腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

Abstract

神経筋接合部（NMJ）が加齢、損傷および疾患の結果として有害な構造的および機能的変化を受けます。したがって、のNMJの維持及び修復に関与する細胞および分子の変化を把握することが不可欠です。この目的のために、我々は、確実かつ一貫してマウスでのNMJの再生検査する方法を開発しました。それは膝の近くに腓腹筋腱の外側頭の上を通過するように、この神経損傷の方法は、共通の腓骨神経を破砕することを含みます。 70日齢の雌のマウスを使用して、我々は運動軸索がポストクラッシュ7日以内に、前シナプス後の標的を神経再支配し始めることを示しています。彼らは完全に12日までに、以前のシナプス領域を再占拠します。この傷害の方法の信頼性を決定するために、我々は個々の70日齢の雌マウスとの間神経再支配率を比較しました。我々はreinnervatedシナプス後サイトの数は7、9でマウスの間で類似していたことがわかった、と12日後にクラッシュ。かどうかを確認するにはこの傷害アッセイはまた、筋肉の分子の変化を比較するために使用することができ、我々は、筋肉ニコチン性受容体（γ-のAChR）および筋特異的キナーゼ（ムスク）のγサブユニットのレベルを調べました。ガンマのAChRサブユニットとムスクは非常に次の除神経をアップレギュレートし、のNMJの再神経支配次の通常のレベルに戻っているします。我々は、これらの遺伝子と筋肉の神経支配の状態のための転写レベルの間の密接な関係を発見しました。我々は、このメソッドはNMJや他のシナプスを修復に関与する細胞および分子変化の我々の理解を加速すると考えています。

Protocol

全ての実験は、NIHガイドラインとバージニア工科大学施設内動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルの下で行いました。

外科1.準備動物

1. 滅菌した1 mlのインスリンシリンジで、皮下鼠径注射ケタミンの混合物（90ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）でマウスを麻酔。キャリア溶液は、0.9％生理食塩水、17.4 mg / mlでケタミン、および2.6 mg / mlとキシラジンの混合物が含まれています。有効にする薬を待っている間にケージに戻って動物を置きます。
   注：負荷用量は処置の持続時間のために十分な麻酔を提供しない場合は、負荷用量の追加の25％が注入されてもよいです。
2. モニターの動物は着実に呼吸数と覚醒レベルの適切なうつ病をチェックするために注射を投稿してください。十分に麻酔をかけたときに何の応答を惹起してはならない後足のピンチで覚醒レベルを確認します。
   注：これは通常3-5かかります25〜30グラムを平均し、若い成体マウス分間。動物は、10分後の注射後も応答する場合、麻酔負荷用量の追加の25％が注入されてもよいです。
3. 乾燥を防ぐために動物の目にワセリンと軽鉱油眼軟膏を適用します。ケージから動物を取り外し、きれいな、平らな面に置きます。手足の唯一の外側面を露出させ、電気ヘアトリマーを使用して、骨盤に足から所望の後肢を剃ります。
4. 1分間剃らサイトに化学脱毛剤を適用します。手動の実験室ワイプを使用して髪を削除します。実験室できれいに脱毛エリアをエタノールに浸したワイプ。

