Abstract
nöromüsküler bileşke (NMJ) yaşlanma, yaralanma ve hastalık sonucu zararlı yapısal ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. Nedenle, bakım ve onarım NMJs katılan hücresel ve moleküler değişiklikleri anlamak için şarttır. Bu amaçla, güvenilir ve sürekli olarak farelerde NMJs rejenere incelemek için bir yöntem geliştirdik. o diz yakın gastroknemius kası tendonun lateral başının üzerinden geçerken Bu sinir yaralanması yöntemi yaygın fibula siniri ezme içerir. 70 günlük dişi fareler kullanarak, motor aksonlar 7 gün sonrası ezmek içinde önceki postsinaptik hedefleri reinnervate başlar göstermektedir. Bunlar tamamen 12 gün önceki sinaptik alanları yeniden işgal. Bu yaralanma yöntemin güvenilirliğini belirlemek için, bireysel 70 günlük dişi fareler arasında reinnervation oranları karşılaştırıldı. Biz tekrar innerve olmuş postsinaptik sitelerin sayısı 7, 9 fareler arasında benzer olduğunu buldu ve 12 gün sonrası crush. olmadığını belirlemek içinBu yaralanma deneyi, kas moleküler değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir biz kas nikotinik reseptör (y-AChR) ve kas özel kinaz (MuSK) gama alt-biriminin seviyeleri araştırılmıştır. gama-AChR alt birim ve MuSK yüksek aşağıdaki denervasyon regüle ve NMJs reinnervation aşağıdaki normal seviyelere geri oluştururlar. Biz bu genlerin ve kasların innervasyonu durumu transkript seviyeleri arasında yakın bir ilişki bulundu. Biz bu yöntem NMJ ve diğer sinaps tamir katılan hücresel ve moleküler değişiklikler anlayışımız hızlandırmak inanıyoruz.
Protocol
Tüm deneyler Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış NIH kurallar ve hayvan protokol çerçevesinde yürütülmüştür.
Cerrahi 1. hazırlanması Hayvanlar
- steril 1 ml insülin şırınga ile ketamin (90 mg / kg) ve deri altı enjeksiyon yoluyla inguinal ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile fareler anestezi. Taşıyıcı çözeltisi% 0.9 tuzlu su, 17.4 mg / ml ketamin ve 2.6 mg / ml ksilazin içeren bir karışım içerir. yürürlüğe girmesi için ilaç beklerken kafeslerde geri hayvanları yerleştirin.
Not: yükleme dozu prosedür süresince yeterli anestezi sağlamıyorsa, yükleme dozunun% 25 ek enjekte edilebilir. - Monitör hayvanlar sürekli solunum oranları ve uyarılma seviyelerinin uygun depresyon kontrol etmek için enjeksiyon sonrası. yeterince anestezi zaman hiçbir tepki ortaya çıkarmak gerekir bir arka ayak tutam ile uyarılma seviyesini kontrol edin.
NOT: Bu genellikle 3-5 alır25 ila 30 g ortalama bir genç yetişkin fare için min. Hayvan de 10 dakika sonrası enjeksiyonundan sonra yanıt ise, anestezi yükleme dozunun% 25 ek enjekte edilebilir. - kuruluğunu önlemek için hayvanın gözlerine vazelin ve hafif mineral yağ oftalmik merhem sürün. temiz, düz bir yüzey üzerine kafes ve yerden hayvanları kaldırın. ekstremitenin sadece yanal yönünü açığa bir elektrikli saç düzeltici kullanarak pelvise ayak istenen arka ekstremite tıraş.
- 1 dakika için traş sitesine bir kimyasal saç çıkarıcı uygulanır. El ile laboratuvar mendil kullanarak tüylerden. laboratuvar ile temizleyin depilated alan etanole batırılmış mendil.
2. Cerrahi Prosedür
- otoklav veya başka uygun yöntem ile cerrahi aletleri sterilize edin. % 80 etanol / H 2 0 ile cerrahi sitesi ve cerrahi kurulu temizleyin. proviodine cerrahi siteyi dezenfekte edin. cerrahi gemide fare yerleştirin ve uzuv sınırlamalar uyum. tutmakDiz eklemi ile anatomik doğal bir pozisyonda hedef arka bacak hafifçe iç veya dış rotasyon olmadan uzatıldı.
- Cerrahi mikroskop altında hayvan ve tahta yerleştirin. yüzeysel noktalarına özellikle kemik diz ekleminde ve tibialis anterior ve gastroknemius kaslar arasındaki sırtın palpasyon yoluyla uygun kesi sitesine yönlendirmek.
