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Neuroscience

O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

Published: August 11, 2016 doi: 10.3791/54186

Abstract

A junção neuromuscular (MNJ) sofre alterações estruturais e funcionais deletérios, como resultado do envelhecimento, ferimentos e doenças. Assim, é imperativo compreender as alterações celulares e moleculares envolvidos na manutenção e reparação NMJs. Para esta finalidade, desenvolvemos um método fiável e consistente para examinar regenerar NMJs em ratinhos. Este método envolve a lesão do nervo esmagamento do nervo fibular comum, uma vez que passa por cima da cabeça lateral do tendão do músculo gastrocnêmio, perto do joelho. Usando ratos fêmeas mais velhas 70 dias, demonstramos que axônios motores começam a reinnervate metas pós-sinápticos anteriores no prazo de 7 dias após o esmagamento. Eles reocupar completamente suas áreas sinápticas anteriores por 12 dias. Para determinar a confiabilidade desse método de lesão, foram comparadas as taxas de reinervação entre camundongos fêmeas velhas 70 dias individuais. Verificou-se que o número de sítios pós-sinápticos reinervados foi semelhante entre os ratinhos em 7, 9, e 12 dias pós-esmagamento. Para determinar seeste ensaio de lesão também pode ser utilizado para comparar as alterações moleculares em músculos, que examinaram os níveis de gama-a subunidade do receptor nicotínico muscular (gama-AChR) e a quinase específica do músculo (almíscares). A subunidade gama-AChR e almíscar que são altamente regulada seguinte desnervação e retornar aos níveis normais após a reinervação dos NMJs. Encontramos uma relação estreita entre os níveis de transcrição para estes genes e status inervação dos músculos. Acreditamos que este método irá acelerar nossa compreensão das mudanças celulares e moleculares envolvidos na reparação do MNJ e outras sinapses.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do NIH e protocolos de animais aprovados pela Comissão de Virginia Tech Institucional animal Cuidado e Uso.

1. Os animais que se preparam para Cirurgia

  1. Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) via injecção subcutânea inguinal com uma seringa de 1 ml estéril insulina. solução portadora contém uma mistura de solução salina a 0,9%, 17,4 mg / ml de cetamina e 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque animais de volta em gaiolas enquanto espera para a medicação fazer efeito.
    NOTA: Se a dose de carga não proporcionar anestesia suficientes para a duração do processo, um adicional de 25% da dose de carga pode ser injectado.
  2. animais do monitor após a injecção para verificar se há taxas respiratórias estáveis ​​e depressão adequada dos níveis de excitação. Verifique o nível de excitação com uma pitada pata traseira, o que deve provocar nenhuma resposta quando suficientemente anestesiados.
    NOTA: Isso normalmente leva 3-5min para um rato adulto jovem, com média de 25 a 30 g. Se o animal ainda é responsivo após a injecção de pós de 10 min, um adicional de 25% da dose de carga de anestésico pode ser injectado.
  3. Aplicar vaselina e pomada oftálmica óleo mineral leve para os olhos do animal para evitar a secura. Remover animais de gaiola e coloque sobre uma superfície plana e limpa. Raspar o membro posterior desejado de pé para pelve, por um aparador de cabelo elétrico, expondo apenas o aspecto lateral do membro.
  4. Aplicar um removedor de cabelo química para o local raspada durante 1 min. remover manualmente o cabelo usando lenços de laboratório. Limpe a área depilada com o laboratório toalhete embebido em álcool.