2.外科的手順

1. オートクレーブまたは他の適切なメソッドを介して手術器具を滅菌します。 80％エタノール/ H ₂ 0と、手術部位や手術用ボードを清掃してください。 proviodineで手術部位を消毒します。手術用ボード上にマウスを置き、手足の拘束と合わせます。キープ膝関節と解剖学的に自然な位置にターゲット後肢がわずかに内部または外部回転させずに拡張しました。
2. 手術用顕微鏡下で動物とボードを置きます。表面的なランドマークの触診、特に骨膝関節と前脛骨筋と腓腹筋の筋肉の間の尾根を経由して、適切な切開部位へのオリエント。
3. 把持するための一般的な鉗子を使用しながら、メスやスプリングはさみを使って皮膚を介して約3cmの切開を行います。共通の腓骨神経の基礎となるコースに垂直切開を行います。
4. 大腿二頭筋と外側広筋の筋肉を露出させ、浅筋膜を通して切開を続けます。接続深い筋膜を切断することにより、これらの筋肉を分離します。 1〜2センチメートルカットが十分でなければなりません。
5. 上腕二頭筋を撤回共通腓骨神経を明らかにし、機械的なリトラクターを使って尾側筋肉大腿。
6. そのインターまで近位に神経をトレース腓腹筋の外側頭の腱を持つセクションが発見されました。注：暴露は後退し、皮膚と筋肉の追加の操作が必要な場合があります。この交点は、神経損傷のための安定したランドマークとして使用されます。
7. 腓腹筋腱の外側縁に平行にヒントを合わせて、細かい鉗子で神経をつかみます。 5秒間安定し、ハード圧力を加えることにより、共通の腓骨神経をつぶします。
8. 外科手術用スコープを通して目視検査で神経の完全なクラッシュを裏付けます。これは、損傷部位で半透明表示されます。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合、蛍光が損傷部位から消えます。
9. 開創器を取り外し、その解剖学的位置に筋肉を再調整。 6-0絹縫合糸で切開部位を閉じます。 1-3単純結節縫合で十分です。クリーンケージ内の加熱パッド上療養マウスを置きます。
10. 2時間後にオペラのためのすべての動物を監視しますションは、呼吸や麻酔への副作用をチェックします。すぐに手術からの回復次の皮下鼠径部の注射を介してブプレノルフィン0.05から0.10まで10mg / kgの初期用量を投与。 3追加の用量次の48時間にわたって12時間毎に与えます。完全に回復した後、動物のケア施設にマウスを返します。

3.単離と染色伸展のDigitorum長い（EDL）筋肉

1. イソフルランを使用して動物を生け贄に捧げます。吸収性labwipesを詰めた50ミリリットルチューブに0.5ミリリットルに液体イソフルランを分注します。密封された2500センチメートル³チャンバー内の動物でキャップされていないチューブを置きます。曝露の少なくとも4分で十分です。二国間の眼瞼、つま先のピンチ、およびテールピンチ反射の損失のための試験各動物は灌流を続行する前に、無意識であることを保証します。
2. 経最初の10mLの0.1M PBSで¹⁶匹の動物を灌流し、0.1M PBS（pH7.4）中の4％パラホルムアルデヒドを25ml。ヘパリン（30単位/ 20G動物の体重）の灌流の結果を向上させる、小さな毛細血管床に血液凝固を防ぐために、（10単位/ ml）のPBSを添加してもよいです。
3. 腹部の周囲の皮膚を通って横方向にカットするはさみを使用して、後肢を覆っている皮膚を取り除きます。ピンセットを用いて、後肢と足を過ぎて皮膚をピールダウン。
4. 把持鉗子で剥がして後肢の浅筋膜を削除します。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合は、50mlチューブに4％PFA中で一晩全体のマウスをポスト修正。 PBSで3回洗浄します。
   注：固定したマウスは、4℃でPBS中に保存することができます。ない場合は、このステップをスキップし、定着後の動物せず3.6に進みます。
5. できるだけ無傷の近位および遠位腱を維持することを確認され、マウス後肢からEDL筋^18を解剖。
6. 少なくとも1時間、緩衝液（0.5％トリトンX-100を、3％BSAおよび5％ヤギ血清を含む1×PBS）でブロッキングEDL筋をインキュベートします。
7. 完全なNMJの神経支配のための陽性対照として、反対無傷EDLを染色します。陰性対照は、4日後の傷害、NMJが完全に除神経された時点で得られEDLだけでなく、二次抗体のみで染色したEDLを含める必要があります。
8. 1日のニューロフィラメントおよびシナプトタグミン-2を検出するために、適切な蛍光タグ付けされた二次抗体を用いて筋肉をインキュベートします。筋肉を1×PBSで3回、10分毎の時間を洗ってください。注：このステップは、ステップ3.10と一緒に行うことができます。末梢軸索内の蛍光タンパク質を発現するマウスを使用している場合、この手順を省略してください。
9. postsyを可視化するために、NMJのnaptic領域は、5μg/ mlの少なくとも2時間、ブロッキング緩衝液中に希釈したアレクサ555共役アルファ - ブンガロトキシンで筋肉をインキュベートします。筋肉を1×PBSで3回、10分毎の時間を洗ってください。
10. 正に荷電したガラススライド上に全体の筋肉をマウントするには、スライド上のメディアをマウントベースグリセロールの数滴を追加し、カバーガラスで覆い、スライド上に直接筋肉を置きます。筋肉を平らにするスライドに対してカバーガラスを押してください。実験用ワイプを使用してスライドとカバーガラスの周囲から取り付けメディアをオフに浸します。カバースリップとスライドの間のエッジをシールするためにマニキュアを適用します。

