Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) subisce cambiamenti strutturali e funzionali deleteri a causa di invecchiamento, lesioni e malattie. Pertanto, è indispensabile per capire i cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella manutenzione e riparazione NMJs. A questo scopo, abbiamo sviluppato un metodo per affidabile e coerente esaminare rigenerante NMJs nei topi. Questo metodo comporta la lesione del nervo schiacciamento del nervo peroneo comune che passa sopra la testa laterale del tendine del muscolo gastrocnemio vicino al ginocchio. Utilizzando vecchi topi di sesso femminile di 70 giorni, dimostriamo che assoni motori cominciano a Reinnervate precedenti obiettivi post-sinaptici entro 7 giorni post-cotta. Essi rioccupano completamente le loro precedenti zone sinaptiche da 12 giorni. Per determinare l'affidabilità di questo metodo di infortunio, abbiamo confrontato i tassi di reinnervazione tra i singoli vecchi topi femmina 70 al giorno. Abbiamo scoperto che il numero di siti post-sinaptici reinnervated era simile tra i topi a 7, 9, e 12 giorni post-cotta. Per determinare sequesto test lesione può essere utilizzato anche per confrontare cambiamenti molecolari nei muscoli, abbiamo esaminato livelli di gamma-subunità del recettore nicotinico muscolare (gamma-AChR) e la chinasi muscolo-specifica (MuSK). La subunità gamma-AChR e muschio di sono altamente sovraregolati dopo denervazione e tornare a livelli normali seguenti reinnervazione di NMJs. Abbiamo trovato una stretta relazione tra i livelli di trascrizione di questi geni e lo stato innervazione dei muscoli. Noi crediamo che questo metodo accelererà la nostra comprensione dei cambiamenti cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del NMJ e altre sinapsi.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida NIH e protocolli animali approvati dal Comitato di Virginia Tech Istituzionale Animal Care e Usa.
1. Gli animali prepara per la chirurgia
- Anestetizzare topi con una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione sottocutanea con inguinale sterile 1 ml siringa da insulina. soluzione Carrier contiene una miscela di soluzione fisiologica 0,9%, 17,4 mg / ml ketamina e 2,6 mg / ml xilazina. Mettere gli animali di nuovo in gabbia in attesa che il farmaco abbia effetto.
NOTA: Se la dose di carico non fornisce anestesia sufficienti per la durata del procedimento, un ulteriore 25% della dose di carico può essere iniettato. - animali Monitor dopo l'iniezione per verificare la frequenza respiratoria e la depressione costante appropriato di livelli di eccitazione. Controllare il livello di eccitazione con un pizzico zampa posteriore, che dovrebbe suscitare alcuna risposta quando sufficientemente anestetizzati.
NOTA: Questo richiede di solito 3-5min per un giovane topo adulto in media da 25 a 30 g. Se l'animale è ancora reattivo dopo la post iniezione 10 min, un ulteriore 25% della dose di carico anestetico può essere iniettato. - Applicare vaselina e olio minerale leggero pomata oftalmica per gli occhi degli animali per prevenire la secchezza. Rimuovere gli animali da gabbia e posto su una superficie piana e pulita. Radere l'arto posteriore desiderato dal piede al bacino tramite un trimmer capelli elettrici, esponendo solo l'aspetto laterale dell'arto.
- Applicare un dispositivo di rimozione dei capelli chimica al sito rasato per 1 min. Rimuovere manualmente i capelli con salviette di laboratorio. Pulire la zona depilata con laboratorio wipe imbevuto di etanolo.
2. Procedura chirurgica
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave o altro metodo appropriato. Pulire il sito chirurgico e bordo chirurgica con l'80% di etanolo / H 2 0. Disinfettare il sito chirurgico con proviodine. Posizionare il mouse sul bordo chirurgico e allinearsi con restrizioni degli arti. Tenerel'arto destinazione posteriori in posizione anatomica naturale con il ginocchio leggermente esteso senza rotazione interna o esterna.
- Mettere animale e tavola sotto il microscopio operatorio. Orientare al corretto sito di incisione attraverso la palpazione dei punti di riferimento superficiali, in particolare il ginocchio ossuto e il crinale tra il tibiale anteriore e muscoli gastrocnemio.
- Fare un'incisione di circa 3 centimetri attraverso la pelle con un bisturi o forbici primavera durante l'utilizzo di pinze generali per la presa. Rendere l'incisione perpendicolare al corso di fondo del nervo peroneo comune.
- Continuare l'incisione attraverso la fascia superficiale, esponendo il bicipite femorale e vasto laterale muscoli. Separare questi muscoli tagliando attraverso la fascia profonda di collegamento. Un taglio 1-2 cm dovrebbe essere sufficiente.
- Ritrarre muscolo bicipite femorale caudale utilizzando divaricatori meccanici, rivelando il nervo peroneo comune.
- Tracciare il nervo prossimalmente fino alla sua trasezione con il tendine del capo laterale del muscolo gastrocnemio è trovato. Nota: L'esposizione può richiedere ulteriori manipolazione della pelle ritratta e muscoli. Questa intersezione viene utilizzato come punto di riferimento stabile per la lesione del nervo.
- Afferrare il nervo con una pinza sottile, allineando le punte in modo parallelo al bordo laterale del tendine gastrocnemio. Schiacciare il nervo peroneale comune applicando costante, pressione dura per 5 sec.
- Corroborare pieno schiacciamento del nervo mediante ispezione visiva attraverso l'ambito chirurgico. Apparirà traslucida presso il sito di lesione. Se si utilizza topi che esprimono proteine fluorescenti in assoni periferici, la fluorescenza scompare dal sito di lesione.
- Rimuovere divaricatori e riallineare i muscoli nelle loro posizioni anatomiche. Chiudere il sito di incisione con 6-0 punti di sutura in seta. 1-3 punti staccati semplici è sufficiente. Mettere recupero del mouse su una piastra elettrica in una gabbia pulita.
- Monitorare tutti gli animali per 2 ore post-operazione per controllare la respirazione e le eventuali reazioni avverse all'anestesia. Somministrare una dose iniziale di buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg tramite iniezione sottocutanea inguinale subito dopo il recupero da un intervento chirurgico. Dare 3 ulteriori dosi ogni 12 hr per il prossimo 48 hr. Dopo il recupero completo, tornare topi per la casa di cura degli animali.
3. Isolamento e colorazione di estensore lungo delle dita Muscoli (EDL)
- Sacrificare animali con isoflurano. Dispensare 0,5 ml isoflurano liquido in un tubo da 50 ml piena di labwipes assorbenti. Posizionare il tubo non livellata con l'animale in una camera stagna 2500 centimetri 3. Almeno 4 minuti di esposizione è sufficiente. Test per la perdita di palpebrale bilaterale, toe-pinch, e riflessi coda pizzico per garantire che ogni animale è incosciente prima di procedere con la perfusione.
- Transcardially profumato 16 animali prima con 10 ml di 0,1 M PBS, poi 25 ml di 4% paraformaldeide in PBS 0,1 M (pH 7,4). Eparina (30 unità / 20g di peso animale) può essere aggiunto con il PBS (10 unità / ml) per prevenire la coagulazione del sangue nei piccoli capillari, migliorando i risultati di perfusione.
- Rimuovere la pelle che copre arti posteriori utilizzando forbici per tagliare trasversalmente attraverso la cute intorno alla circonferenza dell'addome. Sbucciare giù la pelle oltre le arti e le zampe posteriori con pinze.
- Rimuovere fascia superficiale degli arti posteriori afferrando e peeling con una pinza. Se si utilizza topi che esprimono proteine fluorescenti negli assoni periferici, post-risolvere tutto topi durante la notte nel 4% PFA in provette da 50 ml. Risciacquare tre volte con PBS.
NOTA: fissa i topi possono essere memorizzati in PBS a 4 ° C. In caso contrario, saltare questo passaggio e passare al punto 3.6, senza animali pubblicare truccate. - Sezionare i muscoli EDL 18 da topo arti posteriori, essendo sicuri di mantenere il più possibile intatto prossimale e distale tendini.
- Incubare muscoli EDL in tampone bloccante (1x PBS contenente 0,5% Triton X-100, 3% BSA e 5% siero di capra) per almeno 1 ora.
- Colorare il controlaterale indenne EDL come controllo positivo per la completa innervazione NMJ. I controlli negativi dovrebbero comprendere l'EDL ottenuto a 4 giorni post-lesione, un punto temporale in cui il NMJ è completamente denervato, nonché un EDL colorate con solo anticorpo secondario.