- kavrama için genel forseps kullanırken bir neşter veya yaylı makas kullanılarak deri yoluyla yaklaşık 3 cm'lik kesi olun. Ortak fibula sinir yatan tabii dik kesi yapmak.
- Yüzeyel fasya ile kesi Devam biceps femoris açığa ve vastus lateralis kasları. bağlayan derin fasya boyunca keserek bu kasları ayırın. Bir 1-2 cm kesilmiş yeterli olmalıdır.
- pazı geri çekin kaudale ortak fibula siniri açığa mekanik retraktörler kullanarak kas femoris.
- onun Inter kadar proksimal sinir Tracegastroknemius kasının lateral başının tendonu ile bölüm bulunur. Not: Poz geri kas ve deri ek manipülasyonunu gerekebilir. Bu kesişme sinir hasarı için kararlı bir dönüm noktası olarak kullanılır.
- gastroknemyus tendonun lateral sınırına paralel bir şekilde ipuçları hizalama ince bir forseps ile sinir kavrayın. 5 saniye boyunca sabit, sabit basınç uygulayarak ortak fibula sinir Crush.
- Cerrahi kapsamı ile görsel muayene ile sinirin tam ezmek desteklemektedir. Bu yaralanma yerinde saydam görünür. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanıyorsanız, floresan yaralanma yerinde kaybolur.
- retraktörler çıkarın ve anatomik pozisyonlarında kasları realign. 6-0 ipek sütür ile kesi kapatın. 1-3 basit kesintiye dikişler yeterlidir. Temiz bir kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde fare recuperating yerleştirin.
- 2 saat sonrası opera için tüm hayvanları izlemekyon nefes ve anestezi herhangi bir olumsuz reaksiyonlara kontrol etmek için. Ameliyattan hemen kurtarma aşağıdaki subkutan inguinal enjeksiyon yoluyla buprenorfin 0.05-0.10 mg / kg bir başlangıç dozunu. 3 ek doz sonraki 48 saat boyunca her 12 saatte verin. tam iyileşme sonrasında, hayvan bakım tesisine fareler dönün.
3. İzolasyon ve boyanması ekstansör digitorum longus (EDL) Kaslar
- izofluran kullanarak hayvanların Kurban. Emici labwipes ile dolu bir 50 ml'lik bir tüp içine 0.5 ml sıvı izofluran koyun. Mühürlü 2500 cm3 odasında hayvan kapaksız tüp yerleştirin. maruz en az 4 dakika yeterlidir. İkili üst kapağında, ayak-tutam, ve kuyruk-tutam reflekslerinin kaybı için test her hayvan perfüzyon başlamadan önce bilinçsiz olduğundan emin olmak için.
- Transkardiyal ilk 10 mi 0.1 M PBS ile 16 hayvan serpmek, daha sonra 0.1 M PBS (pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehit 25 mi. Heparin (30 ünite / 20g Hayvan ağırlık) / ml) 10 birim perfüzyon sonuçları geliştirmek küçük kapiler yatak kan pıhtılaşmasını önlemek için (PBS ile ilave edilebilir.
- karın çevresi etrafında deri yoluyla enine kesmek için makas kullanarak arka bacaklarda kapsayan cilt kaldırmak. Arka bacaklarda ve ayaklarda forseps kullanarak geçmiş cildi aşağı soyun.
- kavrayarak ve forseps ile soyulması ile arka bacaklarda yüzeysel kaplamasını çıkarın. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanıyorsanız, 50 ml'lik tüplerde% 4 PFA gecede bütün fareler sonrası düzeltmek. PBS ile üç kez yıkayın.
Not: Sabit farenin 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir. Değilse, bu adımı atlayın ve post-sabitleme hayvanlar olmadan 3,6 adıma geçin. - Mümkün olduğunca sağlam proksimal ve distal tendon tutmak için emin olmak, fare arka bacaklarda EDL kasları 18 parçalara ayır.
- en az 1 saat süre ile (1 x PBS,% 0.5 Triton X-100,% 3 BSA ve% 5 keçi serumu ihtiva eden) blokaj tamponunda EDS kasları inkübe edin.
- tam NMJ innervasyonundan bir pozitif kontrol olarak EDL yaralanmamış karşı taraf Leke. Negatif kontroller, 4 gün sonrası yaralanma, NMJ tamamen Denerve bir zaman noktasında elde edilen bir EDS, hem de yalnızca sekonder antikor ile boyanmış bir EDL içermelidir.
