Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54201
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 4, 4, 4, 1,2
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Abstract

כדי לעצב מהנדס חומרים בהשראת המאפיינים של המוח, אם עבור simulants המכאני או ללימודי התחדשות רקמות, רקמות המוח עצמו חייבים להתאפיין גם בסקאלות אורך וזמן שונה. כמו רקמות ביולוגיות רבות, רקמת המוח מפגינה מבנה מורכב והיררכי. אולם בניגוד למרבית ברקמות האחרות, המוח הוא של נוקשות מכאניות נמוכות מאוד, עם E moduli אלסטי של יאנג על סדר 100s של אבא. קשיחות הנמוכה כאלו יכול להוות אתגרי אפיון ניסיוני של תכונות מכאניות מפתח. הנה, אנחנו מדגימים כמה טכניקות אפיון מכאניות כי הותאמו כדי למדוד את תכונות אלסטיות viscoelastic של התייבשות, חומרים ביולוגיים תואמים כגון רקמת המוח, בסקאלות אורך שונה ושיעורי טעינה. באותו microscale, אנו עורכים ניסויים השרץ-ציות כוח הרפיה באמצעות הזחה מאופשר מיקרוסקופ כוח אטומי. באותו mesosקייל, אנחנו עורכים ניסויים זחים השפעה באמצעות indenter instrumented מבוסס מטוטלת. באותו macroscale, אנו עורכים rheometry צלחת במקביל לכמת את moduli אלסטי הגזירה התדיר תלויה. אנו גם לדון באתגרים ומגבלות המשויכות לכל אמצעי. יחד טכניקות אלה מאפשרות אפיון מעמיק מכני של רקמת המוח, שניתן להשתמש בהם כדי להבין טוב יותר את מבנה המוח ואת מהנדס חומרים-בהשראה ביולוגית.

Introduction

רוב הרכות-רקמות המרכיבות איברים ביולוגיים הן מכאניות מבני מורכב, של קשיחות נמוכה לעומת עצם mineralized או חומרים מהונדסים, ולהציג שאינו ליניארי תלוי זמן עיוות. בהשוואה לרקמות אחרות בגוף, רקמת המוח הוא תואם להפליא, עם E moduli אלסטי על סדר 100s של אבא 1. מוח רקמות מפגין ההטרוגניות מבנית עם אפור ברור interdigitated ואזורי חומר לבנים כי גם נבדלים מבחינה תפקודית. מכניקת רקמת מוח הבנה תסייע בעיצוב של חומרי מודלים חישוביים לחקות את התגובה של המוח במהלך פציעה, להקל חיזוי של ניזק מכאני, ולאפשר הנדסה של אסטרטגיות הגנה. בנוסף, ניתן להשתמש במידע זה כדי לשקול מטרות עיצוב לשחזור רקמות, וכדי להבין טוב יותר שינויים מבניים ברקמת מוח הקשורים למחלות כמו טרשת נפוצה ואוטיזם. Here, אנו מתארים ולהפגין כמה גישות ניסיוניות הזמינים לאפיין את מאפייני viscoelastic של רקמות תואמות מכאני כולל רקמת המוח, על מייקרו, meso-, ו-קשקשי מאקרו.

באותו microscale, ערכנו שרץ-ציות ולאלץ ניסויי הרפיה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) זחה שבהם מופעלת. בדרך כלל, כניסת מאופשר AFM משמשת להעריך את מודולוס האלסטיות (או נוקשות מיידיות) של מדגם 2-4. עם זאת, אותו המכשיר יכול לשמש גם כדי למדוד viscoelastic microscale (הזמן- או שיעור תלוי) נכסי 5-10. העיקרון של ניסויים אלה, שמוצגים באיור 1, הוא להגביה AFM משתלח בדיקה לתוך רקמת המוח, לשמור על גודל שצוין בכוח או עומק הזחה, ולמדוד את השינויים המתאימים לעומק הפנמת כוח, בהתאמה, לאורך זמן. בעזרת נתונים אלה, אנו יכולים לחשב את השרץ compliance J C מודולוס הרפיה G R, בהתאמה.

באותו mesoscale, ערכנו ניסויים זחים השפעה בתנאים שקוע נוזל כי לשמור על המבנה רקמת ורמות לחות, באמצעות nanoindenter instrumented מבוסס מטוטלת. הגדרת הניסוי מתוארת באיור 2. כפי מטוטלת נדנדות במגע עם הרקמות, לחקור עקירה נרשמת כפונקציה של זמן עד מטוטלת הנדנוד מגיעה לנוח בתוך הרקמה. מתוך תנועה תנודתית הרמוני דיכא וכתוצאה מכך של החללית, נוכל לחשב את מקסימום x עומק החדירה המקסימלי, K קיבולת בזבוז אנרגיה, ו- Q גורם פיזור איכות (המתייחס לשיעור בזבוז אנרגיה) של הרקמה 11,12.

באותו macroscale, השתמשנו rheometer צלחת במקביל לכמת את moduli אלסטי תלויה בתדירות גזירה,כינת מודולוס מודולוס G 'ואובדן האחסון G ", של הרקמה. בסוג זה של rheometry, אנחנו מיישמים זן זוויתי הרמוני (מקביל זן גזירה) בשעה אמפליטודות ותדרים ידועים למדוד מומנט reactional (מקביל מאמץ גזירה) , כפי שמוצג באיור 3. מתוך בפיגור המשרעת והפאזה וכתוצאה מכך של המומנט הנמדד ומשתנים גיאומטריים של המערכת, נוכל לחשב G 'ו-ז' "בתדרים היישומית עניין 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים הניסוי אושרו על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של החולים לילדים בבוסטון, ומבצעים את המכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הליכי רכישת רקמות עכבר מוח (עבור כניסת AFM מאופשר משולי השפעה)

  1. הכינו תערובת קטמין / xylazine כדי להרדים את העכברים. שלב 5 מ"ל קטמין (500 מ"ג / מ"ל), 1 מ"ל xylazine (20 מ"ג / מ"ל) ו תמיסת מלח 7 מ"ל של 0.9%.
  2. להזריק עכבר (גזע: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; גיל: p21; מין: זכר או נקבה) עם 7 μl לכל משקל גוף גרם של הפתרון קטמין / xylazine.
  3. לאחר העכבר הוא בהרדמה מלאה, כפי שהוכח על ידי חוסר בתגובת צובט בוהן וזנב, להרדים את העכבר על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים לנתיחה גדולים.
  4. הסר את הגולגולת על ידי חיתוך לאמצע באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. החל מ המוחון, remחתיכות אובות של הגולגולת באמצעות מלקחיים מעוקלים. לאחר הסרת הגולגולת, לחלץ את המוח באמצעות מרית שטוחה להרים את המוח, החל משעת המוחון, ומניח את המוח על צלחת פטרי. הסר את המוח הקטן מהמוח באמצעות סכין גילוח.
  5. אם אתם משתמשים במוח כולו לבדיקות כניסת השפעה על רקמות טריות, מוח העביר לתוך צינור עגול תחתי עם 2 CO מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית למבוגרי קרח והמשך לסעיף 4. אחרת המשך לשלב 1.6 לחיתוך נהלים.
  6. התאם את הגדרות vibratome למהירות של 0.7 מ"מ / sec, תדר הרטט של 70 הרץ, ואת עובי פרוסה של 350 מיקרומטר. הקף את מנת vibratome עם קרח. מניחים טיפה של דבק מגע לצלחת vibratome ו הר המוח כך שניתן לחתוך פרוסות העטרה, עם המוח אוריינטציה לחתוך את הצד הגבי הראשון.
  7. מלא את צלחת vibratome עם פוספט שנאגר מלוח מספיק Dulbecco (DPBS) פשוט להטביע את המוח. הַעֲלָאָההמנה על vibratome כך להב הוא שקוע רק ב DPBS.
  8. לחץ כדי להתחיל לחתוך חלקים במוח עטרה 350 מיקרומטר עבה.
  9. באמצעות מכחולים, כדי למנוע נזק לרקמות, להעביר את פרוסות המוח מהאמבטיה vibratome DPBS ו לתוך צינור עגול תחתית עם מזין בינוני עצמאית 2 CO עבור רקמה עצבית למבוגרים קרח ולבצע מדידות על רקמה טרי בתוך 48 שעות. כדי להתחיל ניסויים זחים מאופשר AFM, המשך לסעיף 3.