- Incubare i muscoli con opportuni anticorpi secondari fluorescente con tag per rilevare neurofilament e synaptotagmin-2 per 1 giorno. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta. Nota: Questa operazione può essere effettuata con passo 3.10. Ignorare questo passaggio se si utilizzano topi che esprimono proteine fluorescenti in assoni periferici.
- Per visualizzare il postsyregione naptic del NMJ, incubare i muscoli con 5 mg / ml di Alexa-555 coniugato Alfa Bungarotossina diluito in tampone di bloccaggio per almeno 2 ore. Lavare i muscoli tre volte con PBS 1x e 10 minuti ogni volta.
- Per montare i muscoli interi su vetrini con carica positiva, posizionare il muscolo direttamente sulla diapositiva, aggiungere qualche goccia di glicerolo media sulla slitta di montaggio basati e coprire con un vetrino. Premere il vetrino contro il vetrino per appiattire il muscolo. Impregna fuori dal mezzo di montaggio dal perimetro della diapositiva e coprioggetto utilizzando salviette di laboratorio. Applicare lo smalto per sigillare i bordi tra il vetrino e scivolo.
4. Imaging e analisi dei dati
- Per analizzare la struttura di NMJs, l'immagine del muscolo EDL utilizzando un microscopio confocale a scansione laser attrezzato per eccitare 488, 555 e 633 nm di luce e catturare la luce emessa con 20X e 40X obiettivi.
- Per visualizzare tutta NMJs, creare immagini di proiezione massima intensità del sec otticazioni distanziate da 1 a 2 micron che si estende a parte il più basso al più alto regioni visibili della NMJ. Crea proiezioni di massima intensità utilizzando software di imaging disponibili in commercio.
- Per determinare i tassi di reinnervazione, catalogare NMJs come: 1) completamente denervato = sito post-sinaptica è completamente privo di contatto con gli assoni, meno del 5% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 2) parzialmente innervato = l'assone si sovrappone parzialmente il postsynapse, 5-95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. 3) innervazione completa = quasi perfetta apposizione tra il pre e post-sinapsi, superiore al 95% colocalizzazione tra l'assone e AChRs. Esclusione NMJs che giacciono perpendicolare al piano di imaging e non pienamente visualizzabili nell'immagine. Nota: In tutti questi esperimenti, di almeno 3 animali e 50 NMJs per animale sono stati esaminati. I risultati sono stati ritenuti significativi utilizzando un t-test di Student con un valore di P inferiore a 0,05.
- Per accecare l'operatore, individui separati possono eseguirel'intervento chirurgico e l'immagine di analisi. Senza la conoscenza dei gruppi di trattamento, l'analizzatore può essere obiettivo con NMJ punteggio. In alternativa, le immagini possono essere randomizzati e presentati all'operatore per analisi senza la conoscenza dell'animale sorgente.
5. PCR quantitativa
- Sacrificare animali utilizzando isoflurano e dislocazione cervicale. Togliere la pelle e fascia superficiale che copre i muscoli delle gambe in base al punto 3.3. Sezionare tibiale anteriore e muscoli EDL in base al punto 3.4.
- Flash congelare l'intera tibiale anteriore e muscoli EDL in una provetta da 1,5 ml over azoto liquido. Rimuovere il tessuto dal tubo e posto in un mortaio di pre-raffreddata parzialmente immerso in azoto liquido. Macinare muscolo congelato in una polvere fine con un mortaio e pestello.
- Sciogliere in polvere muscolare congelati in un reagente di estrazione dell'RNA disponibili in commercio e procedere all'estrazione del RNA e la rimozione DNA genomico con un kit disponibile in commercio secondo i produttoreSTRUZIONI.
- Eseguire la trascrizione inversa con un mix trascrittasi inversa disponibili in commercio in base alle istruzioni del produttore.
- Eseguire qPCR utilizzando un kit disponibile in commercio utilizzando opportuni geni housekeeping (vedi tabella dei materiali). Utilizzare un quantitativo termociclatore PCR disponibile in commercio per eseguire la PCR (vedi tabella dei materiali).
- Impostare la temperatura di ricottura a 58 ° C. Regolare i parametri di ciclismo aggiuntive alle specifiche del costruttore di Taq polimerasi / SYBR mix verde. Includere una fase curva di fusione finale in programma termociclatore comprensivi di 0,5 ° aumenti incrementali C da 65 ° C a 95 ° C per testare primer specificità PRIMER formazione dimero.
- Determinare relativi livelli di espressione dell'mRNA per il 2 - metodo di ΔΔCT 21 utilizzando 18S RNA come il gene di controllo.
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Representative Results
Il nervo peroneale comune, chiamato anche il nervo peroneo comune, nasce dal nervo sciatico di sopra della fossa poplitea, dove si oscilla intorno alla testa del perone alla faccia anteriore della gamba (Figura 1A). Ci si dirama nei nervi peroneale superficiali e profondi, insieme fornendo i flessori dorsali del piede e dita del piede (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita e brevis, e alluci estensori muscoli longus), e le everters del piede (muscoli peronei). Questo nervo svolge anche fibre sensoriali che proiettano al dorso del piede e la parte laterale della metà inferiore della gamba. Si tratta di una struttura relativamente sottile composto da motore e assoni sensoriali. Questo ramo del nervo segue un corso anatomica prevedibile. Laterale al ginocchio, il nervo è principalmente superficiale come corre sulla tendine del capo laterale del muscolo gastrocnemio (Figura 1 e Figura 2). thè la posizione serve come punto di riferimento stabile che può essere facilmente raggiungibile con una piccola incisione, limitando i danni alla pelle e fascia (Figura 1A). Il diametro più piccolo di questo nervo, rispetto al sciatico e tibiale, permette di schiacciare tutti assoni usando meno forza, riducendo la probabilità di separare completamente assoni più superficiali.
I topi che esprimono giallo proteina fluorescente (YFP) solo nei neuroni 17 sono stati usati per ottimizzare la procedura cotta per il nervo peroneo comune e senza ambiguità visualizzare assoni rigeneranti. Il nervo è stato schiacciato sul bordo del tendine gastrocnemio più prossimale ai muscoli bersaglio perché questo sito è più accessibile dalla posizione di incisione. Questo sito serve anche come un riferimento anatomico affidabile, rendendo possibile il confronto rigenerazione di NMJs tra gli animali della stessa età e sesso. La compressione del nervo per 5 secondi utilizzando una pinza sottile resULT nella scomparsa della YFP dal luogo della ferita (Figura 2B). Tuttavia, i tessuti e le cellule residenti nel epineurio connettivo rimangono contigui, che serve come un condotto per la rigenerazione rapida e precisa degli assoni ai loro obiettivi originali (Figura 2B). In 70 giorni vecchi topi di sesso femminile, questa lesione è sufficiente a causare la degenerazione di tutti i segmenti assonale distale dal soma neuronale (Figura 4B).
Per determinare l'affidabilità e la riproducibilità di questo metodo lesioni, reinnervazione del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) è stata esaminata. Questo muscolo è stato scelto per diverse ragioni: 1) è prossimale ancora fisicamente separati dai siti pregiudizio incisione e nervose (Figura 3A). Di qui, il muscolo viene modificato solo dalla degenerazione degli assoni innervano mozzate. La sua vicinanza al sito schiacciamento riduce al minimo il tempo necessario per essere reinnervated e atroph muscolarey. 2) è composto principalmente di tipo veloce fibre muscolari scheletriche, che sono più suscettibili di invecchiamento e le malattie. 3) la sua NMJs subiscono significativi cambiamenti strutturali nel corso della progressione delle malattie e l'invecchiamento che può essere attenuato con l'esercizio e la restrizione calorica. 4) E 'facilmente accessibile per l'imaging dal vivo e manipolazione molecolare (Figura 3D). 5) può essere facilmente separato nei suoi quattro componenti falangee che può essere tutto montato rendendo possibile la piena immagine tutti i suoi assoni innervano e le loro connessioni utilizzando la microscopia ottica (Figura 3B).
Reinnervazione di precedenza lasciati liberi siti post-sinaptici dopo schiacciamento del nervo peroneale sulla gamba destra è stata valutata in tre 70 giorni vecchi topi femmina che esprimono YFP in assoni motori. siti post-sinaptici sono stati visualizzati con fluorescenza etichettati Alfa Bungarotossina (BTX), che si lega selettivamente e con elevata affinità ai muscoli nACHRS. I muscoli sono stati considerati denervato, parzialmente o completamente reinnervated seguendo questi criteri: 1) nelle fibre muscolari denervate, assoni motori erano completamente scomparsi da siti post-sinaptici e meno del 5% colocalizzazione tra l'assone ed è stato osservato AChRs. 2) fibre muscolari innervate in parte sono stati classificati da alcuni, ma apposizione incompleta di assoni motori con siti post-sinaptici e 5-95% colocalizzazione tra l'assone ed è stato osservato AChRs. 3) In fibre muscolari completamente innervati, c'era quasi perfetta apposizione tra terminazioni nervose motorie e siti post-sinaptici e superiore al 95% colocalizzazione tra l'assone ed è stato osservato AChRs. NMJs individuali sono stati esclusi dalla conta se i loro endplates depongono perpendicolare al piano di imaging o l'intera NMJ non è stato visualizzato. Utilizzando questi criteri, alta concordanza del tasso e il grado di reinnervazione è stata osservata tra tutti i topi esaminati. A 4 giorni post-schiacciamento, i muscoli sono stati trovati completamente denervato in tutti gli animali examinato (Figura 4B). Questo risultato dimostra che schiaccia il nervo peroneo comune per 5 secondi, come sopra descritto, è sufficiente per recidere tutti gli assoni. In 7 giorni post-schiacciamento, terminazioni nervose erano in procinto di rioccupare siti post-sinaptica in precedenza lasciati liberi (Figura 4C, 4E-F). Tuttavia, la maggior parte delle fibre muscolari sono stati ancora trovati solo parzialmente innervati. Con giorni aggiuntivi post-cotta, terminazioni nervose hanno continuato a differenziarsi in siti presinaptici e NMJs sono state trovate completamente reinnervated da 12 giorni (figura 4D, 4E-F). Importante, c'era poca variabilità fra topi denervati per la stessa durata di tempo (Figura 4E-F), dimostrando che schiaccia il nervo peroneale può essere usato come un test per confrontare reinnervazione di muscoli tra animali della stessa età e sesso.
La possibilità di confrontare fedelmente NMJs rigeneranti tra animali offre opportunitàper capire le caratteristiche cellulari associati ad ogni passo necessario per riparare pienamente questa sinapsi. Per esaminare l'architettura di NMJs denervati e rigeneranti dal 70 giorni i topi utilizzati in precedenza per confrontare i tassi di reinnervazione, sono state ottenute immagini ad alta risoluzione di microscopia confocale di NMJs. Come previsto, questa analisi ha rivelato una serie di cambiamenti che si verificano in α-motorie terminazioni degli assoni nervosi in quanto Reinnervate fibre muscolari (Figura 4G-I). Coni di crescita assonale sembrano espandersi e cominciare a espandersi come si mettono in contatto i siti post-sinaptici (Figura 4G). Questi rami assonali poi crescere nel regioni specifiche del postsynapse, che culmina in un prossimo giustapposizione completa del nervo assone termina con il sito postsinaptica (Figura 4H-I). caratteristiche strutturali aggiuntive a rigenerare le terminazioni nervose del motore che molto assomigliano a quelli trovati durante lo sviluppo sono stati osservati, tra cui più assoni in competizione per la sbersaglio ame (figura 4H), che si conclude con un solo assone che innervano una fibra muscolare da 12 giorni post-schiacciamento. Inoltre, i rami che si estendono oltre assonale siti post-sinaptici, di cui qui come germogli, in tutte le fasi post-infortunio sono stati osservati (Figura 4I). Questi germogli erano altamente prevalenti, anche in NMJs completamente innervati che suggeriscono che la fase finale di riparazione assonale comporta retrazione di rami assonali extrajunctional. Nonostante questi ovvi cambiamenti a terminazioni nervose, siti post-sinaptici una sostanziale indistinguibile in tutte le fasi post-infortunio rispetto a quelli nei muscoli uninjured, anche a 4 giorni post-schiacciamento quando le fibre muscolari si trovano completamente denervato. Non c'era alcun segno evidente di frammentazione o perdita significativa e ridistribuzione alle regioni extra-sinaptici di AChRs. Questi risultati indicano chiaramente che il metodo del perone nervo sbandata può essere usato come un test per identificare e testare interventi molecolari, farmacologiche e di stile di vita tcappello a promuovere la riparazione di terminazioni nervose a livello delle sinapsi, tra cui il NMJ.
Nonostante i recenti progressi, sono stati fatti pochi progressi nell'identificazione di fattori muscolo-derivato necessarie e sufficienti per mantenere e riparare il NMJ. Abbiamo quindi chiesto se il metodo di lesione del nervo peroneale comune può essere utilizzato per identificare le molecole alterate in determinate fasi del processo di reinnervazione e con i potenziali ruoli nella riparazione del NMJ. Come prova del capitale, analisi di espressione di due geni NMJ-associati, la gamma subunità AChR e la chinasi muscolo-specifica, muschio 18 è stata eseguita. Come dimostrato con PCR quantitativa, questi geni sono aumentati dopo denervazione ed è diminuito in NMJs sono reinnervated (Figura 5a-b). Questi geni sono sovraregolati a 4 giorni post-schiacciamento, come riportato in precedenza utilizzando completamente i muscoli denervati 19. Come fibre muscolari nervi Reinnervate, i livelli di questi geni diminuiscono e rapidly tornare alla linea di base. Tra gli animali esaminati, il pattern di espressione di entrambi i geni è quasi identico, dimostrando una stretta correlazione tra i cambiamenti molecolari e cellulari a NMJs rigeneranti. Questo metodo fornisce quindi opportunità uniche per identificare i cambiamenti molecolari associati ai diversi stadi di rigenerazione NMJ.
Figura 1:. Perone comune Anatomia Nerve (A) Schema dettaglio il corso del nervo sciatico e dei suoi rami terminali in relazione a punti di riferimento superficiali e ossee. SCN = nervo sciatico, TN = Nervo tibiale, SRN = nervo surale, CPN = Comune perone Nerve, SPN = superficiale del perone Nervo, Nervo DPN = profonda del perone. Il sito di incisione desiderata viene indicata. (B) Schema di comune posizione del nervo peroneale in relazione ai muscoli circostanti con la pelle rimossa.sito di incisione relativa è mostrata sovrastante la fascia investire. TA = Tibia anteriore EDL = muscolo estensore lungo delle dita. (C) sciatico esposto e nervo peroneo comune. CPN attraversa il tendine del muscolo gastrocnemio (Gn) a livello del ginocchio. Sito Crush rispetto al tendine mostrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Comune perone Nerve Crush Chirurgia (A) L'incisione iniziale deve essere solo un paio di cm di lunghezza. Dopo che penetra attraverso la pelle e fascia superficiale, l'incisione deve essere continuato con l'investire / fascia profonda compresa tra le Bicipite femorale e muscoli TA. (A1) Il nervo peroneale comune è facilmente visualizzabile senza microscopia tttraverso l'incisione (Gn = muscolo gastrocnemio). (A2) L'intersezione dei comuni peroneale nervi e gastrocnemio tendine può essere facilmente visualizzato se l'incisione viene allargato (necessario solo per scopi fotografici). La calca deve essere collocato nella posizione segnata dalla linea rossa perpendicolarmente al nervo e parallela al tendine Gn. (B) Il CPN è ancora più facilmente visualizzato con YFP topi transgenici in un ambito dissezione fluorescente. (B1) Il nervo perde fluorescenza nel sito di schiacciamento, permettendo così di individuare una lesione completa schiacciamento. (B2) Una completa cotta CPN può ancora essere visualizzate con l'illuminazione occhio e la sala nudo. Il nervo diventerà traslucido. L'immagine mette in evidenza il fatto che il epinevrio e la sovrastruttura del CPN rimangono intatte, mentre allo stesso tempo limitare i danni ai vasi sanguigni e dei tessuti circostanti.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Anatomia del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) (A) 3 immagine tridimensionale della EDL in relazione alle ossa degli arti posteriori del mouse. Generati utilizzando JAtlasView (B) del muscolo EDL parzialmente sezionato separato nelle sue quattro divisioni falangee e marcatura le cifre controllati da ogni divisione. (C) YFP ramo del nervo peroneale profondo etichettato come si innerva la banda fine-piatto della divisione EDL che controlla la seconda cifra. (D) rami assonale e dei loro siti a contatto possono essere facilmente identificati, consentendo l'esame costante di NMJs selezionati. Fai clic qui per vedere una versione più grande of questa figura.
Figura 4: tassi simili di Reinnervazione tra gli animali della stessa età e sesso Analisi NMJs nel muscolo EDL dopo schiacciamento del nervo peroneale.. Siti (A) post-sinaptici sono completamente occupate da assoni nei topi illeso. (B) a 4 giorni post-schiacciamento, i muscoli si trovano completamente denervato. (C) Gli assoni cominciano a Reinnervate muscoli 7 giorni post-schiacciamento e (D) rioccupare interamente siti postsinaptici da 12 giorni. (E - F) Il tasso di NMJ ri-occupazione è quasi indistinguibile tra gli animali denervata per lo stesso periodo di tempo. (G - I) Immagini rappresentative della ri-differenziazione terminazioni nervose assonale all'interno di siti presinaptici maturati. Rioccupazione dei siti post-sinaptici segue unschema prevedibile, a partire dal cono di crescita sviluppando rami che occupano alla fine pienamente siti postsinaptici senza estendere oltre la NMJ region.Similar di sviluppo, siti postsinaptici sono inizialmente innervato dal più assoni ri-crescita, ma solo un assone rimane una volta che il NMJ ha completamente rigenerato. (H) Esempi di esuberante germinazione assonale, innervazione parziale senza la piena sovrapposizione tra pre e post-sinaptici apparati, e innervazione da più assoni indicati. 70 topi di sesso femminile di un giorno sono stati esaminati; Scala Bar = 50 micron (AD), 20 micron (GI). barra di errore = SEM. N = 3 topi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il nervo del perone Crush metodo come unn Tenore di identificare i geni candidati coinvolti nella riparazione del NMJ (A - B). Il livello di mRNA di due geni NMJ-associati, la gamma subunità AChR e muschio, sono allo stesso modo alterato nel muscolo TA di topi denervato per la stessa durata di tempo . Con l'aumento della lesione del nervo dopo tempo, i livelli di entrambi i trascritti diminuiscono, tornando ai valori basali, che confermano l'analisi istologica che mostra progressiva reinnervazione di NMJs. Ciascuna linea rappresenta un mouse individuo. Errore bar = errore standard della media delle repliche tecniche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo presentato in questo manoscritto fornisce opportunità uniche per identificare i meccanismi coinvolti nella riparazione di giunzioni neuromuscolari (NMJ). Questo metodo comporta la frantumazione del nervo peroneo comune che passa sopra il gastrocnemio tendine vicino al ginocchio. Abbiamo dimostrato che dopo soli 5 secondi di compressione del nervo con una pinza, completa degenerazione è notato da 4 giorni dopo l'infortunio. Nei topi giovani adulti, gli assoni alfa-motori cominciano a Reinnervate precedenti siti sinaptici del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) a 7 giorni post-infortunio, si conclude con la riforma dei siti presinaptici che sono indistinguibili da quelli in topi indenne da 12 giorni. Inoltre, abbiamo dimostrato che i livelli di selezionare molecole NMJ-associati strettamente correlati con lo stato innervazione del NMJ. È importante sottolineare che questi cambiamenti cellulari e molecolari sono altamente riproducibili tra gli animali dello stesso sesso ed età (Figura 5a-b), offrendo opportunità per identificare e tesfattori t che agiscono per riparare il NMJ. In termini di procedure chirurgiche, il ramo del nervo peroneale comune è altamente accessibile al passaggio sopra il tendine gastrocnemio, che richiede solo una piccola incisione che si traduce in pochi danni ai muscoli circostanti e vascolarizzazione.