- 1 gün sinir lifi ve synaptotagmin-2 algılamak için uygun floresan etiketli sekonder antikor ile kasları kuluçkaya yatmaktadır. kasları 1x PBS ile üç kez 10 dakika her biri bir zaman yıkayın. Not: Bu adım adım 3.10 ile birlikte yapılabilir. Periferik aksonların floresan proteinleri ifade fareler kullanılarak bu adımı atlayın.
- postsy görselleştirmek içinNMJ naptic bölgesi, 5 ug / ml, en az 2 saat boyunca blokaj tamponu içinde seyreltilmiş Alexa-555 konjuge alfa bungarotoxin kasların inkübe edin. kasları 1x PBS ile üç kez 10 dakika her biri bir zaman yıkayın.
- pozitif yüklü cam slaytlar üzerinde tüm kasları monte etmek için, slayt üzerinde orta montaj dayalı gliserol birkaç damla ekleyin ve lamel ile kaplayın, slayt doğrudan kas yerleştirin. kas düzleştirmek için slayt karşı lamel basın. slayt ve lamel kullanarak laboratuvar mendil çevresinden montaj medya kapalı ıslatın. lamel ve slayt arasındaki kenarları mühür oje sürün.
4. Görüntüleme ve Veri Analizi
- NMJs, görüntü 488, 555 ve 633 nm ışık heyecanlandırmak ve 20X ve 40X hedefleri ile yayılan ışığı yakalamak için donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak EDL kas yapısını analiz etmek.
- Bütün NMJs görselleştirmek için, optik sn maksimum intensite projeksiyon görüntüler oluşturmakleri ayrı NMJ en yüksek görünen bölgeler düşük uzanan 1 mikron 2 aralıklı. piyasada mevcut görüntüleme yazılımı kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyonlar oluşturun.
- 1) Tamamen Denerve = postsinaptik sitesi akson ve AChRs arasında akson ile temas,% 5'ten az ko tamamen yoksun: olarak reinnervation oranlarını belirlemek için, NMJs sınıflandırır. 2) Kısmen innerve = akson kısmen akson ve AChRs arasındaki postsynapse,% 5-95 ko çakışıyor. 3) Tüm innervasyonu = öncesi ve sonrası sinaps arasında neredeyse mükemmel appozisyon, akson ve AChRs arasında% 95'ten fazla ko. görüntüleme düzlemine dik yalan veya tamamen görüntüde görselleştirilemediği NMJs hariç. Not: Tüm bu deneyler, en az 3 hayvan ve hayvan başına 50 NMJs incelenmiştir. Sonuçlar 0,05'ten P değerine sahip bir öğrenci t-testi kullanılarak anlamlı kabul edildi.
- operatörü kör, ayrı bireyler yapabilirCerrahi ve resim analizi. tedavi gruplarının bilgisi olmadan, analizörü NMJ puanlama ile objektif olabilir. Seçenek olarak ise, resim, randomize ve kaynak hayvan bilgisi olmadan analiz için operatöre sunulabilir.
5. Nicel PCR
- izofluran ve servikal dislokasyon kullanarak hayvanların Kurban. Cildi ve 3.3 adıma göre bacak kaslarını örten yüzeyel fasya çıkarın. tibialis anterior ve 3.4 adıma göre EDL kasları parçalara ayır.
- Flaş sıvı nitrojen üzerinde 1.5 ml tüp bütün tibialis anterior ve EDS kasları donma. kısmen sıvı azot içine daldırıldığında, bir ön-soğutulmuş havan içinde tüp ve yerden doku çıkarın. bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz haline dondurulmuş kas öğütün.
- Bir ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifi içine donmuş kas tozu çözmek ve ticari olarak temin edilebilen bir kit üreticisinin I'e göre olan RNA ekstraksiyonu ve genomik DNA giderme gerçekleştirmeknstructions.
- üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilir ters transkriptaz karışımı ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
- qPCR uygun temizlik genler kullanılarak ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirin (malzeme tabloya bakınız). (Malzeme tabloya bakınız) PCR yürütmek için piyasada mevcut olan kantitatif PCR termal döngü kullanın.
- 58 ° C olarak ayarlandı tavlama sıcaklığı. Taq polimeraz / SYBR yeşil karışımı imalatçısının şartnamesine ek bisiklet parametrelerini ayarlamak. Primer özgüllük için test dimer oluşumunu astar 95 ° C ila 65 ° C ila 0.5 ° C artan artar oluşan termal döngü programına bir son erime eğrisi aşamasını içerir.