2. Procedimento Cirúrgico

  1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave ou outro método adequado. Limpar o local da cirurgia e tábua cirúrgico com 80% de etanol / H 2 0. Desinfectar o local cirúrgico com proviodine. Coloque o mouse na placa cirúrgica e alinhar-se com as restrições dos membros. Guardao membro alvo traseira em uma posição anatomicamente natural com a articulação do joelho ligeiramente estendido sem rotação interna ou externa.
  2. Coloque o animal e tábua sob o microscópio cirúrgico. Orientar para o local da incisão adequada através da palpação dos marcos superficiais, especificamente a articulação do joelho ossudo eo cume entre o tibial anterior e gastrocnêmio.
  3. Fazer uma cerca de 3 cm da incisão através da pele utilizando um bisturi ou uma tesoura de mola enquanto estiver usando uma pinça gerais para emocionante. Fazer a incisão perpendicular ao curso subjacente do nervo fibular comum.
  4. Continue a incisão através da fáscia superficial, expondo o bíceps femoral e vasto lateral. Separar estes músculos cortando a fáscia profunda ligação. A 1-2 cm corte deve ser suficiente.
  5. Retrair o músculo bíceps femoral caudal com afastadores mecânicas, revelando o nervo fibular comum.
  6. Trace o nervo proximal até suas interseção com o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio é encontrado. Nota: A exposição pode requerer manipulação adicional da pele retraída e músculo. Esta intersecção é utilizado como o ponto de referência estável para a lesão do nervo.
  7. Segure o nervo com uma pinça fina, alinhando as pontas de uma forma paralela à borda lateral do tendão gastrocnêmio. Esmagar o nervo fibular comum, aplicando pressão constante, dura por 5 s.
  8. Corroboram queda completa do nervo por inspeção visual com o espaço cirúrgico. Ele aparece translúcido no local da lesão. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, a fluorescência irá desaparecer do local da lesão.
  9. Remover afastadores e realinhar os músculos em suas posições anatômicas. Feche o local da incisão com 6-0 seda. 1-3 suturas interrompidas simples é suficiente. Coloque recuperando do mouse sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa.
  10. Monitorar todos os animais para 2 horas pós-óperação para verificar se há respiração e quaisquer reacções adversas à anestesia. Administrar uma dose inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg por via de injecção subcutânea inguinal imediatamente a seguir à recuperação da cirurgia. Dê 3 doses adicionais a cada 12 horas durante o próximo 48 horas. Após a recuperação completa, voltar ratos para a instalação de cuidados com os animais.

3. Isolamento e Coloração de extensor longo dos dedos músculos (EDL)

  1. Sacrificar animais com isoflurano. Pipetar 0,5 ml de isoflurano líquido para um tubo de 50 mL embalada com labwipes absorventes. Colocar o tubo destapado com o animal numa câmara selada 2,500 centímetros 3. Pelo menos 4 min de exposição é suficiente. Teste para perda de palpebral bilateral, toe-beliscão, e reflexos rabo-de aperto para garantir que cada animal está inconsciente antes de prosseguir com a perfusão.
  2. Transcardialmente perfundir 16 animais em primeiro lugar com 10 ml de 0,1 M de PBS, em seguida, 25 ml de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de PBS (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso do animal), pode ser adicionado com o PBS (10 unidades / ml) para evitar a coagulação do sangue em pequenos capilares, melhorando os resultados de perfusão.
  3. Remover a pele que cobre os membros posteriores, utilizando uma tesoura para cortar transversalmente através da pele em torno da circunferência do abdómen. Descascar para baixo a pele após os membros e patas traseiras com a pinça.
  4. Remover fáscia superficial de membros posteriores, segurando e peeling com fórceps. Se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos, pós-fix ratos toda a noite em 4% PFA em tubos de 50 ml. Lavar três vezes com PBS.
    NOTA: Fixa ratinhos podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C. Se não, pule esta etapa e vá para a etapa 3.6, sem animais pós-fixação.
  5. Dissecar músculos EDL 18 de rato membros traseiros, tendo a certeza de manter proximal e distal tendões tão intacto quanto possível.
  6. Incubar músculos EDL em tampão de bloqueio (PBS 1x contendo 0,5% de Triton X-100, BSA a 3% e soro de cabra a 5%) durante pelo menos 1 h.
  7. Manchar o contralateral ileso EDL como um controlo positivo para a inervação completa MNJ. Os controlos negativos devem incluir uma EDL obtido em 4 dias pós-ferimento, um ponto de tempo onde o JNM é completamente desnervado, bem como uma EDL coradas com anticorpo secundário única.
  8. Incubar músculos com anticorpos secundários marcados fluorescentemente apropriadas para detectar neurofilamento e sinaptotagmina-2 durante 1 dia. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez. Nota: Este passo pode ser realizado juntamente com o passo 3.10. Pule esta etapa se utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes em axônios periféricos.
  9. Para visualizar a postsynaptic região do MNJ, músculos incubar com 5 ug / mL de Alexa-555 conjugado alfa-bungarotoxina diluído em tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 h. Lave músculos três vezes com 1x PBS e 10 min de cada vez.
  10. Para montar músculos inteiros em lâminas de vidro com carga positiva, coloque o músculo diretamente sobre o slide, adicionar algumas gotas de glicerol com base médio no slide de montagem e cobrir com uma lamela. Pressione a lamela contra o slide para achatar o músculo. Mergulhe off meios de montagem a partir do perímetro da lâmina e lamela usando lenços de laboratório. Aplique unha polonês para selar as arestas entre as lamelas e slide.

4. Imagem e Análise de Dados

  1. Para analisar a estrutura da NMJs, imagem do músculo EDL usando um microscópio confocal de varrimento laser equipado para excitar 488, 555 e 633 nm de luz e capturar a luz emitida com 20X e 40X objectivos.
  2. Para visualizar toda NMJs, criar imagens projeção de intensidade máxima de sec ópticações espaçadas de 1 a 2 mm que se estende para além do menor para o maior regiões visíveis do MNJ. Crie projeções de intensidade máxima, utilizando software de imagens disponível no mercado.
  3. Para determinar as taxas de reinervação, categorizar NMJs como: 1) completamente desnervado = sítio pós-sináptico é completamente desprovida de contacto com axônio, menos de 5% co-localização entre o axônio e AChRs. 2) parcialmente inervado = o axónio sobrepõe parcialmente o postsynapse, 5-95% de co-localização entre o axónio e AChRs. 3) inervação completa = cerca de aposição perfeita entre o pré e pós-sinapse, superior a 95% co-localização entre o axônio e AChRs. Excluir NMJs que se encontram perpendiculares ao plano de imagem, ou não são totalmente visualizadas na imagem. Nota: Em todas estas experiências, pelo menos, 3 animais e 50 NMJs por animal foram examinados. Os resultados foram considerados significativos usando um teste t de Student, com um valor P inferior a 0,05.
  4. Para cegar o operador, indivíduos separados pode executara análise de cirurgia e imagem. Sem o conhecimento dos grupos de tratamento, o analisador pode ser objectivo com JNM de pontuação. Alternativamente, as imagens podem ser aleatorizados e apresentados ao operador para análise sem o conhecimento do animal de origem.

5. Quantitative PCR

  1. Sacrificar animais utilizando isoflurano e deslocamento cervical. Retire a pele e fáscia superficial que cobre os músculos da perna de acordo com o passo 3.3. Dissecar tibial anterior e músculos EDL acordo com o passo 3.4.
  2. Flash congelar todo o tibial anterior e músculos EDL em um tubo de 1,5 ml sobre azoto líquido. Remover o tecido do tubo e colocar num almofariz pré-arrefecido parcialmente submerso em azoto líquido. Moer músculo congelado em um pó fino usando um almofariz e pilão.
  3. Dissolve-se pó de músculo congelado em um reagente de extracção de ARN comercialmente disponível e efectuar a extracção de ARN e a remoção de DNA genómico com um kit disponível comercialmente de acordo com I do fabricantenstructions.
  4. Realizar a transcrição reversa com uma transcriptase reversa mistura disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Execute qPCR utilizando um kit disponível comercialmente usando genes de limpeza adequados (ver tabela de materiais). Use um quantitativo termociclador PCR comercialmente disponível para realizar PCR (ver tabela de materiais).
  6. Ajuste temperatura de recozimento de 58 ° C. Ajustar os parâmetros de ciclismo adicionais às especificações do fabricante de Taq polimerase / SYBR mix verde. Incluir um passo final da curva de fusão do programa de termociclador consistindo de 0,5 ° C aumentos incrementais de 65 ° C a 95 ° C para testar a especificidade do iniciador e o iniciador a formação de dímeros.
  7. Determinar os níveis de expressão de ARNm relativa pelos 2 - Método ΔΔCT 21 utilizando 18S ARN como o gene de controlo.

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Representative Results

O nervo fibular comum, também chamado o nervo fibular comum, surge a partir do nervo ciático acima da fossa poplítea, onde ele oscila ao redor da cabeça da fíbula ao aspecto anterior da perna (Figura 1A). Lá ramificações nos nervos fibulares superficial e profunda, em conjunto fornecendo os dorsiflexores do pé e dos dedos (tibial anterior, extensor longo dos dedos e brevis, e hálux músculos extensores longus), e os everters do pé (músculos fibulares). Este nervo também transporta fibras sensoriais que se projectam para o dorso do pé e face lateral da parte inferior da perna. É uma estrutura relativamente fina composta por motor e axónios sensoriais. Este ramo do nervo segue um curso anatômica previsível. Lateral para o joelho, o nervo é mais superficial como ele é executado sobre o tendão da cabeça lateral do músculo gastrocnêmio (Figura 1 e Figura 2). ºé a localização serve como um ponto de referência estável que pode ser facilmente alcançado com uma pequena incisão, limitando os danos para a pele e fáscia (Figura 1A). O diâmetro menor do nervo, quando comparado com o nervos ciático e tibial, faz com que seja possível para esmagar todos os axônios usando menos força, reduzindo a probabilidade de separar completamente os axónios mais superficiais.

Camundongos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) apenas em neurônios 17 foram usadas para otimizar o processo de esmagamento no nervo fibular comum e sem ambiguidade visualizar os axônios em regeneração. O nervo foi esmagado na borda do tendão do gastrocnémio mais proximal para os músculos do alvo porque neste sítio são mais acessíveis a partir do local da incisão. Este local também serve como um ponto de referência anatómica fiável, tornando-se possível comparar a regeneração de NMJs entre animais da mesma idade e sexo. Comprimindo o nervo durante 5 segundos usando uma pinça fina resÜLTS no desaparecimento de YFP a partir do local da lesão (Figura 2B). No entanto, o tecido conjuntivo e células que residem no perineuro permanecem contíguo, servindo como uma conduta para regeneração rápida e precisa dos axónios para os seus objectivos originais (Figura 2B). Em camundongos fêmeas de 70 dias de idade, esta lesão é suficiente para causar a degeneração de todos os segmentos axonal distais da soma neuronal (Figura 4B).

Para determinar a confiabilidade e reprodutibilidade deste método lesão, foi examinado reinervação do músculo extensor longo dos dedos (EDL). Este músculo foi escolhido por várias razões: 1) É proximal ainda fisicamente separados dos sítios de lesão de nervos e de incisão (Figura 3A). Assim, o músculo só podem ser alterados por degeneração de axónios inervação cortadas. Sua proximidade com o local do esmagamento minimiza o tempo necessário para que possa ser reinervadas e atroph musculary. 2) Ele é composto principalmente de tipo rápido fibras musculares esqueléticas, que são mais suscetíveis ao envelhecimento e doenças. 3) Seus NMJs sofrer alterações estruturais significativas durante a progressão de doenças e envelhecimento que pode ser atenuada por exercício e restrição calórica. 4) É de fácil acesso para imagens ao vivo e manipulação molecular (Figura 3D). 5) Pode ser facilmente separado nos seus quatro componentes falangeais que pode ser todo montado tornando-se possível totalmente imagem de todos os seus axónios inervação e suas conexões usando microscopia de luz (Figura 3B).

Reinervação dos previamente desocupado locais pós-sinápticos após o esmagamento do nervo fibular na perna direita foi avaliada em três ratos fêmeas 70 dias de idade que expressam YFP em axônios motores. locais pós-sinápticas foram visualizadas utilizando fluorescente etiquetado alfa-bungarotoxina (BTX), que se liga selectivamente e com elevada afinidade para os músculos nACHRS. Músculos foram consideradas ser desnervado, parcial ou totalmente reinervadas seguindo estes critérios: 1) No caso das fibras do músculo desnervado, axônios motores estavam completamente ausentes dos locais pós-sinápticos e menos de 5% co-localização entre o axônio e foi observado AChRs. 2) fibras musculares parcialmente inervados foram categorizados por alguns, mas aposição incompleta de axônios motores com locais pós-sinápticos e 5-95% co-localização entre o axônio e foi observado AChRs. 3) No caso das fibras musculares totalmente inervados, houve aposição quase perfeita entre as terminações nervosas motoras e locais de pós-sinápticos e maior do que 95% de co-localização entre o axónio e foi observada AChRs. NMJs individuais foram excluídas da contagem de se estabelecer as suas placas terminais perpendicular ao plano de imagem ou toda a JNM não foi visualizado. Utilizando estes critérios, foi observada alta concordância na tarifa e grau de reinervação entre todos os ratos examinados. Aos 4 dias pós-esmagamento, os músculos foram encontrados totalmente desnervado em todos os animais examinado (Figura 4B). Esta descoberta mostra que o esmagamento do nervo fibular comum por 5 s, como descrito acima, é suficiente para romper todos os axônios. Por 7 dias pós-esmagamento, terminações nervosas estavam no processo de reocupar locais pós-sinápticos previamente desocupado (Figura 4C, 4E-F). No entanto, a maioria das fibras musculares foram ainda encontradas apenas parcialmente inervados. Com dias adicionais de pós-esmagamento, terminações nervosas continuou a se diferenciar em sites e NMJs pré-sinápticos foram encontrados totalmente reinervados por 12 dias (Figura 4D, 4E-F). Importante, houve pouca variabilidade entre ratos desnervados para o mesmo período de tempo (Figura 4E-F), demonstrando que o esmagamento do nervo fibular pode ser utilizado como um ensaio para comparar reinervação dos músculos entre animais da mesma idade e sexo.

A capacidade de comparar fielmente NMJs regeneração entre os animais oferece oportunidadespara entender as características celulares associados com cada passo necessário para reparar completamente este sinapse. Para examinar a arquitetura do NMJs desnervados e regeneração obtidos com ratos de idade de 70 dias usado anteriormente para comparar as taxas de reinervação, foram obtidas imagens de alta resolução de microscopia confocal de NMJs. Como esperado, esta análise revelou uma série de mudanças que ocorrem no α-motoras terminações nervosas do axônio como eles reinnervate fibras musculares (Figura 4G-I). Cones crescimento axonal aparecem para expandir e começar a ramificar-se como eles entrar em contato com sites de pós-sináptico (Figura 4G). Estes ramos axonais depois crescer em regiões específicas do postsynapse, culminando no próximo justaposição completa do nervo axon terminando com o site pós-sináptica (Figura 4H-I). características estruturais adicionais na regeneração de terminações nervosas motor que muito se assemelham aos encontrados durante o desenvolvimento foram observadas, incluindo vários axônios concorrentes para o s-alvo ame (Figura 4H), culminando com apenas um axônio que inervam uma fibra muscular por 12 dias pós-esmagamento. Além disso, ramos axonais que se estendem além dos sites pós-sinápticos, referido aqui como brotos, em todas as fases pós-lesão foram observados (Figura 4I). Esses brotos foram altamente prevalentes, mesmo em NMJs totalmente inervados sugerindo que a fase final de reparação axonal envolve retração de ramos axonais extrajuncional. Apesar destas mudanças óbvias em terminações nervosas, locais pós-sinápticos permaneceu praticamente indistinguíveis em todas as fases pós-lesão em comparação com aqueles nos músculos lesionados, incluindo a 4 dias após o esmagamento quando as fibras musculares são encontrados totalmente desnervado. Não havia nenhum sinal óbvio de fragmentação ou perda significativa e redistribuição para as regiões extra-sinápticos de AChRs. Estes resultados indicam fortemente que o método fibular esmagamento do nervo pode ser utilizado como um ensaio para identificar e testar agentes moleculares, farmacológicos e de estilo de vida tchapéu de promover a reparação de terminações nervosas nas sinapses, incluindo o MNJ.

Apesar dos avanços recentes, muito pouco progresso tem sido feito na identificação dos fatores derivadas de músculos necessários e suficientes para manter e reparar o MNJ. Por isso, perguntou se o método de lesão do nervo fibular comum pode ser usado para identificar moléculas alteradas em fases específicas do processo de reinervação e com potenciais papéis na reparação do MNJ. Como prova do capital, a análise dos dois genes associados JNM-expressão, a subunidade gama AChR e a quinase específicos do músculo, almíscar 18 foi executada. Tal como demonstrado por PCR quantitativo, estes genes são aumentadas seguinte desnervação e diminuiu à medida que são NMJs reinervadas (figura 5a-b). Estes genes são regulados positivamente em 4 dias pós-esmagamento, conforme relatado anteriormente usando os músculos completamente desnervados 19. Como fibras musculares reinnervate nervos, os níveis destes genes e diminuir rapiDivina retornar à linha de base. Entre os animais examinados, o padrão de expressão de ambos os genes é quase idêntica, o que demonstra uma correlação estreita entre as alterações celulares e moleculares na NMJs regeneração. Por conseguinte, este método proporciona oportunidades únicas para identificar alterações moleculares associados a diferentes estágios de MNJ regeneração.

figura 1
Figura 1:. Fibular comum anatomia do nervo (A) Representação esquemática detalhando o curso do nervo ciático e seus ramos terminais em relação a pontos de referência superficiais e ósseas. SCN = nervo ciático, TN = Tibial Nerve, SRN = nervo sural, CPN = fibular comum do nervo, SPN = Superficial fíbula, nervo DPN = profunda fíbula. O local da incisão desejado está indicado. (B) Diagrama do local comum nervo fibular em relação aos músculos que rodeiam com a pele removida.local da incisão relativo é mostrado que cobre o fascia investir. TA = tibial EDL Anterior Muscle = Extensor longo dos dedos do músculo. (C) ciático exposto e nervo fibular comum. PCN atravessa ao longo do tendão do músculo gastrocnémio (Gn) ao nível do joelho. Local do esmagamento em relação ao tendão mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Esmagamento do nervo fibular comum Cirurgia (A) A incisão inicial precisa ser apenas alguns centímetros de comprimento. Depois de penetrar através da pele e fáscia superficial, a incisão deve ser prosseguido através do investimento fascia / profunda situada entre os bíceps femoral e músculos TA. (A1) O nervo fibular comum é facilmente visualizado sem microscopia through a incisão (Gn = músculo gastrocnêmio). (A2) A intersecção do nervo e músculo gastrocnêmio tendão fibular comum pode ser facilmente visualizado se a incisão é alargada (necessária apenas para fins fotográficos). O esmagamento deve ser colocado na posição marcada pela linha vermelha perpendicular ao nervo e paralela ao tendão Gn. (B) O CPN é ainda mais facilmente visualizadas com camundongos transgênicos YFP sob um escopo de dissecação fluorescente. (B1) O nervo perde fluorescência no local de esmagamento, permitindo a confirmação de uma lesão por esmagamento completo. (B2) Uma queda CPN completo ainda pode ser visualizado com a iluminação dos olhos e quarto nu. O nervo vai tornar translúcida. Esta imagem destaca o fato de que o epineuro e superestrutura do CPN permanecem intactos, limitando simultaneamente danos aos tecidos e vasos sanguíneos próximos.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Anatomia do músculo extensor longo dos dedos (EDL) (A) 3 uma imagem bidimensional do EDL em relação aos ossos do membro posterior do rato. Gerado usando JAtlasView (B) Parcialmente dissecados músculo EDL separados em suas quatro divisões falanges e marcação dos dígitos controladas por cada divisão. (C) YFP rotulados ramo do nervo fibular profundo, uma vez que inerva o band-placa final da divisão EDL controlar o segundo dígito. (D) ramos axonal e seus sites de contato podem ser facilmente identificados, permitindo a análise consistente de NMJs selecionados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.

Figura 4
Figura 4: taxas semelhantes de reinervação entre animais da mesma idade e sexo Análise de NMJs no músculo EDL após esmagamento do nervo fibular.. Locais (A) pós-sinápticos estão completamente ocupadas por axônios em ratos lesionados. (B) a 4 dias após o esmagamento, os músculos são encontrados totalmente desnervado. (C) Os axônios começar a reinnervate músculos 7 dias pós-queda e (D) completamente reocupar locais pós-sinápticos por 12 dias. (E - F) A taxa de MNJ re-ocupação é quase indistinguível entre animais desnervado para o mesmo período de tempo. (G - I) Imagens representativas de terminações nervosas axonal diferenciação re-em locais pré-sinápticos amadurecidas. Reocupação de locais pós-sinápticos segue umpadrão previsível, começando com o cone de crescimento o desenvolvimento de ramos que ocupam, eventualmente, completamente sem locais pós-sinápticos que se estende para além do MNJ region.Similar para o desenvolvimento, sítios pós-sinápticos são inicialmente inervado por múltiplos axónios em crescimento re-mas apenas um axónio permanece uma vez que o MNJ foi completamente regenerada. (H) Exemplos de axônios exuberante, inervação parcial sem completa sobreposição entre pré e pós-sinápticos aparelhos, e inervação por vários axônios indicados. 70 ratos fêmeas dias de idade foram examinados; Barra de escala = 50 uM (AD), de 20 um (GI). barra de erro = SEM. N = 3 ratos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: O nervo fibular Esmagar Método como umn ensaio para identificar genes candidatos envolvidos na reparação do MNJ (A - B). O nível de mRNA de dois genes JNM-associados, a subunidade gama AChR e almíscar, são igualmente alterados no músculo TA de ratos desnervado para o mesmo período de tempo . Com o aumento da lesão pós nervo tempo, níveis de ambas as transcrições diminuir, retornando à linha de base, corroborando análise histológica mostrando reinervação progressiva de NMJs. Cada linha representa um ratinho individual. Barra de erro = erro padrão da média de repetições técnicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O método apresentado neste manuscrito oferece oportunidades únicas para identificar mecanismos envolvidos na reparação de junções neuromusculares (JNM). Este método envolve o esmagamento do nervo fibular comum que passa sobre o tendão gastrocnêmio, perto do joelho. Mostramos que após apenas 5 segundos de compressão do nervo com um fórceps, degeneração completa é conhecida por 4 dias após a lesão. Em ratos adultos jovens, os axônios alfa-motoras começam a reinnervate sítios sinápticos anteriores no músculo extensor longo dos dedos (EDL) em 7 dias após a lesão, culminando com a reforma dos locais pré-sinápticos que são indistinguíveis daqueles em camundongos ileso por 12 dias. Além disso, demonstramos que os níveis de selecionar moléculas JNM-associados estreitamente correlacionados com o status de inervação do MNJ. Mais importante, estas alterações celulares e moleculares são altamente reprodutíveis entre os animais do mesmo sexo e idade (Figura 5a-b), fornecendo oportunidades para identificar e TESfatores de t que agem para reparar o MNJ. Em termos de procedimentos cirúrgicos, o ramo do nervo fibular comum é altamente acessível à medida que passa sobre o tendão gastrocnêmio, necessitando apenas de uma pequena incisão que resulta em pouco dano aos músculos circundantes e vasculatura.

Há um número de vantagens de usar o nervo peroneal comum para examinar as alterações celulares e moleculares associadas com NMJs regeneração. O tendão gastrocnêmio serve como um marco anatômico estável para ferir de forma consistente o nervo fibular comum na mesma localização e distância de músculos alvo. Isto faz com que seja possível comparar de forma fiável a taxa de regeneração de axónios e reinervação dos músculos entre animais da mesma idade e sexo. Os passos essenciais para esse sucesso incluem a garantia de que o local da lesão é consistente entre as cirurgias, esmagamento do nervo completo é obtido em cada animal, e o mínimo dano é sustentado às estruturas circundantes. Entre músculos inervados pelo cOMUM nervo fibular, tibial anterior (TA) e os músculos extensor longo dos dedos (EDL) são excelentes alvos para avaliar a reparação MNJ. Estes dois músculos são compostos principalmente de fibras musculares do tipo rápidas que são gravemente afectados por lesões, envelhecimento e doenças 5. Para a análise MNJ, o músculo EDL é particularmente atraente porque pode ser todo montado para a imagem todos os NMJs sem distorções. Ele também torna possível correlacionar alterações no NMJs com alterações em outros lugares em fibras musculares, axônios motores e células circundantes.

Os músculos TA e EDL têm sido amplamente utilizados para avaliar o impacto de diferentes intervenções moleculares e estilo de vida sobre o músculo e reparação MNJ por causa de sua localização anatômica 20. No entanto, a desnervação longo prazo altera a expressão de genes com função crítica na atrofiadora fibras musculares, células imunitárias activadas e células satélite 12-14, tornando-o mais difícil de avaliar CH celular e molecularanges necessário para promover especificamente a regeneração de NMJs. No método descrito aqui o nervo fibular é esmagado em estreita proximidade com os músculos TA e EDL, permitindo que o nervo para alcançá-los no prazo de 7 dias após o esmagamento em ratos adultos jovens. Assim, este método deve minimizar a perda de massa muscular e alterações moleculares associados com atrofia das fibras musculares nos músculos TA e EDL.

O protocolo de esmagamento do nervo fibular pode ser modificado de várias formas distintas. lesão corte do nervo pode ser prontamente substituído por esmagamento, permitindo uma melhor em tempo real de imagens in vivo da regeneração do nervo periférico. Um corte remove material axônio morto como um obstáculo para a rebrota e garante danos homogénea de cada axônio dentro do tubo endoneural.

Quando realizada corretamente o esmagamento do nervo fibular tem poucas complicações associadas. Um problema que pode ser encontrada é falha do nervo para reinnervate JNM alvos originais. Isto pode ser causado por accidental cortar a lesão do nervo durante a cirurgia. Certifique-se de verificar a pinça de ponta fina esmagamento por quaisquer bordas afiadas. Se em algum momento durante a cirurgia a qualidade de um esmagamento do nervo é questionável, a incisão original pode ser ampliado para melhor visualizar o nervo. Enquanto isso aumenta o tamanho da ferida e podem danificar estruturas adicionais, que podem ajudar a identificar correctamente o nervo peroneal e determinar se ou não um esmagamento completo foi alcançado.

A técnica descrita aqui não possuem algumas limitações. Em primeiro lugar, é útil principalmente em ratos adultos, como as estruturas nesses animais são suficientemente grandes para manipular. Recém-nascido e camundongos adolescentes são muito menores, aumentando significativamente a dificuldade da cirurgia. Em segundo lugar, o nervo fibular contém axônios sensitivos e motores, resultando em desnervação de tecidos-alvo que podem afetar as taxas de MNJ regeneração.

O JNM é reconhecido como um local focal de patologia em lat amiotróficaesclerose eral (ALS) e envelhecimento. Ele também tem de ser reparado após lesão dos nervos periféricos para evitar comprometer as habilidades motoras e perder massa muscular. O método de esmagamento do nervo fibular deve ajudar na identificação e teste de moléculas com importantes papéis na reparação do MNJ. Em uma abordagem, este método pode ser usado para perfil de mRNA e microARN com papéis chave em diferentes fases de regeneração JNM utilizando análise da sequência de ARN. Ele também pode ser aplicado para determinar selectivamente a função de genes candidatos introduzidos e eliminados a partir de músculos. Além disso, este método se presta bem a testar a capacidade de moléculas exógenas para acelerar a regeneração do nervo e JNM utilizando imagiologia estático e ao vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VetOne 501072
Xylazine Lloyd Inc.  003437 
Buprenorphine  Zoopharm 1Z-73000-150910 
Nair Nair
Kim-wipes Kimtech 34155
Electric Razor Braintree Scientific CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors Vannas 91500-09
No. 15 scalpel Braintree Scientific SSS 15
#5 Forceps Dumont 11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle  Suture Express 752B 
Rodent Heating Pad Braintree Scientific AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX Molecular Probes B35451
Vectashield Vector Labs H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope Olympus 562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump Fisher Scientific 13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix Bio-Rad 1708840
SsoFast Evagreen Supermix Bio-Rad 1725200
Bio-Rad CFX96 Bio-Rad 1855196
Puralube Vet ointment Puralube 1621
Synaptotagmin-2 antibody Antibodies-Online ABIN401605
Neurofilament antibody Antibodies-Online ABIN2475842

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References

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Neurociência Edição 114 NNJ Synapse Reparação lesão do nervo Nerve Regeneration Degeneration fíbula nervo fibular EDL
O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares
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Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. More

Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (114), e54186, doi:10.3791/54186 (2016).

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