4.イメージングとデータ解析

1. NMJ、画像488、555および633 nmの光を励起し、20X及び40Xの目的で放出された光を捕捉するように装備共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてEDL筋の構造を解析します。
2. 全体のNMJを視覚化するために、光秒の最大値投影画像を作成しますションは離れてNMJのに最高の可視領域の最下位から伸びる1〜2μmで間隔をあけ。市販のイメージングソフトウェアを使用して、最大強度の投影を作成します。
3. 1）完全に除神経=シナプス後部位が軸索とAChRs間の軸索と接触し、5％未満の共局在を完全に欠いている：として神経再生の速度を決定するために、のNMJを分類。 2）部分的に神経支配=軸索は、部分的に軸索とAChRs間postsynapse 5〜95％の共局在と重なります。 3）全神経支配=前後シナプス間のほぼ完全な同格、軸索とAChRsの間、95％を超える共局在。撮像面に対して垂直に位置するか、完全に画像で視覚化されていないのNMJを除外します。注：すべてのこれらの実験では、少なくとも3匹の動物および動物あたり50のNMJを調べました。結果は、0.05未満のP値はスチューデントt検定を用いて有意とみなしました。
4. 演算子を盲目にするには、別々の個人が実行することができます手術および画像解析。治療群の知識がなくても、アナライザは、NMJの得点と客観することができます。代替的に、画像はランダム化原料動物の知識なしに分析のためにオペレータに提示することができます。

5.定量PCR

1. イソフルランと頸椎脱臼を使用して動物を生け贄に捧げます。皮膚とステップ3.3に応じて足の筋肉を覆う浅筋膜を削除します。 3.4段階に応じて前脛骨とEDL筋肉を解剖。
2. Flashは、液体窒素に対する1.5mlチューブ全体の前脛骨とEDL筋肉を凍結します。部分的に液体窒素中に沈め予め冷却乳鉢でチューブと場所から組織を削除します。乳鉢と乳棒を用いて微粉末に凍結された筋肉を挽きます。
3. 市販のRNA抽出試薬に凍結筋肉粉末を溶解し、市販のキットを製造業者のIに従っててRNA抽出およびゲノムDNAの除去を行いますnstructions。
4. 製造元の説明書に従って市販の逆転写酵素ミ​​ックスを用いて逆転写を行います。
5. （材料の表を参照）、適切なハウスキーピング遺伝子を用いて、市販のキットを用いて定量PCRを実行します。 （材料の表を参照）、PCRを実施するために、市販の定量的PCRサーマルサイクラーを使用してください。
6. 58℃に設定し、アニール温度。 Taqポリメラーゼ/ SYBRグリーンミックスの製造業者の仕様書に追加のサイクリングパラメーターを調整します。プライマー特異性についてテストし、プライマーダイマー形成するために95℃まで65℃から0.5℃の増分増加からなるサーマルサイクラープログラムの最終融解曲線ステップを含みます。
7. コントロール遺伝子として18S RNAを用いて^{、ΔΔCT法 21から2}による相対mRNA発現レベルを決定します。

Representative Results

共通腓骨神経は、また、総腓骨神経と呼ばれる、それは脚部（ 図1A）の前方側面に腓骨の頭の周りに揺動膝窩、上記の坐骨神経から生じます。そこに浅と深い腓骨神経に分岐し、一緒に（前脛骨筋、長指伸筋とブレビス、および伸筋halluces長い筋）足の背屈筋とつま先を供給し、足のeverters（腓骨筋）。この神経はまた、足の甲と足の下半分の外側面に突出感覚線維を運びます。それは、運動および感覚軸索から成る比較的薄い構造です。この神経枝は、予測可能な解剖学的経過をたどります。それは腓腹筋（ 図1および図2）の外側頭の腱上で実行されるように膝に横方向、神経は主に表面的です。目場所は容易に皮膚および筋膜（ 図1A）への損傷を制限し、小さな切開で到達することができ安定したランドマークとして機能しています。坐骨及び脛骨神経に比較して、この神経の小さい直径は、完全より表面軸索を切断する可能性を減少させる、より少ない力を使用して、すべての軸索を粉砕することができます。