- Kontrol geni olarak 18S RNA kullanılarak ΔΔCT yöntem 21-2 göreceli mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortak fibula sinir, aynı zamanda, peroneal sinir olarak adlandırılan bacak (Şekil 1A) ön yönüne fibula başının etrafında sallanır popliteal fossada yukarıdaki siyatik sinirin, doğar. yüzeysel ve derin fibula sinir içine dalları birbirine ayak ve ayak dorsifleksör tedarik (anterior tibialis, extensor digitorum longus ve brevis ve ekstansör halluces longus kasları) ve ayağın everters (peroneus kaslar) Orada olmuyor. Bu sinir de ayak ve bacağın alt yarısının lateral sırtına proje duyusal lifleri taşır. Bu motor ve duyu aksonları oluşan, nispeten ince bir yapıdır. Bu sinir dalı öngörülebilir anatomik bir seyir izlemektedir. O gastroknemius kasının (Şekil 1 ve Şekil 2) yanal başının tendonu üzerinde çalışır gibi diz yan, sinir çoğunlukla yüzeyseldir. thKonumu kolayca deri ve fasya (Şekil 1A) zarar sınırlandırılması, küçük bir kesi ile ulaşılabilir istikrarlı bir dönüm noktası olarak hizmet vermektedir olduğunu. siyatik ve tibial sinirlerin karşılaştırıldığında, bu sinirin daha küçük çaplı, mümkün tamamen daha yüzeysel aksonlar koparılması olasılığını azaltarak daha az güç kullanarak tüm aksonlar ezmek için yapar.
Sadece nöronlar 17 sarı floresan protein (YFP) ifade Fareler ortak fibula sinir üzerinde ezilme işlemini optimize etmek ve net bir şekilde rejenere aksonlar görselleştirmek için kullanıldı. Sinir bu site kesi yerden daha erişilebilir olduğundan hedef kaslara en yakın gastroknemius tendon kenarında ezilmiş. Bu site de mümkün, aynı yaş ve cinsiyetteki hayvanlar arasında NMJs yenilenmesini karşılaştırmak için yapım, güvenilir bir anatomik dönüm noktası olarak hizmet vermektedir. ince bir forseps res kullanılarak 5 saniye sinir Sıkıştırmayaralanma yerinde (Şekil 2B), YFP kaybolmasıyla ka bul etmez. Ancak, bağ dokusu ve epinöriumun ikamet eden hücreler kendi orijinal hedefler (Şekil 2B) akson hızlı ve hassas rejenerasyon için bir kanal olarak hizmet veren, bitişik kalır. 70 günlük, dişi farelerde bu yaralanma nöronal soma (Şekil 4B) distal Tüm aksonal segmentlerinin dejenerasyonu neden olmak için yeterlidir.
Bu yaralanma yönteminin güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği belirlemek için, ekstansör digitorum longus (EDL) kas reinnervation incelenmiştir. Bu kas, çeşitli nedenlerden dolayı seçildi: 1) proksimal henüz fiziksel olarak kesi ve sinir hasarı siteleri (Şekil 3A) ayrıştırılır. Bu nedenle, kas, sadece kopmuş canlandıran aksonlardan dejenerasyonu ile değiştirilir. ezilme sitesine olan yakınlığı tekrar innerve olmuş ve kas atroph edilmesi için gerekli zamanı en aza indirirY. 2) Öncelikle yaşlanmaya ve hastalıklara karşı daha duyarlı hızlı tip iskelet kas liflerinden oluşur. 3) Onun NMJs egzersiz ve kalori kısıtlaması ile zayıflatılmış edilebilir hastalıklar ve yaşlanma ilerlemesi sırasında önemli yapısal değişikliklere uğrarlar. 4) Bu canlı görüntüleme ve moleküler manipülasyon (Şekil 3D) için kolayca erişilebilir. 5) kolayca tüm monte mümkün kılan olabilir dört falanks bileşenlerine ayrılabilir ışık mikroskobu (Şekil 3B) kullanarak innerve akson ve onların bağlantıları tamamen görüntü tüm.