2. נוהלי רכישת רקמות חזיר המוח (עבור rheology)

  1. השג מוח חצי חזירי פרוס sagittally בתוך ~ 1 שעות של קרבה מתוך קצב מקומי. מניח את המוח וחצי 2 CO מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית מבוגרת, ולאחסן על קרח.
  2. השתמש סכין גילוח או אזמל לעשות פרוסת מוח עטרה עבה ~ 5 מ"מ ולאחסן CO 2 מזין בינוני עצמאי עבור רקמה עצבית מבוגרת. ודא כי פרוסת surface הוא שטוח ככל האפשר. משתמש בתנועות לרוחב זהירות עם תער / אזמל במהלך חתך.
  3. רקמת מוח חזיר חנות במדיום עצמאי מזין 2 CO עבור רקמה עצבית למבוגרי קרח ולבצע מדידות rheometry (סעיף 5) על רקמות טריות בתוך 48 שעות.

3. כוח אטומי מיקרוסקופ מאופשר הזחה

  1. הכן 60 מ"מ בקוטר פטרי (P60) מנות עם bioadhesive שבלול הנגזרות פי הוראות היצרן.
    1. הכינו מלאי של פתרון חיץ נייטרלי המורכב 0.1 M סודיום ביקרבונט במים סטריליים עם PH אופטימלי של 8.0. מסנן לעקר (0.2 מיקרון) למאגר סודיום ביקרבונט ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. במנדף זרימה למינרית, לערבב פתרון של דבק-ביו 6.25% נבעו-שבלול ו 3.125% NaOH במאגר סודיום ביקרבונט.
    3. 100μl פיפטה של ​​הפתרון ביו-דבק מן 3.1.2 על קצה פיפטה צלחת ושימוש 60 מ"מ בקוטר פטרי (P60) להפיץ solution לעיגול בקוטר 3-5 ס"מ.
    4. השאירו P60 מנות חשפו ברדס זרימה למינרית ולתת להתייבש פתרון (~ 30 דקות). מנות לשטוף 1x עם PBS 2x עם מים סטריליים. בואו אוויר יבש מנות ברדס זרימה למינרית ולאחסן בשקית פלסטיק אטומה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
  2. כייל את AFM מדגם מוח הגדרה ב AFM.
    הערה: פעל בהתאם להוראות כיול AFM לפי היצרן.
    1. בזהירות לטעון חללית AFM עם קבוע קפיץ נומינלי של 0.03 N / m וחרוז בורוסיליקט 20 מיקרומטר בקוטר לתוך מחזיק בדיקה.
    2. כייל את קבוע הקפיץ ורגישות מנוף אופטי ההפוך (InvOLS) של שלוחת AFM בשיטת מנגינת תרמית 15,16.
      הערה: לאחר קבוע הקפיץ עבור חללית AFM מחושב, זה צריך להישאר קבוע עם שימוש חוזר. עם זאת, InvOLS השלוחה יהיה צורך recalibrated בכל פעם הליזר משורטט השלוחה. בנוסף, כיולצריכה להתבצע נגד צו מצע כמה גודל נוקשה יותר השלוחה, כגון פוליסטירן.
    3. הפעל את החימום הבמה רכוב והטמפרטורה מוגדרת 37 ° C.
    4. הר פרוסת המוח על מנות P60 המוכנים בסעיף 3.1.
      1. בעדינות יוצקת פרוס מוח עבה 350 מיקרומטר, כמו גם מדיום העצמאי CO 2 מהבקבוק התחתי העגול לתוך צלחת P60 מצופית bioadhesive הנגזרות השבלול.
      2. על ידי הטיית צלחת P60 בעדינות, מקם את פרוסת המוח במרכז המנה. במידת צורך, פיפטה לאט בינוני מתוך pipetter ידני נפרש פרוסת מוח אשר מקופלת על על עצמו או יותר מיקום פרוסת המוח במרכז המנה.
      3. מוציאים בזהירות התקשורת עודף באמצעות pipetter P1000 (לא להשתמש ואקום).
      4. מניח כיסוי על צלחת P60 ולתת פרוסת המוח לדבוק במשך 20 דקות.
    5. הסר את ראש AFM, למקם את פרוסת המוח הרכוב P60צלחת על הבמה AFM, ולהוסיף ~ 2 מ"ל מראש חימם 2 CO בינוני עצמאית.
    6. בזהירות להוסיף טיפה של תקשורת על חללית AFM כדי להגן עליו מפני שבירה בשל שטח מתח כאשר הוא הוריד לתוך תקשורתי סביב פרוסת המוח.
    7. למקם את ראש AFM לבמה, ולהתחיל הרכנת הראש עד שהוא שקוע לתוך התקשורת.
    8. באמצעות מצלמת CCD-מבט מלמעלה, למקם מחדש את לייזר על גבי שלוחה.
      הערה: היישור של הליזר על השלוחה תהיה השתנתה מעט בשל השוני מקדם שבירה של אוויר ובינוני.
    9. מתן 5 דקות עבור השלוחה להסתגל שאני שקוע בתוך נוזל חם, ולאחר מכן לאפס את היישור במראה כדי סטייה חינם של 0 V.
    10. הפעל ספקטרום תרמית על חללית AFM פי הוראות היצרן 16. השתמש בכושר שיא התרמית הראשון מחדש לחשב את InvOLS של חללית AFM בתקשורת.
    11. באמצעות מיקרוסקופ אופטי,להזיז את הבמה המדגמת כך את האזור של עניין המוח מתחת חללית AFM.
      הערה: כפיס המוח יופיע כהה כפי שהוא אטום יותר מאשר החומר האפור שמסביב. קליפת המוח היא עדיפה על כפיס המוח.
    12. אפס את היישור במראה כדי סטייה חינם של 0 V.
    13. על הסכום ומטר הסטה בתוכנת AFM, לחץ "מעורבות" כדי להעסיק את ראש AFM.
    14. באמצעות עמדת החיוג על ראש AFM, מנמיך את הראש עד קשר בין השלוחה ואת המדגם הוא עשה.
  3. (אופציונאלי) אם תרצה, למדוד את מודולוס האלסטיות של המדגם, כפי שתואר לעיל 4,17,18.
  4. ניסויי ציות שרץ.
