Abstract
신경 근육 접합부 (NMJ)은 노화, 상해 및 질병으로 인한 해로운 구조적 및 기능적 변화를 겪는다. 따라서, 유지 보수 NMJs 관련된 세포 및 분자 변화를 이해하는 것이 필수적이다. 이를 위해, 우리는 신뢰성 있고 일관 생쥐 NMJs 재생 조사하는 방법을 개발 하였다. 이 무릎 근처 비복근 근육 힘줄의 측방 헤드를 통과 신경 손상이 방법은 공통 비골 신경 분쇄 포함한다. 칠십일 세 여자 마우스를 사용하여, 우리는 모터 축삭 7 일 후 호감 내에서 이전 시냅스 목표를 reinnervate하기 시작 것을 보여줍니다. 그들은 완전히 십이일에 의해 이전 시냅스 영역을 다시 선점. 이 부상 방법의 신뢰성을 확인하기 위해, 우리는 개별 칠십일 세 여성 쥐 사이 reinnervation 속도를 비교했다. 우리는 reinnervated 시냅스 사이트의 수는 7, 9에서 마우스와 유사한 것을 발견하고, 십이일 후 호감. 있는지 확인하려면이 상처 분석법 또한 근육 분자량 변화를 비교하기 위해 사용될 수 있고, 우리는 근육의 니코틴 성 수용체 (감마 ACHR) 및 근육 특정 키나아제 (MUSK)의 감마 서브 유닛의 수준을 조사 하였다. 감마 - ACHR 서브 유닛과 사향이 높은 다음 탈 신경을 상향 조절하고 NMJs의 reinnervation 다음 정상 수준으로 돌아되어 있습니다. 우리는이 유전자와 근육의 신경 분포 상태에 대한 성적 수준 사이의 밀접한 관계를 발견했다. 우리는이 방법은 NMJ 및 기타 시냅스 수리에 관련된 세포 및 분자 변화에 대한 우리의 이해를 가속화 할 것이라고 믿는다.
Protocol
모든 실험은 버지니아 공대 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 NIH 가이드 라인과 동물 프로토콜 하에서 수행 하였다.
수술 1. 준비 동물
- 멸균 된 1 ml의 인슐린 주사기 케타민 (90 ㎎ / ㎏) 및 서혜부 피하 주사를 통해 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 생쥐를 마취. 캐리어 솔루션은 0.9 % 식염수, 17.4 ㎎ / ㎖ 케타민, 2.6 ㎎ / ㎖ 자일 라진의 혼합물을 포함한다. 을 적용하려면 약물 치료를 기다리는 동안 케이지 다시 동물을 놓습니다.
주 : 로딩 용량이 절차 동안 충분한 마취를 제공하지 않는 경우, 부하 용량의 추가 25 %가 주입 될 수있다. - 모니터 동물은 정상 호흡 요금과 각성 수준의 적절한 우울증를 확인하기 위해 주사를 게시 할 수 있습니다. 충분히 마취 할 때 어떤 반응을 유도하지해야 뒷발 핀치와 각성 수준을 확인합니다.
참고 :이 일반적으로 3-5 소요25g 30에 평균 젊은 성인 마우스 분. 동물은 여전히 10 분 포스트 분사 후 응답하는 경우, 마취 로딩 도즈의 추가 25 %가 주입 될 수있다. - 건조 함을 방지하기 위해 동물의 눈에 바셀린 가벼운 미네랄 오일 안과 연고를 적용합니다. 깨끗하고 평평한 표면에 케이지와 장소에서 동물을 제거합니다. 사지의 좌우 측면을 노출, 전기 헤어 트리머를 사용하여 골반에 발에서 원하는 뒷다리를 면도.
- 1 분 동안 면도 사이트에 화학 머리 제거를 적용합니다. 수동으로 실험실 와이프를 사용하여 머리를 제거합니다. 실험실 청소 면도 한 영역은 에탄올에 배어 와이프.
2. 수술
- 오토 클레이브 또는 다른 적절한 방법을 통해 수술 도구를 소독. 80 % 에탄올 / H 2 0과 수술 부위 및 수술 보드를 청소합니다. proviodine으로 수술 부위를 소독. 수술 보드에 마우스를 놓고 사지 구속과 맞 춥니 다. 유지무릎 관절을 가진 해부학 적 자연 위치에서 대상 뒷다리가 약간 내부 또는 외부 회전없이 확장.