Sağ bacağında fibula sinir ezdikten sonra önceden boşalan post-sinaptik siteleri reinnervation motorlu aksonlarında YFP ifade eden üç 70 gün eski dişi farelerde değerlendirildi. Post-sinaptik siteler NAC kas, yüksek bir afinite ile seçici olarak bağlanan alfa-bungarotoxin (BTX), floresan kullanılarak etiketlendi görselleştirilmiştirHRS. 1) Denerve kas lifleri, motor aksonlar tamamen post-sinaptik sitelerden eksik ve akson ve AChRs gözlendi arasında% 5'ten az ko: Kaslar kısmen ya da tamamen bu kriterlere aşağıdaki tekrar innerve olmuş, sinirsiz olarak kabul edildi. 2) Kısmen innerve kas lifleri akson ve AChRs gözlendi arasında post-sinaptik siteler ve% 5-95 ko motor akson eksik appozisyon ancak bazı göre kategorize edildi. 3) tam innerve kas lifleri ise, akson ve AChRs gözlendi arasındaki motor sinir uçlarında ve post-sinaptik siteleri ve% 95'ten fazla ko arasında neredeyse mükemmel appozisyon oldu. onların omurun görüntülenmiştir değildi görüntüleme düzlemi veya tüm NMJ dik yatıyordu Bireysel NMJs sayıları alınmadı. Bu kriterler kullanılarak, hızı ve reinervasyon derece yüksek uyum incelenen tüm fare arasında gözlenmiştir. 4 gün sonrası ezmek at, kaslar tüm hayvanların EXA tamamen Denerve bulunduçıkartılmaktadır (Şekil 4B). Bu bulgu, yukarıda tarif edildiği gibi, 5 saniye için ortak fibula siniri kırma, tüm aksonlar koparmaya yeterli olduğunu göstermektedir. Post-crush 7 gün ile, sinir uçları daha önce boşalan post-sinaptik siteleri (Şekil 4C, 4E-F) tekrar işgal sürecinde idi. Ancak, çoğu kas lifleri hala sadece kısmen innerve bulundu bulundu. Ek gün sonrası ezmek ile, sinir uçları tamamen 12 gün (Şekil 4D, 4E-F) tarafından tekrar innerve olmuş halde bulunmuştur presinaptik siteleri ve NMJs içine ayırt etmek için devam etti. Önemlisi, zaman aynı uzunlukta (Şekil 4E-F) sinirsiz fareler arasında küçük değişkenlik vardı, fibula sinir ezilmesi aynı yaş ve cinsiyetteki hayvanlar arasındaki kasların reinnervation karşılaştırmak için bir tahlil olarak kullanılabileceğini gösteren.
sadakatle hayvanlar arasındaki rejenere NMJs karşılaştırmak yeteneği fırsatlar sunartam olarak bu sinaps onarmak için gerekli her adımda ile ilişkili hücresel özelliklerini anlamak için. reinnervation oranlarını karşılaştırmak için yukarıda kullanılan 70 gün eski farelerden Denerve ve yenileyici NMJs mimarisini incelemek için, NMJs yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi görüntüleri elde edildi. Beklendiği gibi, bu analiz onlar kas liflerini (Şekil 4G-I) reinnervate olarak α-motorlu akson sinir uçlarında meydana gelen bir dizi değişiklik gösterdi. Aksonal büyüme konileri genişletmek ve postsinaptik siteleri (Şekil 4G) ile irtibata olarak şube başlamak görünür. Bu aksonal dalları daha sonra postsinaptik ekibi (Şekil 4H-l) ile biten akson sinirin yakın komple yan yana sonuçlanan postsynapse spesifik bölgeleri üzerinde büyür. Çok gelişimi sırasında bulunanlar s için yarışan birden aksonlar olmak üzere, gözlendi benzer motor sinir uçlarını yenileyici Ek yapısal özellikleriSadece bir akson sonuçlanan ame hedef (Şekil 4H), post-crush 12 gün tek kas lifi innerve. Tüm post-yaralanma (Şekil 4I) gözlenmiştir aşamaları de Ek olarak, post-sinaptik siteler ötesinde akson dalları, filizi olarak anılacaktır. Bu lahanası bile aksonal onarım son aşaması extrajunctional aksonal şube geri çekilmesini içeren düşündüren tam innerve NMJs olarak, oldukça yaygın idi. sinir uçlarında bu bariz değişikliklere rağmen, post-sinaptik siteler kas lifleri tamamen Denerve bulunduğunda sonrası ezmek 4 gün olmak üzere yaralanmamış kaslarda olanlar karşılaştırıldığında tüm aşamalarında sonrası yaralanma çoğunlukla ayırt kalmıştır. AChRs ekstra-sinaptik bölgelere parçalanma ya da önemli bir kayıp ve yeniden dağıtım belirgin belirtisi yoktu. Bu bulgular, güçlü fibula siniri paralizi yöntemi molekül, farmakolojik ve yaşam tarzı müdahaleler t belirlemek ve test etmek için bir tahlil olarak kullanılabileceğini göstermektedirşapka NMJ dahil, sinaps sinir uçlarının tamir teşvik.