    1. לבנות פונקצית כוח ליישם בעורך הפונקציה של התוכנה. פונקצית הכח מורכבת רמפת 0.1 שניות עד לנקודת סט של 5 ננ והחזק אותו במשך 20 שניות, ואחריו שניות 1 כבש לכוח היישומית 0 NN.
      1. על הזחה Master Pאנל, לפי שיטת הכניסה, בחר "Load" עבור Indenter מצב; "N" עבור יחידות; ו "עורך פונקציה" לתפקוד Indenter.
      2. בעורך הפונקציה, על מגזר לוח Parms, צור פלח פונקצית כוח ליישם שמתחיל ב 0 NN, ומסתיים 5 NN, עם זמן של 0.1 שניות. לחץ על "הוספה ->".
      3. במקטע הבא, בחר להתחיל 5 NN, קץ 5 NN, וזמן עד 20 שניות. לחץ "כנס ->."
      4. במקטע האחרון, קבע מתחילים 5 NN, קץ 0 NN, וזמן 1 שניות. לחץ על "לצייר" ולסגור את חלון עורך פונקציה.
    2. על חיל Tab של לוח ההורים, לבדוק "רמפת indenter לאחר הדק" ולהגדיר את פונקצית הכח המופעל על הדק לאחר שהגיע לנקודת הפעלה של 0.1 V.
    3. לחץ "יחיד חיל" על החלק התחתון של חיל Tab של לוח ההורים, אשר יפעיל את פונקצית הכח להחיל בנוי לעמידת שרץ.
    4. לאחרכניסת כוח אחד הוא סיים, להעלות את ראש AFM כך שזה מתוך קשר עם המדגם מחדש ולאחר מכן להעסיק את הראש מחדש אפס סטייה בחינם.
    5. למקם את הבמה מדגם לאתר תחום עניין חדש, ולהפחית את הראש AFM ליצור קשר. הערה: ראש AFM חייב להיות חזר בו מן השטח מדגם כאשר הבמה מדגם מועבר. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום ניזק שלוחת AFM העדינה.
    6. חזרו על שלבי 3.4.3-3.4.5 עד כמות הנתונים רצויה נאספה.
  5. ניסויי הרפית כוח.
    1. לבנות פונקצית כניסה שיושמה עורך הפונקציה של התוכנה. פונקצית הכניסה מורכבת רמפת 0.1 שניות עד לנקודת סט של 3 מיקרומטר והחזק אותו במשך 20 שניות, ואחריו שניות 1 כבש לעומק זח של 0 מיקרומטר.
      1. בלוח מאסטר הזחה, לפי שיטת הכניסה, בחר "הזחה" עבור Indenter מצב; "מ" עבור יחידות; ו "; עורך פונקציה "לתפקוד Indenter.
      2. בעורך הפונקציה, על מגזר לוח Parms, צור פלח פונקצית כוח ליישם שמתחיל ב 0 מיקרומטר, ומסתיים 3 מיקרומטר, עם זמן של 0.1 שניות. לחץ על "הוספה ->".
      3. במקטע הבא, בחר להתחיל 3 מיקרומטר, קץ 3 מיקרומטר, וזמן עד 20 שניות. לחץ "כנס ->."
      4. במקטע האחרון, קבע מתחילים 3 מיקרומטר, קץ 0 מיקרומטר, וזמן 1 שניות. לחץ על "לצייר" ולסגור את חלון עורך פונקציה.
    2. על חיל Tab של לוח ההורים, לבדוק "רמפת indenter לאחר הדק" ולהגדיר את פונקצית הכח המופעל על הדק לאחר שהגיע לנקודת הפעלה של 0.1 V.
    3. לחץ "יחיד חיל" על החלק התחתון של חיל Tab של לוח ההורים, אשר יפעיל את הפונקציה כניסה להחיל נבנתה לרגיעת כוח.
    4. לאחר כניסת כוח אחד הוא סיים, להעלות את ראש AFM כך שזהמתוך קשר עם המדגם ולאחר מכן לשוב וללבוש את ראש הסטייה מחדש אפס.
    5. מיקום מחדש את הבמה כדי לאתר שטח חדש של עניין, ולהפחית את הראש כדי ליצור קשר.
    6. חזור על שלבי 5.3-5.5 עד כמות הנתונים רצויה נאספה.
  6. להסיק ניסויים וניקוי.
    1. לאחר שסיים ניסויים, להעלות את ראש AFM ולהסירו מן המדגם.
    2. השתמש רקמות במעבדה כדי להסיר עודפי נוזלים בזהירות בלי לגעת השלוחה.
    3. בזהירות לנקות את בעל שלוחה AFM באמצעות כמות קטנה של אתנול. אין לחשוף את האלקטרוניקה העדינה על בעל שלוחת אתנול. הסר השלוחה ומקום AFM במכל אחסון.
    4. השלך את דגימת רקמות המוח על ידי ביצוע פרוטוקולי בטיחות ביולוגי מתאימים.
  7. באמצעות MATLAB, לחשב תאימות השרץ ולאלץ moduli הרפיה שימוש בגיאומטריה indenter, על פי הפתרון הנובע ידי לי Radok 1960 19.
    1. חישוב הכח F ועומק זח משוואה 1 מנתונים על z עמדת שלוחה, סטיית ד, ו קבוע קפיץ, ג k

      משוואה 1 ו משוואה 1 .
    2. אתר את נקודת המגע לאורך עקומת הכניסה באמצעות האלגוריתם המתואר לין et al. 20.
    3. גדר חלון עניין לניתוח נתונים. החלון של עניין הוא האזור בו גם כוח (לתאימות השרץ) או עומק ההזחה (לרגיעה כוח) נשמר לפי שווי setpoint (כלומר, אזור 3 כפי שמוצג באיור 1C, D).
    4. בניסויי ציות שרץ, לחשב את מודולוס ציות השרץ הניסיון, ג J (t), בתגובת עומס צעדn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,201 / 54201eq4.jpg "/>:
      משוואה 1 ,
      כאשר H (t) הוא פונקצית צעד Heavyside ו R הוא הרדיוס של החללית הכדורית.
    5. בניסויי הרפית כוח, לחשב את מודולוס הרפית כוח הניסיוני, G R (t), בתגובה לעומק זחת צעד משוואה 1 :
      משוואה 1 .

