Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تميز خصائص متعددة النطاقات الميكانيكية للأنسجة المخ عن طريق مجهر القوة الذرية، تأثير المسافة البادئة، وRheometry

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

لتصميم ومهندس المواد مستوحاة من خصائص الدماغ، سواء كان ذلك لالمحاكاة الآلية أو في دراسات تجديد الأنسجة، وأنسجة المخ نفسها يجب أن يتسم جيدا في طول ووقت مختلف المستويات. مثل العديد من الأنسجة البيولوجية، أنسجة المخ المعارض لذلك، بنية هرمية معقدة. ومع ذلك، وعلى النقيض من معظم الأنسجة الأخرى، والدماغ هو من صلابة ميكانيكية منخفضة جدا، مع الرجوعية E يونغ مرنة بناء على أمر من 100s من السلطة الفلسطينية. هذا صلابة منخفضة يمكن أن تشكل تحديات لتوصيف التجريبية من الخواص الميكانيكية الرئيسية. هنا، علينا أن نظهر العديد من التقنيات توصيف الميكانيكية التي تم تكييفها لقياس خصائص المرونة واللزجة من المواد المائية، ومتوافقة البيولوجية مثل أنسجة المخ، في جداول طول مختلفة ومعدلات التحميل. في الميكروسكيل، ونحن إجراء زحف الامتثال والتنفيذ الاسترخاء التجارب باستخدام القوة الذرية المسافة البادئة تمكين المجهر. في mesosكال، ونحن أداء التجارب المسافة البادئة تأثير باستخدام إندينتر المجهزة القائم على البندول. في macroscale، ونحن إجراء مواز لوحة rheometry لقياس التردد يعتمد القص الرجوعية المرنة. نحن أيضا مناقشة التحديات والقيود المرتبطة بكل طريقة. معا هذه التقنيات تمكن توصيف الميكانيكية للأنسجة المخ والتي يمكن استخدامها لفهم أفضل للبنية الدماغ وهندسة المواد مستوحاة من الحيوية في العمق.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

معظم ما الأنسجة الرخوة التي تضم أجهزة البيولوجية هي ميكانيكيا ومعقدة من الناحية الهيكلية، من صلابة منخفضة مقارنة مع العظام المعدنية أو المواد الهندسية، ويحمل غير الخطية والتي تعتمد على الوقت تشوه. مقارنة مع الأنسجة الأخرى في الجسم، وأنسجة المخ متوافقة بشكل ملحوظ، مع الرجوعية E مرنة بناء على أمر من 100s من السلطة الفلسطينية 1. أنسجة المخ المعارض التجانس الهيكلي مع الرمادي متميزة وinterdigitated والمناطق المادة البيضاء التي تختلف أيضا وظيفيا. سيساعد فهم الميكانيكا أنسجة المخ في تصميم المواد والنماذج الحسابية لتقليد استجابة من الدماغ أثناء الإصابة، وتسهيل التنبؤ الأضرار الميكانيكية، وتمكين الهندسة استراتيجيات وقائية. بالإضافة إلى ذلك، هذه المعلومات يمكن استخدامها للنظر في أهداف التصميم لتجديد الأنسجة، وإلى فهم أفضل للتغيرات الهيكلية في أنسجة المخ التي ترتبط مع أمراض مثل التصلب المتعدد ومرض التوحد. Hيحرث، نحن وصف وشرح العديد من المقاربات التجريبية المتوفرة لتوصيف خصائص اللزجة من الأنسجة المتوافقة ميكانيكيا بما في ذلك أنسجة المخ، في الصغرى، meso-، وجداول الماكرو.

في الميكروسكيل، أجرينا زحف الامتثال واجبار التجارب الاسترخاء باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) المسافة البادئة تعمل بتقنية. عادة، يتم استخدام المسافة البادئة تمكين AFM لتقدير معامل المرونة (أو تصلب لحظية) من عينة 2-4. ومع ذلك، فإن الصك نفسه يمكن أن تستخدم أيضا لقياس اللزجة الميكروسكيل خصائص (زمنية أو التي تعتمد على معدل) 5-10. مبدأ هذه التجارب، كما هو موضح في الشكل رقم 1، هو البادئة فؤاد الكابولي التحقيق في أنسجة المخ، والحفاظ على حجم معين من القوة أو عمق المسافة البادئة، وقياس التغيرات المقابلة في عمق المسافة البادئة وقوة، على التوالي، مع مرور الوقت. باستخدام هذه البيانات، يمكننا حساب شركات زحفliance جي سي والاسترخاء معامل G على التوالي.

في النطاق المتوسط، أجرينا تجارب المسافة البادئة تأثير في ظروف مغمورة السوائل التي تحافظ على بنية الأنسجة ومستويات الترطيب، وذلك باستخدام nanoindenter المجهزة القائم على البندول. ويتضح من الإعداد التجريبية في الشكل 2. كما يتأرجح البندول في اتصال مع الأنسجة، والتحقيق يتم تسجيل النزوح بوصفها وظيفة من الوقت حتى يأتي البندول تتأرجح للراحة داخل الأنسجة. من الناتج ثبط الحركة التذبذبية التوافقي لجنة التحقيق، يمكننا حساب أقصى عمق الاختراق س كحد أقصى، وتبديد الطاقة قدرة وعامل الجودة تبديد Q (التي تتعلق معدل تبديد الطاقة) من الأنسجة 11،12.

في macroscale، استخدمنا لوحة مقياس غلفاني مواز لقياس تردد القص تعتمد الرجوعية المرنة،وصف تخزين معامل G 'وفقدان معامل G "، من الأنسجة. في هذا النوع من rheometry، ونحن نطبق سلالة الزاوي التوافقي (وسلالة القص المقابلة) في سعة المعروفة والترددات وقياس عزم الدوران reactional (وإجهاد القص المقابلة) ، كما هو مبين في الشكل (3). من الناتج السعة ومرحلة متخلفة من عزم الدوران قياس والمتغيرات الهندسية للنظام، يمكننا حساب G 'وG "على ترددات التطبيقية التي تهم 13،14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة البحوث الحيوانية من مستشفى بوسطن للأطفال ويتوافق مع المعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. ماوس الدماغ إجراءات الأنسجة شراء (للتسنن تمكين AFM والمسافة البادئة الأثر)