Ci sono un certo numero di vantaggi di utilizzare il nervo peroneo comune per esaminare cambiamenti cellulari e molecolari associati NMJs rigeneranti. Il tendine gastrocnemio serve come un punto di riferimento stabile anatomica a ferire in modo coerente il nervo peroneale comune sulla stessa posizione e la distanza dai muscoli bersaglio. Questo permette di confrontare in modo affidabile il tasso di rigenerazione di assoni e reinnervazione dei muscoli tra animali della stessa età e sesso. I passaggi critici di tale successo assicurare anche che il luogo di ferita è coerente tra ambulatori, completo schiacciamento del nervo si ottiene in ogni animale, ed un danno minimo è sostenuto alle strutture circostanti. Tra muscoli innervati dal cCOMUNE nervi peroneale, il tibiale anteriore (TA) e muscoli estensori delle dita (EDL) sono ottimi obiettivi per valutare la riparazione NMJ. Questi due muscoli sono composti principalmente da fibre muscolari di tipo veloce che sono gravemente colpiti da una lesione, l'invecchiamento e le malattie 5. Per l'analisi NMJ, il muscolo EDL è particolarmente interessante perché può essere tutto montato all'immagine tutti NMJs senza distorsioni. Essa consente inoltre di correlare le alterazioni a NMJs con i cambiamenti altrove nelle fibre muscolari, assoni motori e le cellule circostanti.
I muscoli TA e EDL sono stati ampiamente utilizzati per valutare l'impatto dei vari interventi molecolari e dello stile di vita sulla muscolare e la riparazione NMJ causa della loro posizione anatomica 20. Tuttavia, denervazione a lungo termine altera espressione di geni con funzione critica in atrophying fibre muscolari, cellule immunitarie attivate e cellule satelliti 12-14, il che rende più difficile valutare ch cellulare e molecolareanges necessaria per promuovere in particolare la rigenerazione di NMJs. Nel metodo descritto qui il nervo fibulare è schiacciato in prossimità ai muscoli TA e EDL, permettendo il coraggio di raggiungerli entro 7 giorni dopo la sbandata in topi giovani adulti. Così, questo metodo dovrebbe ridurre al minimo la perdita di massa muscolare e cambiamenti molecolari associati atrophying fibre muscolari nei muscoli TA e EDL.
Il protocollo di schiacciamento del nervo peroneale può essere modificato in più mode distinti. lesioni taglio del nervo può essere facilmente sostituito cotta, consentendo una migliore tempo reale imaging in vivo della rigenerazione dei nervi periferici. Un taglio rimuove il materiale assone morto come un ostacolo per la ricrescita e assicura danni omogenea di ogni assone all'interno del tubo endoneurale.
Quando eseguito correttamente la calca dei nervi peroneale ha poche complicazioni associate. Un problema che potrebbe essere rilevato è il fallimento del nervo di Reinnervate obiettivi NMJ originali. Ciò può essere causato da accidentale tagliato lesioni al nervo durante l'intervento chirurgico. Assicuratevi di controllare le pinze a punta fine frantumazione per eventuali spigoli vivi. Se in qualsiasi momento durante l'intervento chirurgico la qualità di uno schiacciamento del nervo è discutibile, l'incisione originale può essere ampliata per visualizzare meglio il nervo. Anche se questo aumenta la dimensione della ferita e può danneggiare le strutture aggiuntive, può aiutare a identificare correttamente il nervo peroneale e valutare se non è stata raggiunta una cotta pieno.
La tecnica qui descritta fa possedere alcune limitazioni. Innanzitutto, è utile soprattutto in topi adulti le strutture in questi animali sono abbastanza grandi da manipolare. Newborn topi adolescenti sono molto più piccoli, aumentando notevolmente la difficoltà della chirurgia. In secondo luogo, il nervo peroneale contiene assoni sensoriali e motori, con conseguente denervazione dei tessuti bersaglio che possono influenzare i tassi di rigenerazione NMJ.
Il NMJ è riconosciuto come un luogo focale della patologia in amiotrofica latLa sclerosi rale (SLA) e l'invecchiamento. Ha anche essere riparato dopo un trauma ai nervi periferici per evitare di compromettere le capacità motorie e di perdere massa muscolare. Il metodo di schiacciamento del nervo peroneale dovrebbe facilitare l'identificazione e la sperimentazione di molecole con un ruolo importante nella riparazione del NMJ. In un approccio, questo metodo potrebbe essere usato al profilo mRNA e microRNA con ruoli chiave nelle diverse fasi della rigenerazione NMJ utilizzando analisi di sequenza di RNA. Può anche essere applicato per determinare selettivamente la funzione dei geni candidati introdotti e cancellate dai muscoli. Inoltre, questo metodo si presta bene a testare la capacità delle molecole esogene per accelerare la rigenerazione dei nervi e NMJ utilizzando immagini statiche e vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
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