiske mikroskop. Orient til den korrekte incisionssted via palpation af overfladiske vartegn, specifikt knoklede knæled og højderyggen mellem tibialis anterior og gastrocnemius muskler.
3. Lav en ca 3 cm incision gennem huden ved hjælp af en skalpel eller forår saks, mens du bruger generelle pincet til at gribe. Gør snittet vinkelret på den underliggende løbet af fælles fibular nerve.
4. Fortsæt snittet gennem den overfladiske fascia, udsætte biceps femoris og vastus lateralis muskler. Adskil disse muskler ved at skære gennem den forbindende dybe fascia. En 1-2 cm snit skulle være tilstrækkeligt.
5. Træk biceps femoris musklen kaudalt bruge mekaniske retraktorer, afslører den fælles fibular nerve.
6. Trace nerven proksimalt indtil dens intersektion med senen af ​​den laterale hoved af musculus gastrocnemius er fundet. Bemærk: Udsættelse kan kræve yderligere manipulation af den tilbagetrukne hud og muskel. Dette skæringspunkt anvendes som stabil vartegn for nerveskade.
7. Tag fat i nerven med en fin pincet, justere tip i en parallelt med den laterale kant af gastrocnemius senen. Knus den fælles fibular nerve ved at anvende stabil, hård pres i 5 sek.
8. Bekræfte fuld crush af nerven ved visuel inspektion gennem den kirurgiske rækkevidde. Det vil blive vist gennemsigtig på stedet for skaden. Hvis der anvendes mus, der udtrykker fluorescens proteiner i perifere axoner, vil fluorescensen forsvinde fra skadestedet.
9. Fjern retraktorer og justere muskler i deres anatomiske positioner. Luk incisionssted med 6-0 silke suturer. 1-3 simple afbrudte suturer er tilstrækkelig. Placer genvinde mus på en varmepude i et rent bur.
10. Overvågning af alle dyr til 2 timer efter operation for at kontrollere for vejrtrækning og eventuelle bivirkninger ved bedøvelsen. Administrer en indledende dosis på buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg via subkutan lyskelymfeknuder injektion umiddelbart efter genopretning fra kirurgi. Giv 3 yderligere doser hver 12 timer over de næste 48 timer. Efter fuld helbredelse, returnere mus til dyret pleje facilitet.

3. Isolering og Farvning af extensor digitorum longus (EDL) Muskler

1. Sacrifice dyr ved hjælp isofluran. Dispenser 0,5 ml væske isofluran i et 50 ml rør pakket med absorberende labwipes. Anbring udjævnede rør med dyret i en forseglet 2.500 ^cm3 kammer. Mindst 4 min eksponering er tilstrækkelig. Test for tab af bilateral palpebral, toe-knibe, og hale-knivspids reflekser for at sikre, at hvert dyr er bevidstløs, før du fortsætter med perfusion.
2. Transkardialt perfundere ¹⁶ dyr først med 10 ml 0,1 M PBS, derefter 25 ml af 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 enheder / 20g dyrevægt) kan tilsættes sammen med PBS (10 enheder / ml) til forebyggelse af blodpropper i små kapillære beds, forbedre perfusion resultater.
3. Fjerne huden dækker bagben ved hjælp saks til at klippe tværs gennem huden rundt om omkredsen af ​​maven. Skræl ned huden forbi bagbenene og fødder med en pincet.
4. Fjern overfladisk fascia af bagben ved at gribe fat og afskalning med pincet. Hvis du bruger mus udtrykker fluorescens proteiner i perifere axoner, post-fix hele mus natten over i 4% PFA i 50 ml rør. Skyl tre gange med PBS.
   BEMÆRK: Fast mus kan opbevares i PBS ved 4 ° C. Hvis ikke, skal du springe dette trin over og fortsætte til trin 3.6 uden efterbetalte fastsættelse dyr.
5. Dissekere ud EDL muskler ¹⁸ fra mus bagben, og sørg for at holde proksimale og distale sener så intakt som muligt.
6. Inkuber EDL muskler i blokerende buffer (1x PBS indeholdende 0,5% Triton X-100, 3% BSA og 5% gedeserum) i mindst 1 time.
7. Farv den kontralaterale uskadt EDL som en positiv kontrol for komplet NMJ innervation. Negative kontroller bør omfatte en EDL fås ved henvendelse til 4 dage efter skaden, et tidspunkt, hvor NMJ er helt denerveres, samt en EDL farves med kun sekundært antistof.
8. Inkuber muskler med passende fluorescens mærkede sekundære antistoffer til påvisning neurofilament og synaptotagmin-2 i 1 dag. Vask muskler tre gange med 1x PBS og 10 minutter hver gang. Bemærk: Dette trin kan udføres sammen med trin 3.10. Spring dette trin, hvis du bruger mus udtrykker fluorescens proteiner i perifere axoner.
9. For at visualisere postsynaptic region af NMJ, inkuberes muskler med 5 ug / ml Alexa-555 konjugeret alfa-bungarotoxin fortyndet med blokerende buffer i mindst 2 timer. Vask muskler tre gange med 1x PBS og 10 minutter hver gang.
10. For at montere hele muskler på positivt ladede objektglas, læg musklen direkte på dias, tilføje et par dråber af glycerol baseret montering medium på dias og dække med et dækglas. Tryk dækglasset mod objektglasset at flade musklen. Soak off montering medier fra omkredsen af ​​dias og dækglas hjælp laboratorie klude. Påfør neglelak til at forsegle kanterne mellem dækglasset og dias.