4. השפעת הזחה

  1. כייל את nanoindenter המאובזרת ולהתאים הגדרות ברירת מחדל כדי לאפשר ניסויי השפעה דינמיים על רקמות מוח hydrated פי הוראות היצרן.
    1. הר בדיקה כדורית ידי החלקתה על המטוטלת באמצעות פינצטה.
    2. מדביקי מדגם קוורץ התמזג על הפרסום המדגם, אשר מוברג לתוך translationalשלב.
    3. לכו לתפריט כיול ובחר "נוזל התא." פעל על פי ההוראות של התוכנה כדי ליצור קשר עם מדגם קוורץ התמזגו.
    4. בחר "רגילה" עבור סוג Indenter ולהשתמש ערך ברירת המחדל של 0.05 Mn עבור טען Indenter. לחץ על "המשך" כדי לבצע את הכיול עבור תצורת indenter הנורמלית.
    5. הזז את הבמה מדגם בחזרה על ידי 5 מ"מ לפחות. הר זרוע המנוף, המאפשרת הבדיקה כדי להיות וריד לתוך נוזל התא, וחזור על כיול נוזל תא בתצורה החדשה על ידי בחירה "נוזל תא" עבור סוג Indenter. לחץ על "המשך" כדי לקבל את פקטור כיול נוזל התא.
    6. הפעל את אפשרות תוכנת נוזל תא על ידי הלחיצה על תפריט הניסוי ובחירה "אפשרויות מיוחדות." השתמש ערך הכיול האחרון.
    7. להגדיל את מרווח צלחת קבלים כמו זה יוביל עד לעומק מדידים מרבי גדול, אשר הכרחי כאשר בודקים גדולחומרים תואמים hly.
      1. בתפריט המערכת, בחר "הגדרות מוגנות ללא" ו "מכונת פרמטרים" כדי לשנות את שיעור עומס בדיקת מטוטלת, שיעור עומס אפס, רמפת מתנה לקזז 0.5 MN / sec, 0.1 MN / sec, ו -3 V, בהתאמה.
      2. עם מפתח ברגים, להפוך את שלושת אגוזים שולט כיוון השעון מרווח צלחת קבלים במרווחים קטנים.
      3. לאחר כל תור שלם בכיוון השעון, בחר "התאמת תיבת גשר" תחת תפריט תחזוקה ולקבל מבחן מטוטלת טוב, אשר יחייב הזזת משקל נגד מאזן הרחק המטוטלת.
      4. חזור על שלבים 4.1.7.2-4.1.7.3 עד כיול עומק משוער קורא ערך של 70,000 ננומטר / V ומעלה.
    8. מקם עצירת מגבלה חדשה בתחתית המטוטלת שניתן להדליק ולכבות באמצעות ספק כוח. לחזור בו תחנת הגבול המקורית יושבת מאחורי המטוטלת כדי להסיר מכשול פוטנציאלי של המטוטלת ולאפשר גבוהיםמירויות השפעה כמו גם במעמקי חדירה גבוהים לתוך דגימות תואמות.
    9. אפשר הקבינט כדי להגיע לשיווי משקל תרמי (לוקח כ 1 שעה).
    10. בעוד הקבינט equilibrates, לחזור לתפריט המערכת ובחר "הגדרות מוגנות ללא" ו "פרמטרים של מכונה." הגדר את כיול העומק (dcal) קשר המהיר עד 1 מיקרומטר / sec, מהירות קשר הזחה העיקרית עד 3 מיקרומטר / sec, ואת מהירות קשר עומס אולטרה הנמוכה עד 1 מיקרומטר / sec.
    11. בתפריט הכיול, בצע כיול עומק סטנדרטי תצורה חדשה זו.
    12. הפעל את אספקת החשמל של סולנואיד ולהגדיר אותו ל -10 V. עבור לתפריט ניסוי ובחר "אימפקט" ו "התאם אימפולס תזוזה." פעל בהתאם להוראות תוכנה (הנחיות אוטומטיות) כדי לכייל את מרחק התנופה של המטוטלת.
  2. הר רקמת מוח עכבר בתא הנוזלי.
    1. לאחר קצירת המוח כולו מן STEp 1.5, לאחסן אותו מיד ב- CO 2 מזין בינוני עצמאית למדיה רקמה עצבית למבוגרים קרח.
    2. כאשר ההתקנה הזחה השפעה תושלם במלואה, בזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי יחד עם 2 CO בינוני עצמאית. פורסים את המוח לתוך 6 מ"מ חלקים עבים עם משטחים שטוחים משני צדי.
    3. ציית את רקמת פרוס לתפקיד מדגם אלומיניום עם שכבה דקה של דבק cyanoacrylate.
    4. חלק את התא הנזיל בהיקף של למעלה O-Ring השני על הפרסום המדגם, ולמלא את נוזל התא עם 5 מיליליטר של מדיום עצמאי 2 CO לטבול את הרקמה מלאה. פירסום המדגם מכן הוא רכוב בזהירות על הבמה translational בתוך nanoindenter המאובזרת.
  3. למדוד את תגובת ההשפעה של רקמת המוח.
    1. במידת הצורך, הסר את החללית כדורית ולהחליף אותו עם החללית של עניין מבלי להסיר את זרוע המנוף.
    2. בתפריט המערכת, בחר "ללא מוגןהגדרות "ו" פרמטרים של מכונה. "שנו את מהירות קשר ההשפעה העיקרית עד 5 מיקרומטר / sec.
    3. עם מדגם אמבטיה נמוכה (כיוון -Z) ורחוק המטוטלת (+ x כיוון), לנוע בכיוון -x עד הקצה על זרוע המנוף ממוקם כראוי מעל האמבט. צעד בכיוון + Z עד הקצה הוא שקוע לחלוטין בתוך האמבטיה מול המדגם.
    4. באמצעות חלון מדגם שליטת במה, ליצור קשר בזהירות, ואחר כך שוב בשלב ממשטח המדגם בכ -30 מיקרומטר.
    5. בתפריט הניסוי, לחץ על "שפעת" כדי להגדיר ניסוי השפעה. בחר טעינה ספציפי דחף שיתייחס ישירות מהירות ההשפעה שמתקבל על סמך כיול מרחק התנופה. הפעל את הניסוי המתוכנן.
    6. כאשר המטוטלת נעה הלוך שטח המדגם ממשיך לנוע למישור המדידה, סובב את המתג להפסיק גבול התחתון כבוי.
    7. שים לב כמו מטוטלת נדנדות forwARD להשפיע על המדגם. העקירה של החללית כפונקציה של זמן תתועד על ידי התוכנה.
    8. כשחלון xyz הבמה מופיע, סובב את המתג להפסיק להגביל מחדש.
    9. חזור על שלבים 3.4-3.8 כדי לבדוק כמה מטענים במקומות שונים לפי הצורך.
  4. ניתוח העקירה רכשה לעומת זמן תגובה של המטוטלת באמצעות סקריפטים MATLAB מותאמים אישית כדי לקבוע את מקסימום x עומק חדירה המקסימאלי, K קיבולת בזבוז אנרגיה, ו- Q גורם איכות פיזור. 11
    1. לכו לתפריט הניתוח ולייצא את הנתונים בקובץ טקסט.
    2. קח את נגזרת הזמן של פרופיל העקירה להשיג מהירות כפונקציה של זמן. גדר אפס תזוזה כמו O1 x נקודת קשר.
      הערה: נ מהירות השפעה היא המהירות המרבית הערב לפנות מקסימום x תואם את העיוות שבו החללית.מהירות הפוחתת ראשונה לאפס. x O2, שהוא שווה ערך ל x r, הוא המיקום הנדרש כדי לחדש את הקבלה במגע עם המדגם המעווה במחזור הבא. V המהיר ריבאונד החוצה הוא המהירות ב r x העקירה.
    3. גדר K (unitless) כאנרגיה הנצרכת על ידי המדגם מתוקנן לפי סכום האנרגיות המדגמות התאוששו התפוגגו במהלך מחזור ההשפעה הראשון. חישוב K מבוסס על המאפיינים הפנימיים של המטוטלת 21 (כגון קשיחות סיבוב ריסון), x O1, x max, x r, v ב, ומתוך נ.
      הערה: לקבלת מידע נוסף, ניתן להתייעץ העבודה של Kalcioglu ואח ', 2011..
    4. מאז עקירה ניתן לתאר תנועה תנודתית הרמונית דכאה, להתאים פונקצית דעיכה מעריכית אל המקסימום של דיסמיקום לעומת עקומת זמן.
    5. חישוב ש (unitless) כמו π כפול מספר מחזורים נדרש עבור משרעת התנודה להקטין בפקטור של e. ערך Q גבוה יותר פירושו שיעור פיזור אנרגיה נמוך יותר.