ニューロンのみ¹⁷で黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するマウスは、共通の腓骨神経の挫滅手順を最適化し、明確再生軸索を可視化するために使用されました。このサイトは、切開の位置からよりアクセス可能であるため、神経をターゲットの筋肉に最も近い腓腹筋腱の縁で粉砕しました。このサイトには、同じ年齢および性別の動物の間でのNMJの再生を比較することが可能となる、信頼性の高い解剖学的ランドマークとして機能します。細かい鉗子解像度を使用して5秒間神経を圧迫損傷部位（ 図2B）からのYFPの消失でults。しかし、結合組織および神経上膜に存在する細胞は、それらの元のターゲット（ 図2B）への軸索の迅速かつ正確な再生のための導管として、連続したまま。 70日齢の雌マウスでは、この傷害は、神経細胞体（ 図4B）から遠位のすべての軸索セグメントの変性を引き起こすのに十分です。

この傷害法の信頼性と再現性を決定するために、長指伸筋（EDL）筋肉の再神経支配を調べました。この筋肉は、いくつかの理由のために選択した：1）は、近位まだ物理的に切開し、神経損傷部位（ 図3A）から分離されます。したがって、筋肉だけ切断神経支配軸索の変性によって変更されます。圧潰部位への接近は、reinnervatedおよび筋肉atrophするために必要な時間を最小化しますY。 2）それは、主に老化と疾病の影響を受けやすい高速型骨格筋線維で構成されています。 3）そののNMJは、運動とカロリー制限によって減衰させることができる病気や老化の進行の間に有意な構造変化を受けます。 4）それは、ライブイメージングと分子操作（ 図3D）のために容易にアクセス可能です。 5）これは、容易にその神経支配の軸索とその接続のすべてが光学顕微鏡（ 図3B）を用いて完全にイメージすることが可能となる全マウントすることができ、その4つの指節成分に分離することができます。

右足の腓骨神経を破砕した後、以前に空いたポストシナプス部位の再神経支配は、モータ軸索にYFPを発現している3 70日齢の雌マウスで評価しました。シナプス後部位を蛍光筋肉NACに選択的かつ高親和性で結合するαブンガロトキシン（BTX）を、タグ付けされたを使用して可視化しましたHRS。筋肉が、除神経されたものとみなさ部分的または完全にこれらの基準以下reinnervatedた：1）除神経筋線維では、モータの軸索は完全にシナプス後部位から欠落していたと軸索とAChRs間の5％未満の共局在が観察されました。 2）部分的に神経支配筋線維は軸索とAChRs間のシナプス後部位および5から95パーセントの共局在と運動軸索の不完全な並置が、いくつかによって分類されたが観察されました。 3）完全に神経支配筋線維では、軸索とAChRsが観察された間の運動神経終末とシナプス後部位と95％を超える共局在の間ほぼ完全な並置がありました。自分のエンドプレートは、撮像面に垂直に置くか、全体NMJが可視化されなかった場合は、個々のNMJはカウントから除外しました。これらの基準を用いて、神経再生の速度と程度の高い一致を調べ、すべてのマウスの間で観察されました。 4日後にクラッシュでは、筋肉はすべての動物のエクサで完全に除神経発見されました採掘された（ 図4B）。この発見は、上記のように、5秒間の共通腓骨神経を破砕は、すべての軸索を切断するのに十分であることを示しています。 7日後に破砕することにより、神経終末は、以前に空いたポストシナプス部位（ 図4C、4E-F） を reoccupyingの過程にありました。しかし、ほとんどの筋線維は、まだ部分的にしか支配が見出されました。追加日後にクラッシュすると、神経終末がシナプス前部位とのNMJに分化し続け、完全に12日間（ 図4D、4E-F）によってreinnervated発見されました。重要なことは、マウスの間ではほとんど変動は、腓骨神経を破砕すると、同じ年齢および性別の動物の間の筋肉の再支配を比較するためのアッセイとして使用することができることを実証し、同じ長さの時間（ 図4E-F）のための除神経がありました。

忠実に動物との間で再生のNMJを比較する能力は、機会を提供します完全にこのシナプスを修復するために必要な各ステップに関連した細胞の特徴を理解します。神経再生の速度を比較するために上記で使用し70日齢マウスから除神経と再生のNMJの構造を調べるために、のNMJの高解像度の共焦点顕微鏡画像が得られました。予想されたように、この分析は、彼らが筋線維（ 図4G-I）の神経再支配としてα-運動軸索神経終末に起こる変化の数を明らかにしました。軸索成長円錐は、彼らがシナプス後部位（ 図 4G）に連絡のように分岐するように拡張し始めるように見えます。これらの軸索の枝は、その後、シナプス後部位（ 図4H-I）で終わる軸索神経のほぼ完全な並置で最高潮に達する、postsynapseの特定の領域の上に成長します。開発中に見られるものが秒間競合する複数の軸索を含む、観察された非常に似ている運動神経終末の再生中に追加の構造的特徴唯一の軸索で最高潮に達する雨ターゲット（ 図4H）は 、ポストクラッシュ12日までに1筋線維を支配します。さらに、もやしのようにここでいうシナプス後部位、を越えて延びる軸索の枝は、全く損傷後は（ 図4I）が観察されたステージ。これらの芽があっても、軸索修復の最終段階はextrajunctional軸索の枝の後退を伴うことを示唆している、完全に神経支配のNMJで、非常に流行していました。神経終末でのこれらの明らかな変化にもかかわらず、シナプス後サイトは、筋線維が完全に除神経発見された場合、ポストクラッシュ4日目を含む無傷の筋肉のものと比較して、すべてのステージ、損傷後で、ほとんど見分けがつかないままでした。 AChRsの余分なシナプス領域への断片化または重大な損失と再分配の明らかな兆候はありませんでした。これらの知見は、腓骨神経挫滅法は、分子、薬理学的およびライフスタイル介入Tを特定し、試験するためのアッセイとして使用され得ることを示します帽子はNMJを含む、シナプスで神経終末の修復を促進します。

最近の進歩にもかかわらず、非常に小さな進歩が必要とNMJを維持し、修復するのに十分な筋肉由来の因子を同定してなされたもの。共通腓骨神経損傷方法は、神経再生プロセスの特定の段階で及びNMJを修復における潜在的な役割に変更する分子を同定するために使用することができる場合、そこで尋ね。プリンシパルの証明二NMJ関連遺伝子の発現解析のAChRのガンマサブユニットおよび筋肉特異的キナーゼとして、ムスク^18を行いました。定量的PCRを用いて実証されたように、これらの遺伝子は、除神経の後に増加しているとのNMJは、（ 図5A-B）を reinnervatedされる減少しました。以前に完全に除神経筋^19を使用して報告されているように、これらの遺伝子は、4日後にクラッシュでアップレギュレートされます。神経神経再支配、筋線維のように、これらの遺伝子のレベルが減少し、RAPIDLYにベースラインに戻ります。調べた動物の中でも、両方の遺伝子についての発現パターンは、再生のNMJでの分子と細胞の変化との間の密接な相関関係を実証し、ほぼ同一です。したがって、この方法はNMJ再生の異なる段階に関連した分子の変化を識別するためのユニークな機会を提供しています。

図1： 一般的な腓骨神経解剖学 （A）は概略坐骨神経のコースと表面的と骨のランドマークとの関係でその末端枝を詳述。 SCN =坐骨神経、TN =脛骨神経、SRN =腓腹神経、CPN =共通腓骨神経、SPN =浅腓骨神経、DPN =ディープ腓骨神経。所望の切開部位が示されています。削除皮膚と周囲の筋肉に関連した共通の腓骨神経の場所の（B）図。相対的な切開部位は、投資筋膜の上にある示されています。 TA =前脛骨筋EDL =伸筋Digitorum長い筋肉。 （C）露出坐骨と共通腓骨神経。 CPNは、膝のレベルでの腓腹筋（GN）腱を横切ります。示さ腱に比べてクラッシュサイト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：共通腓骨神経挫滅手術は、（A）最初の切開の長さは数cmである必要があります。皮膚や表在筋膜を貫通した後、切開部は大腿二頭筋とTA筋の間にある投資/深い筋膜を介して継続する必要があります。 （A1）、共通の腓骨神経を簡単に顕微鏡トンせずに可視化されます切開（GN =腓腹筋）hrough。切開は、（のみ、写真の目的のために必要な）広くされている場合（A2）共通腓骨神経及び腓腹筋腱の交点を容易に可視化することができます。クラッシュは、Gnの腱に神経と並列に垂直な赤線でマークされた場所に配置する必要があります。 （B）CPNは一層容易に蛍光解剖スコープの下でYFPトランスジェニックマウスを用いて可視化されます。 （B1）神経は完全な圧挫損傷を事前に確認でき、クラッシュのサイトで蛍光を失います。 （B2）フルCPNクラッシュはまだ肉眼や部屋の照明で可視化することができます。神経は半透明になります。この画像は、同時に近くの組織および血管への損傷を制限しながらCPNの神経上膜と上部構造が無傷のままであるという事実を強調しています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図 3： 伸筋Digitorum長い（EDL）筋の解剖学 （A）マウスの後肢の骨に関連したEDLの3次元画像。 JAtlasView（B）部分的に切開したEDL筋その4趾骨部門に分離し、各部門によって制御される数字をマーキングを使用して生成されます。それは二桁目を制御EDL部門のエンドプレートのバンドを神経支配するように（C）YFPは深い腓骨神経の枝のラベル。 （D）軸索の枝とその接触部位が容易に選択のNMJの一貫性の検査を可能にする、識別することができます。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてください。この図F。

図4： 同じ年齢および性別の動物間の再神経支配の同様の料金のNMJの分析EDL筋における腓骨神経を破砕した後。 （A）ポストシナプス部位が完全に損傷していないマウスでは軸索によって占有されています。 （B）4日後にクラッシュで、筋肉が完全に除神経発見されました。 （C）軸索は、ポストクラッシュおよび（D）完全に12日によってシナプス後サイトを再占拠する7日間の筋肉を神経再支配し始めます。 （E - F）は 、同じ時間の長さのための除神経NMJの再占有率は動物の間ほぼ見分けがつきません。 （G - I）成熟したシナプス前部位への再分化する軸索神経終末の代表的な画像。シナプス後部位の再占領が続きます予測可能なパターンは、最終的には完全に開発にNMJ region.Similarを越えて延びることなく、後シナプス部位を占める枝を開発する成長円錐で始まる、シナプス後部位は、最初に、複数の再成長軸索によって神経支配されているが、NMJが完全に再生した後にのみ1軸索が残っています。 （H）あふれんばかりの軸索発芽、示された複数の軸索によってフルプレとシナプス後装置間のオーバーラップ、および神経支配のない部分の神経支配の例を。 70日齢の雌マウスを調べました。スケールバー=50μmの （AD）、20ミクロン（GI）。エラーバー= SEM。 N = 3匹。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5： として腓骨神経挫滅法nはNMJの修復に関与する候補遺伝子を同定するためのアッセイ（A - B）。2 NMJ関連遺伝子のmRNAレベル、のAChRのγサブユニットとムスクが、同様にマウスのTA筋に変化している時間の同じ長さのための除神経。時間後の神経損傷が増加すると、両方の転写物のレベルはのNMJの漸進的な再神経支配を示す組織学的分析を裏付け、ベースラインに戻って、減少します。各行は、個々のマウスを表しています。エラーバー=技術的反復の平均の標準誤差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

この原稿に提示された方法は、神経筋接合部（NMJ）の修復に関与するメカニズムを識別するためのユニークな機会を提供しています。それは膝の近くに腓腹筋腱上を通過するように、この方法は、共通の腓骨神経を破砕することを含みます。私たちは、ピンセットで神経圧迫のわずか5秒後に、完全な変性は、損傷後4日までに指摘されていることを示しています。若い成体マウスでは、アルファモーター軸索は12日までに損傷していないマウスのものと区別できないシナプス前部位の改革で最高潮に達する、損傷後7日目に長指伸筋筋（EDL）の前のシナプス部位を神経再支配し始めます。加えて、我々は選択NMJ関連分子のレベルが密接にNMJの神経支配の状況と相関することを示しています。重要なことは、これらの細胞および分子の変化は、識別するための機会とTESを提供し、同じ性別と年齢（ 図5a-B）の動物間で高度に再現可能ですNMJを修復するように作用するT因子。それは周囲の筋肉や血管系にはほとんど損傷をもたらすだけ小さな切開を必要とする、腓腹筋腱上を通過する外科的手技の面では、共通の腓骨神経枝は非常にアクセス可能です。

再生のNMJに関連する細胞および分子の変化を調べるために、共通の腓骨神経を使用する利点は多数あります。腓腹筋腱は、一貫して、ターゲットの筋肉から同じ位置との距離に共通腓骨神経を傷つけるために安定した解剖学的ランドマークとして機能します。これは、確実に、軸索と同じ年齢および性別の動物間筋の再神経支配の再生の速度を比較することができます。このような成功への重要なステップは、完全な神経挫滅は、すべての動物で得られ、かつ最小限の損傷が周囲の構造に維持され、損傷部位は、手術の間に一貫性があることを確実にすることが含まれます。 cで神経支配筋のうち、腓骨神経ommon、前脛骨（TA）および長指伸筋（EDL）筋肉はNMJ修復を評価するための優れた標的です。これら二つの筋肉は主に深刻な損傷、加齢や疾病⁵の影響を受けている高速タイプの筋線維で構成されています。全体に取り付けられた歪みなしですべてのNMJの画像にすることができるためNMJ分析のために、EDL筋は、特に魅力的です。また、筋線維、運動軸索および周囲の細胞中の他の場所の変化とのNMJでの変化を相関させることができます。

TAとEDL筋が広く、それらの解剖学的位置²⁰の筋肉とNMJ修理上の異なる分子やライフスタイル介入の影響を評価するために使用されています。しかし、長期的除神経は、それがより困難細胞および分子のCHを評価すること、筋線維、活性化免疫細胞、衛星細胞の^12-14萎縮に重要な機能を有する遺伝子の発現を変化させます特にのNMJの再生を促進するために必要なアンジェス。ここで説明する方法では腓骨神経は、神経は、若い成体マウスにおける7日後のクラッシュ内でそれらに到達することを可能にする、TAおよびEDL筋に近接して粉砕します。したがって、この方法は、筋肉量とTAとEDL筋肉の萎縮筋線維に関連する分子の変化の損失を最小限に抑える必要があります。

腓骨神経圧挫プロトコルは、複数の異なる様式で修飾することができます。神経切断損傷は容易に、末梢神経再生のインビボイメージングにおけるより良いリアルタイムのを可能にする、クラッシュのために置換することができます。カットは、再成長のための障害物として死んだ軸索材料を除去し、神経内膜チューブ内のすべての軸索の均質なダメージを保証します。

正しく実行すると腓骨神経粉砕は、いくつかの関連する合併症を持っています。遭遇することができた一つの問題は、元のNMJ目標を神経再支配する神経の障害です。これは、ACCが原因で発生することができ手術中に神経の損傷をカットidental。任意のシャープなエッジのために先の細い破砕鉗子を確認してください。手術中の任意の時点で神経挫滅の品質が疑わしい場合には、元の切開は、より良好な神経を可視化するために広げることができます。これは傷の大きさを増大させ、付加的な構造に損傷を与えることができますが、それは正しく腓骨神経を識別し、完全なクラッシュが達成されたかどうかを評価するに役立つことができます。

ここに記載された技術は、いくつかの制限を持って行います。これらの動物における構造を操作するのに十分な大きさであるように、まず、それが成体マウスにおいて主に有用です。新生児と思春期のマウスが大幅に手術の難易度が高く、非常に小さいです。第二に、腓骨神経はNMJ再生の速度に影響を与える可能性が標的組織の脱神経で、その結果、感覚と運動軸索が含まれています。

NMJは、筋萎縮性側索緯度における病理の焦点サイトとして認識されていますERAL硬化症（ALS）と老化。また、運動能力を損なうと筋肉量を失うことを避けるために、末梢神経への損傷後の修復することがあります。腓骨神経挫滅方法は、NMJの修復に重要な役割を有する分子の同定および試験に役立つはずです。 1つのアプローチでは、この方法は、RNAの配列分析を使用して、NMJの再生の様々な段階で重要な役割を有するmRNAおよびマイクロRNAのプロファイルを使用することができます。また、選択的に導入され、筋肉から削除候補遺伝子の機能を決定するために適用することができます。また、この方法は、静的およびライブイメージングを用いて、神経とNMJ再生を高速化する外因性分子の能力を試験によく適しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube Vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842