4. Billedbehandling og dataanalyse

1. For at analysere strukturen af ​​NMJs, billede EDL muskler ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop udstyret til at ophidse 488, 555 og 633 nm lys og indfange det udsendte lys med 20x og 40X mål.
2. For at visualisere hele NMJs, skabe maksimal intensitet projektion billeder af optisk sectioner afstand 1 til 2 um bortset strækker sig fra laveste til højeste synlige regioner i NMJ. Opret maksimale projektioner intensitet ved hjælp af kommercielt tilgængelig imaging software.
3. For at bestemme satser reinnervation, kategorisere NMJs som: 1) helt denerveres = postsynaptiske site er fuldstændig blottet for kontakt med axon, mindre end 5% colokalisering mellem Axon og AChRs. 2) Delvist innerverede = Axon delvist overlapper postsynapse, 5-95% co-lokalisering mellem Axon og AChRs. 3) Fuld innervation = næsten perfekt apposition mellem før og efter synapse, mere end 95% colokalisering mellem Axon og AChRs. Udelukke NMJs der ligger vinkelret på billedplanet eller ikke fuldt visualiseres i billedet. Bemærk: I alle disse eksperimenter blev mindst 3 dyr og 50 NMJs per dyr undersøgt. Resultater blev anset signifikant ved anvendelse af en student t-test med en P-værdi på mindre end 0,05.
4. Til blinde operatøren, kan separate individer udførekirurgi og billedanalyse. Uden kendskab til behandlingsgrupperne, kan analysatoren være objektiv med NMJ scoring. Alternativt kan billederne blive randomiseret og præsenteres for operatøren til analyse uden kendskab til kilden dyr.

5. Kvantitativ PCR

1. Sacrifice dyr ved anvendelse isofluran og cervikal dislokation. Fjern huden og overfladiske fascia dækker benmusklerne henhold til trin 3.3. Dissekere tibialis anterior og EDL muskler efter trin 3.4.
2. Flash fryse hele tibialis anterior og EDL muskler i et 1,5 ml rør under flydende nitrogen. Fjerne væv fra røret og anbringes i en forkølet morter delvist nedsænket i flydende nitrogen. Grind frosset muskel til et fint pulver under anvendelse af morter og støder.
3. frosset muskel pulver opløses i et kommercielt tilgængeligt RNA-ekstraktion reagens og udfører RNA-ekstraktion og genomisk DNA fjernelse med et kommercielt tilgængeligt kit ifølge producentens Instructions.
4. Udføre revers transkription med en kommercielt tilgængelig revers transkriptase mix ifølge producentens anvisninger.
5. Udfør qPCR ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit ved hjælp af passende husholdning gener (se tabel af materialer). Brug et almindeligt tilgængeligt kvantitativ PCR thermal cycler at udføre PCR (se tabel af materialer).
6. Indstil annealingstemperatur til 58 ° C. Juster yderligere cykling parametre til specifikationerne for producenten af ​​Taq-polymerase / SYBR grøn mix. Indbefatter en endelig smelte kurve trin i termisk cykliseringsapparat program bestående af 0,5 ° C trinvise stigninger fra 65 ° C til 95 ° C for at teste for primer specificitet og primer dimer formation.
7. Bestem relative mRNA ekspression niveauer af 2 ^{- ΔΔCT} metode ²¹ ved hjælp af 18S RNA som kontrol-genet.

Representative Results

Den fælles fibularis nerve, også kaldet den fælles peronealnerve opstår fra iskiasnerven ovenfor knæhasen, hvor den svinger omkring hovedet af fibula til den forreste del af benet (figur 1A). Der er det grene ind i overfladiske og dybe fibular nerver sammen leverer de dorsiflexors af foden og tæerne (anterior tibialis, extensor digitorum longus og brevis, og extensor halluces longus muskler), og everters af foden (peroneus muskler). Denne nerve udfører også sensoriske fibre, der rager til dorsum af foden og laterale aspekt af den nederste halvdel af benet. Det er en forholdsvis tynd struktur bestående af motoriske og sensoriske axoner. Denne nerve gren følger et forudsigeligt anatomisk kursus. Lateral til knæet, nerven er hovedsagelig overfladisk som det løber over senen af den laterale hoved af musculus gastrocnemius (figur 1 og figur 2). ther placeringen tjener som en stabil milepæl, der let kan nås med et lille snit, begrænse skader på hud og fascia (figur 1A). Den mindre diameter af denne nerve, når der sammenlignes med ischiadicus og tibial nerver, gør det muligt at knuse alle axoner bruge mindre kraft, hvilket reducerer sandsynligheden for fuldstændig adskillelse af de mere overfladiske axoner.

Mus, der udtrykker gul fluorescens protein (YFP) kun i neuroner ¹⁷ blev brugt til at optimere crush procedure om den fælles fibular nerve og utvetydigt visualisere regenererende axoner. Nerven blev knust på kanten af ​​gastrocnemius senen mest nærmest målet muskler, fordi dette site er mere tilgængelig fra placeringen af ​​snittet. Dette site fungerer også som en pålidelig anatomisk vartegn, hvilket gør det muligt at sammenligne regenerering af NMJs blandt dyr af samme alder og køn. Komprimering nerven i 5 sek med en fin pincet resÜLTS i forsvinden YFP fra skadestedet (figur 2B). Men den bindevæv og celler, der er bosiddende i epineurium forblive sammenhængende, fungerer som kanal for hurtig og præcis regenerering af axoner til deres oprindelige mål (Figur 2B). I 70 dage gamle hunmus, denne skade er tilstrækkelig til at forårsage degenerering af alle axonale segmenter distalt fra den neuronale soma (figur 4B).

For at bestemme pålidelighed og reproducerbarhed af denne skade metode blev reinnervation af extensor digitorum longus (EDL) muskel undersøgt. Denne muskel blev valgt af flere grunde: 1) Det er proksimal endnu fysisk adskilt fra incision og nervebeskadigelse sites (figur 3A). Derfor er musklen kun ændres ved degeneration af adskilte innerverer axoner. Dens nærhed til crush stedet minimerer den nødvendige tid for at blive reinnervated og muskel atrophy. 2) Det er primært sammensat af hurtig typen skeletmuskulatur fibre, som er mere modtagelige for aldring og sygdomme. 3) Dens NMJs undergår væsentlige strukturelle ændringer i udviklingen af ​​sygdomme og aldring, der kan dæmpes ved motion og kaloriefattige begrænsning. 4) Det er let tilgængelige for direkte billedvisning og molekylær manipulation (figur 3D). 5) Det kan let adskilles i dets fire falankse komponenter, der kan være hel-monteret, hvilket gør det muligt fuldt billede alle sine innerverer axoner og deres forbindelser ved hjælp af lysmikroskopi (figur 3B).

Reinnervation af tidligere fraflyttede postsynaptiske websteder efter knuse fibular nerve på højre ben blev vurderet i tre 70 dage gamle hunmus udtrykker YFP i motoriske axoner. Post-synaptiske steder blev visualiseret under anvendelse af fluorescerende mærkede a-bungarotoxin (BTX), som binder selektivt og med høj affinitet til muskler NAcHRS. Muskler blev anset for at være denerveres, delvis eller helt reinnervated efter disse kriterier: 1) I denerverede muskelfibre blev motoriske axoner helt mangler fra post-synaptiske steder og mindre end 5% co-lokaliseringstoppe mellem Axon og AChRs blev observeret. 2) Delvist innerverede muskelfibre blev kategoriseret efter nogle, men ufuldstændig anbringelsen af ​​motoriske axoner med post-synaptiske steder og 5-95% colokalisering mellem Axon og AChRs blev observeret. 3) I fuldt innerverede muskelfibre, der var næsten perfekt apposition mellem motorens nerveender og post-synaptiske steder og mere end 95% co-lokalisering mellem Axon og AChRs blev observeret. Individuelle NMJs blev udelukket fra tællinger, hvis deres endeplader lå vinkelret på billedplanet eller hele NMJ var ikke visualiseret. Ved hjælp af disse kriterier, blev høj konkordans i satsen og graden af ​​reinnervation observeret blandt alle mus undersøges. På 4 dage efter knuse blev muskler fundet helt denerveres i alle dyr EXAudvindes (figur 4B). Dette resultat viser, at knuse fælles fibular nerve i 5 sek, som beskrevet ovenfor, er tilstrækkelig til at afskære alle axoner. Ved 7 dage efter knuse, nerveender var i færd med at genbesætter tidligere fraflyttede postsynaptiske steder (figur 4C, 4E-F). Men de fleste muskelfibre lå stadig kun delvist innerveres. Med ekstra dage efter knuse, nerveender fortsatte at differentiere til præsynaptiske steder og NMJs blev fundet fuldt reinnervated med 12 dage (figur 4D, 4E-F). Vigtigere, der var lidt variation blandt mus denerveres for samme tidsrum (figur 4E-F), hvilket viser, at knusning nervus fibularis kan anvendes som et assay til at sammenligne reinnervation af muskler mellem dyr af samme alder og køn.

Evnen til trofast sammenligne regenererende NMJs mellem dyr giver mulighederat forstå de cellulære træk forbundet med hvert trin kræves for fuldt ud at reparere denne synapser. For at undersøge arkitektur denerverede og regenererer NMJs fra 70 dage gamle mus anvendt ovenfor til at sammenligne satserne for reinnervation blev opnået høj opløsning konfokal mikroskopi billeder af NMJs. Som forventet, denne analyse afslørede en række forandringer, der sker i α-motoriske Axon nerveender, som de reinnervate muskelfibre (Figur 4G-I). Axonal vækst kegler synes at udvide og begynder at forgrene sig, da de kontakter postsynaptiske steder (Figur 4G). Disse axonale grene derefter vokse over specifikke regioner af postsynapse, der kulminerede i den nærmeste fuldstændig sidestilling af Axon nerve slutter med den postsynaptiske stedet (Figur 4H-I). Yderligere strukturelle træk i regenerere motor nerveender, der stærkt ligner dem, der findes under udviklingen blev observeret, herunder flere axoner konkurrerer om same mål (Figur 4H), der afsluttes i kun én Axon innerverer en muskelfiber med 12 dage efter knuse. Derudover axonale grene rækker ud post-synaptiske steder, der er nævnt heri som spirer, i alle faser blev observeret efter skaden (Figur 4I). Disse spirer var meget udbredt, selv i fuldt innerverede NMJs tyder på, at den sidste fase af axonal reparation indebærer tilbagetrækning af extrajunctional axonale grene. På trods af disse åbenlyse ændringer på nerveender, post-synaptiske sites forblev det meste ikke skelnes på alle stadier efter skaden i forhold til dem i uskadt muskler, herunder på 4 dage efter knuse når muskelfibre findes helt denerveres. Der var ingen tydelige tegn på fragmentering eller betydeligt tab og omfordeling til ekstra-synaptiske regioner AChRs. Disse resultater indikerer kraftigt, at nervus fibularis crush metode kan anvendes som et assay til at identificere og teste molekylære, farmakologiske og livsstil interventioner that fremme reparation af nerveender på synapser, herunder NMJ.

Trods nylige fremskridt, der er gjort meget få fremskridt med at identificere muskel-afledte faktorer, der kræves og tilstrækkelige til at vedligeholde og reparere NMJ. Vi spurgte derfor, om der kan bruges det fælles fibular nerveskade metode til at identificere molekyler ændret på bestemte stadier af reinnervation processen og med potentielle roller i reparation af NMJ. Som bevis på principal, ekspression analyse af to NMJ-associerede gener, AChR gamma underenheden og muskel-specifik kinase, moskus ¹⁸ blev udført. Som demonstreret med kvantitativ PCR, er disse gener steg efter denervering og faldt som NMJs er reinnervated (Figur 5a-b). Disse gener opreguleres på 4 dage efter knuse, som tidligere rapporteret ved brug helt denerverede muskler ^19. Som nerver reinnervate muskelfibre, niveauer af disse gener falde og RapiDLY tilbage til baseline. Blandt dyr undersøges, mønstret for udtryk for begge gener er næsten identisk, viser en tæt sammenhæng mellem molekylære og cellulære forandringer på regenererende NMJs. Denne fremgangsmåde tilvejebringer derfor enestående muligheder for at identificere molekylære ændringer i forbindelse med forskellige stadier af NMJ regenerering.

Figur 1:. Fælles fibular Nerve Anatomi (A) Skematisk beskriver forløbet af iskiasnerven og dens terminale grene i relation til overfladiske og benede landmærker. SCN = iskiasnerven, TN = tibial Nerve, srn = Sural Nerve, CPN = Common fibular Nerve, SPN = Overfladisk fibular Nerve, DPN = Deep fibular Nerve. Den ønskede indsnit site er indikeret. (B) Diagram af blød fibular nerve placering i forhold til de omgivende muskler med huden fjernet.Relativ incisionssted vises overliggende den investerende fascia. TA = tibialis anterior muskel EDL = extensor digitorum Longus Muscle. (C) Udsat ischiadicus og fælles fibular nerve. CPN krydser over musculus gastrocnemius (Gn) sene på niveauet af knæet. Crush websted i forhold til senen vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Fælles fibular Nerve Crush Surgery (A) Den oprindelige snit behøver kun være et par cm i længden. Efter at trænge gennem huden og overfladiske fascia, skal snittet fortsættes gennem investering / dybe fascia ligger mellem Biceps femoris og TA muskler. (A1) Den fælles fibular nerve let visualiseres uden mikroskopi through snittet (Gn = musculus gastrocnemius). (A2) Skæringspunktet mellem den fælles fibular nerve og gastrocnemius senen let kan visualiseres hvis snittet udvides (kun nødvendigt til fotografiske formål). Crush skal placeres på det sted markeret med den røde linje vinkelret på nerve og parallelt med Gn senen. (B) The CPN er endnu lettere visualiseret med YFP transgene mus under en fluorescerende dissektionsmikroskop. (B1) Nerven mister fluorescens på det sted, crush, der giver mulighed for bekræftelse af en komplet crush skade. (B2) En fuld CPN crush kan stadig visualiseret med det blotte øje og rumbelysning. Nerven bliver gennemskinnelige. Dette billede fremhæver, at epineurium og overbygning af CPN forbliver intakt samtidig begrænse skader på nærliggende væv og blodkar.Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:. Anatomi af extensor digitorum Longus (EDL) Muscle (A) 3 dimensionelle billede af EDL i forhold til knoglerne i musen bagbenet. Genereret ved hjælp JAtlasView (B) Delvist dissekeret EDL muskler adskilt i sine fire falankse divisioner og mærkning cifrene kontrolleres af hver division. (C) YFP mærket gren af den dybe fibular nerve, da den innerverer den endelige plade bånd af EDL division styrer det andet ciffer. (D) axonale filialer og deres kontaktoplysninger sites let kan identificeres, der giver mulighed for konsekvent undersøgelse af udvalgte NMJs. Klik her for at se en større version of denne figur.

Figur 4: Lignende Satser for reinnervation mellem dyr af samme alder og køn Analyse af NMJs i EDL muskler efter knuse fibular nerve.. (A) Post-synaptiske sites er helt besat af axoner i uskadte mus. (B) På 4 dage efter knuse, er muskler findes helt denerveres. (C) Axoner begynder at reinnervate muskler 7 dage efter crush og (D) fuldstændigt genbesætte postsynaptiske steder med 12 dage. (E - F) Satsen for NMJ re-belægning er næsten umulig at skelne mellem dyr denerveres for samme tidsrum. (G - I) Repræsentative billeder af re-differentierende axonal nerveender i modnet præsynaptiske steder. Genbesættelse af postsynaptiske steder følger enforudsigeligt mønster, startende med væksten kegle udvikle grene, der i sidste ende helt optager postsynaptiske websteder uden strækker sig ud over NMJ region.Similar til udvikling, postsynaptiske steder er oprindeligt innerveres af flere re-voksende axoner, men kun én Axon tilbage når NMJ har fuldstændig regenereret. (H) Eksempler på sprudlende axonal spiring, delvis innervation uden fuld overlapning mellem før og postsynaptiske apparater, og innervation af flere axoner angivet. 70 daggamle hunmus blev undersøgt; Scale Bar = 50 um (AD), 20 um (GI). Fejl bar = SEM. N = 3 mus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: fibular nerveknusning Fremgangsmåde som enn Indhold at identificere kandidatgener involveret i Reparation af NMJ (A - B). mRNA niveau på to NMJ-associerede gener, AChR gamma subunit og moskus, er tilsvarende ændret i TA musklen af mus denerveres for samme tidsrum . Med stigende tid efter nerveskade, niveauer af begge udskrifter falde, vendte tilbage til baseline, der bekræfter histologiske analyse viser progressiv reinnervation af NMJs. Hver linje repræsenterer en individuel mus. Fejl bar = standardafvigelse af gennemsnittet af tekniske gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Metoden præsenteres i dette manuskript giver unikke muligheder for at identificere mekanismer involveret i reparation neuromuskulære junctions (NMJ). Denne fremgangsmåde involverer knuse fælles fibular nerve, når den passerer hen over gastrocnemius senen nær knæet. Vi viser, at efter kun 5 sek af nerve kompression med en pincet, er komplet degeneration bemærket af 4 dage efter skade. Hos unge voksne mus, alpha-motoriske axoner begynder at reinnervate tidligere synaptiske steder i extensor digitorum longus musklen (EDL) på 7 dage efter skaden, der kulminerede i reformationen af ​​præsynaptiske websteder, der er umulig at skelne fra dem i skadede mus ved 12 dage. Desuden viser vi, at niveauer af udvalgte NMJ-associerede molekyler tæt korrelerer med innervation status NMJ. Vigtigt er det, disse cellulære og molekylære ændringer er meget reproducerbar mellem dyr af samme køn og alder (figur 5a-b), der giver mulighed for at identificere og test faktorer, der virker til at reparere NMJ. Med hensyn til kirurgiske procedurer, den fælles fibular nerve gren er meget tilgængelig, når den passerer hen over gastrocnemius senen, som kun kræver et lille snit, der resulterer i ringe skade på omkringliggende muskler og kar.

Der er en række fordele ved at anvende den fælles fibular nerve at undersøge cellulære og molekylære ændringer i forbindelse med regenererende NMJs. Den gastrocnemius senen tjener som en stabil anatomisk vartegn til konsekvent skade den fælles fibular nerve på samme sted og afstand fra mål muskler. Dette gør det muligt på pålidelig sammenligne hastigheden for regenerering af axoner og reinnervation af muskler mellem dyr af samme alder og køn. Trinene er kritiske for en sådan succes omfatter at sikre, at skaden site er konsistent mellem operationer, er fuld nerve crush opnået i hvert dyr, og minimal skade opretholdes til omkringliggende strukturer. Blandt muskler innerveres af cFÆLLES fibular nerve, tibialis anterior (TA) og extensor digitorum longus (EDL) muskler er fremragende mål for vurdering af NMJ reparation. Disse to muskler er primært sammensat af hurtige typen muskelfibre, der er hårdt ramt af skader, aldring og sygdomme ^5. For NMJ analyse, EDL muskler er særligt attraktivt, fordi det kan være hel-monteret på billedet alle NMJs uden forvrængninger. Det gør det også muligt at korrelere ændringer på NMJs med ændringer andre steder i muskelfibre, motor axoner og de omkringliggende celler.

TA og EDL muskler er blevet flittigt brugt til at vurdere virkningen af forskellige molekylære og livsstil interventioner på muskler og NMJ reparation på grund af deres anatomiske placering ^20. Men langsigtet denervering ændrer ekspression af gener med kritisk funktion i atrophying muskelfibre, aktiverede immunceller og satellitceller ^12-14, hvilket gør det vanskeligere at vurdere cellulær og molekylær lmanges forpligtet til specifikt at fremme regenerering af NMJs. I den her beskrevne fremgangsmåde nervus fibularis knuses i umiddelbar nærhed af TA og EDL muskler, hvilket tillader nerven at nå dem inden for 7 dage efter crush hos unge voksne mus. Derfor bør denne metode minimere tab af muskelmasse og molekylære ændringer i forbindelse med atrophying muskelfibre i TA og EDL muskler.

Nervus fibularis crush protokol kan modificeres på flere forskellige mode. Nerve cut skade kan let erstattes crush, der giver mulighed for bedre realtid in vivo-billeddannelse af perifer nerve regenerering. En nedskæring fjerner døde Axon materiale som en hindring for genvækst og sikrer homogen skader af enhver Axon i endoneurale rør.

Når udført korrekt fibularis nerve crush har få tilknyttede komplikationer. Et problem, der kunne opstå, er svigt af den frækhed at reinnervate originale NMJ mål. Dette kan være forårsaget af accidental skære skade på nerven under operationen. Sørg for at tjekke de fine spids knusning pincet for skarpe kanter. Hvis kvaliteten af ​​en nerve crush på noget tidspunkt under operationen er tvivlsom, kan den oprindelige indsnit udvides bedre at visualisere nerven. Mens dette øger størrelsen af ​​såret og kan skade yderligere strukturer, kan det hjælpe med korrekt identificerer fibular nerve og vurdering af, om en fuld crush blev opnået.

Den her beskrevne teknik er i besiddelse af et par begrænsninger. For det første er det hovedsageligt nyttigt i voksne mus som strukturerne i disse dyr er store nok til at manipulere. Newborn og unge mus er meget mindre, en væsentlig forøgelse af vanskeligheden ved operationen. For det andet, den fibularis nerve indeholder sensoriske og motoriske axoner, hvilket resulterer i denervering af målvæv, der kan påvirke satser for NMJ regenerering.

Den NMJ er anerkendt som et centralt sted for patologi i amyotrofisk latrelle sklerose (ALS) og aldring. Det skal også repareres efter beskadigelse af perifere nerver at undgå at skade motorik og miste muskelmasse. Den fibular nerve crush metode bør hjælpe med identifikation og afprøvning af molekyler med vigtige roller i reparation af NMJ. I en metode, kunne denne metode bruges til at profilere mRNA og microRNA med centrale roller på forskellige stadier af NMJ regenerering bruger RNA-sekvens analyse. Den kan også anvendes til selektivt bestemme funktionen af ​​kandidatgener indført og slettet fra muskler. Desuden denne metode egner sig godt til at afprøve, om eksogene molekyler til at fremskynde nerve og NMJ regenerering hjælp statisk og direkte billedvisning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube Vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842