5. Rheology

  1. הגדרה וכיול של rheometer לפי הוראות היצרן.
    1. אתחל את rheometer ידי פתיחת החלונית מכשיר / שליטה. בכרטיסיית לוח בקרה, לחץ על "לאתחל".
    2. הר צלחת מדידה 25 מ"מ בקוטר (PP25) ומערכת תרמית.
    3. (אופציונאלי) כדי להפחית פליטה בין לוחות rheometer ואת הרקמות, לגזור פרוסות נייר זכוכית דבק התואמות את הצורה של צלחת rheometer העליונה לדבוק נייר הזכוכית לצלחת העליונה ותחתונה.
    4. הפוך על קשר בין הצלחת העליונה ותחתונה על ידי לחיצה על "להגדיר אפס פער" בלוח הבקרה.
    5. אפס מתמר כוח נורמלי על ידי CLIcking "לאפס כוח נורמלי."
    6. לבצע בדיקת אינרציה ידי פתיחת לשונית השירות בלוח הבקרה, לחיצה על "מערכת מדידה," ולאחר מכן לחיצה על "מבחן אינרציה". רשום את האינרציה הישנה וחדשה. ודא כי האינרציה היא בתוך מגבלת המותר עבור החללית, כמפורט על ידי היצרן.
  2. טען מדגם לתוך rheometer.
    1. לאחר קצירת רקמות חיתוך קטע העטרה של המוח חזיר ~ 5 מ"מ עובי, ולאחסן אותו על הקרח ב- CO 2 בינוני עצמאית.
    2. מניח את המוח בין שתי הצלחות. הסר טיפות מים גדולות מן המשטח העליון והתחתון של המדגם כדי למנוע החלקה, אבל לא לייבש את המדגם.
    3. לאט לאט להוריד את צלחת המדידה עד שהצליח במגע מלא עם המשטח העליון של הרקמה ואת הכח הנורמלי הנמדד עקבי 0.01 Mn לאחר תקופת רגיעה 5-10 דקות.
      1. בלוח הבקרה, זן לגבהים נמוכים ברציפות in בתיבת מדידת המיקום ולוחץ על "מדידת מיקום" להנמיך את צלחת המדידה לאט.
      2. כאשר בתוך מילימטר של מגע עם הרקמות, מנמיך את צלחת המדידה במרווחי 0.1 מ"מ עד שהצלחת מלאה במגע עם המשטח העליון של הרקמה. ודא כי הכח הנמדד-הנורמלי הוא עקבי 0.01 Mn לאחר תקופת רגיעה 5-10 דקות.
      3. רשום את הכח הנורמלי המדוד הראשוני. מדידות חוזרות יש לנקוט באותו מדגיש / זנים דחיסה.
    4. חתוך את המדגם עם להב פלסטיק אם המדגם עולה על הקוטר של הצלחת. פיפטה בנפח קטן (~ 1-2 מ"ל) של התקשורת על הקצוות של המדגם כדי ללחלח את הרקמה.
    5. (אופציונלי) מנמיכים את מכסה המנוע תרמית. בלוח הבקרה, להגדיר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס ולחץ על "להגדיר".
  3. בצעו לטאטא המשרעת להקים בטווח viscoelastic ליניארי של החומר (כלומר, גזירהזנים שבו G 'ו-ז' 'הם קבועים) בתדרים של עניין (למשל, 1 rad / sec).
    1. בחר "קובץ / חדש". בכרטיסייה ג'ל בחר "לטאטא Amplitude: טווח LVE." בחר חלון ולחץ על "מדידה 1:. לטאטא משרעת" לחץ לחיצה כפולה על תיבת התנודה. הזן את זן התחלתי וסופי (למשל, 0.01 כדי 105), תדירות (למשל, 1 rad / sec) ואת מספר הנקודות לכל עשור (למשל, 6 נקודות / דצמבר). בחר "אישור" ולחץ להתחיל. "
    2. חזור על הליך זה במשך כמה פרוסות עם ניסויים חוזרים ונשנים על מנת להבטיח עקביות של הטווח ליניארי אלסטי. הדחיסה הצירית של המדגם צריכה להישאר קבועה בין דגימות.
  4. לנהל תדר מטאטא של הרקמה זן בטווח viscoelastic ליניארי של רקמות (למשל, 1% זן) 22, ובבית טווח תדרים של עניין (למשל, 0.1-100 rad / sec).
    1. נְקִישָׁה "קובץ / חדש" תחת לשונית ג'ל בוחר "תדר לטאטא." לחץ חלון / מדידה 1: לטאטא תדר. לחץ לחיצה כפולה על תיבת התנודה. הזן את טווח התדרים (למשל, 0.1 כדי 100 rad / sec), זן (למשל, 1% זן) ומספר נקודות לעשור (למשל, 6 נקודות / דצמבר). "בסדר" בחר ולחץ על "התחל" כדי ליזום את לטאטא תדירות.
  5. לטאטא תדירות חזור (שלב 5.4) ב כפילויות או triplicates.
  6. בדוק את הנתונים המחושבים וייצא אוטומטית על ידי rheometer: G 'ו-ז' "כפונקציה של (לטאטא תדר) תדירות או זן גזירה (לטאטא משרעת) הערה:. G" ו- G '' מחושבים מתוך (מקסימום של המדגם T reactional משרעת מומנט) '0, וזווית עקירת סיבוב (או זווית הטיה) משוואה 1 בפיגור, והפאזהמשוואה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,201 / 54201eq9.jpg "/>, תשובת מדגם לזן תנודתית יישומית (איור 3):
    משוואה 1
    משוואה 1
    כאשר R ו- H הוא הרדיוס וגובה של המדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מראה הפנמת כוח נציג לעומת תגובות זמן (איור 4 ב ', ה) לתאימות שרץ ולאלץ ניסויי הרפיה, בהתחשב כוח שימושי או עומק הזחה (איור 4 א, ​​ד), בהתאמה. בעזרת נתונים אלה ואת הגיאומטריה של המערכת, ג J השרץ הציות (t) ולאלץ הרפיה moduli G R (t) ניתן לחשב עבור אזורים שונים של המוח (איור 4C, F). בעוד שמחקרים קודמים הראו הבדל בין moduli אלסטי של אזורים השונים של המוח 23, מאפייני viscoelastic נמדדו בדרך זו עבור פרוסות רקמת מוח עכבר לא מראה וריאציה אזורית בתוך פרוסת רקמה נתונה.