- 수술 현미경으로 동물과 보드를 놓습니다. 표면 랜드 마크, 특히 뼈 무릎 관절과 전 경골근과 비복근 근육 사이의 능선의 촉진을 통해 적절한 절개 사이트에 동양.
- 그립의 일반 집게를 사용하는 동안 메스 또는 스프링 가위를 사용하여 피부를 통해 약 3cm의 절개를합니다. 일반적인 비골 신경의 기본 과정에 수직 절개를합니다.
- , 피상적 인 밴드를 통해 절개를 계속 이두근 대퇴골을 노출하고 광근의 근육을 lateralis. 연결 깊은 근막을 통해 절단하여 이러한 근육을 분리합니다. 1-2 센티미터 컷은 충분합니다.
- 이두근을 철회하는 것은 꼬리 쪽 공통 비골 신경을 드러내는, 기계 견인기를 사용하여 근육 대퇴.
- 그 간까지 근위 신경을 추적비복근 근육의 측면 머리의 건과 절 발견된다. 참고 : 노출 후퇴 피부와 근육의 추가 조작이 필요할 수 있습니다. 이 교차로는 신경 손상에 대한 안정 랜드 마크로서 사용된다.
- 비복근 건의 측면 테두리에 병렬 방식으로 팁을 정렬, 미세 집게로 신경을 잡고. 5 초 동안 꾸준히, 열심히 압력을 적용하여 일반적인 비골 신경 크러시.
- 수술 범위를 통해 육안 검사로 신경의 전체 호감을 확증. 그것은 부상의 사이트에서 반투명 나타납니다. 주변 축삭의 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우, 형광 부상의 사이트에서 사라집니다.
- 견인기를 제거하고 자신의 해부학 적 위치에 근육을 재편성. 6-0 실크 봉합사와 절개 사이트를 닫습니다. 1-3 간단한 중단 봉합 충분하다. 깨끗한 케이지에 가열 패드에 마우스를 회복 놓습니다.
- 2 시간 포스트 오페라에 대한 모든 동물을 모니터링기 호흡과 마취에 대한 부작용에 대해 확인합니다. 즉시 수술에서 회복 다음 피하 사타구니 주사를 통해 프레 노르 핀 0.05-0.10 ㎎ / ㎏의 초기 용량을 관리 할 수 있습니다. 3 추가 투여 48 시간 동안 매 12 시간을 제공합니다. 전체 복구 후, 동물 보호 시설에 마우스를 반환합니다.
3. 분리 및 염색 신근의 심지 Longus (EDL) 근육
- 이소 플루 란을 이용하여 동물을 희생. 흡수 labwipes로 포장 50 ML 튜브에 0.5 ml의에게 액체 이소 플루 란을 분배. 밀폐 2,500cm 3 실에서 동물과 캡핑 튜브를 놓습니다. 노출의 적어도 4 분이면 충분하다. 양측 눈꺼풀, 발가락 핀치, 꼬리 - 핀치 반사 손실에 대한 테스트는 각각의 동물 관류를 진행하기 전에 의식이 있는지 확인합니다.
- 첫째로 transcardially 10 ㎖의 0.1M PBS 16 동물들을 관류하고 0.1M PBS (PH 7.4)의 4 % 파라 포름 알데히드의 25 ㎖. 헤파린 (30 대 / 20g 동물 체중) / ㎖) 10 단위 관류 결과를 향상 작은 모세관 침대에서 혈액 응고를 방지하기 위해 (PBS를 첨가 할 수있다.
- 복부의 둘레 주위의 피부를 통해 횡 방향으로 절단 가위를 사용하여 뒷다리를 덮고있는 피부를 제거합니다. 뒷다리 사지와 발 집게를 사용하여 과거의 피부를 벗겨.
- 잡고 집게로 박리에 의해 뒷다리의 표면 근막을 제거합니다. 주변 축삭에 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우, 50 ㎖ 튜브에 4 % PFA에서 하룻밤 전체 쥐를 후 수정. PBS로 3 회 씻어.
주 : 고정 마우스는 4 ℃에서 PBS에 저장 될 수있다. 그렇지 않은 경우,이 단계를 건너 뛰고 후 고정 동물없이 3.6 단계로 진행합니다. - 가능한 한 그대로 근위 및 원위 힘줄을 유지해야되고, 마우스 뒷다리에서 EDL 근육 (18)을 해부하다.
- 적어도 1 시간 동안 (1X PBS, 0.5 % 트리톤 X-100, 3 % BSA, 5 % 염소 혈청을 함유) 완충액 블로킹 EDL 근육 인큐베이션.
- 전체 NMJ의 신경 분포에 대한 양성 대조군으로 EDL 손상되지 않은 반대측을 얼룩. 음성 대조군 4 일 후 부상의 NMJ 완전히 denervated있는 시점에서 얻어진 EDL뿐만 아니라, 단지 차 항체로 염색 EDL을 포함해야한다.
- 1 일 신경 미세 섬유 및 synaptotagmin-2를 검출하기 위해 적절한 찬란 태그 이차 항체와 근육을 품어. 근육을 1X PBS로 3 회 10 분마다 씻으십시오. 주의 :이 단계는 단계 3.10와 함께 수행 될 수있다. 주변 축삭의 형광 단백질을 발현하는 마우스를 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다.
- postsy을 시각화하는 방법NMJ의 naptic 지역은 5 μg의 / ㎖ 이상 2 시간 동안 버퍼를 차단에 희석 알렉사 - 555 복합 알파 - bungarotoxin와 근육을 품어. 근육을 1X PBS로 3 회 10 분마다 씻으십시오.
- 양으로 대전 된 유리 슬라이드에 전체 근육을 마운트하려면, 슬라이드에 매체를 장착 기반 글리세린 몇 방울을 추가하고 coverslip에와 커버 슬라이드에 직접 근육을 놓습니다. 근육을 평평하게 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 슬라이드 및 coverslip에 사용하는 실험실 와이프의 경계에서 설치 미디어를 만끽 해보세요. 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 가장자리를 밀봉 매니큐어를 적용합니다.
4. 영상 및 데이터 분석
- NMJs 화상 488, 555 및 633 nm의 광을 여기하고 20X 및 40X 목적으로 방출 된 광을 포착 갖춘 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 EDL 근육의 구조를 분석한다.
- 전체 NMJs 시각화 광 초의 최대 강도 투사 이미지를 만들TIONS는 떨어져 NMJ의 가장 높은 보이는 지역 가장 낮은에서 연장 1 μm의 2 간격. 시중에서 판매하는 이미징 소프트웨어를 사용하여 최대 강도 예측을 만듭니다.
- 1) 완전히 denervated = 시냅스 사이트가 축삭과 AChRs 사이의 축삭과 접촉, 5 % 미만의 colocalization을 완전히없는 상태입니다으로 reinnervation의 속도를 확인하려면 NMJs을 분류합니다. 2) 부분적으로 신경 지배는 = 축삭은 부분적으로 축삭과 AChRs 사이의 postsynapse, 5~95%의 colocalization을 중첩. 3) 전체 신경 분포 = 사전 및 사후 시냅스 사이의 거의 완벽한 동격, 축삭과 AChRs 사이의보다 큰 95 % colocalization을. 결상면에 수직으로 놓여 또는 완전히 이미지에 가시화되지 NMJs를 제외합니다. 주 : 모든 실험에서, 적어도 3 동물 및 동물 당 50 NMJs을 조사 하였다. 결과는 0.05 미만의 P 값을 갖는 학생 t-test를 이용하여 의미있는 것으로 간주 하였다.
- 연산자를 눈 멀게하려면 별도의 개인이 수행 할 수 있습니다수술 및 이미지 분석. 치료 그룹의 지식없이, 분석기는 NMJ 점수와 목적이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 무작위로 이미지 및 소스 동물 모르게 분석을 위해 조작자에게 제공 될 수있다.
5. 정량적 PCR
- 이소 플루 란과 자궁 경부 전위를 사용하여 동물을 희생. 피부와 3.3 단계를 따라 다리 근육을 덮고 표면 근막을 제거합니다. 전 경골근과 3.4 단계에있어서, EDL 근육을 해부하다.
- 플래시는 액체 질소에 비해 1.5 ML 튜브의 전체 경골근과 EDL 근육을 동결. 부분적으로 액체 질소에 잠긴 미리 냉장 박격포에 튜브와 장소에서 조직을 제거합니다. 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 갈아 냉동 근육.
- 시판 RNA 추출 시약에 냉동 근육 분말을 용해시키고, 시판의 키트를 제조자의 난에있어서와 RNA 추출 및 게놈 DNA의 제거를 수행nstructions.
- 제조업체의 지시에 따라 시판중인 역전사 효소 믹스 역전사를 수행한다.
- qPCR에 적절한 하우스 키핑 유전자를 이용하여 시판되는 키트를 사용하여 수행 (물질의 표를 참조). (재료의 표 참조) PCR을 수행하기 위해 시중에서 판매하는 정량적 PCR 열 순환기를 사용합니다.
- 58 ° C로 설정 소둔 온도. Taq 중합 효소 / SYBR 녹색 믹스 제조업체의 사양에 추가로 자전거 매개 변수를 조정합니다. 프라이머 특이성에 대한 테스트 및 이량 체 형성을 프라이머 95 ° C에 65 ° C에서 0.5 ° C 증가 증가로 구성된 열 자전거 타는 프로그램에서 최종 용융 곡선 단계를 포함합니다.
- 제어 유전자로서 18S RNA를 사용 ΔΔCT 방법 21 - 2 의한 상대적인 mRNA의 발현 수준을 결정한다.
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Representative Results
일반적인 비골 신경은 또한, 공통 비골 신경이라고는 다리 (그림 1A)의 전방 측면에 비골의 머리 주위 스윙 오금 포사 위의 좌골 신경에서 발생한다. 피상적 깊은 비골 신경으로 분기 함께 발과 발가락의 dorsiflexors을 공급 (전방 경골근, 신근 심지 longus 및 브레비스 및 신근 halluces longus 근육), 그리고 다리의 everters (peroneus 근육)이 그것. 신경이 또한 발과 다리의 하단의 좌우 측면의 배부에 돌출 감각 섬유를 운반한다. 이는 운동 및 감각 축삭 구성된 비교적 얇은 구조이다. 이 신경 분기 예측 해부학 과정을 따른다. 그것은 비복근 근육 (도 1 및도 2)의 횡 방향 헤드의 건을 통해 실행되는 무릎 횡 신경 주로 표면이다. 일위치를 쉽게 피부 근막 (도 1a)의 손상을 제한 작은 절개로 도달 할 수있는 안정한 랜드 마크로서 기능한다. 좌골 신경 및 경골과 비교할 때 신경의 더 작은 직경은 가능 완전히 이상의 표면 축삭 절단 가능성을 줄이고, 적은 힘을 사용하여 모든 축삭을 분쇄 할 수있다.
단지 신경 17 옐로우 형광 단백질 (YFP)를 발현하는 마우스는 공통 비골 신경의 분쇄 과정을 최적화하고 명백하게 재생 축삭을 시각화하는데 사용되었다. 신경이 사이트는 절개의 위치에서 더 접근하기 때문에 목표 근육에 가장 근접 비복근 건의 가장자리에 짓 눌린했다. 이 사이트는 또한 가능한 한 같은 연령과 성별의 동물들 NMJs의 재생을 비교하고, 신뢰할 수있는 해부학 적 랜드 마크 역할을합니다. 미세 집게 입술을 사용하여 5 초 동안 신경을 압축부상의 사이트 (그림 2B)에서 YFP의 실종에 ULTS. 그러나, 결합 조직 및 세포에 존재 epineurium 원래 타겟 (도 2B)에 축삭 신속 정확한 재생을위한 도관으로서의 연속 남아있다. 칠십일 오래 암컷 마우스에서이 부상 신경 소마 (도 4b)의 말단 모든 세그먼트 축삭 퇴행을 야기하기에 충분하다.
이 부상 방법의 신뢰성과 재현성을 확인하려면, 신근 심지 longus (EDL) 근육의 reinnervation 조사 하였다. 이 근육은 여러 가지 이유로 선택되었다 : 1)이 인접 아직 물리적으로 절개 신경 부상 사이트 (그림 3A)에서 분리합니다. 따라서, 근육만을 절단 근에 분포 축삭 변성에 의해 변경된다. 호감 사이트에 그것의 근접은 reinnervated 근육 atroph 될 때까지 필요한 시간을 최소화와이. 2)은 주로 노화 및 질병에 더 민감 형 고속 골격근 섬유로 구성된다. 3) 그 NMJs는 운동과 칼로리 제한에 의해 감쇠 될 수 질병과 노화의 진행 동안 상당한 구조적 변화를 겪는다. 4) 라이브 이미징 및 분자 조작 (그림 3D)에 대한 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 5) 전체를 쉽게 장착하는 것이 가능하게 될 수 있다는 네 지절 성분으로 분리 될 수있는 광 현미경 (도 3B)을 사용하여 근에 분포하는 축삭과 그 연결의 완전한 이미지 모두.
오른쪽 다리의 비골 신경을 분쇄 한 후 이전에 비워진 후 시냅스 사이트의 Reinnervation 모터 축삭에 YFP을 표현하는 세 가지 칠십일 세 여성 마우스에서 평가 하였다. 후 시냅스 사이트는 NAC 근육에 높은 친화력과 선택적으로 결합 알파 - bungarotoxin (BTX)을 찬란 사용하여 태그하여 시각화 하였다시간. 1) denervated 근섬유에는 모터 축삭 완전히 시냅스 후 위치에서 누락시키고 축색 AChRs 관찰 하였다 사이의 5 % 미만 colocalization을 : 근육 부분적으로 또는 완전히 이러한 기준은 다음 reinnervated, denervated 것으로 간주 하였다. 2) 부분적으로 신경 지배 근육 섬유는 축삭과 AChRs가 관찰되었다 사이의 후 시냅스 사이트와 5~95%의 colocalization을 가진 모터 축삭의 완전 동격하지만 몇 가지로 분류 하였다. 3) 완전히 신경 지배 근육 섬유에서 축삭과 AChRs가 관찰되었다 사이의 운동 신경 말단 및 사후 시냅스 사이트와 이상 95 % colocalization을 사이에 거의 완전한 동격이 있었다. 자신의 종판이 가시화되지 않은 영상 평면 또는 전체 NMJ에 수직 배치하는 경우 개별 NMJs은 계산에서 제외 하였다. 이러한 기준을 이용하여, 레이트 및 reinnervation 정도 높은 일치도 검사 모든 생쥐 중 관찰되었다. 사일 후 호감에서, 근육은 모든 동물의 엑사 완전히 denervated 발견채굴 (그림 4B). 이러한 결과는 전술 한 바와 같이 5 초 동안 공통 비골 신경 분쇄 모든 축삭을 절단하기에 충분한 것으로 나타났다. 후 호감 칠일으로 신경 종말 이전에 비워진 후 시냅스 사이트 (그림 4C, 4E-F)를 재 장악하는 과정에 있었다. 그러나, 대부분의 근섬유 여전히 부분적으로 만 분포하는 발견되었다. 추가 일 후 호감으로, 신경 종말은 완전히 십이일 (그림 4D, 4E-F)에 의해 reinnervated 발견 된 시냅스 사이트와 NMJs로 분화하는 것을 계속했다. 중요한 것은, 시간의 동일한 길이 (도 4E-F)에 대해 denervated 쥐 중 작은 변동이 존재하고, 비골 신경 분쇄하는 것은 동일한 나이 및 성별 동물 사이의 근육의 reinnervation과 비교 분석법으로 사용될 수 있음을 입증.
충실 동물 사이에 재생 NMJs을 비교하는 능력은 기회를 제공완전히이 시냅스를 복구하는 데 필요한 각 단계와 관련된 세포의 기능을 이해합니다. reinnervation의 요금을 비교하는 위에서 사용 된 70 일 이전 마우스에서 denervated 및 재생 NMJs의 구조를 검사하기 위해, NMJs 고해상도 공 촛점 현미경 이미지를 얻었다. 예상대로,이 분석은 근육 섬유 (그림 4G-I)를 reinnervate으로 α-모터 축삭 신경 말단에서 발생하는 변경의 숫자를 한 것으로 밝혀졌습니다. 축삭의 성장 콘 확장하고 그들이 시냅스 사이트 (그림 4 세대)에 문의로 밖으로 분기 시작 보인다. 이 축삭 분기 후 시냅스 사이트 (그림 4H-I)로 끝나는 축삭 신경의 가까운 완전한 병렬에서 남중의 postsynapse의 특정 지역을 통해 성장한다. 고도의 개발 과정에서 발견되는이의 경쟁 여러 축삭을 포함, 관찰 닮은 모터 신경 종말의 재생에 추가 구조적 특징하나의 축삭에서 남중 AME 대상 (그림 4H)는, 이후 호감 십이일 하나 근육 섬유에 분포. 모든 후 부상이 (그림 4I) 관찰 단계에서 또한, 후 시냅스 사이트를 넘어 연장 축삭 가지, 콩나물로 여기 라. 이 콩나물도 축삭 수리의 마지막 단계는 extrajunctional 축삭 가지의 철회를 포함 것을 건의 완전히 신경 지배 NMJs에서 매우 널리 퍼져 있었다. 신경 말단에서 이러한 명백한 변화에도 불구하고, 후 시냅스 사이트는 근육 섬유가 완전히 denervated 발견되면 후 호감 사일에 포함하여 손상되지 않은 근육들에 비해 모든 단계 이후 부상에서 거의 구별 남아 있었다. AChRs의 추가 시냅스 지역으로 분열 또는 상당한 손실 및 재배포의 명백한 표시가 없었다. 이러한 결과는 강하게 비골 신경 분쇄 방법은 분자 약리학 및 생활 방식의 중재 t를 식별하고 테스트하는 분석법으로서 사용할 수 있음을 나타낸다모자는 NMJ을 포함하여 시냅스에서 신경 종말의 복구를 촉진한다.
최근의 발전에도 불구하고, 거의 진전이 근육에서 파생 된 요소 유지하고 NMJ를 복구하는 데 필요한 충분한 식별을했다. 공통 비골 신경 손상 방법은 reinnervation 프로세스의 특정 단계에서 상기 NMJ 수리 잠재적 역할과 변경 분자를 식별하는 데 사용될 수 있다면 우리는 따라서 물었다. 주요한 두 NMJ - 관련 유전자의 발현 해석의 증거로서, ACHR 감마 서브 유닛 및 근육 특정 키나제, 머스크 18 행 하였다. 정량적 PCR에 입증 된 바와 같이, 이러한 유전자는 탈 신경을 따라 증가하고 NMJs는 (도 5A-B)를 reinnervated대로 감소 하였다. 이전에 완전히 denervated 근육 (19)를 사용하여보고 된이 유전자는 4 일, 후 호감에서 상향 조절된다. 신경 reinnervate 근육 섬유 등이 유전자의 수준은 감소하고 RAPIDLY 기본으로 돌아갑니다. 시험 동물 중 두 유전자 발현의 패턴은 재생 NMJs에서 분자 및 세포 변화 사이에 밀접한 상관 관계를 보여 거의 동일하다. 이 방법은 따라서 NMJ 재생의 다른 단계와 관련된 분자 변화를 식별하기 위해 고유의 기회를 제공합니다.
그림 1 :. 일반 비골 신경 해부학 (A) 도식하여 좌골 신경의 코스와 표면과 뼈 랜드 마크와 관련하여 자사의 단말기 가지를 자세히 설명. SCN은 = 좌골 신경, TN = 경골 신경, SRN = 수랄 신경, CPN = 일반 비골 신경, SPN = 피상적 인 비골 신경, DPN = 깊은 비골 신경. 원하는 절개 사이트가 표시됩니다. 제거 피부와 주변 근육에 관련된 공통 비골 신경의 위치 (B) 다이어그램.상대 절개 사이트는 투자 근막 상부에 표시됩니다. TA = 앞정 전방 근육 EDL = 신근 심지 Longus 근육. (C) 노출 좌골 및 일반 비골 신경. CPN 무릎의 높이에서 비복근 근육 (내지 Gn) 건과 교차. 도시 건에 대해 호감 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 일반 비골 신경 호감 수술 (A) 초기 절개는 길이가 몇 cm가 될 필요는 없다. 피부 표면 근막 관통 한 후, 절개는 이두근 대퇴 및 TA 근육 사이에 누워 투자 / 깊은 근막을 통해 계속해야합니다. (A1) 공통 비골 신경 용이 현미경 t없이 가시화절개 (내지 Gn = 비복근 근육) hrough. 절개가 (만 사진을 위해 필요한) 확대 된 경우 (A2) 공통 비골 신경과 비복근 건의 교차 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 호감이 수직 내지 Gn 건에 신경 및 병렬로 빨간 선으로 표시된 위치에 배치해야합니다. (나) CPN은 더 쉽게 형광 해부 범위에 YFP 유전자 변형 마우스로 가시화된다. (B1) 신경은 전체 압박 손상의 확인을 허용, 호감의 사이트에서 형광을 잃는다. (B2) 전체 CPN 호감은 여전히 육안과 실내 조명으로 시각화 할 수 있습니다. 신경이 반투명하게 될 것이다. 이 이미지는 동시에 주변 조직과 혈관의 손상을 제한하면서 CPN의 epineurium와 상부 구조가 그대로 유지된다는 사실을 강조한다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 신근 심지 Longus (EDL) 근육의 해부학 (A) 마우스 뒷다리의 뼈와 관련하여 EDL의 3 차원 이미지. 각 부서에 의해 제어되는 숫자를 네 지절 부문으로 분리 JAtlasView (B) 부분적으로 해부 EDL 근육을 사용하여 표시 생성됩니다. 이 두 번째 숫자를 제어하는 EDL 부문의 최종 판 대역을 innervates로 (C) YFP은 깊은 비골 신경의 지점을 표시. (D) 축삭 지점과의 접촉 사이트를 쉽게 선택 NMJs의 일관성 검사를 허용, 식별 할 수 있습니다. 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.
그림 4 :. 비골 신경을 분쇄 한 후 EDL 근육의 같은 나이와 NMJs의 섹스 분석의 동물 사이 Reinnervation의 비슷한 요금. (A) 후 시냅스 사이트가 완전히 손상되지 않은 쥐에서 축색 돌기에 의해 점령된다. 사일 후 호감에서 (B)는, 근육이 완전히 denervated 발견된다. (C) 축삭 7 일 후 호감과 (D)를 근육을 reinnervate 완전히 십이일에 의해 시냅스 사이트를 다시 선점하기 시작합니다. (E는 - F) NMJ 재 점유 비율은 동물 걸리는 시간 denervated 사이 거의 구별. (G - I) 성숙 시냅스 사이트로 다시 분화 축삭 신경 종말의 대표 이미지. 시냅스 사이트의 Reoccupation이 따르는예측 가능한 패턴은 결국 완전히 개발에 NMJ region.Similar 넘어 연장하지 않고 시냅스 부위를 차지 가지 현상 성장 원추 시작하여 시냅스 부위는 초기에 여러 재성장 축삭 의해 신경 지배되지만 NMJ 완전히 재생되면 단지 하나의 엑손이 남아있다. 표시된 여러 축삭에 의해 사전과 시냅스 장치, 및 신경 분포 사이의 전체 중복없이 무성한 축삭 발아 부분 신경 분포의 (H) 예. 칠십일 된 암컷 마우스 조사 하였다; 스케일 바 = 50 μm의 (AD), 20 μm의 (GI). 오류 바 = SEM. N = 3 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 비골 신경이 같은 방법 크러시N 분석은 NMJ 복구에 참여 후보 유전자를 확인하는 (A - B).이 NMJ 관련 유전자의 ACHR 감마 서브 유닛과 사향의 mRNA의 수준은, 마찬가지로 마우스의 TA 근육에 변경되는 시간의 같은 기간 동안 denervated . 증가 시간 후 신경 손상으로 모두 성적 증명서의 수준은 NMJs의 진보적 reinnervation을 보여주는 조직 학적 분석을 확증, 기본으로 돌아 감소. 각 행은 개별 마우스를 나타냅니다. 오류 바 = 기술 복제의 평균의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서 제시하는 방법은 신경근 접합부 (NMJ)을 수리에 관여하는 메커니즘을 식별하는 고유 한 기회를 제공합니다. 이 무릎 근처 비복근 건 통과하여이 방법은 공통 비골 신경 분쇄 포함한다. 우리는 집게와 신경 압축의 5 초 후, 완전한 변성 부상 후 사일에 의해 주목을 보여준다. 젊은 성인 쥐에서 알파 - 모터 축삭은 십이일에 의해 손상되지 않은 쥐와는 구별 시냅스 사이트의 개혁에서 남중, 이후 부상 칠일에 신근 심지 longus 근육 (EDL)의 이전 시냅스 사이트를 reinnervate 시작합니다. 또, 선택 NMJ 관련 분자 수준 밀접 NMJ의 신경 분포 상태와 상관 관계가 있음을 보여준다. 중요한 것은, 이들 세포 및 분자의 변화를 식별 할 기회를 제공 TES 동일한 성별, 나이 (도 5A-B)의 동물 사이의 높은 재현성NMJ를 복구하는 역할을 t 요인. 그것이 주위의 근육과 혈관에 작은 손상을 초래 단지 작은 절개를 필요 비복근 건 통과하여 수술 절차의 관점에서, 공통 비골 신경 가지 매우 접근한다.
재생 NMJs과 관련된 세포 및 분자의 변화를 조사하기 위해 공통 비골 신경을 이용하는 장점이있다. 비복근 건은 지속적으로 목표 근육에서 동일한 위치와 거리에 공통 비골 신경을 손상 할 수있는 안정적인 해부학 적 랜드 마크 역할을합니다. 이 확실하게 동일한 나이 및 성별 동물 사이의 근육의 축삭 재생의 속도 reinnervation을 비교 가능하게한다. 이러한 성공에 중요한 단계는 부상 부위가 수술 사이의 일관성을 보장 포함, 전체 신경 호감은 모든 동물에서 얻어진하고, 최소한의 손상은 주변 구조물에 유지된다. ㄴ에 의해 신경 지배 근육 중비골 신경 ommon, 경골근 (TA)과 신근 심지 longus (EDL) 근육 NMJ 수리를 평가하기위한 훌륭한 목표입니다. 이 두 근육은 주로 심한 손상, 노화 및 질병 (5)에 의해 영향을받는 고속 형 근육 섬유로 구성된다. 전체 장착 왜곡없이 모든 NMJs 이미지 수 있기 때문에 분석 NMJ 들어, EDL 근육이 특히 매력적이다. 또한 가능 다른 근섬유 모터 축삭 세포 및 주변의 변화 NMJs에서 변경을 연관시킬 수있다.
조교와 EDL 근육이 광범위 때문에 해부학 적 위치 (20)의 근육과 NMJ 수리에 다른 분자와 라이프 스타일 개입의 영향을 평가하기 위해 사용되었다. 그러나, 장기간의 탈 신경은 더욱 어렵게 세포 및 분자 채널을 평가할 수있어 근육 섬유, 면역 세포 활성화 및 위성 세포 12-14 atrophying 중요한 기능을 갖는 유전자의 발현을 변경특히 NMJs의 재생을 촉진하는 데 필요한 ANGES. 여기에 설명 된 방법에서 비골 신경은 신경 젊은 성인 쥐에서 7 일 이내에 후 호감을 그들에 도달 할 수 있도록, 조교 및 EDL 근육에 근접 분쇄된다. 따라서,이 방법은 근육 및 TA 및 EDL 근육의 근섬유를 atrophying과 관련된 분자량의 변화 손실을 최소화한다.
비골 신경 호감 프로토콜은 여러 독특한 패션으로 수정 될 수 있습니다. 신경 절단 부상 용이 말초 신경 재생의 생체 촬상 더 나은 실시간을 허용 분쇄로 대체 될 수있다. 컷은 재성장에 대한 장애물로 죽은 축삭 물질을 제거하고 endoneurial 튜브 내의 모든 축삭의 균일 손상을 보장합니다.
올바르게 수행 할 때 비골 신경 호감은 몇 관련된 합병증을 가지고있다. 발생 될 수있는 하나의 문제는 원래 NMJ 목표를 reinnervate하는 신경의 실패입니다. 이것은 ACC에 의해 발생할 수 있습니다idental는 수술 중 신경에 손상을 잘라. 어떤 날카로운 모서리의 뾰족한 분쇄 집게를 확인하십시오. 수술하는 동안 어느 시점에서 신경 호감의 품질이 의심되는 경우, 원래의 절개 더 신경을 시각적으로 확대 될 수있다. 이 상처의 크기를 증가시키고, 추가의 구조를 손상시킬 수 있지만, 그것은 올바르게 비골 신경을 식별하고, 완전 분쇄가 달성되었는지 여부를 평가하는데 도움을 수있다.
여기에 설명 된 기술은 몇 가지 제한을 소유한다. 이 동물의 구조를 조작하기에 충분히 큰만큼 첫째, 성인 마우스에서 주로 유용합니다. 신생아 및 청소년 마우스 크게 수술의 어려움을 증가시키는, 훨씬 더 작다. 둘째, 비골 신경 NMJ 재생의 속도에 영향을 미칠 수있는 표적 조직의 탈 신경의 결과로, 감각과 운동 축삭이 포함되어 있습니다.
NMJ은 근 위축성 북에서 병리학의 초점 사이트로 인식되고대한 일반적인 경화증 (ALS) 및 노화. 또한 운동 능력 저하와 근육 질량의 손실을 방지하기 위해 말초 신경 손상 후 복구해야합니다. 비골 신경 호감 방법은 식별 및 NMJ 복구에 중요한 역할 분자의 테스트에 도움이됩니다. 한 접근법에서,이 방법은 RNA 서열 분석을 사용 NMJ 재생의 다른 단계에서 중요한 역할을하고, 마이크로 RNA와 mRNA의 프로파일을 사용할 수있다. 또한, 선택적으로 도입되고 근육 삭제 후보 유전자의 기능을 결정하기 위해 적용될 수있다. 또한,이 방법은 정적 및 라이브 영상을 이용하여 신경 NMJ 재생 속도를 위해 외래 분자의 능력을 시험 웰에 빌려 준다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
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