son ilerlemelere rağmen, çok az bir gelişme, kas kaynaklı faktörler korumak ve NMJ onarmak için gerekli ve yeterli tanımlama yapılmamıştır. Ortak fibula sinir yaralanması yöntemi reinnervation işleminin belirli aşamalarında ve NMJ tamir potansiyel rolleri ile değiştirilmiş molekülleri tanımlamak için kullanılabilir eğer Bu nedenle istedi. Anapara, iki NMJ ilişkili genlerin ifade analizi bir kanıtı olarak, AChR gama alt birim ve kas-spesifik kinaz, MuSK 18 gerçekleştirildi. Kantitatif PCR ile gösterildiği gibi, bu genler denervasyon takip artar ve NMJs (Şekil 5a-b) tekrar innerve olmuş gibi düştü. Daha önce tamamen Denerve kaslar 19 kullanılarak bildirilen Bu genler, 4 gün sonrası ezmek artış gösterirler. sinirler reinnervate kas lifleri gibi, bu genlerin seviyelerini azaltmak ve RAPIDLY başlangıca geri dönün. incelenen hayvanların arasında, her iki genler için ifadenin desen yenileyici NMJs moleküler ve hücresel değişiklikler arasında sıkı bir korelasyon gösteren, hemen hemen aynıdır. Bu yöntem, bu nedenle NMJ rejenerasyon farklı aşamalarında ile ilişkili moleküler değişiklikleri belirlemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır.
Şekil 1:. Ortak Fibula Sinir Anatomisi (A) şematik siyatik sinirin seyrini ve yüzeysel ve kemik noktalara ilişkin terminal dalları detaylandırma. SCN = Siyatik Sinir, TN = Tibial Sinir, SRN = Süral Sinir, NKP = Ortak Fibula Sinir, SPN = Yüzeysel Fibula Sinir, DPN = Derin Fibula Sinir. İstenilen kesi sitesi gösterilir. Çıkarılmış cilt ile çevresindeki kaslar ile ilgili olarak ortak fibula sinir konumu (B) Diyagram.Bağıl kesi sitesi yatırım fasya örten gösterilmiştir. TA = tibialis anterior kas EDL = extensor digitorum longus kas. (C) Maruz siyatik ve ortak fibula sinir. NKP diz seviyesinde gastroknemius kası (Gn) tendonu üzerinde haçlar. Gösterilen tendonun göre Crush sitesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Ortak Fibula Sinir Crush Cerrahisi (A) ilk kesi sadece uzunluğu birkaç cm gerek. Deri ve yüzeyel fasya nüfuz sonra, kesi biseps femoris ve TA kaslar arasındaki yatan yatırım / derin fasya boyunca devam edilmelidir. (A1) ortak fibula sinir kolayca mikroskopi t olmadan görüntülenmiştirinsizyon (Gn = Gastrocnemius kas) hrough. Kesi (sadece fotoğraf amaçlı gerekli) genişletilmiş ise (A2) ortak fibula sinir ve gastroknemius tendonu kavşak kolaylıkla görülebilir. ezmek dik Gn tendon ve sinir paralel kırmızı çizgi ile işaretlenen yere konulmalıdır. (B) NKP daha kolay bir floresan diseksiyon kapsamında YFP transgenik fareler görüntülenmiştir. (B1) sinir tam bir ezilme yaralanması teyidi için izin ezilme yerinde floresan kaybeder. (B2) tam NKP ezmek hala çıplak göz ve oda aydınlatması ile görüntülendi olabilir. Sinir saydam hale gelecektir. Bu resim aynı zamanda yakındaki doku ve kan damarlarına zarar sınırlandırarak NKP ve epinöriyuma ve üstyapı bozulmadan kalması gerçeğini vurgulamaktadır.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Extensor digitorum longus (EDL) kas anatomisi (A) fare arka bacak kemiklerinin ilişkin EDL 3 boyutlu görüntü. Her bölümü tarafından kontrol edilen basamak dört falanks bölüme ayrılır JAtlasView (B) Parçalı disseke EDL kas kullanarak ve işaretleme oluşturulur. Ikinci rakamı kontrol EDL bölünme sonu plakalı bant innervates (C) YFP derin fibula sinir dalı etiketli. (D) Aksonal dalları ve iletişim siteleri kolayca seçilmiş NMJs tutarlı inceleme için izin tespit edilebilir. Daha büyük bir versiyon o görmek için lütfen buraya tıklayınızBu rakam f.
Şekil 4:. Fibula siniri ezme sonra EDL kasının Aynı Çağ ve NMJs Seks Analizi Hayvanların Arasında reinnervation Benzer Oranları. (A) Post-sinaptik siteler tamamen yaralanmamış farelerde akson tarafından işgal edilmiştir. 4 gün sonrası ezmek At (B), kaslar tamamen Denerve bulunmuştur. (C) Aksonlar 7 gün sonrası ezmek ve (D) kasları reinnervate tamamen 12 gün postsinaptik siteleri yeniden işgal etmeye başlar. (E - F) NMJ yeniden doluluk oranı hayvanlar aynı zaman süresi için sinirsiz arasında neredeyse ayırt edilemez. (G - I) olgunlaşmış presinaptik sitelere yeniden ayırt aksonal sinir uçlarının Temsilcisi görüntüler. sinaps sonrası alanları yeniden işgal izleyenöngörülebilir desen, sonunda tam olarak gelişmesine NMJ region.Similar ötesine geçilmediği sürece postsinaptik siteleri işgal dalları gelişen büyüme konisinin ile başlayan, postsinaptik siteleri başlangıçta birden yeniden büyüyen aksonlar tarafından innerve ancak NMJ tamamen yeniden bir kez tek bir akson kalır. Belirtilen birden fazla akson tarafından ön ve postsinaptik aparatları ve innervasyon arasında tam örtüşme olmadan coşkulu aksonal filizlenme, kısmi innervasyon (H) Örnekler. 70 günlük dişi fareler incelendi; Ölçek Bar = 50 mikron (AD), 20 um (Gl). Hata bar = SEM. N = 3 fareler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: fibula sinir bir yönteme uygun bir yöntem ezmekn Tahlili NMJ Tamir ilgilendim aday genleri belirlemek için (A - B). İki NMJ ilişkili genlerin, AChR gama alt birim ve misk mRNA düzeyi, benzer farelerin TA kaslarda değişmiş zaman aynı uzunlukta için sinirsiz . artan zaman sonrası sinir hasarı, her iki transkript seviyeleri NMJs ilerici reinnervation gösteren histolojik analiz doğrulayan, başlangıca dönen azalır. Her çizgi bir tek farenin temsil eder. Hata bar = teknik çoğaltır ortalamanın standart hatası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda sunulan yöntem nöromüsküler kavşaklar (NMJ) tamir katılan mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunar. o diz yakın gastroknemius tendonu üzerinden geçerken Bu yöntem yaygın fibula siniri ezme içerir. Bir forseps ile sinir sıkışmasının sadece 5 saniye sonra, tam bir dejenerasyonu yaralanması 4 gün sonra belirtilen olduğunu göstermektedir. genç yetişkin farelerde, alfa-motor aksonlar 12 gün yaralanmamış farelere olanlardan ayırt edilemez presinaptik sitelerin Reformasyon sonuçlanan, post-yaralanma 7 gün ekstansör digitorum longus kas (EDL) önceki sinaptik siteleri reinnervate başlar. Buna ek olarak, seçme NMJ ilişkili moleküllerin düzeyleri yakından NMJ innervasyon durumu ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önemlisi, bu hücresel ve moleküler değişiklikler tespit etmek fırsat ve tes sağlayarak, aynı cinsiyet ve yaş (Şekil 5a-b) hayvanlar arasındaki yüksek tekrarlanabilirNMJ onarmak için harekete t faktörleri. çevredeki kasları ve damar az zararla sonuçlanır sadece küçük bir kesi gerektiren, gastroknemius tendonu üzerinden geçerken cerrahi girişimler açısından, ortak fibula sinir dalı son derece erişilebilir.
yenileyici NMJs ile ilişkili hücresel ve moleküler değişiklikleri incelemek için ortak fibula siniri kullanmanın avantajları vardır. gastroknemius tendonu sürekli hedef kaslar aynı yer ve mesafeye ortak fibula sinir yaralama istikrarlı bir anatomik dönüm noktası olarak hizmet vermektedir. Bu güvenilir, aynı yaş ve cinsiyetteki hayvanlar arasındaki kasların akson yenilenme oranı ve reinnervation karşılaştırmak mümkün kılar. Böyle başarısı için kritik adımlar yaralanma sitesi ameliyatları arasında tutarlı olmasını sağlamak dahil, tam sinir ezilme her hayvan elde edilir ve en az hasar çevre yapılara sürdürülür. c innerve kaslar arasındafibula sinir ommon, tibialis anterior (TA) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kas NMJ onarım değerlendirmek için mükemmel hedeflerdir. Bu iki kas öncelikle ciddi yaralanma, yaşlanma ve hastalıklar 5 etkilenen hızlı tip kas lifleri oluşmaktadır. o bütün monte bozulmaları olmadan tüm NMJs görüntüye olabilir çünkü NMJ analiz için, EDL kas özellikle çekici. Aynı zamanda, mümkün olan başka kas lifleri motor akson ve çevreleyen hücreler değişikliklerle NMJs değişiklikler ilişkili kolaylaştırır.
TA ve EDS kaslar yoğun nedeniyle anatomik konumu 20 kas ve NMJ onarım farklı moleküler ve yaşam tarzı müdahalelerin etkisini değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, uzun dönem denervasyon daha zor hücresel ve moleküler CH değerlendirmek için yapım kas liflerini aktive bağışıklık hücrelerini ve uydu hücreleri 12-14 atrofiye kritik fonksiyonu ile genin ekspresyonunu değiştirirözellikle NMJs rejenerasyonunu teşvik etmek için gerekli anges. Burada anlatılan yöntemde fibula sinir sinir genç erişkin farelerde 7 gün içinde sonrası ezmek onları ulaşmasını sağlayan, TA ve EDS kaslara yakın ezilir. Böylece, bu yöntem, kas kütlesinin, TA ve EDS kas kas lifleri atrofiye ilişkili moleküler değişikliklerin kaybını en aza indirmek gerekir.
fibular sinir ezilme protokolü birden çok farklı moda değiştirilebilir. Siniri kesilmiş yaralanması kolaylıkla periferik sinir rejenerasyonu in vivo görüntüleme daha gerçek zamanlı izin ezmek için ikame edilebilir. Bir kesim büyütme için bir engel olarak ölü akson malzemeyi kaldırır ve endonöral tüp içindeki her akson homojen hasarını önler.
Doğru yapıldığında fibula sinir ezilme birkaç ilişkili komplikasyonlar vardır. karşılaştı olabilir Bir problem orijinal NMJ hedefleri reinnervate için sinirin başarısızlığıdır. Bu ACC kaynaklanabiliridental cerrahi sırasında sinir yaralanması kesti. Herhangi bir keskin kenarlar için ince uçlu kırma forseps kontrol ettiğinizden emin olun. Ameliyat sırasında herhangi bir noktada sinir ezmek kalitesi sorgulanabilir, orijinal insizyon daha iyi sinir görselleştirmek için genişletilebilir. Bu yaranın boyutunu artırır ve ek yapılar zarar verebilir iken, doğru fibula siniri belirlenmesi ve tam bir ezilme elde edildi olup olmadığını değerlendirirken yardımcı olabilir.
Burada açıklanan teknik birkaç sınırlaması sahip yapar. Bu hayvanlarda yapılar işlemek için yeterince büyük olan Birincisi, yetişkin farelerde faydalıdır. Yenidoğan ve ergen fareler önemli ölçüde cerrahi artan zorluk, çok daha küçüktür. İkincisi, fibula sinir NMJ rejenerasyon oranları etkileyebilir hedef dokuların denervasyon sonucu, duyusal ve motor aksonlar içerir.
NMJ Amyotrofik lat patolojinin bir odak alanı olarak kabul edilmektedireral skleroz (ALS) ve yaşlanma. Aynı zamanda motor becerileri ödün ve kas kütlesini kaybetmemek için periferik sinirlerin yaralanma aşağıdaki tamir edilmelidir. fibular sinir ezilme yöntemi tespiti ve NMJ tamir önemli rolleri olan moleküllerin test yardımcı olmalıdır. Bir yaklaşımda, bu yöntem, bir RNA sekansı analizi kullanılarak NMJ rejenerasyon farklı aşamalarında önemli rolleri ile mRNA ve mikroRNA profil kullanılabilir. Ayrıca, seçici olarak kişiye ve kas silinir aday genlerin işlevini belirlemek için uygulanabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, statik ve canlı görüntüleme kullanılarak ve sinir NMJ rejenerasyonunu hızlandırmak için dış kaynaklı moleküllerin yeteneğini test etmek için de çok uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