כניסת השפעה מודדת את התכונות המכאניות של הרקמות בשיעורים גבוהים של במרחב ובזמן Concentraטעינת טד. התוצאות של ניסויים אלה מספקים מידע על אופן שבו הרקמות מתפוגגות אנרגיה בתגובה לפציעה טראומטית או עיוות מכוונת הקשורים לניתוח. הצעת תנודתית דכאה של חללית זחת השפעה (תרשים 2B) מספק מידע כדי לחשב את מקסימום x עומק חדירה המקסימאלי (איור 5 א), K קיבולת בזבוז אנרגיה (איור 5 ב) ו- Q שיעור פיזור אנרגיה (איור 5 ג) של הרקמה. עומק חדירה מודד את התנגדות דפורמציה, אשר עולים בקנה אחד החזקה עם מודולוס האלסטיות של הרקמות: רקמות נוקשות להפגין מעמקי חדירה קטנים עבור מהירות השפעה נתונה והשפעת אנרגיה. קיבולת אנרגית פיזור היא מדד unitless של המידה שבה הרקמות מתפוגגות אנרגית ההשפעה במהלך מחזור ההשפעה הראשון. פיזור אמצעי גורם איכות כמה מחזורים להתרחש לפני תנודות מ- impact הם דיכא באופן משמעותי - זה נוגע ישירות שיעור פיזור האנרגיה, אם כי זה לא בא לידי ביטוי ביחידות של זמן. שלוש השפעה אלה פרמטרי תגובה ניתן לכמת במהירויות השפעה שונות, אשר מספקת אמצעי ללמוד את המאפיינים תלויי שיעור של הרקמה.

איור 6 מציג macroscale G 'ו-ז' "עבור תדרים החל 0.1 rad / sec 50 rad / sec. מודולוס אחסון כמעט בסדר גודל גדול יותר מודולוס אובדן בתדרים נמוכים. עם זאת, היחס בין moduli אחסון ואובדן יורד ככל שתדר. זה מצביע על כך תכונות אלסטיות להשתלט על ההתנהגות של רקמת המוח, מאז מודולוס אחסון מתאר תכונות אלסטיות מודולוס אובדן מתאר הפסדים צמיגים של החומר. בתדר גבוה טעינת דיו, moduli האחסון והאובדן יהיה שווה, המציין את הנקודה שבההחומר מתחיל לזרום (כלומר, נכסים צמיגים להשתלט על ההתנהגות של המדגם). עבור המקרה של רקמת המוח נמדד כפי שמודגם להלן, מגבלות פיסיות של המכשור אינן מאפשרות לנו למדוד תכונות חומר בתדרים גבוהים יותר.

איור 1
איור 1. איור של ציות שרץ מאופשר AFM ולאלץ ניסויי הרפיה. (א) כניסת מאופשר AFM מתנהל באמצעות שלוחה גמישה עם חרוז כדורי של ננו רדיוס microscale המצורף-הקצה החופשי. (ב) במהלך הכניסה, סטיה שלוחה נמדד באמצעות לייזר המוחזר מן הקצה של שלוחה ואל פוטודיודה. (ג) ניסויי הרפית חיל נערכים ע"י הפנמת השלוחה עד לעומק שימושי מתמיד, בעוד ריקבון הכח עם מילהימור לעת נמדד. (ד) Creep ציות מודד את עומק כניסת השינוי של השלוחה עם כוח ליישם קבוע. (ג) ו- (ד) כבר מחולק לחמישה אזורים (טקסט ירוק): (1) גישה של חללית AFM אל פני השטח המדגם, (2) לתקשר עם מדגם רמפה עד זחת setpoint / כוח, (3) תחזוקה של הכניסה / כוח setpoint, (4) כבש ו (5) הכחשה של חללית AFM מפני השטח המדגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור איור 2. ניסויים זחים השפעה. (א) סכמטי של זחת השפעה, הממחיש את היכולת לבצע ניסויים בתנאי hydrated מלא. (ב) Repres פרופיל עקירה החללית entative כפונקציה של הזמן שנאסף פרוסה במוח עכבר ופרופיל המהירות המקבילה. עקירה נמדדת מפתח ופרמטרים מהירים מחושבים לכמת פיזור אנרגיה מסומנת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור איור 3. ניסויי rheometer הצלחת במקביל. (א) סכמטי של ניסוי rheometer צלחת במקביל והגדרות הקשורות זן גזירה תנודתית שימושי. (ב) נציג להחיל לכאביה לחץ שנוצר כפונקציה של זמן. מודולוס אחסון גזירה G 'ו-ז' מודולוס אובדן גזירה "מחושבים באמצעות משרעת המתח54,201 / 54201eq12.jpg "/>, 'T משרעת מומנט 0, בפיגור שלב משוואה 1 החללית, מדגם רדיוס R, מדגם בגובה h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. נציג נתונים מקיום השרץ ולאלץ ניסויים הרפיה. (A, B) מהנתונים הגולמיים באיור 1, אזור של אינטרס מוגדר לתאימות השרץ כזמן שבו מיושם כוח נשאר קבוע (א) בעוד עומק ההזחה נמדדת (B). הבלעה ב (א) מראה נתונים מניסוי מוצלח שבו piezo AFM לא הצליחכדי לשמור על הכח המופעל ואת ההבלעה ב (ב) מציג את תגובת הכניסה המתאימה, שהוא איכותי בדומה לנתונים של ניסוי מוצלח שמוצג (ב '). (ג) עם נתוני הכח המופעל, הזחה נמדדה, וידע של הגיאומטריה של החללית, זחילה לעמידה J ג (t) מחושב. (D, E) ב הרפית כוח, עומק הזחה מוחזק קבוע (D), בעוד כוח לעומת הזמן נמדד (E). (F) באמצעות נתונים אלה, כוח הרפיה מודולוס G R (t) ניתן לחשב. תאימות Creep ולאלץ ניסויי הרפיה יכולים להתנהל על אזורים שונים אנטומית של המוח, כגון כפיס המוח (אדום) ואת הקליפה (הכחול). הנתונים (C, F) הם ממוצע של מדידות מ n = 5 עכברים. אנא Click כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. נציגי נתונים מניסויים זחים השפעה. מקסימום x עומק חדירה מקסימאלי, K קיבולת בזבוז אנרגיה, ו- Q גורם פיזור איכות רקמת מוח עכבר מחושב מפרופילי עקירת גלם המתקבלים במהירויות השפעה שונות. נתונים מיוצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 18 מדידות לשכפל לכל נקודה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. נציג נתונים מניסויים rheometry. חפצים G 'ואובדן G '' moduli של פרוסות עטרה של מוח חזיר. Tanδ כמות מחושבת כיחס בין הפסד מודולוס אחסון. נתונים מיוצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 4 מדידות לשכפל לכל נקודה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקה כל המוצג במאמר זה מודד היבטים שונים של תכונות מכניות של המוח רקמות. תאימות זחילה ו moduli הרפית המתח הם מידה של תכונות מכאניות תלוי זמן. Moduli האחסון והאובדן מייצג תכונות מכאניות תלוי שיעור. כניסת שפעת גם מודדת תכונות מכאניות תלוי מקום, אבל בהקשר של פיזור אנרגיה. כאשר ואפיון תכונות מכניות רקמות, הן הזחה AFM מאופשר ו rheology משמשים שיטות נפוצות. כניסת AFM מאופשר חשובה מאוד מכיוון בנוסף לספק תכונות חומר תלוי זמן, פרמטרים ניסיוניים שונים ניתן להשתמש כדי למדוד תא מודולוס אלסטיות רקמת 4 ואפילו תדירות נכסים תלויים 24, כפי שתוארו לעיל. עם זאת, פרשנות מדויקת של הנתונים והעיצוב של ניסויים יכולה להיות מאתגרת עבור רקמות תואמות, התייבשות. בעוד אמצעי rheometry בתפזורת נאיםקשרים של הרקמה, זחת מאופשר AFM בוחן microscale כרכים רלוונטיים microenvironment של התאים. כניסת שפעת מספקת אמצעי לכמת באופן ספציפי כיצד חומר ומעווה בהקשר של עומס השפעה מרוכז, דינמי, וזה שימושי ביישומים כמו ללמוד פגיעה מוחית טראומטית שנגרמה כתוצאה מפגיעת מוקדים. בעוד את התוצאות מכל טכניקה אינן בני השוואה ישירות, המאפיינים פיזור האנרגיה נמדדים באמצעות זחת השפעה פעלו באותה מגמות כמו מודולוס אובדן הגזירה נמדד באמצעות rheology, כמפורט להלן.

בשקע מאופשר AFM של רקמת המוח מאויר בזאת, מדדנו נכסים viscoelastic באמצעות ציות השרץ ולאלץ הרפיה. בגלל היקף קטן של החללית AFM, טכניקה זו יכולה למדוד תכונות מכניות של תחומים ברורים אנטומית של המוח, כגון אזורים בחומר הלבן והאפור של callosum ואת קליפת קורפוס, בהתאמה (איור. 4

מצאנו כי התנהגות viscoelastic של רקמת המוח נמדד באופן זה היא איכותית דומה שדווח בעבר תוצאות לפי אלקין & מוריסון 26. בעוד הגודל של הערכים הנמדדים עבור מודולוס הרפיה לא מסכים, זה ככל הנראה בשל ההבדל בתנאי ניסוי. אלקין & מוריסון להשתמש אגרוף 250 מיקרומטר בקוטר שטוח, לעומת כדור 20 מיקרומטר בקוטר שלנו. בנוסף, אלקין & מוריסון לבצע מדידות על רקמת המוח של חולדות, בזמן שאנחנו בצענו מדידות על רקמת המוח שהתקבלה בעכברים. למרות ההבדלים הללו, הן טכניקות MEAsured תכונות מכניות הטרוגניות בתוך רקמת המוח, או ליתר דיוק, כי החומר הלבן של כפיס המוח מפגין מודולוס הרפיה נמוך החומר האפור של קליפת במישור העטרה.

חשוב לציין כי בעוד חישבנו עמידת השרץ ולאלץ moduli הרפיה בתגובה עומס צעד מתבקש או הזחה צעד, בהתאמה, העומס המופעל באופן ניסיוני מהשוליים אינם אידיאליים פונקציית מדרגות (מיידית). עומסי חריצים מוחלים על לוחות זמנים קצרים (<1 sec), והיסטוריות טעינה אלה יכולים להשפיע על השרץ נמדד ותגובות הרפית 7,25. באופן ספציפי, בהנחת תוצאות זחת צעד שיושמו קל מתחת להערכת מודולוס ההרפיה, בעוד בהנחת תוצאות עומס צעד מיושמות על-הערכה הקלה של מודולוס ציות שרץ. הפערים בין moduli אלסטי בפועל ומחושב יקטינו את שיעורי הרמפהשל עומסים שיושמו עליית כניסה.

צעד מרכזי בניהול הרפית עומס הוא בחירת הגודל הנכון של כוח שמר (כלומר, setpoint המתאים למתח פוטודיודה המתייחס ישירות הכח ליישם). כוח setpoint לתאימות שרץ חייב להיבחר כך: (1) התגובה היא גדולה מספיק כדי לייצר שינויים מדידים בקלות לעומק כניסה; ו (2) קטן מספיק כי עומק ההזחה נדרשים בכדי לשמור על כוח setpoint אינו הופך להיות כל כך גדול כמו להסחף מחוץ לטווח של מפעיל פיזואלקטריים AFM כי מודולציה את המיקום האנכי של בסיס שלוחה AFM. בפרוטוקול שהוצג, שהצענו כוח setpoint 5 NN, אשר עבד גם עבור ההתקנה הניסיונית שלנו. עם זאת, אם פייזו AFM הוא מסוגל לשמור על אותו הכח בשל טווח התנועה המוגבל שלה (ראה איור. 4 א, ​​הבלעה), הערך שאפשר להוריד. נושא ניסיוני זה לא encountered עם ניסויי הרפית כוח לשמור על עומק הזחה מתמיד, מחושב באמצעות לולאת משוב.

בניגוד הזחה AFM מאופשר מעין-סטטי nanoNewton (NN) בהיקף כוחות ועומקים בקנה מידה מיקרומטר, הזחה השפעה חל עומס דינמי מרוכזת של כוחות בקנה מידה MN ומודד את התגובה דפורמציה של הדגימה לעומקים מתקרבים בקנה מידה מילימטר. השתמשנו בעבר כניסת השפעה לכמת את ההתנהגות של הלב וכבד 9,11,12, וצופים תלות דומה תגובת פיזור אנרגיה על קצב טעינה עבור רקמות מאיברים אלה.

כניסת שפעת יכולה להכיל רדיוס חללית החל מיקרומטר מ"מ. בנוסף, ניסויי זחת השפעה יכולים להתנהל בסביבות שקועות לחלוטין, המאפשרות האפיון המכאני של רקמות hydrated 21. כאשר בודקים דגימות תואמות מאוד כגון רקמת המוח, שדשיקולי ortant חייבים להילקח בחשבון. ראשית, את העומק למדידת מקסימלית לתוך החומר הוא כ 1 מ"מ, מגבלה שקבעה את כף האורך של המכשיר עצמו; כל תזוזת מטוטלת עוד תיעצר פיזית על ידי ההתנגשות בין סליל האלקטרומגנטים ממוקם בחלק העליון של המטוטלת ואת הצלחת המגנטית הנייחת. עבור רקמת מוח, זה מגביל את מהירות ההשפעה הגדולה ביותר שיכול להיות מיושמת בהצלחה כ 5 מ"מ / sec. שים לב בעוד מירויות ההשפעה הן בסדר גודל המ"מ / s, צפיפויות אנרגית זן המקבילות הן בסדר גודל של kJ / מ '3, אשר מתקרב תנאים בליסטיים, בשל ממדיו הקטנים של רדיוס הבדיקה 11. שנית, זה יכול להיות קשה פוטנציאלי עבור המכשיר כדי לזהות קשר בין החללית לבין פני שטח רקמות. כשלב המדגם נוסע לכיוון החללי, קשר מזוהה כאשר המטוטלת היא דחפה בחזרה על ידי המדגם המרגש. עם זאת, עבור מאוד complianדגימות t, המטוטלת לא יכולה להיות מוסחת במובחן בעוד החללית חודרת לתוך המדגם.

כדי לטפל בבעיה זו, אנו יכולים להגביר את המהירות שבה הבמה מדגם מהלכים כאלה כי תהיה תנופה רבה יותר במהלך מגע לנהוג המטוטלת בחזרה. המדגם צריך להיות גם שטוח ככל האפשר, כדי לצמצם עוד יותר שגיאות בזיהוי נקודת המגע התקינה. לבסוף, יש לציין כי עומס ההשפעה אינו עומס דחף אמיתי, שזרם אלקטרומגנטית בראש המטוטלת ממשיך לספק כוח מניע לחדירה לאחר אירוע ההשפעה הראשון. כתוצאה מכך, שרץ עלול להתרחש במיוחד על תנאי ההעמסה הגבוהים, אשר מסבך ניתוח המאפיינים פיזור אנרגיה. עבודה נוספת על טכניקה זו יכולה לערב decoupling התגובה שרץ מתגובת ההשפעה, מציגה בקרת טמפרטורה כדי לאפשר לימודים בטמפרטורת גוף, כולל ההדמיה של שטח מדגם רקמות באמצעות microscopדואר תואם עם נוזל התא.

Rheometry מודד את תכונות מכניות תלויה בתדירות של מוצקים viscoelastic במישור macroscale. רכיבי moduli הגזירה, אחסון G 'ואובדן G ", ניתן למדוד תדירות טווחי בדרך כלל פורש 0.001-.1 rad / sec כדי 10-100 rad / sec, תלוי במכשיר, גיאומטרית בדיקה, מדגם 13. לקבלת מדידה מדויקת צריכה להתבצע, גידול לטאטא המשרעת לפני סוויפ תדירות כדי לקבוע את הטווח ליניארי אלסטי של החומר; זהו הטווח של הזן עבורו G 'ו-ז' 'נשאר קבוע 14,27 זן הגזירה נבחר עבור התדר. לטאטא צריך להיות גבוה ככל האפשר בתוך מגבלת viscoelastic ליניארי (בדרך כלל 1-2% זן גזירה) כך מומנט מספיק מושגת בזמן המדידה. המומנט במהלך המדידות תמיד צריך להיות בטווח המותר שסיפק היצרן על מנת להבטיח ככלufficient יחס אות לרעש.

בנוסף, חללית rheometry בשימוש צריך להיות גדול ככל האפשר על מנת למקסם את המומנט, אבל חייב כיסוי עם המדגם 13 לחלוטין. בהכנת המדגם, הרקמה צריכה להיות פרוסה שטוחה ככל האפשר כדי למזער הדרגתי לחץ בזמן של יצירת קשרים בין הלוחות. כאשר נוצר מגע עם המדגם, הרקמה לא צריכה שום טיפות מים על זה כדי למזער להחליק על הממשק. עם זאת, הרקמה גם אסור התייבשה לפני או בזמן המדידה כמו זה יהיה לבזות את מבנה הרקמה 13. הרקמה צריכה להיות hydrated מלא עם תקשורת לאחר מגע בין שני הצלחות. דבק, נייר זכוכית עמידה למי יתכן שיצורף גם את הצלחות כדי למזער תלוש 28. בנוסף, דחיסה צירית הוכחה לשנות את סדר הגודל של G 'של מוח רקמות 29. מאז דגימות rheology הן בדרך כלל רזה (~ 5 מ"מ), שינויים קטנים בגובה (~ 500מיקרומטר) עשוי לייצר זני דחיסה גדולים (למשל, ~ 10%), ולכן שינויים משמעותיים מודולוס הגזירה. יתר על כן, כמו המדגם הוא viscoelastic, החומר יעבור הרפית מתח עקב דחיסה צירית 28, אשר עשוי להשפיע מדידות. לכן, מדידות חוזרות צריכות להתבצע על זנים ציריים ביצוע דומים, ואת המדגם צריך להיות מותר להירגע (למשל, 5-10 דקות) לפני המדידה. שגיאה הקשורים תופעות אלה היא מגבלה של הטכניקה. מגבלות אחרות של rheometry כוללים את ההנחה כי החומר הוא הומוגני איזוטרופיים, אשר לעיתים קרובות לא נכון בדגימות רקמה 13. בנוסף, טמפרטורה צריכה להישמר בתנאים פיסיולוגיים כמו זה ישפיע G 'ו-ז' "22. ברקמת המוח במיוחד, טמפרטורה גדלה הוכחה על מנת להפחית את G 'ו-ז' 'בצניעות מבלי לשנות את החוק החזק Behavior עם תדר, ובכך בא מנהלת סופרפוזיציה בטמפרטורת זמן 22,30. הנתונים שלנו הם בהסכם טוב עם מחקרים קודמים 22,27 במוח חזירי, אשר ציינו בהירויות דומות של G 'ו-ז' ', כמו גם תלות תדירה חוק הכח חלש בשני G' ו-ז ' ".

Tanδ היחס מחושב = G "/ G '(איור. 6) מספק אחד בסיס ההשוואה בין rheometry משולי השפעה. בשנת זחת השפעה, מצאנו כי קיבולת פיזור אנרגיה של מוח הרקמות גדלה עם שיעורי העמסה מוגברים. שימוש rheometry, מצאנו כי כמו בתדירות גבוהה מהרגיל, tanδ גם גדל. במילים אחרות, החומר היה בעל כושר פיזור יותר בתדרים גבוהים יותר. בנוסף, בעוד מדידות הזחה השפעה לא לכמת מודולוס אלסטיות ישירות, הירידה מקסימום x מעמקי החדירה ישירות עם increasing מודולוס אלסטיות.

יחד, בשיטות המתוארות במאמר זה לאפשר אפיון מכני של רקמת המוח על מיקרו, meso-, וקשקשת אורך המקרו, ובשיעורים טעינה שונים. השיטות שהוצגו במסמך זה ניתן להשתמש על מספר חומרים התואמים, כולל הוא רקמות ביולוגיות הידרוג מהונדסים. עם הבנה מעמיקה של מאפייני viscoelastic multiscale של רקמת המוח, ניטיב חומרי תכנון הנדסיים לחקות את התגובה המכאנית של המוח. חומרים simulant רקמות אלה יכולים להקל חיזוי של נזק מכני והנדסי שיטות ההגנה. בנוסף, את תכונות החומר של המוח יכול לשמש כדי לעצב חומרים bioinspired עבור במבחנה במחקרים vivo כדי להבין טוב יותר צמיחה וקישוריות של תאים במערכת העצבים המרכזית, במיוחד בהקשר של מחלות נוירולוגיות כמו אוטיזם וטרשת נפוצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. , Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". , Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4 (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16 (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).

Tags

Neuroscience גיליון 115 רקמת המוח מכניקה מודולוס אלסטיות viscoelasticity זחה זחת השפעה rheology מדעי המוח אוטיזם טרשת נפוצה עכבר
אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B.,… More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter