Abstract
设计和工程师由大脑的属性激发的材料，无论是机械模拟物或组织再生的研究中，脑组织本身必须很好地表征在不同的长度和时间尺度。像许多生物组织，脑组织呈现出一个复杂的，分层结构。然而，与大多数其它组织，脑是非常低的机械刚度，以Pa的100s的顺序上杨氏弹性模量即这种低刚度可以呈现挑战关键的机械性能的实验表征。在这里，我们表明，已适应测量水分，符合生物材料的脑组织等，在不同的尺度和负荷率弹性和粘弹性能几种机械表征技术。在微尺度，我们进行使用原子力显微镜启用压痕蠕变遵守和力量松弛实验。在mesos凯尔，我们执行使用的是基于钟摆仪器化压压痕冲击实验。在宏观尺度，我们进行平行板流变量化该频率依赖剪切弹性模量。我们还讨论了与每个方法相关的挑战和限制。这些技术共同使脑组织，可用于更好地理解脑的结构和工程师仿生材料进行了深入的机械特性。
Introduction
包含生物器官最软组织是在机械上和结构复杂，低刚度相比矿化骨或工程材料，并显示出非线性的和取决于时间的变形。相比，在身体的其他组织，脑组织是非常柔顺的，以帕1的100秒的数量级上的弹性模量例如脑组织呈现出具有鲜明和相互交叉的灰质和白质区域也有所不同功能结构的异质性。理解脑组织力学会在材料和计算模型的设计有助于向模拟大脑损伤时的反应，促进机械损伤的预测，并启用的保护策略工程。此外，这样的信息可以用来考虑的组织再生的设计目标，以更好地理解脑组织是与疾病，如多发性硬化症和孤独症有关的结构变化。 HERE，我们描述和证明了可用来表征机械柔性组织中，包括脑组织的粘弹性能几个实验方法，在微观，中观和宏观尺度。
在微尺度，我们进行了蠕变遵守和用原子力显微镜（AFM） - 启用压痕力松弛实验。通常情况下，使能AFM压痕用于估计样品2-4的弹性模量（或瞬时刚度）。然而，同样的仪器也可用于测量微尺度粘弹性（时间或速率依赖性）性质：5-10。这些实验中，在图1所示的原理，是缩进悬臂探针进入脑组织的AFM，保持力或压痕深度指定大小，并测量在分别压痕深度和力，相应的变化，随着时间的推移。通过这些数据，我们可以计算出蠕变补偿分别lianceĴC和松弛模量G R，。
在尺度，我们在维持组织结构和水化水平液体浸泡条件下进行冲击试验压痕，使用的是基于钟摆仪器化纳米压痕。实验装置如图2所示，随着钟摆成与组织接触，探针直到振荡摆锤涉及到组织内休息位移记录为时间的函数。从探头所得阻尼谐振荡运动，我们可以计算出最大穿透深×max时 ，耗能能力K和耗散品质因数Q（其涉及能量耗散率）的组织11,12。
在宏观尺度，我们使用了平行板流变仪来量化该频率依赖剪切弹性模量，称为储能模量G'和损耗模量G“时，组织的。在这种类型的流变的，我们应用一个谐波角株（和对应的剪应变）在已知振幅和频率，并测量reactional扭矩（和相应的剪切应力） ， 如图3，从所测量的转矩的产生幅度和相位滞后和系统的几何变量，我们可以在感兴趣13,14施加的频率计算G'和G“。
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Protocol
伦理学声明：所有的实验方案是由波士顿儿童医院的动物研究委员会批准并符合健康指南实验动物的护理和使用全国学院。
1.鼠标脑组织采集程序（启用了AFM压痕和影响压痕）
- 准备氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。结合5毫升氯胺酮（500毫克/毫升），加入1ml甲苯噻嗪（20毫克/毫升）和7毫升0.9％盐溶液中。
- 每氯胺酮/甲苯噻嗪溶液克体重7微升注入小鼠（男或女品种：TSC1; Syn的Cre重组酶; PLP-EGFP;：;年龄性别P21）。
- 一旦鼠标完全麻醉，这表现在缺乏应对脚趾和尾掐的，安乐死通过使用大型清扫剪刀斩首鼠标。
- 删除通过使用更小的解剖剪刀剪下来中间的头骨。在小脑开始，REM奥雅纳件用弯钳的头骨。除去头骨后，通过使用一个平铲解除脑，开始于小脑提取大脑，并放置在脑上的培养皿。从使用刀片大脑除去小脑。
- 如果使用对新鲜组织，转移脑冲击压痕测试整个大脑进入圆底管在冰上成人神经组织CO 2独立营养培养基，然后继续部分4。否则进行到步骤1.6切片的程序。
- 调整vibratome设置以0.7毫米/秒，70赫兹的振动频率，以及350微米的切片厚度的速度。环绕冰的vibratome菜。将强力胶民建联到vibratome板安装的大脑，使冠状切片可以切割，用脑面向通过背侧削减第一。
- 填充有足够的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS），以刚刚浸没大脑vibratome菜。提高在使叶片刚好淹没在DPBS的vibratome的菜。
- 按开始开始切割冠状脑切片350微米厚。
- 使用漆刷以避免组织损伤，从vibratome DPBS浴并进入圆底管在冰上成人神经组织CO 2独立营养培养基转移脑切片和48小时内的新鲜组织进行测量。要开始启用AFM压痕试验，进行第3节。
2.猪脑组织采集程序（用于流变）
- 从当地屠夫获得的牺牲〜1小时内矢状切猪一半大脑。放置在成人神经组织CO 2独立营养培养基中半脑，并储存在冰上。
- 使用刀片或手术刀进行的CO 2独立的营养介质中的约5毫米厚冠状脑切片和存储成年神经组织。确保切片面传热e是尽可能平坦。切片时使用剃刀/手术刀小心横向运动。
- 商店猪脑组织中的CO 2独立培养基在冰上成人神经组织和48小时内的新鲜组织进行流变测量（第5节）。
启用显微镜-3，原子力压痕
- 根据制造商的说明用贻贝衍生生物粘附制备60毫米直径的Petri（P60）的菜肴。
- 制备的由在无菌水中的0.1M碳酸氢钠为8.0的最佳pH中性缓冲溶液中的股票。过滤杀菌（0.2微米），在4℃下的碳酸氢钠缓冲液和存储。
- 在层流罩，混合6.25％贻贝衍生生物粘合剂和3.125％的NaOH在碳酸氢钠缓冲液中的溶液。
- 从3.1.2生物粘合剂溶液中吸取100μL到毫米直径的60 Petri网（P60）的菜和使用枪头蔓延溶胶ution成3-5厘米直径的圆。
- 离开P60菜肴在层流罩未覆盖并让溶液干燥（〜30分钟）。洗涤碗碟1倍，用PBS，并用无菌水2次。让层流罩，存放在一个密封的塑料袋菜空气干燥，在4℃下长达1个月。
- 校准在AFM中的原子力显微镜和建立大脑样本。
注：按照AFM校准说明，按制造商。- 小心地用0.03牛顿/米的标称弹簧常数和一个20直径微米的硼硅酸盐珠插入探头保持器加载一个原子力显微镜探针。
- 校准使用热调方法15,16的AFM悬臂的弹簧常数和逆光杠杆灵敏度（InvOLS）。
注意：一旦一个AFM探针弹簧常数计算的，它应该保持重复使用恒定。然而，悬臂InvOLS将需要每个激光重新对准与悬臂时被重新校准。此外，校准应针对幅度比悬臂，如聚苯乙烯较硬的基板几个的顺序进行。 - 打开阶段安装的加热器和设定温度至37℃。
- 安装脑片到3.1节准备的P60菜肴。
- 轻轻倒入350微米厚的脑切片，以及从圆底烧瓶中的CO 2的非依赖性介质进入涂覆有贻贝衍生生物粘附一个P60培养皿中。
- 轻轻倾斜P60盘，在盘的中心位置大脑切片。如果需要的话，慢慢从手动移液器吸取介质展开的脑切片已折叠在自身或更好的位置脑切片在盘的中心。
- 小心使用P1000移液器（不使用真空）去除多余的介质。
- 放置在P60菜盖，让大脑切片坚持20分钟。
- 取出AFM头，将装在P60的脑片这道菜在AFM阶段，并添加约2ml预热CO 2独立网上平台。
- 小心添加的媒体一滴到AFM探针以保护其免受破坏，由于当它被降低到周围脑切片的媒体表面张力。
- 重新定位AFM头搬上舞台，并开始降低头部，直到它被淹没到媒体。
- 使用顶视图CCD照相机，重新定位激光到所述悬臂。
注：在悬臂的激光的取向将已由于在空气和介质的折射率的差略有改变。 - 等待5分钟，悬臂调整到一个温暖的液体被淹没，那么，准直镜重置为0 V的自由偏转
- 根据制造商的说明16上的原子力显微镜探针运行热谱。使用第一热峰的配合在媒体重新计算的AFM探针的InvOLS。
- 使用光学显微镜，移动样品台，使得的AFM探针下面感兴趣的大脑区域。
注：胼胝体将出现暗，因为它比周围的灰质更不透明。皮质优于胼胝体。 - 重置镜对准到0V的自由偏转
- 的总和与偏转仪表在AFM软件，点击“互动”搞原子力显微镜头。
- 在原子力显微镜头使用位置表盘，直到悬臂和样品之间的接触是由低下头。
- （可选）如果需要的话，测量样品的弹性模量，如先前4,17,18说明。
- 进行蠕变柔实验。
- 建设中的软件的功能编辑器中所施加的力的功能。力功能由一个0.1秒斜坡至5 NN的一组点的并保持20秒，接着是1秒减速到0 NN的作用力。
- 压痕法师P头面板，压痕方法下，选择压头模式“装载”; “N”为单位;和“功能编辑器”的压痕功能。
- 在功能编辑器中，在段PARMS面板，创建一个作用力功能段从0开始NN，5 NN结束后，用0.1秒的时间。点击“插入 - >”。
- 在接下来的环节，集开始5 NN，结束5 NN，并且时间为20秒。点击“插入 - >”。
- 对于最后段，设置开始5 NN，端至0 NN，并且时间为1秒。点击“抽奖”，并关闭功能的编辑器窗口。
- 在主面板的强制标签，勾选“触发后压斜”，并设置作用力功能达到了0.1 V的触发点之后触发
- 点击主面板的部队标签的底部，这将触发蠕变柔构造施加强制功能“单一力量”。
- 之后单个力压痕完成时，提高AFM的头部，使得它不与样品接触，然后重新接合头，并重新零自由偏转。
- 重新定位样品台来定位感兴趣的一个新的区域，并降低了原子力显微镜头进行接触。注：AFM头必须从样品表面被收回时的样品台移动。如果不这样做可能导致的微妙AFM悬臂损害。
- 重复步骤3.4.3-3.4.5直到数据的所需量的已收集。
- 建设中的软件的功能编辑器中所施加的力的功能。力功能由一个0.1秒斜坡至5 NN的一组点的并保持20秒，接着是1秒减速到0 NN的作用力。
- 进行力量松弛实验。
- 建设中的软件的功能编辑所加缩进功能。压痕功能由一个0.1秒斜坡至3微米的一组点的并保持20秒，接着是1秒斜坡下降到0微米的压痕深度。
- 压痕主面板，压痕方法下，选择“缩进”的压痕模式; “米”为单位;和“;功能编辑器“的压痕功能。
- 在函数编辑器中，在段PARMS面板，创建一个施加的力的功能段从0开始微米，在3微米结束后，用0.1秒的时间。点击“插入 - >”。
- 为下段，设置开始到3微米，端至3微米，时间为20秒。点击“插入 - >”。
- 对于最后段，设置开始到3微米，结束为0微米，时间为1秒。点击“抽奖”，并关闭功能的编辑器窗口。
- 在主面板的强制标签，勾选“触发后压斜”，并设置作用力功能达到了0.1 V的触发点之后触发
- 点击主面板的部队标签的底部，这将触发力松弛构造，应用缩进功能“单一力量”。
- 单个力压痕完成后，提高AFM头，以便它出与样品，然后接触的重新接合的头部和重新零偏转。
- 重新定位阶段来定位感兴趣的一个新的区域，并降低头部进行接触。
- 直到数据的所需量的已收集重复步骤5.3-5.5。
- 建设中的软件的功能编辑所加缩进功能。压痕功能由一个0.1秒斜坡至3微米的一组点的并保持20秒，接着是1秒斜坡下降到0微米的压痕深度。
- 结束实验和清理。
- 实验结束后，提高AFM头，从样品中取出。
- 使用实验室组织小心地除去多余的液体无需接触悬臂。
- 使用的少量乙醇仔细清洗AFM悬臂支架。不要暴露在悬臂支架乙醇细腻的电子产品。删除在存储容器中的原子力显微镜悬臂和地点。
- 按照适当的生物安全协议处理脑组织样本。
- 用MATLAB计算蠕变柔，用压头几何迫使松弛模量，根据Lee和Radok，1960年得出的解决方案 19。
- 计算力F和压痕深度
从悬臂位置Z的数据，偏差d和弹簧常数，K C的 
和
。 - 定位沿着用Lin等 20所描述的算法的压入曲线的接触点。
- 定义的用于数据分析的兴趣的一个窗口。感兴趣的窗口是任力（用于蠕变柔）或压痕深度（对于力缓和）被保持在一个设定值的区域（ 即 ，如在图1C，D示出3区）。
- 对于蠕变柔实验，计算出试验蠕变柔弹性模量，J C（t）的，在响应于一个阶跃负载N + 1“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg“/>：
，
其中H（t）是Heavyside阶梯函数和R是球形探针的半径。 - 对于力松弛实验，计算实验力松弛模量，G R（T），响应一步压痕深度
： 
。
- 计算力F和压痕深度
从悬臂位置Z的数据，偏差d和弹簧常数，K C的 
和
。 
， 
： 
。 4.影响压痕
- 校准仪器纳米压痕和调整默认设置根据制造商的说明，以使上水合脑组织动态冲击实验。
- 通过滑动到用镊子摆挂载球形探头。
- 胶稠石英样品到样品后，它被拧入的平移阶段。
- 进入校准菜单并选择“液体池”。按照软件的指示，使与熔融石英样品接触。
- 选择“正常”的压痕类型和用途0.05 Mn的默认值压头负载。点击“继续”执行校准对于正常压头配置。
- 通过至少5mm移动样本台后面。安装杠杆臂，允许所述探针被降低到液体电池中，并通过选择“液体细胞”为压头类型重复液细胞校准在新配置。点击“继续”，以获得液体池校准因子。
- 通过转到实验菜单并选择激活液体池软件选件“特殊选项”。使用最新的校准值。
- 增加电容器板间距，因为这将导致更大的最大可测量深度，测试HIG时，这是必要的溶血素兼容的材料。
- 在系统菜单中，选择“非保护设置”和“机器参数”来改变钟摆测试负载率，零负载率和备用坡道偏移到0.5万/秒分别为0.1万/秒，3 V，。
- 用扳手，将这种小幅度的电容板间距顺时针控制三个螺母。
- 每完成顺时针旋转后，选择“桥箱调整”维护菜单下，取得了良好的摇摆试验，这将需要移动抗衡的重量从摆了。
- 重复步骤4.1.7.2-4.1.7.3直到近似深度校准读取70000纳米/ V或更高的值。
- 一个新的限制停止在能够打开和关闭通过一个电源被切换摆的底部定位。缩回原来的限位挡坐在后面摆删除钟摆运动的潜在障碍，并允许更高冲击速度以及更高的穿透深度成遵循样品。
- 让橱柜达到热平衡（约需1小时）。
- 而橱柜达到平衡，回到系统菜单，然后选择“非保护设置”和“机器参数”。深度校准（DCAL）接触速度设定为1微米/秒时，主缩进接触速度至3μm/秒，以及超低负载接触速度为1微米/秒。
- 在校准菜单，在这个新的配置执行标准深度校准。
- 打开了电磁阀的电源并将其设置为10 V.转到实验菜单，选择“影响”和“调整脉冲位移”。按照软件的指示（自动提示）来校准钟摆的摆动距离。
- 安装在液体细胞进行小鼠脑组织。
- 从STE收获全脑后p 1.5，立即保存它CO冰上成人神经组织媒体2独立营养培养基。
- 当冲击缺口的设置是全面完成，小心脑转移到培养皿用CO 2独立媒体一起。切片脑入6mm厚切片两边有平坦的表面。
- 粘附切片组织到铝样品后用氰基丙烯酸酯类粘合剂的薄层。
- 滑过的样品后的第二O形环的液体池，并填写细胞液5毫升CO 2独立媒体的充分沉浸组织。该样品后，然后小心地安装到仪表里面纳米压痕平移阶段。
- 测量脑组织的影响的响应。
- 如果需要的话，取出球形探针和与感兴趣的探针更换而不除去该杆臂。
- 在系统菜单中，选择“非受保护设置“和”机器参数。“更改主要影响接触速度至5微米/秒。
- 与样品浴低（-z方向）和远离摆（+ x方向），移动在-x方向，直到在杠杆臂的前端正确地位于熔池上方。移动在+ z方向直至尖端在浴和在样品的前面完全浸没。
- 使用样品台控制窗口中，仔细地使接触，然后通过约30微米备份阶段远离样品表面。
- 根据实验菜单上，单击“影响”设立一个冲击实验。选择将直接与基于该摆动距离校准所得冲击速度的比冲载荷。运行计划的实验。
- 当摆锤摆动，回到样品表面继续移动到测量平面，转动底部限位挡开关。
- 观察的钟摆FORWARD冲击样品。探针的作为时间的函数的位移将由软件被记录。
- 当出现某某阶段窗口，打开限制停止开关。
- 重复步骤3.4-3.8根据需要测试许多不同的负载和位置。
- 使用定制的MATLAB脚本来确定最大渗透深×max时 ，耗能能力K和耗散品质因数Q分析所获取的排量与摆锤的时间响应。11
- 进入分析菜单，并在文本文件中导出数据。
- 取位移分布的时间导数以获得速度作为时间函数。设为零排量为接触点X 01。
注： 在冲击速度v是最大速度接触立即之前的x 最大值对应于变形在该探头。速度首先减小到零英寸x O 2，这相当于X 读 ，是重新发起与在下一循环中的变形的样品接触所需的位置。回弹速度V OUT是在位移x r处的速度。 - 定义K（无单位），通过所述第一冲击周期期间由回收并消散样本的能量的总和归一化的样品消耗的能量。基于摆锤21的固有特性计算K（如旋转刚度和阻尼系数）中，x O1 中，x 最大值 ，X 的R，V 中 ，和V OUT。
注：欲了解更多信息，可以咨询Kalcioglu 等人，2011年的工作。 - 由于位移可谓阻尼谐振荡运动，适合指数衰减函数来DIS的最大值放置 - 时间曲线。
- 计算Q（无单位），为π乘以E的因子，以减少所需的振幅的周期数。较高的Q值意味着较低的能量消耗率。
5.流变
- 设置和校准流变仪根据制造商的说明。
- 通过打开设备/控制面板初始化流变仪。在控制面板选项卡，单击“初始化”。
- 安装直径为25mm的测量板（PP25）和热系统。
- （可选的）要降低流变仪板和组织之间的滑动，切出相匹配的顶部流变仪板的形状并粘附在砂纸的顶部和底部板，其粘接剂砂纸片。
- 通过点击“设定零间隙”在控制面板上使顶部和底部板之间的接触。
- 零由CLI正常的力传感器盛泰“复位正常的力量。”
- 通过打开服务选项卡中的控制面板上，点击“测量系统”，然后点击“惯性测试”的行为惯性测试。记录的新老惯性。验证该惯性为探针的允许极限之内，由制造商所列出。
- 装载样品放入流变仪。
- 收获的组织切片猪脑的冠状段约5毫米的厚度，它保存在冰中的CO 2独立媒体之后。
- 放置在两个板之间的大脑。从样品以防止滑动的顶部和底部表面除去大的水滴，但不干燥样品。
- 慢慢降低测量板直到该板是与组织和测量的法向力的顶面完全接触是在5-10分钟松弛期间后0.01 MN一致。
- 在控制面板中，输入连续降低高度，我n个测量位置复选框，然后单击“测量位置”慢慢降低测量板。
- 时与组织接触的一毫米内，降低测量板以0.1 mm的增量，直到该板是完全与组织的顶面接触。确保所测量的正常力始终以0.01 Mn为5-10分钟松弛段之后。
- 记录初始测量的法向力。重复测量应在相同的压缩应力/应变作出。
- 如果样品超出该板的直径用塑料刀片修剪样品。吸取样品上水合的组织的边缘的小体积的介质（〜1-2毫升）中。
- （可选）降低热罩。在控制面板上，设置温度为37℃，然后点击“设置”。
- 执行幅度扫描来建立材料的线性粘弹性范围内（ 即，剪切菌株在其中，G'和G'在感兴趣（ 例如，1弧度/秒）的频率'是常数）。
- 选择“文件/新建”。根据凝胶选项卡中选择“幅度扫描：LVE范围。”选择窗口，然后单击“测量1：扫幅。”双击振荡箱。输入的初始和最终的应变（ 例如，0.01至105），频率（ 例如，1弧度/秒）和每十点的数量（ 例如，6点/分解）。选择“确定”，然后点击开始。“
- 重复此过程几片，用反复试验，以保证线弹性范围内的一致性。样品的轴向压缩应保持样本之间恒定。
- 在应变进行组织的频率扫描中的组织（ 例如，1％的应变）22的线性粘弹性范围内，并且在感兴趣（ 例如 ，0.1〜100弧度/秒）的频率范围。
- 点击 “文件/新建”凝胶选项卡下选择“扫频”。点击窗口/测量1：频率扫描。双击振荡箱。输入的频率范围（ 例如 ，0.1至100弧度/秒），应变（ 例如 ，1％应变），并每十点的数量（ 例如 ，6点/分解）。选择“确定”，然后单击“启动”启动频率扫描。
- 在副本一式三份或重复频率扫描（步骤5.4）。
- 审查自动计算和流变仪导出的数据：'作为频率（频率扫描）的函数和G“或剪切应变（振幅扫描）。注意：G'G和G''被从样品的（最大计算）reactional转矩振幅T'0，和旋转位移角（或偏转角）
和相位滞后方程式1“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg“/>，样品对所施加的振动应变响应（ 图 3）： 
其中R和h是样品的半径和高度。
和相位滞后方程式1“SRC =”/文件/ ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg“/>，样品对所施加的振动应变响应（ 图 3）： 
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Representative Results
图4示出代表压痕和力与时间的反应（ 图4B，C）用于蠕变柔和力松弛实验中，给定分别施加的力或压痕深度（ 图4A中的D）。利用这些数据和系统的几何形状，蠕变柔量J C（t）和强制松弛模量ģR（T）可被计算为大脑（ 图4C中的F）的不同的区域。虽然以前的研究表明大脑23的不同区域的弹性模量之间的差，粘弹性特性以这种方式对小鼠脑组织切片不显示给定的组织切片中的区域间的变化进行测定。
冲击压痕在空间和时间上concentra高速率测量组织的机械性质特德加载。这些实验的结果提供了关于组织响应于外伤性损伤或与手术相关故意的变形如何消耗能量的信息。冲击压痕探针的阻尼振荡运动（ 图2B）提供的信息来计算最大穿入深× 最大 （ 图5A），能量耗散率k（ 图5B）和所述组织的能量耗散率Q（ 图5C）。穿透深度测量抗变形能力，有力地与组织的弹性模量密切相关：更严厉的组织表现出对于给定的冲击速度和冲击能量更小的穿透深度。耗能能力是其中第一冲击循环期间组织耗散冲击能量的程度的一个无单位的量度。耗散品质因数的措施有多少次我从振荡发生前MPACT被显著阻尼 - 这直接涉及能量耗散率，虽然这是不以时间为单位来表示。这三种冲击响应参数可以在不同的冲击速度，这提供研究的组织的速率依赖特性的装置进行定量。
图6示出宏观G'和G“为频率范围从0.1弧度/秒至50弧度/秒。储能模量几乎要比在低频损耗模量大一个数量级，然而，存储和损耗模量之间的比值随频率的增加而增加。这表明弹性性质支配脑组织的行为，因为储能模量描述弹性性能和损耗模量描述该材料的粘滞度损失。在一个足够高的装载次数，所述存储和损耗模量都等同，指示在该点该材料开始流动（ 即 ，粘性性质支配样品的行为）。如本文所示测量脑组织的情况下，仪器仪表的物理限制不允许我们在更高的频率测量的材料特性。
图1. 启用AFM-蠕变柔的插图，并迫使松弛实验。（A）中启用的AFM-缩进使用柔性悬臂具有纳米的球状珠附着到自由端微尺度半径进行。 （B）在缩进，悬臂偏转使用激光反射离开悬臂的并到达光电二极管结束时测量。 （C）力松弛实验被缩进悬臂恒定的应用进行了深入的，而力衰减与资源PECT时间被测量。 （D）的蠕变柔措施以恒定作用力悬臂的变化压痕深度。 （C）和（D）已经被分为五个区域（绿色文本）：（1）原子力显微镜探针与样品表面的方法，（2）与样品接触，并上升到设定值压痕/力，（3）维护设定压痕/力，（4）减速并（5）从样品表面的原子力显微镜探针的回缩。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 插图影响压痕实验。（A）冲击压痕示意图，说明在充分水化条件进行实验的能力。 （B）Repres entative探针位移分布作为来自小鼠脑切片和相应的速度分布收集时间的函数。关键测量位移，用来量化耗能指示计算速度参数， 请点击这里查看该图的放大版本。
图3.的平行板流变仪的实验。（A）的平行板流变仪实验和与施加的振荡剪切应变定义的示意图。 （B）的代表性的外加应变和所得应力作为时间的函数。剪切储能模量G'和剪切损耗模量G“经由应变振幅计算54201 / 54201eq12.jpg“/>，扭矩幅度T'0，相位滞后
，探针和样品半径R，和样品高度h。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.从蠕变柔代表性数据，并迫使松弛实验。（A，B）从图1中的原始数据，感兴趣区域为蠕变柔如那里施加力时定义保持不变（A）中 ，而压痕深度测定（B）中 。 （A）中的插图显示了一个不成功的实验，其中AFM压电无法数据保持所施加的力，并在（B）中的插图显示了对应的压痕反应，这是定性类似于在（B）中示出的成功实验的数据。 （c）与从所施加的力的数据，测量的压痕，以及探针的几何形状的知识，蠕变柔量J C（t）被计算出来。 （D，E）在力松弛，压痕深度保持恒定（D），而力与时间的测定（E）。 （F）的利用这些数据，力松弛模量G R（T）可以被计算出来。蠕变柔并迫使松弛实验可对大脑的解剖不同的区域，如胼胝体（红色）和皮质（蓝色）进行。在（C，F）数据是从N = 5只小鼠测量的平均值。 请CLICķ此处查看该图的放大版本。
图5.影响压痕实验的代表性数据。最大穿透深x 最大值 ，耗能能力K，和耗散品质因子小鼠脑组织Q的从不同的冲击速度获得的原始位移范围计算。数据表示为平均值±标准偏差（n =每18点重复测量）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.流变实验的代表性数据。存储G'和损失G''猪大脑冠状切片的模量。量的tanδ计算为丧失对储能模量的比值。数据表示为平均值±标准偏差（n =每4点重复测量）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文提出的每个技术测量脑组织的机械性能的不同方面。蠕变柔和应力松弛模量随时间变化的机械性能的量度。储存和损耗模数代表率相关的机械性能。冲击压痕还测量速率依赖性机械特性，但在能量耗散的情况下。当表征组织的机械性能，同时启用AFM压痕和流变的常用方法。因为除了提供时间相关的材料性质，不同的实验参数可以用来测量细胞和组织的弹性模量4，甚至频率相关特性24，如先前所述使能的AFM压痕是特别有用的。然而，实验的数据和设计的准确解释是具有挑战性的标准，水合组织。虽然流变措施散装适合组织的联系，使AFM压痕探测相关细胞的微环境微尺度卷。冲击压痕提供的材料以浓缩，动态冲击负荷，这是在像学习造成的焦点冲击创伤性脑损伤应用中是有用的上下文中如何变形以具体量化的装置。而从各技术的结果是不能直接比较，通过冲击压痕测量的能量耗散特性遵循相同的趋势，通过流变学测量的剪切损耗弹性模量，如下文所讨论。
在这里说明脑组织的启用AFM压痕，我们通过测量蠕变柔并迫使松弛粘弹性。由于AFM探针的小规模的，这种技术可以测量的脑的解剖学不同的区域，如胼胝体和皮质，分别为（ 图 11的白质和灰质区域的机 械性能。4
我们发现，以这种方式测得的脑组织的粘弹行为性质上类似于以前报道由埃尔金＆莫里森26的结果。而测得的值的松弛模量的大小不同意，这可能是由于在实验条件的差异。埃尔金 - 莫里森使用直径250微米的平冲头，相对于我们的直径为20微米的球体。此外，埃尔金 - 莫里森脑组织进行测量大鼠，而我们进行了从小鼠的脑组织上的测量。尽管存在这些差异，这两种技术MEAS被保险脑组织内异质的机械性能，或者更具体地，胼胝体的白质具有较低的松弛模量比在冠状面皮层灰质。
要注意的是，虽然我们计算蠕变柔并迫使松弛模量响应于请求步骤负荷或步骤压痕，分别用实验施加载荷和缩进是不理想的（瞬时）步骤的功能是很重要的。载荷和凹槽是施加在短的时间尺度（<1秒），而这些加载历史可以影响测量的蠕变和松弛响应7,25。具体来说，假设低估松弛模量轻微施加的一步缩进效果，同时假设蠕变柔模量略有高估施加阶跃负载的结果。实际和计算出的弹性模量之间的差异将减小，升温速率的施加的负荷和缩进增加。
在进行负荷放松的一个关键步骤是选择保持力的适当幅度（ 即对应，直接关系到所施加的力光电二极管的电压设定值）。用于蠕变柔设定值力，必须选择，使得：（1）该反应是大到足以产生压痕深度容易可测量的变化;和（2）足够小，以保持给定值的力所需的压痕深度不会变得过大，以致该调制AFM悬臂基座的垂直位置的原子力显微镜的压电致动器的范围之外漂移。在所提出的协议中，我们建议5 NN，这对于我们的实验装置运转良好的额定值力。然而，如果AFM压电无法维持该力由于其有限的运动范围（ 参见图4A，插图），该值可以降低。这个实验的问题不是encountERED与力松弛实验即保持通过反馈环路常数，计算出的压痕深度。
与此相反的准静态启用AFM压痕在nanoNewton（NN）比例的力和微米尺度深处，冲击压痕应用于MN尺度力的集中动态负载，并测量试样的变形响应于接近毫米级的深度。我们以前使用的影响压痕量化心脏和肝脏9,11,12的行为，并观察到类似的负荷率从这些器官组织耗能响应依赖。
影响压痕可容纳探针半径范围从微米到毫米。此外，冲击压痕实验可以在完全浸入的环境中，其允许水合组织21的机械特性来进行。当测试高度兼容样本的脑组织，如，IMPortant考虑必须加以考虑。第一，最大可测深度进料为约1毫米，限制由仪器本身的长度尺度集;任何进一步的摆位移将由设在摆的顶部和固定磁性板的电磁线圈之间的碰撞被物理停止。对于脑组织，这限制了可成功地应用到约5毫米/秒的最高冲击速度。注意，虽然冲击速度都在顺序毫米/秒，相应的应变能量密度为千焦/米3的顺序，接近弹道的条件下，由于探头半径11的小的尺寸上。第二，它可以潜在地变得困难的仪器来检测探针和组织表面之间的接触。作为样品台朝向探针行进时，当摆锤通过移动样品被推回被检测到的接触。然而，对于高度complian吨样品，钟摆可能无法检测地而探针穿入样品偏转。
为了解决这个问题，我们可以增加在该样品台移动，使得会出现接触时更大的动量，以驱动摆回的速度。样品也应尽可能平坦，以便在检测到适当的接触点进一步减少任何错误。最后，注意，冲击载荷是不是真正的脉冲负载，在于在摆锤顶部的电磁电流继续在第一冲击事件之后提供用于渗透的驱动力。其结果是，可以特别是在更高加载条件下，其复杂的能量耗散特性分析发生蠕变。关于这种技术的进一步工作可涉及解耦从冲击响应蠕变响应，经由显微镜引入温度控制，以使在体温下的研究，并包括组织样品表面的可视化Ë与液体细胞相容。
流变测量在宏观水平的粘弹性固体的频率相关的机械性能。剪切模量部件，存储G'和损耗G“，可以在频率被测量范围通常跨越0.001-0.1弧度/秒至10-100弧度/秒，这取决于仪器，探头的几何形状，和样品13。为了精确的测量，振幅扫应之前的频率扫描被执行，以确定该材料的线性弹性范围，这是对于其中G'和G''保持不变14,27的应变的范围内选择的频率的剪切应变。扫应的线性粘弹性限度内是尽可能的高（通常为1-2％的剪切应变），使得在测量过程中足够的扭矩来实现的。在测量过程中的扭矩应始终在由生产商以确保所提供的允许范围ufficient信噪比。
此外，流变测定探针使用应尽可能大，以最大限度的转矩，但必须与样品完全13叠加。在制备样品，组织应切片尽可能平坦时接触板之间进行，以尽量减少应力梯度。当接触与样品制作中，组织不应该有它的任何水滴，以尽量减少在该界面滑移。然而，组织也不能之前或在测量过程中干燥出来，因为这将降低组织结构13。该组织应与媒体都板之间接触后充分水化。粘合剂，防水砂纸也可附连到所述板，以减少滑28。此外，轴向压缩已经显示出改变的脑组织29的G'的大小。因为流变样品通常是薄的（约5毫米），高度的小变化（〜500微米）可能会产生较大的压缩应变（ 例如 ，〜10％），并在剪切模量因此显著变化。此外，由于样品是粘弹性，该材料会经受应力缓和由于轴向压缩28，这可能会影响测量结果。因此，重复测量应在相似的操作轴向应变来进行，并且样品应该允许（ 例如，5-10分钟）放松测量之前。这些现象相关的误差是该技术的限制。流变的其它限制包括这样的假设的材料是均匀的和各向同性的，这常常是不组织样本13在真实的。此外，温度应保持在生理条件，因为这将影响G'和G“22，在脑组织中具体地，增加的温度已经显示出减少两个G'不改变幂BEHA和G''温和vior与频率，从而继时间-温度叠加主要22,30。我们的数据与在猪脑以前的研究22,27，其观察到的G'和G'的类似的量值，以及在这两个G'和G“弱幂频率依赖性一致。
计算出的比率的tanδ= G“/ G'（ 图6）提供流变和冲击压痕之间的比较中的一个基础。在冲击压痕，我们发现，脑组织的能量耗散能力增加负载率增加。使用流变，我们发现作为频率的增加，tanδ的也有所增加。换句话说，该物质是在更高的频率更耗散。另外，虽然冲击压痕测量不直接量化的弹性模量，则穿透深度点¯x 最大值减少直接与increasin克弹性模量。
一起，在本文中所描述的方法使脑组织的力学特性在微观，中观，和宏观尺度，并在不同的负荷率。本文所提出的方法也可以在许多柔性材料，包括生物组织和工程化水凝胶的使用。随着脑组织的多尺度粘弹特性的深入了解，我们可以更好地设计，以模拟大脑的机械响应设计材料。这些组织模拟材料可促进机械损伤和保护战略工程的预测。此外，脑的材料性质可用于设计用于体外 和体内研究的仿生材料，以更好地了解细胞的生长和连接在中枢神经系统中，特别是在神经系统疾病如孤独症和多发性硬化的情况下。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | Lloyd Laboratoried | perscription drug | |
| Ketamine | AnaSed Injections | perscription drug | |
| Vibratome (Vibrating blade microtome) | Leica | VT1200 | |
| Hibernate-A Medium | Gibco | A1247501 | CO2-independent neural medium for adult tissue |
| Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO | Asylum Research | - | |
| Petri Dish Heater | Asylum Research | - | |
| AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere | Novascan | PT.GS | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | mussel-derived bioadhesive |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | alternate suppliers can be used |
| Sodium Hydroxide, 1 N | Sigma-Aldrich | 59223C | alternate suppliers can be used |
| Instrumented Indenter, NanoTest Vantage | Micro Materials Ltd. | - | probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length) |
| NanoTest Liquid Cell | Micro Materials Ltd. | - | |
| Parallel Plate Rheometer MCR501 | Anton-Parr | - | |
| PP25 | Anton-Parr | - | 25 mm diameter flat measurement plate |
| Adhesive Sandpaper | McMaster-Carr | 4184A48 | alternate suppliers can be used |
| Loctite 4013 Instant Adhesive | Henkel | 20268 | alternate suppliers can be used |
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