  1. تحضير خليط الكيتامين / زيلازين لتخدير الفئران. الجمع بين 5 مل الكيتامين (500 ملغ / مل)، 1 مل زيلازين (20 ملغ / مل) و 7 مل من 0.9٪ محلول ملحي.
  2. حقن الفأر (السلالة: TSC1، SYN-لجنة المساواة العرقية، حزب العمال التقدمي-EGFP، العمر: P21، الجنس: ذكر أو أنثى) مع 7 ميكرولتر في الجسم غرام من الحل الكيتامين / زيلازين.
  3. مرة واحدة يتم تخدير الماوس بشكل كامل، كما يتبين من عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين والذيل القرصات، الموت ببطء الماوس عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص تشريح كبيرة.
  4. إزالة الجمجمة عن طريق خفض منتصف باستخدام مقص تشريح الصغيرة. بدءا من المخيخ، عينيقطع اوفه من الجمجمة باستخدام ملقط المنحنية. بعد إزالة الجمجمة، واستخراج الدماغ باستخدام ملعقة مسطحة لرفع الدماغ، بدءا من المخيخ، ووضع الدماغ على طبق بيتري. إزالة المخيخ من الدماغ باستخدام شفرة حلاقة.
  5. في حالة استخدام كامل الدماغ للاختبارات المسافة البادئة تأثير على أنسجة جديدة، نقل الدماغ في أنبوب القاع مستديرة مع CO 2 مستقلة من وسط غذائي لالأنسجة العصبية الكبار على الجليد، والشروع في الفقرة 4. المضي قدما إلا إلى الخطوة 1.6 تشريح إجراءات.
  6. ضبط إعدادات vibratome إلى سرعة 0.7 ملم / ثانية، تردد الاهتزاز من 70 هرتز، وسمك شريحة من 350 ميكرون. تحيط طبق vibratome مع الثلج. وضع لمسة من superglue على لوحة vibratome وجبل الدماغ بحيث يمكن خفض شرائح الاكليلية، مع الدماغ توجه لقطع طريق الجانب الظهري أولا.
  7. ملء الطبق vibratome مع ما يكفي من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) لغمر فقط الدماغ. رفعالطبق على vibratome بحيث يتم غمر شفرة فقط في DPBS.
  8. الصحافة البدء في تشريح أقسام الدماغ الاكليلية 350 ميكرون سميكة تبدأ.
  9. باستخدام فرشاة التلوين لتجنب الأضرار التي لحقت الأنسجة، ونقل شرائح الدماغ من الحمام vibratome DPBS وفي أنبوب القاع مستديرة مع CO 2 مستقلة من وسط غذائي لالأنسجة العصبية الكبار على الجليد وإجراء القياسات على أنسجة جديدة خلال 48 ساعة. لبدء التجارب المسافة البادئة تمكين AFM، انتقل إلى القسم 3.

2. خنزير الدماغ إجراءات الأنسجة شراء (لالريولوجيا)

  1. الحصول على شرائح sagittally نصف الخنازير في الدماغ داخل ~ 1 ساعة التضحية من جزار المحلية. ضع نصف الدماغ في CO 2 مستقلة من وسط غذائي لالأنسجة العصبية الكبار، وتخزينها على الجليد.
  2. استخدام شفرة حلاقة أو مشرط لجعل سميكة شريحة الدماغ الاكليلية ~ 5 ملم ومخزن في CO 2 مستقلة من وسط غذائي لالأنسجة العصبية البالغة. تأكد من أن surfac شريحةالبريد مسطح قدر الإمكان. استخدام الاقتراحات الجانبية حذرا مع الحلاقة / مشرط خلال باجتزاء.
  3. متجر أنسجة الخنزير الدماغ في CO 2 مستقلة من وسط غذائي لالأنسجة العصبية الكبار على الجليد وإجراء قياسات rheometry (القسم 5) على أنسجة جديدة خلال 48 ساعة.

3. القوة الذرية مجهر تمكين المسافة البادئة

  1. إعداد أطباق 60 ملم القطر بيتري (P60) مع bioadhesive المستمدة من بلح البحر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. إعداد المخزون من حل العازلة محايد تتكون من 0.1 M بيكربونات الصوديوم في الماء المعقم مع درجة الحموضة المثلى من 8.0. فلتر تعقيم (0.2 ميكرون) المخزن المؤقت بيكربونات الصوديوم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. في غطاء تدفق الصفحي، خلط محلول 6.25٪ المستمدة من بلح البحر هيدروكسيد الصوديوم لاصقة الحيوية و3.125٪ في المخزن المؤقت بيكربونات الصوديوم.
    3. 100μl ماصة من الحل الحيوية اللصق من 3.1.2 إلى 60 مم القطر بيتري (P60) طبق واستخدام ماصة لنشر سولution في دائرة قطرها 3-5 سم.
    4. ترك P60 أطباق كشف في الصفحي غطاء تدفق والسماح حل الجافة (~ 30 دقيقة). أطباق غسل 1X مع برنامج تلفزيوني و 2x مع الماء المعقم. اسمحوا الجافة أطباق الهواء في غطاء تدفق الصفحي وتخزينها في كيس من البلاستيك مختوم في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  2. معايرة AFM وانشاء عينة الدماغ في AFM.
    ملاحظة: اتبع تعليمات AFM معايرة حسب الشركة المصنعة.
    1. بعناية تحميل التحقيق AFM مع ثابت الربيع الاسمي من 0.03 نيوتن / متر و 20 ميكرومتر قطرها البورسليكات حبة إلى صاحب التحقيق.
    2. معايرة ثابت الربيع ومعكوس حساسية رافعة البصرية (InvOLS) من ناتئ فؤاد باستخدام طريقة ضبط الحراري 15،16.
      ملاحظة: عندما يتم حساب ثابت الربيع الى اجراء تحقيق AFM، ينبغي أن تظل ثابتة مع الاستخدام المتكرر. ومع ذلك، سوف تحتاج إلى تعديلها في كل مرة يتم تكييفها ليزر مع ناتئ في InvOLS ناتئ. بالإضافة إلى ذلك، المعايرةيجب أن يتم تنفيذ ضد عدة أجل ركيزة من حجم أكثر صلابة من ناتئ، مثل البوليسترين.
    3. تشغيل سخان محمولة على خشبة المسرح، وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    4. تركيب شريحة الدماغ على الأطباق P60 أعدت في القسم 3.1.
      1. صب بلطف 350 ميكرون شريحة سميكة الدماغ، وكذلك CO 2 متوسطة مستقلة من من قارورة أسفل جولة في طبق P60 المغلفة مع bioadhesive المستمدة من بلح البحر.
      2. عن طريق إمالة بلطف طبق P60، ضع شريحة الدماغ في وسط الطبق. إذا لزم الأمر، ماصة ببطء المتوسطة من pipetter اليدوي لتتكشف شريحة الدماغ الذي مطوية على نفسها أو على وضع أفضل شريحة الدماغ في وسط الطبق.
      3. إزالة بعناية وسائل الإعلام الزائد باستخدام pipetter P1000 (لا تستخدم الفراغ).
      4. وضع غطاء على طبق P60 والسماح للشريحة الدماغ تلتزم لمدة 20 دقيقة.
    5. إزالة الرأس AFM، ضع شريحة الدماغ التي تقام في P60طبق على المسرح AFM، وإضافة ~ 2 مل قبل تحسنت CO 2 متوسطة مستقلة من.
    6. بعناية إضافة قطرة من وسائل الإعلام على التحقيق AFM لحمايتها من كسر بسبب التوتر السطحي عندما يخفض ذلك إلى وسائل الإعلام المحيطة شريحة الدماغ.
    7. إعادة رئيس فؤاد على خشبة المسرح، والبدء في خفض رأسه حتى غمرت ذلك في وسائل الإعلام.
    8. باستخدام كاميرا CCD أعلى عرض، إعادة الليزر على تعزية.
      ملاحظة: محاذاة الليزر على ناتئ سيكون قد تغير قليلا بسبب اختلاف في معامل انكسار الهواء والمتوسطة.
    9. الانتظار 5 دقائق لتعزية للتكيف مع الغرق في السائل الدافئ، ثم إعادة تعيين محاذاة مرآة لانحراف الحر لل0 خامسا
    10. تشغيل الطيف الحراري على التحقيق AFM وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 16. استخدام نوبة من الذروة الحرارية الأولى لإعادة حساب InvOLS التحقيق AFM في وسائل الإعلام.
    11. باستخدام المجهر الضوئي،نقل المرحلة عينة من هذا القبيل أن منطقة الدماغ من الفائدة تحت التحقيق فؤاد.
      ملاحظة: إن الجسم الثفني تظهر الظلام كما هو أكثر غموضا من المادة الرمادية المحيطة بها. القشرة متفوقة على الجسم الثفني.
    12. إعادة تعيين محاذاة مرآة لانحراف الحر لل0 خامسا
    13. على مبلغ والإمالة متر في البرنامج AFM، انقر فوق "الانخراط" لإشراك رئيس فؤاد.
    14. عن طريق الاتصال الهاتفي موقف على رأسه فؤاد، خفض رأسه حتى يتم الاتصال بين ناتئ وعينة.
  3. (اختياري) إذا رغبت في ذلك، وقياس معامل مرونة من العينة، كما هو موضح سابقا 4،17،18.
  4. إجراء التجارب الامتثال زحف.
    1. بناء وظيفة القوة المطبقة في تحرير وظيفة البرنامج. وتتكون وظيفة القوة من منحدر 0.1 ثانية إلى نقطة مجموعة من 5 ن ن وأنه عقد لمدة 20 ثانية، تليها 1 ثانية منحدر أسفل إلى القوة المطبقة من 0 ن ن.
      1. على المسافة البادئة ماستر Pآنيل، وفقا لطريقة المسافة البادئة، حدد "تحميل" لوضع إندينتر. "N" للوحدات. و "تحرير وظيفة" لإندينتر وظيفة.
      2. في المحرر وظيفة، على لوحة Parms القطاع، وخلق شريحة وظيفة القوة المطبقة الذي يبدأ في 0 ن ن، وينتهي في 5 NN، في زمن قدره 0.1 ثانية. انقر على "إدراج ->".
      3. لهذا الجزء المقبل، تعيين تبدأ في 5 NN، نهاية إلى 5 ن ن، والوقت إلى 20 ثانية. انقر على "إدراج ->".
      4. لهذا الجزء النهائي، تعيين تبدأ في 5 NN، نهاية ل0 ن ن، والوقت ل1 ثانية. انقر على "رسم" وإغلاق نافذة محرر وظيفة.
    2. على علامة التبويب قوة الفريق ماستر، تحقق "منحدر إندينتر بعد الزناد" وضبط وظيفة القوة المطبقة لتحريك بعد الوصول إلى نقطة الزناد من 0.1 V.
    3. انقر على "قوة واحدة" على الجزء السفلي من علامة التبويب قوة الفريق الرئيسي، الذي من شأنه أن يؤدي وظيفة القوة المطبقة شيدت من أجل الامتثال زحف.
    4. بعدالانتهاء تسنن قوة واحدة، ورفع رئيس AFM بحيث يكون من الاتصال مع العينة ومن ثم إعادة الانخراط في الرأس وإعادة الصفر انحراف مجانا.
    5. إعادة المرحلة عينة لتحديد منطقة جديدة من الفائدة، وخفض رأس AFM لاجراء اتصالات. ملاحظة: يجب أن تراجع رئيس فؤاد من سطح العينة عندما يتم نقل مرحلة العينة. يمكن عدم القيام بذلك يؤدي إلى الأضرار التي لحقت ناتئ فؤاد دقيق.
    6. كرر الخطوات 3.4.3-3.4.5 حتى تم جمع المبلغ المطلوب من البيانات.
  5. إجراء التجارب الاسترخاء القوة.
    1. بناء وظيفة المسافة البادئة تطبيقها في محرر وظيفة البرنامج. وتتكون وظيفة المسافة البادئة من منحدر 0.1 ثانية إلى نقطة مجموعة من 3 ميكرون والاحتفاظ بها لمدة 20 ثانية، تليها 1 ثانية المنحدر وصولا الى عمق المسافة البادئة 0 ميكرون.
      1. على لوحة ماستر المسافة البادئة، وفقا لطريقة المسافة البادئة، حدد "المسافة البادئة" لوضع إندينتر. "م" عن وحدة؛ و"، وظيفة محرر "لإندينتر وظيفة.
      2. في المحرر وظيفة، على لوحة Parms القطاع، وخلق شريحة وظيفة القوة المطبقة الذي يبدأ في 0 ميكرون، وينتهي في 3 ميكرون، في زمن قدره 0.1 ثانية. انقر على "إدراج ->".
      3. لهذا الجزء المقبل، تعيين تبدأ في 3 ميكرون، نهاية إلى 3 ميكرون، والوقت إلى 20 ثانية. انقر على "إدراج ->".
      4. لهذا الجزء النهائي، تعيين تبدأ في 3 ميكرون، نهاية ل0 ميكرون، والوقت ل1 ثانية. انقر على "رسم" وإغلاق نافذة محرر وظيفة.
    2. على علامة التبويب قوة الفريق ماستر، تحقق "منحدر إندينتر بعد الزناد" وضبط وظيفة القوة المطبقة لتحريك بعد الوصول إلى نقطة الزناد من 0.1 V.
    3. انقر على "قوة واحدة" على الجزء السفلي من علامة التبويب قوة الفريق الرئيسي، الذي من شأنه أن يؤدي وظيفة المسافة البادئة تطبيق شيدت لقوة الاسترخاء.
    4. بعد الانتهاء من تسنن قوة واحدة، ورفع رئيس AFM بحيث يكونمن اتصال مع العينة ومن ثم إعادة إشراك الرأس وانحراف إعادة الصفر.
    5. إعادة المرحلة لتحديد منطقة جديدة من الفائدة، وخفض رأسه لاجراء اتصالات.
    6. كرر الخطوات من 5،3-5،5 حتى يتم جمع المبلغ المطلوب من البيانات.
  6. تختتم التجارب والتنظيف.
    1. بعد عدة تجارب الختامية، ورفع رئيس فؤاد وإزالته من العينة.
    2. استخدام الأنسجة مختبر لإزالة بعناية السائل الزائد دون لمس ناتئ.
    3. بعناية تنظيف حامل ناتئ فؤاد باستخدام كمية صغيرة من الايثانول. لا تعرض الالكترونيات الدقيقة على حامل ناتئ إلى الإيثانول. إزالة ناتئ فؤاد وضعها في وعاء التخزين.
    4. التخلص من عينة أنسجة المخ من خلال اتباع البروتوكولات المناسبة للسلامة الأحيائية.
  7. باستخدام MATLAB، وحساب الامتثال زحف والقوة الاسترخاء الرجوعية باستخدام الهندسة إندينتر، وفقا لحل يكتسبه لي وRadok، 1960 19.
    1. حساب قوة F وعمق المسافة البادئة المعادلة 1 من البيانات على موقف ناتئ ض، انحراف د، وثابت الربيع، ك ج

      المعادلة 1 و المعادلة 1 .
    2. تحديد نقطة اتصال على طول منحنى المسافة البادئة باستخدام الخوارزمية الموضحة في لين وآخرون. 20.
    3. تحديد إطار الاهتمام لتحليل البيانات. نافذة الفائدة المنطقة حيث يتم الاحتفاظ إما قوة (للامتثال زحف) أو عمق المسافة البادئة (للقوة الاسترخاء) بقيمة المضبوطة مسبقا (أي منطقة 3 كما هو موضح في الشكل 1C، D).
    4. للتجارب الامتثال زحف، وحساب تجريبي زحف معامل الامتثال، J ج (ر)، وردا على الحمل خطوةن 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      المعادلة 1 ،
      حيث H (ر) هي وظيفة خطوة Heavyside وR هو نصف قطرها من التحقيق كروية.
    5. للتجارب قوة الاسترخاء، وحساب تجريبي معامل القوة الاسترخاء، G R (ر)، وردا على عمق خطوة المسافة البادئة المعادلة 1 :
      المعادلة 1 .

4. تأثير المسافة البادئة

  1. معايرة nanoindenter المجهزة وضبط الإعدادات الافتراضية لتمكين التجارب تأثير الحيوية على أنسجة المخ المائية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. جبل تحقيق كروية من الانزلاق وضعها على البندول باستخدام الملقط.
    2. الغراء عينة الكوارتز المنصهر على آخر عينة، الذي هو مشدود إلى متعديةالمسرح.
    3. انتقل إلى القائمة المعايرة واختر "خلية السائل." اتبع تعليمات البرنامج على اجراء اتصالات مع عينة الكوارتز المنصهر.
    4. حدد "عادي" لنوع إندينتر واستخدام القيمة الافتراضية من 0.05 مليون لتحميل إندينتر. انقر على "متابعة" لأداء المعايرة لتكوين إندينتر العادي.
    5. نقل المرحلة عينة الظهر لا يقل عن 5 مم. تركيب ذراع الرافعة، والذي يسمح لجنة التحقيق أن خفضت في الخلية السائلة، وتكرار المعايرة الخلية السائلة في التكوين الجديد عن طريق اختيار "خلية السائل" لنوع إندينتر. انقر على "متابعة" للحصول على السائل عامل المعايرة الخلية.
    6. تفعيل خيار البرمجيات خلية السائل عن طريق الذهاب إلى قائمة تجربة واختيار "خيارات الخاصة." استخدام أحدث قيمة المعايرة.
    7. زيادة التباعد لوحة مكثف لأن هذا سيؤدي إلى أقصى عمق للقياس أكبر، وهو أمر ضروري عند اختبار المهزومةالمواد متوافقة مع HLY.
      1. ضمن القائمة النظام، حدد "إعدادات غير المحمية" و "معلمات آلة" لتغيير معدل اختبار البندول الحمل، ومعدل الحمل الصفر، ومنحدر الاستعداد تعويض إلى 0.5 مليون / ثانية، 0.1 مليون / ثانية، و 3 V، على التوالي.
      2. مع وجع، وتحويل المكسرات الثلاثة التي تتحكم في تباعد في اتجاه عقارب الساعة لوحة مكثف في زيادات صغيرة.
      3. بعد كل بدوره في اتجاه عقارب الساعة كاملة، حدد "تعديل جسر بوكس" ضمن القائمة الصيانة والحصول على اختبار البندول جيد، الأمر الذي يتطلب تحريك الوزن مكافحة التوازن بعيدا عن البندول.
      4. كرر الخطوات 4.1.7.2-4.1.7.3 حتى يقرأ معايرة عمق التقريبية لقيمة 70000 نانومتر / V أو أعلى.
    8. ضع حدا الحد الجديد في الجزء السفلي من البندول التي يمكن أن تحول على نحو متقطع عن طريق امدادات الطاقة. التراجع عن وقف الحد الأصلي يجلس وراء البندول لإزالة العراقيل المحتملة للحركة البندول والسماح للأعلىالسرعات تأثير فضلا عن ارتفاع أعماق اختراق عينات متوافقة.
    9. تسمح الحكومة للوصول إلى التوازن الحراري (يستغرق حوالي 1 ساعة).
    10. في حين equilibrates مجلس الوزراء، والعودة إلى القائمة النظام وحدد "إعدادات غير محمية" و "معلمات آلة". تعيين عمق معايرة (dcal) الاتصال السرعة إلى 1 ميكرون / ثانية، والابتدائية المسافة البادئة الاتصال السرعة إلى 3 ميكرون / ثانية، وسرعة فائقة منخفضة تحميل اتصال إلى 1 ميكرون / ثانية.
    11. ضمن القائمة المعايرة، إجراء معايرة عمق القياسية في هذا التكوين الجديد.
    12. بدوره على امدادات الطاقة عن الملف اللولبي وتعيينه إلى 10 خامسا العودة إلى القائمة تجربة وحدد "الأثر" و "ضبط الاندفاع المهجرين". اتبع تعليمات البرنامج (المطالبات التلقائية) لمعايرة المسافة تأرجح البندول.
  2. تركيب الأنسجة مخ الفأر في الخلية السائلة.
    1. بعد حصاد الدماغ كله من الظريفص 1،5، واحفظها مباشرة في CO 2 وسط غذائي مستقلة من وسائل الإعلام الأنسجة العصبية الكبار على الجليد.
    2. عندما الإعداد تأثير المسافة البادئة اكتمال بالكامل، ونقل بعناية الدماغ في طبق بتري جنبا إلى جنب مع CO 2 متوسطة مستقلة من. شريحة الدماغ إلى 6 ملم أبواب سميكة مع الأسطح المسطحة على أي من الجانبين.
    3. تلتزم الأنسجة شرائح لعينة آخر الألمنيوم بطبقة رقيقة من مادة لاصقة cyanoacrylate.
    4. الشريحة الخلية السائلة على الثانية يا الدائري على آخر عينة، وملء الخلية السائلة مع 5 مل من CO 2 متوسطة مستقلة من أن تزج تماما الأنسجة. ثم هي التي شنت هذا المنصب عينة بعناية على خشبة المسرح متعدية داخل nanoindenter المجهزة.
  3. قياس استجابة تأثير أنسجة المخ.
    1. إذا لزم الأمر، وإزالة التحقيق كروية واستبدالها مع لجنة التحقيق من الفائدة دون إزالة ذراع الرافعة.
    2. ضمن القائمة النظام، حدد "غير المحميةإعدادات "و" معلمات آلة. "تغيير سرعة تأثير الاتصال الابتدائية إلى 5 ميكرون / ثانية.
    3. مع حمام عينة منخفضة (الاتجاه -z) وبعيدا عن البندول (+ س الاتجاه)، التحرك في اتجاه -x حتى يقع في تلميح على ذراع الرافعة بشكل صحيح فوق الحمام. التحرك في اتجاه z + حتى يتم المغمورة تماما طرف في الحمام وأمام العينة.
    4. باستخدام إطار التحكم مرحلة عينة، وجعل الاتصال بعناية ومن ثم دعم المرحلة بعيدا عن سطح العينة قبل ما يقرب من 30 ميكرون.
    5. ضمن القائمة تجربة، انقر فوق "الأثر" لإعداد التجربة تأثير. اختيار تحميل الدافع المحدد الذي سوف تتصل مباشرة إلى سرعة التأثير الناتج على أساس المعايرة المسافة البديل. تشغيل التجربة المقرر.
    6. عندما يتأرجح البندول الظهر ويستمر سطح العينة للانتقال إلى طائرة القياس، وتحويل السفلي التبديل الحد توقف قبالة.
    7. مراقبة مثل البندول يتأرجح forwارض للتأثير على العينة. يتم تسجيل تشريد التحقيق بوصفها وظيفة من الزمن من قبل البرنامج.
    8. عندما يظهر إطار المرحلة XYZ، أدر مفتاح الحد توقف مرة أخرى.
    9. كرر الخطوات من 3،4-3،8 لاختبار العديد من الأحمال ومواقع مختلفة حسب الحاجة.
  4. تحليل تشريد المكتسبة مقابل زمن استجابة البندول باستخدام البرامج النصية MATLAB مخصصة لتحديد الحد الأقصى لعمق الاختراق س كحد أقصى، والقدرة على تبديد الطاقة وتبديد عامل الجودة Q 11
    1. انتقل إلى القائمة تحليل وتصدير البيانات في ملف نصي.
    2. اتخاذ مشتق وقت الشخصي تشريد للحصول على سرعة بوصفها وظيفة من الزمن. تعيين الصفر النزوح كنقطة اتصال نقطة س O1.
      ملاحظة: تأثير بسرعة v في الحد الأقصى لسرعة مباشرة قبل الاتصال س كحد أقصى يتوافق مع تشوه الذي التحقيق.سرعة تنخفض لأول مرة إلى الصفر. س O2، وهو ما يعادل س ص، هو الموقف المطلوب على بدء اتصالات مع عينة مشوهة في الدورة القادمة. انتعاش بسرعة v من هو السرعة في تشريد س ص.
    3. تحديد K (الكمية اللابعدية) مثل الطاقة تبدد من قبل عينة طبيعية من مجموع طاقات عينة تعافى وتبدد خلال دورة تأثير الأولى. حساب K والتي تعتمد على الخصائص الجوهرية للالبندول 21 (مثل تصلب التناوب والتخميد معامل)، والعاشر O1، س كحد أقصى، س ص، والخامس في، وضد بها.
      ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات، يمكن الرجوع للعمل Kalcioglu وآخرون، 2011.
    4. منذ يمكن وصفها التشرد حركة متذبذبة متناسق ثبط، وتناسب وظيفة تسوس الأسي إلى الحدود القصوى من ديسوضع مقابل منحنى الوقت.
    5. حساب Q (الكمية اللابعدية) كما π مضروبا في عدد من الدورات المطلوبة لسعة التذبذب لتقليل بعامل ه. قيمة س أعلى يعني انخفاض معدل تبديد الطاقة.

5. دراسة الخواص الانسيابية

  1. انشاء ومعايرة مقياس غلفاني وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. تهيئة مقياس غلفاني عن طريق فتح لوحة الجهاز / السيطرة. في علامة التبويب لوحة التحكم، انقر فوق "تهيئة".
    2. تركيب لوحة 25 مم القطر قياس (PP25) والنظام الحراري.
    3. (اختياري) للحد من الانزلاق بين لوحات مقياس غلفاني والنسيج، قطع شرائح الصنفرة لاصق التي تتناسب مع شكل من أعلى لوحة مقياس غلفاني والالتزام الصنفرة لوحة العلوية والسفلية.
    4. جعل الاتصال بين لوحة العلوية والسفلية بالنقر على "تحديد الفجوة صفر" في لوحة التحكم.
    5. الصفر محول القوة العادي عن طريق المبادرة القطريةCKING "إعادة قوة طبيعية."
    6. إجراء اختبار الجمود عن طريق فتح علامة التبويب خدمة في لوحة التحكم، والنقر فوق "نظام القياس"، ثم النقر فوق "اختبار الجمود". تسجيل الجمود القديم والجديد. تحقق من أن الجمود هو ضمن الحد المسموح به للتحقيق، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  2. عينة الحمل في مقياس غلفاني.
    1. بعد حصاد الأنسجة وتشريح شريحة الاكليلية للدماغ خنزير لسمك ~ 5 ملم، واحفظها على الجليد في CO 2 متوسطة مستقلة من.
    2. وضع الدماغ بين الصفيحتين. إزالة قطرات الماء الكبيرة من السطح العلوي والسفلي من عينة لمنع انزلاق، ولكن لا تجف العينة.
    3. انخفاض ببطء لوحة القياس حتى لوحة على اتصال كامل مع السطح العلوي للنسيج وقوة طبيعية قياس يتفق على 0.01 مليون بعد فترة استرخاء 5-10 دقيقة.
      1. في لوحة التحكم، أدخل ارتفاعات أقل تباعا طن المربع موضع القياس وانقر فوق "موقف قياس" لخفض ببطء لوحة القياس.
      2. عندما في المليمتر اتصال مع الأنسجة، وانخفاض لوحة قياس بزيادات 0.1 ملم حتى لوحة هي تماما في اتصال مع السطح العلوي للنسيج. تأكد من أن قوة قياس العادية هي على الدوام عند 0.01 مليون بعد فترة استرخاء 5-10 دقيقة.
      3. تسجيل قوة طبيعية مدروسة الأولية. ينبغي أن تؤخذ القياسات المتكررة في نفس الضغط الضغوط / السلالات.
    4. تقليم عينة بشفرة البلاستيكية إذا تجاوزت عينة قطر من لوحة. ماصة حجم صغير (~ 1-2 مل) من وسائل الإعلام على حواف العينة على ترطيب الأنسجة.
    5. (اختياري) انخفاض الغطاء الحراري. في لوحة التحكم، ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وانقر على "ضبط".
  3. إجراء مسح السعة لإنشاء مجموعة اللزجة خطية من المواد (أي القصسلالات الذي G 'ومجموعة' 'لثابت) على ترددات من الفائدة (على سبيل المثال، 1 راد / ثانية).
    1. حدد "ملف / جديد". تحت علامة التبويب هلام حدد "الاجتياح السعة: LVE المدى." اختر نافذة وانقر على "قياس 1: الاجتياح السعة". انقر مرتين على مربع التذبذب. أدخل سلالة الأولي والنهائي (على سبيل المثال، ،01-105)، وتردد (على سبيل المثال، 1 راد / ثانية) وعدد من النقاط في العقد (على سبيل المثال، 6 نقاط / ديسمبر). حدد "موافق" وانقر فوق ابدأ ".
    2. كرر هذا الإجراء لعدة شرائح مع التجارب المتكررة لضمان اتساق نطاق مرن خطي. وينبغي أن يظل ضغط محوري من العينة المستمر بين العينات.
  4. إجراء مسح التردد من الأنسجة في سلالة في نطاق اللزجة خطية من الأنسجة (على سبيل المثال، 1٪ سلالة) 22، وعلى مدى التردد من الفائدة (على سبيل المثال، ،1-100 راد / ثانية).
    1. انقر "ملف / الجديد" وتحت علامة التبويب هلام حدد "الاجتياح تردد." انقر نافذة / قياس 1: الاجتياح التردد. انقر مرتين على مربع التذبذب. أدخل نطاق التردد (على سبيل المثال، ،1-100 راد / ثانية)، وسلالة (على سبيل المثال، 1٪ سلالة) وعدد من النقاط في العقد (على سبيل المثال، 6 نقاط / ديسمبر). حدد "موافق" ثم انقر فوق "ابدأ" لبدء الاجتياح تردد.
  5. الاجتياح تكرار التردد (الخطوة 5.4) في مكررة أو يثلث.
  6. مراجعة البيانات التي يتم حسابها تلقائيا والتي تصدرها مقياس غلفاني: G 'وG "بوصفها وظيفة من التردد (تردد الاجتياح) أو سلالة القص (الاجتياح السعة) ملاحظة: G' ومجموعة '' تحسب من العينة (الحد الأقصى ) reactional عزم الدوران السعة T '0، وزاوية الإزاحة الدورانية (أو زاوية انحراف) المعادلة 1 ، ومرحلة متخلفةالمعادلة 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>، استجابة عينة لسلالة متذبذبة التطبيقية (الشكل 3):
    المعادلة 1
    المعادلة 1
    حيث R و h هي دائرة نصف قطرها وارتفاعها من العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 4 المسافة البادئة التمثيلية وقوة مقابل الردود الوقت (الشكل 4B، E) للامتثال زحف ويجبر التجارب الاسترخاء، نظرا لقوة التطبيقية أو تسنن عمق (الشكل 4A، D)، على التوالي. باستخدام هذه البيانات وهندسة النظام، وJ الامتثال زحف ج (ر)، وإجبار الاسترخاء الرجوعية G R (ر) يمكن أن تحسب لمناطق مختلفة من الدماغ (الشكل 4C، F). في حين أن دراسات سابقة أظهرت وجود اختلاف بين الرجوعية المرنة من مناطق مختلفة من الدماغ 23، والخصائص اللزجة قياس في هذا الطريق لشرائح الأنسجة مخ الفأر لا تظهر التباين بين داخل شريحة نسيج معين.

يقيس المسافة البادئة تأثير الخواص الميكانيكية للأنسجة في ارتفاع معدلات مكانيا وزمانيا concentraتيد التحميل. توفر نتائج هذه التجارب من المعلومات حول كيفية تبدد الأنسجة الطاقة في الاستجابة لإصابة مؤلمة أو تشويه مقصود المرتبطة جراحة. حركة متذبذبة ثبط من تحقيق تأثير المسافة البادئة (الشكل 2B) يوفر المعلومات لحساب أقصى عمق الاختراق س كحد أقصى (الشكل 5A)، والقدرة على تبديد الطاقة K (الشكل 5B) وس معدل تبديد الطاقة (الشكل 5C) من الأنسجة. عمق الاختراق يقيس مقاومة التشوه، والذي يرتبط بقوة مع معامل مرونة الأنسجة و: الأنسجة أشد يحمل أعماق اختراق أصغر لسرعة تأثير معين وتأثير الطاقة. قدرة تبديد الطاقة هي مقياس الكمية اللابعدية من مدى الأنسجة تبدد الطاقة تأثير خلال دورة تأثير الأولى. تدابير عامل الجودة تبديد عدد دورات تحدث قبل التذبذبات من أناوثبط MPACT بشكل ملحوظ - وهذا يرتبط مباشرة إلى معدل تبديد الطاقة، وإن كان هذا لا يعبر في وحدات من الزمن. ويمكن قياس هذه المعايير استجابة ثلاثة تأثير في السرعات تأثير مختلفة، الأمر الذي يوفر وسيلة لدراسة الخصائص التي تعتمد على نسبة الأنسجة.

ويبين الشكل 6 macroscale G 'وG "للترددات تتراوح ما بين 0.1 راد / ثانية إلى 50 راد / ثانية، ومعامل التخزين ما يقرب من أمر من حجم أكبر من معامل الخسارة في الترددات المنخفضة. ومع ذلك، فإن النسبة بين التخزين وفقدان الرجوعية ينخفض ​​مع زيادة تردد. وهذا يدل على خصائص المرونة تهيمن على سلوك أنسجة المخ، حيث أن معامل التخزين يصف خصائص المرونة ويصف فقدان معامل خسائر لزجة من المواد. وفي تردد تحميل عالية بما فيه الكفاية، وتخزين وفقدان الرجوعية مساواة، مشيرا إلى النقطة التيالمادة تبدأ في التدفق (أي الخصائص اللزجة تهيمن على السلوك من العينة). بالنسبة لحالة أنسجة المخ قياس كما هو موضح هنا، والقيود المادية من الأجهزة لا تسمح لنا بقياس خصائص المواد على ترددات أعلى.

شكل 1
الشكل 1. رسم توضيحي للامتثال زحف تمكين AFM واجبار التجارب الاسترخاء، وتجرى (أ) تمكين AFM المسافة البادئة باستخدام ناتئ مرنة مع حبة كروية من نانو لدائرة نصف قطرها الميكروسكيل تعلق على نهاية المجانية. (ب) خلال المسافة البادئة، يتم قياس انحراف ناتئ باستخدام الليزر ينعكس قبالة نهاية ناتئ وعلى الثنائي الضوئي. وتجرى (C) تجارب الاسترخاء القوة من خلال تحريك ناتئ إلى عمق التطبيقية مستمر، في حين أن تسوس قوة مع الدقةيتم قياس pect لآخر. تدابير (D) زحف الامتثال لتغيير عمق المسافة البادئة للتعزية مع قوة التطبيقية مستمرة. (C) و (D) تم تقسيمها إلى خمس مناطق (نص الأخضر): (1) نهج لجنة التحقيق AFM لسطح العينة، (2) الاتصال مع عينة وتكثيف لالمضبوطة مسبقا المسافة البادئة / القوة، (3) صيانة المضبوطة مسبقا المسافة البادئة / القوة، (4) الطريق المنحدر إلى أسفل و(5) تراجع لجنة التحقيق AFM من سطح العينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. توضيح من التجارب المسافة البادئة التأثير. (A) رسم تخطيطي للتسنن تأثير، مما يدل على القدرة على إجراء التجارب في ظروف المائية بشكل كامل. (ب) Repres entative الشخصي التحقيق النزوح بوصفها وظيفة من الوقت التي تم جمعها من شريحة دماغ الفأر وملامح سرعة المقابلة. النزوح قياس الرئيسية ومؤشرات قوة الاندفاع حساب المستخدمة لقياس تبديد الطاقة والمشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. رسم توضيحي الموازية التجارب لوحة مقياس غلفاني. (A) رسم تخطيطي لوحة موازية التجربة مقياس غلفاني والتعاريف المتعلقة التطبيقية سلالة القص متذبذبة. تطبيق (ب) ​​الممثل التوتر والإجهاد الناتج بوصفها وظيفة من الزمن. وتحسب تخزين معامل القص G 'وفقدان القص معامل G "من خلال السعة سلالة54201 / 54201eq12.jpg "/>، وعزم دوران السعة T '0، مرحلة متخلفة المعادلة 1 ، التحقيق وعينة دائرة نصف قطرها وعينة ارتفاع ح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. بيانات تمثيلية من الامتثال زحف وقوة التجارب الاسترخاء. (A، B) من البيانات الخام في الشكل 1، يعرف المنطقة من اهتمام للامتثال زحف كما في المرة حيث القوة المطبقة ثابتا (A)، في حين عمق المسافة البادئة يتم قياس (ب). وأقحم في الفقرة (أ) تظهر بيانات من تجربة فاشلة حيث كان بيزو فؤاد قادرللحفاظ على القوة المطبقة وأقحم في الفقرة (ب) يدل على استجابة المسافة البادئة المقابلة، وهو ما يماثل نوعيا لبيانات تجربة ناجحة هو مبين في (ب). (C) مع البيانات من القوة المطبقة، المسافة البادئة يقاس، والمعرفة من هندسة لجنة التحقيق، يتم احتساب الامتثال زحف J ج (ر). (D، E) في قوة الاسترخاء، ويقام عمق المسافة البادئة ثابت (D)، في حين يتم قياس القوة مقابل الوقت (E). (F) باستخدام هذه البيانات، قوة الاسترخاء معامل G R (ر) يمكن حسابها. ويمكن إجراء الامتثال زحف وقوة التجارب الاسترخاء على مناطق مختلفة تشريحيا من الدماغ، مثل الجسم الثفني (الحمراء)، والقشرة (الأزرق). البيانات في (C، F) هي في المتوسط ​​من القياسات من ن = 5 الفئران. الرجاء أنقرك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
يتم احتساب الرقم 5. بيانات تمثيلية من التجارب تأثير المسافة البادئة. أقصى عمق الاختراق س كحد أقصى، والقدرة على تبديد الطاقة ونوعية تبديد عامل س من نسيج مخ الفأر من ملامح التشرد الخام التي تم الحصول عليها في السرعات تأثير مختلفة. تمثل البيانات يعني كما ± الانحراف المعياري (ن = 18 قياسات تكرار في نقطة واحدة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. بيانات تمثيلية من التجارب rheometry. التخزين G 'وفقدان G '' الرجوعية للمن شرائح الاكليلية أدمغة الخنازير. ويتم احتساب tanδ الكمية ونسبة الخسارة إلى معامل التخزين. تمثل البيانات يعني كما ± الانحراف المعياري (ن = 4 قياسات تكرار في نقطة واحدة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كل تقنية الواردة في هذه الورقة يقيس جوانب مختلفة من الخصائص الميكانيكية أنسجة الدماغ. الامتثال زحف والإجهاد الاسترخاء الرجوعية هي مقياس الخواص الميكانيكية تعتمد على الوقت. تمثل التخزين وفقدان الرجوعية الخواص الميكانيكية التي تعتمد على معدل. كما يقيس المسافة البادئة تأثير الخواص الميكانيكية التي تعتمد على معدل، ولكن في سياق تبديد الطاقة. عندما تميز الخواص الميكانيكية النسيج، وتستخدم كل من المسافة البادئة تمكين AFM والريولوجيا عادة الأساليب. المسافة البادئة تمكين AFM مفيدة بشكل خاص لأنه بالإضافة إلى توفير الوقت خصائص المواد تعتمد معلمات تجريبية مختلفة يمكن استخدامها لقياس الخلايا والأنسجة معامل مرونة 4 وحتى تردد خصائص تعتمد 24، كما هو موضح سابقا. ومع ذلك، وتفسير دقيق للبيانات وتصميم التجارب يمكن أن يكون تحديا لأنسجة متوافقة، رطب. بينما التدابير rheometry الأكبر المناسبةروابط النسيج، المسافة البادئة تمكين منهما يبحث مجلدات الميكروسكيل ذات الصلة المكروية الخلايا. توفر المسافة البادئة تأثير وسيلة لتحديد على وجه التحديد كيف تشوه مادة في سياق أثر تحميل المركزة، ودينامية، وهو أمر مفيد في تطبيقات مثل دراسة إصابات في الدماغ الناجم عن تأثير البؤري. في حين أن النتائج من كل تقنية لا يمكن مقارنتها مباشرة، وخصائص تبديد الطاقة تقاس عن طريق المسافة البادئة تأثير تتبع نفس الاتجاهات ومعامل خسارة القص قياس عبر الريولوجيا، كما هو مبين أدناه.

في المسافة البادئة تمكين AFM من أنسجة المخ هو موضح هنا، قمنا بقياس الخصائص اللزجة باستخدام الامتثال زحف والقوة الاسترخاء. بسبب صغر حجم التحقيق AFM، يمكن هذا الأسلوب قياس الخواص الميكانيكية للمناطق متميزة تشريحيا من الدماغ، مثل المناطق المادة البيضاء والرمادية من الجسم الثفني وقشرة، على التوالي (الشكل 4

وجدنا أن السلوك اللزجة من أنسجة المخ تقاس بهذه الطريقة يشبه نوعيا لذكر سابقا النتائج والكين وموريسون (26). في حين أن حجم القيم المقاسة لمعامل الاسترخاء لا نتفق، وهذا هو الأرجح بسبب الاختلاف في الظروف التجريبية. الكين وموريسون استخدام لكمة شقة 250 ميكرون قطر، مقارنة دينا المجال 20 ميكرون قطر. بالإضافة إلى ذلك، الكين وموريسون إجراء قياسات على أنسجة المخ من الفئران، في حين أجرينا القياسات على أنسجة المخ الحصول عليها من الفئران. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، سواء تقنيات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافمحكم الخواص الميكانيكية غير متجانسة داخل أنسجة المخ، أو بشكل أكثر تحديدا، أن المادة البيضاء من الجسم الثفني المعارض انخفاض معامل الاسترخاء من المادة الرمادية من القشرة في الطائرة الاكليلية.

ومن المهم أن نلاحظ أنه في حين حسبنا الامتثال زحف وقوة الرجوعية الاسترخاء ردا على الحمل خطوة طلب أو خطوة المسافة البادئة، على التوالي، وتحميل تطبيق التجربة والمسافة البادئة ليست مثالية (لحظية) وظائف خطوة. يتم تطبيق الأحمال والمسافات البادئة على امتداد فترات زمنية قصيرة (<1 ثانية)، ويمكن لهذه التواريخ تحميل يؤثر على زحف قياس واستجابات الاسترخاء 7،25. على وجه التحديد، على افتراض وتطبيقها خطوة النتائج المسافة البادئة في طفيف تحت تقدير معامل الاسترخاء، في حين افتراض تطبيق نتائج الحمل خطوة في طفيف الإفراط في تقدير معامل الامتثال زحف. فإن التناقضات بين الرجوعية المرنة الفعلية وحساب تنخفض معدلات منحدرمن الأحمال المطبقة وزيادة المسافة البادئة.

خطوة رئيسية في إجراء الاسترخاء الحمل هو اختيار حجم مناسب للقوة المحافظة (أي المضبوطة مسبقا الموافق الجهد الضوئي التي تتصل مباشرة الى القوة المطبقة). يجب اختيار القوة المضبوطة مسبقا للامتثال زحف ذلك ما يلي: (1) استجابة كبيرة بما يكفي لإحداث تغييرات قابلة للقياس بسهولة في عمق المسافة البادئة. و (2) صغيرة بما يكفي أن عمق المسافة البادئة المطلوبة للحفاظ على قوة المضبوطة مسبقا لا تصبح كبيرة جدا بحيث ينجرف خارج نطاق المحرك كهرضغطية AFM أن ينظم الوضع الرأسي للقاعدة ناتئ فؤاد. في بروتوكول المعروضة، اقترحنا قوة المضبوطة مسبقا من 5 NN، التي عملت بشكل جيد من أجل الإعداد التجريبية لدينا. ومع ذلك، إذا كان بيزو AFM غير قادر على الحفاظ على تلك القوة نظرا لنطاق محدود للحركة (انظر الشكل رقم 4A، أقحم)، يمكن خفض هذه القيمة. هذه المسألة التجريبية ليست encountالدو مع التجارب القوة الاسترخاء التي تحافظ على ثابت، وتحسب عمق المسافة البادئة من خلال حلقة مفرغة.

وعلى النقيض من المسافة البادئة تمكين AFM شبه ثابت في nanoNewton (ن ن) حجم القوات وأعماق ميكرون الحجم، وتأثير المسافة البادئة تنطبق على دينامية تحميل مركزة من القوات MN على نطاق وتدابير الاستجابة تشوه العينة إلى أعماق تقترب من مقياس ملليمتر. لقد كانت تستخدم في السابق المسافة البادئة تأثير لقياس السلوك من القلب والكبد 9،11،12، ولاحظ الاعتماد مماثل من استجابة تبديد الطاقة على معدل التحميل لأنسجة من تلك الأجهزة.

تسنن تأثير يمكن أن تستوعب نصف قطر التحقيق بدءا من ميكرون لملم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء التجارب المسافة البادئة تأثير في بيئات مغمورة تماما، والذي يسمح لتوصيف الميكانيكية للأنسجة المائية 21. عند اختبار عينات متوافقة إلى حد كبير مثل أنسجة المخ، عفريتيجب أن تؤخذ الاعتبارات ortant بعين الاعتبار. أولا، أقصى عمق للقياس في مادة ما يقرب من 1 ملم، وجود قيود التي وضعتها جداول الطول من الصك نفسه. أي نزوح مزيد من البندول سيتم وقف جسديا من قبل التصادم بين وشيعة تقع في الجزء العلوي من البندول ولوحة المغناطيسية الثابتة. لأنسجة المخ، وهذا يحد من أعلى سرعة التأثير الذي يمكن تطبيقه بنجاح إلى حوالي 5 ملم / ثانية. لاحظ أنه في حين أن السرعات تأثير هي على الترتيب ملم / ثانية، وكثافة الطاقة سلالة المقابلة هي بناء على أمر من كج / م الذي يقترب الظروف البالستية، ويرجع ذلك إلى أبعاد صغيرة من دائرة نصف قطرها التحقيق 11. ثانيا، من المحتمل أن يصبح من الصعب على أداة للكشف عن اتصال بين التحقيق وسطح الأنسجة. كما يسافر المرحلة عينة نحو التحقيق، تم الكشف عن اتصال عندما يتم الضغط على البندول مرة أخرى بواسطة العينة تتحرك. ومع ذلك، لcomplian للغايةعينات ر، لا يجوز نحيد البندول detectably بينما تخترق التحقيق في العينة.

لمعالجة هذه المشكلة، ونحن يمكن أن تزيد من السرعة التي مرحلة عينة يتحرك مثل هذه من شأنها أن تكون هناك قوة دفع أكبر خلال الاتصال على دفع البندول الظهر. وينبغي أيضا أن تكون العينة شقة قدر الإمكان، إلى مزيد من تقليل أي أخطاء في الكشف عن نقطة الاتصال المناسبة. وأخيرا، لاحظ أن الحمل الأثر ليس حمولة الدافع الحقيقي في أن يستمر التيار الكهرومغناطيسي في الجزء العلوي البندول لتوفير القوة الدافعة لاختراق بعد الصدم الأول. ونتيجة لذلك، قد تحدث زحف خصوصا في ظروف التحميل أعلى، مما يعقد تحليل الخصائص تبديد الطاقة. مزيد من العمل على هذه التقنية يمكن أن تنطوي على فصل الاستجابة زحف من الاستجابة تأثير، وإدخال التحكم في درجة الحرارة لتمكين الدراسات في درجة حرارة الجسم، وبما في ذلك التصور من سطح عينات الأنسجة عن طريق مجهرالبريد متوافق مع الخلية السائلة.

Rheometry يقيس التردد الخواص الميكانيكية تعتمد من المواد الصلبة اللزجة على مستوى macroscale. مكونات القص الرجوعية، تخزين G 'وفقدان G "، يمكن قياس تردد يتراوح عادة ما تمتد 0،001-0،1 راد / ثانية إلى 10-100 راد / ثانية، اعتمادا على الصك، والهندسة التحقيق، وعينة 13 للحصول على القياس الدقيق ، يجب إجراء مسح السعة قبل الاجتياح تردد لتحديد مدى مرونة خطية من المواد، وهذا هو مجموعة من السلالة التي G 'ومجموعة' 'تظل ثابتة 14،27 ​​سلالة القص الذي تم اختياره للتردد. وينبغي أن يكون الاجتياح أعلى مستوى ممكن في حدود اللزجة الخطية (عادة 1-2٪ القص سلالة) بحيث يتم تحقيق عزم دوران كاف خلال قياس، وعزم الدوران خلال القياسات يجب أن تكون دائما في النطاق المسموح به المقدمة من قبل الشركة المصنعة لضمان كماufficient إشارة إلى نسبة الضوضاء.

بالإضافة إلى ذلك، التحقيق rheometry المستخدمة يجب أن تكون كبيرة ممكن لتحقيق أقصى قدر من عزم الدوران، ولكن يجب أن تراكب مع العينة تماما (13). في إعداد العينة، يجب شرائح الأنسجة مسطح ممكن للتقليل من التدرجات الإجهاد عندما يتم الاتصال بين لوحات. عندما يتم الاتصال مع العينة، لا ينبغي أن يكون النسيج أي قطرات الماء عليها للحد من الانزلاق في تلك الواجهة. ومع ذلك، يجب ألا جفت الأنسجة أيضا من قبل أو أثناء القياس لأن هذا سوف تتحلل بنية الأنسجة (13). الأنسجة يجب رطب تماما مع وسائل الاعلام بعد اتصال بين كل من لوحات. ويمكن أيضا أن ترفق لاصقة، ورق زجاج مقاوم للماء إلى لوحات للحد من الانزلاق 28. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين ضغط المحوري لتغيير حجم G 'من أنسجة المخ 29. منذ عينات الريولوجيا وعادة ما تكون رقيقة (~ 5 ملم)، والتغييرات الصغيرة في الارتفاع (~ 500ميكرون) قد تنتج سلالات كبيرة ضغطي (على سبيل المثال، ~ 10٪)، والتغيرات بالتالي هامة في معامل القص. وعلاوة على ذلك، وكانت العينة اللزجة، والمواد الخضوع الإجهاد الاسترخاء بسبب ضغط المحوري 28، والتي قد تؤثر على القياسات. وبالتالي، يجب أن يتم تنفيذ القياسات المتكررة في سلالات محوري التشغيل مماثلة، وينبغي أن يسمح للعينة للاسترخاء (على سبيل المثال، 5-10 دقيقة) قبل القياس. خطأ المرتبطة بهذه الظواهر وجود قيود على هذه التقنية. وتشمل القيود الأخرى من rheometry افتراض أن المواد غير متجانسة والخواص، والتي غالبا ما تكون غير صحيح في عينات الأنسجة 13. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الحفاظ على درجة الحرارة في الظروف الفسيولوجية لأنها سوف تؤثر G 'وG "(22). وفي أنسجة المخ على وجه التحديد، وقد تبين ارتفاع درجات الحرارة في الانخفاض كل من مجموعة" وG' 'متواضعة دون تغيير بهاء قانون السلطةvior مع التردد، وبالتالي التالية في المرة درجات الحرارة تراكب مدير 22،30. البيانات المتوفرة لدينا هي في اتفاق جيد مع دراسات سابقة 22،27 في الدماغ الخنازير، التي لاحظت مقادير مماثلة من G 'ومجموعة' '، فضلا عن قانون السلطة ضعيفة الاعتماد تردد في كل G' وG ".

نسبة tanδ المحسوب = G "/ G '(الشكل 6) يوفر أساس واحد للمقارنة بين rheometry والمسافة البادئة تأثير. وفي المسافة البادئة الأثر، وجدنا أن قدرة تبديد الطاقة أنسجة الدماغ زادت مع زيادة معدلات التحميل. عن طريق rheometry، وجدنا أن كما زاد التردد، كما زادت tanδ. وبعبارة أخرى، فإن المزيد من المواد المبددة على ترددات أعلى. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن قياسات تأثير المسافة البادئة لا كميا ومعامل المرونة مباشرة، أعماق اختراق س كحد أقصى انخفاض مباشرة مع في التزايدز معامل المرونة.

معا، والطرق الموضحة في هذه الورقة تمكين توصيف الميكانيكية للأنسجة المخ في الدقيقة، meso-، وجداول الطول الكلي، وفي معدلات التحميل المختلفة. الأساليب المقدمة هنا يمكن استخدامها على عدد من المواد المتوافقة، بما في ذلك الأنسجة البيولوجية والهلاميات المائية هندسيا. مع فهم متعمق لخصائص اللزجة المتعددة النطاقات من أنسجة المخ، يمكننا تحسين المواد التصميم الهندسي لتقليد الاستجابة الميكانيكية للدماغ. ويمكن لهذه المواد منشط الأنسجة يسهل التنبؤ الضرر والهندسة استراتيجيات وقائية الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخصائص المادية للدماغ يمكن أن تستخدم لتصميم مواد bioinspired لفي المختبر، والدراسات المجراة على فهم أفضل النمو والتواصل بين الخلايا في الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في سياق الأمراض العصبية مثل مرض التوحد والتصلب المتعدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
تميز خصائص متعددة النطاقات الميكانيكية للأنسجة المخ عن طريق مجهر القوة الذرية، تأثير المسافة البادئة، وRheometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter