Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering multiscale Mekaniske egenskaber af hjernevæv Brug Atomic force mikroskopi, Impact Indrykning, og Rheometry

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

At designe og ingeniør materialer inspireret af egenskaberne i hjernen, uanset om mekaniske simulatorer eller vævsregeneration studier, skal hjernevævet selv være godt karakteriseres ved forskellige længde og tidshorisonter. Ligesom mange biologiske væv, hjernevæv udviser en kompleks, hierarkisk struktur. Men i modsætning til de fleste andre væv, hjerne er af meget lav mekanisk stivhed, med Youngs elasticitetsmoduler E af størrelsesordenen 100s Pa. Denne lave stivhed kan præsentere udfordringer til eksperimentel karakterisering af vigtige mekaniske egenskaber. Her viser vi adskillige mekaniske teknikker karakterisering, der er tilpasset til at måle de elastiske og viskoelastiske egenskaber af hydratiserede, overensstemmende biologiske materialer, såsom hjernevæv, på forskellige længdeskalaer og Belastningen. På mikroskala, gennemfører vi krybning-compliance og force afslapning eksperimenter med atomic force mikroskop-aktiveret indrykning. På mėsoscale, vi udfører indvirkning indrykning forsøg med et pendul-baserede instrumenteret indrykning. På Makroskalaplacering gennemfører vi parallel plade rheometri at kvantificere frekvensafhængige forskydning elasticitetsmoduler. Vi diskuterer også de udfordringer og begrænsninger forbundet med hver metode. Sammen disse teknikker muliggøre en grundig mekanisk karakterisering af hjernevæv, der kan anvendes til bedre at forstå strukturen i hjernen og at ingeniør inspireret af biologiske materialer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fleste bløde væv omfattende biologiske organer er mekanisk og strukturelt kompleks, med ringe stivhed sammenlignet med mineraliseret knogle eller manipuleret materialer og udviser ikke-lineær og tidsafhængig deformation. Sammenlignet med andre væv i kroppen, hjernevæv er bemærkelsesværdigt efterlevelse, elasticitetsmoduler E af størrelsesordenen 100s Pa 1. Brain væv udviser strukturel heterogenitet med tydelig og sammenflettet grå og hvid substans regioner, der også adskiller funktionelt. Forståelse hjernevæv mekanik vil støtte i udformningen af ​​materialer og beregningsmodeller at efterligne reaktionen af ​​hjernen under skade, lette forudsigelse af mekaniske skader, og muliggøre konstruktion af beskyttende strategier. Derudover kan disse oplysninger bruges til at overveje design mål for vævsregenerering, og for bedre at forstå de strukturelle ændringer i hjernevævet, der er forbundet med sygdomme, såsom multipel sklerose og autisme. Here, vi beskrive og demonstrere flere eksperimentelle metoder, der er tilgængelige til at karakterisere de viskoelastiske egenskaber af mekanisk kompatible væv, herunder hjernevæv, på mikro-, mellem-, og makro-skalaer.

På mikroskala, vi gennemførte krybe overholdelse og tvinge afslapning eksperimenter ved hjælp atomic force mikroskop (AFM) -aktiveret indrykning. Typisk AFM-aktiveret fordybning anvendt til at estimere elasticitetsmodulet (eller øjeblikkelig stivhed) af en prøve 2-4. Imidlertid kan det samme instrument også anvendes til at måle mikroskala viskoelastisk (tids- eller rate-afhængige) egenskaber 5-10. Princippet i disse eksperimenter, vist i figur 1, er at indrykke en AFM udkraget probe ind i hjernevævet, opretholde en bestemt størrelse af kraft eller fordybning dybde, og måle de tilsvarende ændringer i indrykning dybde og kraft, henholdsvis over tid. Ved hjælp af disse data, kan vi beregne krybe compliance J C og afslapning modulus G R hhv.

På mesoscale, vi gennemførte impact indrykning eksperimenter i fluid-nedsænket forhold, der opretholder vævet struktur og hydrering niveauer, ved hjælp af et pendul-baserede instrumenteret nanoindenter. Forsøgsopstillingen er vist i figur 2. Som pendulet svinger i kontakt med vævet, probedeplacering registreres som funktion af tiden, indtil den oscillerende pendulet kommer til hvile i vævet. Fra den resulterende dæmpede harmoniske oscillerende bevægelse af sonden, kan vi beregne den maksimale indtrængningsdybde x max, energi dissipation kapacitet K, og spredning kvalitetsfaktor Q (som vedrører hastigheden af energi spredning) af vævet 11,12.

På Makroskalaplacering, brugte vi en parallel plade rheometer at kvantificere frekvensafhængige shear elasticitetsmoduler,betegnet opbevaringsmodul G 'og tabsmodul G ", af vævet. I denne type rheometri, pålægges et harmonisk kantet stamme (og tilsvarende stamme forskydning) ved kendte amplituder og frekvenser og måle Reaktionshypnose drejningsmoment (og tilsvarende forskydningsspænding) som vist i figur 3. fra den resulterende amplitude og fase forsinkelse af den målte drejningsmoment og geometriske variable af systemet, kan vi beregne G 'og G "på anvendte frekvenser af interesse 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik Statement: Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af udvalget af Boston Børnehospital Animal Research og overholde National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Mus hjernevæv Acquisition Procedurer (for AFM-aktiveret indrykning og virkning indrykning)

  1. Forbered en ketamin / xylazin blanding til bedøve musene. Kombiner 5 ml ketamin (500 mg / ml), 1 ml xylazin (20 mg / ml) og 7 ml 0,9% saltvandsopløsning.
  2. Sprøjt mus (Race: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP, Alder: p21; Køn: Mand eller kvinde) med 7 pi per gram kropsvægt af ketamin / xylazin løsning.
  3. Når musen er fuldt bedøvet, hvilket fremgår af en mangel på reaktion på tå og hale trykker, aflive musen ved halshugning hjælp af store dissektion saks.
  4. Fjern kraniet ved at skære ned i midten bruge mindre dissektion saks. Starter ved lillehjernen, remove stykker af kraniet ved buede pincet. Efter fjernelse af kraniet, ekstraher hjernen ved hjælp af en flad spatel til at løfte hjernen, der starter ved cerebellum, og placer hjernen på en petriskål. Fjern cerebellum fra hjernen under anvendelse af et barberblad.
  5. Hvis du bruger en hel hjerne for impact indrykning test på frisk væv, overførsel hjerne ind i en rundbundet rør med CO 2 -uafhængig næringssubstrat for voksne nervevæv på is og fortsæt til afsnit 4. Ellers fortsæt til trin 1,6 til udskæring procedurer.
  6. Juster indstillingerne Vibratome til en hastighed på 0,7 mm / sek, en vibration frekvens på 70 Hz, og en skive tykkelse på 350 um. Surround den vibratome skål med is. Placer en klat superlim på vibratome plade og montere hjerne så koronale skiver kan skæres, med hjernen orienteret at skære gennem dorsale side først.
  7. Fyld vibratome skål med nok Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) til kun nedsænke hjernen. Hævefadet på vibratome så bladet bare er nedsænket i DPBS.
  8. Tryk på start for at begynde at skære koronale hjernesnit 350 um tyk.
  9. Brug af malerpensler for at undgå skade på vævet, overføre hjernen skiver fra vibratome DPBS bad og ind i en rundbundet rør med CO2 -uafhængig næringsmedium for voksne nervevæv på is og udføre målinger på frisk væv i 48 timer. Til at begynde AFM-aktiveret indrykning eksperimenter, gå videre til punkt 3.

2. Pig hjernevæv Acquisition Procedurer (for rheologi)

  1. Anskaf en sagittalt skåret porcint halv hjerne indenfor ~ 1 time offer fra en lokal slagter. Placer halv hjerne i CO 2 -uafhængig næringssubstrat for voksne nervevæv, og gemme på is.
  2. Brug et barberblad eller skalpel til at lave en ~ 5 mm tyk koronale hjerne skive og butik i CO 2 -uafhængig næringssubstrat for voksne nervevæv. Sørg for, at skive overflade er så flade som muligt. Brug omhyggelige laterale bevægelser med barbermaskine / skalpel under sektionering.
  3. Store gris hjernevæv i CO 2 -uafhængig næringssubstrat for voksne nervevæv på is og udføre Rheometry målinger (afsnit 5) på frisk væv i 48 timer.

3. atomic force mikroskop-aktiveret Indrykning

  1. Forbered 60 mm-diameter Petri (P60) retter med en musling-afledt bioadhæsiv ifølge producentens anvisninger.
    1. Forbered et lager af neutral pufferopløsning bestående af 0,1 M natriumbicarbonat i sterilt vand med en optimal pH på 8,0. Filter-sterilisere (0,2 mikron) i natriumbicarbonatpuffer og opbevares ved 4 ° C.
    2. I en laminær strømning, blande en opløsning af 6,25% mussel-afledt bio-adhæsive og 3,125% NaOH i natriumbicarbonatbuffer.
    3. Pipette 100 pi af bio-adhæsive opløsning fra 3.1.2 på en 60 mm-diameter Petri (P60) skål og anvendelse pipettespidsen at sprede solution i en cirkel diameter 3-5 cm.
    4. Lad P60 retter afsløret i laminar flow hætte og lad løsning tør (~ 30 min). Vask retter 1x med PBS og 2x med sterilt vand. Lad retter lufttørre i laminar flow hætte og opbevares i en forseglet plasticpose ved 4 ° C i op til 1 måned.
  2. Kalibrer AFM og set-up hjerne prøve i AFM.
    BEMÆRK: Følg AFM kalibrering instruktioner pr producenten.
    1. indlæse omhyggeligt en AFM probe med en nominel fjederkonstant på 0,03 N / m og en 20 um diameter borsilicat vulst i holderen sonden.
    2. Kalibrer fjederkonstanten og inverse optisk løftestang følsomhed (InvOLS) i AFM cantilever ved hjælp af den termiske melodi metode 15,16.
      BEMÆRK: Når fjederkonstanten for en AFM probe er beregnet, skal den forblive konstant ved gentagen brug. Dog vil udliggeren InvOLS skal rekalibreres hver gang laseren reguleret med udliggeren. Derudover kalibreringbør udføres mod et substrat flere størrelsesorden stivere end udliggeren, såsom polystyren.
    3. Tænd scenen monterede varmelegeme og indstille temperaturen til 37 ° C.
    4. Monter hjernen skive ned på P60 retter tilberedt i afsnit 3.1.
      1. Hæld forsigtigt en 350 um tyk hjerne skive, samt CO 2 -uafhængig medium fra den rundbundede kolbe til en P60 skål coatet med muslinge-afledte bioadhæsiv.
      2. Ved langsomt at vippe P60 fad, placere hjernen skive i midten af ​​fadet. Hvis det er nødvendigt, langsomt pipettere medium fra en manuel pipette at udfolde en hjerne skive, der har foldet over sig selv eller bedre position hjernen skive i midten af ​​skålen.
      3. Fjern forsigtigt overskydende medier ved hjælp af en P1000 pipette (brug ikke vakuum).
      4. Placer dækslet på P60 skålen og lad hjernen skive adhærere i 20 min.
    5. Fjern AFM hovedet, placere hjernen skive monteret i P60parabol på AFM scenen, og tilføje ~ 2 ml forvarmet CO2 -uafhængig medium.
    6. Der tilsættes forsigtigt en dråbe medier på AFM probe for at beskytte den fra at bryde på grund af overfladespænding, når den sænkes ned i mediet omgiver hjernen skive.
    7. Flyt AFM hovedet ind på scenen, og begynde at sænke hovedet, indtil det er nedsænket i mediet.
    8. Brug af top-view CCD-kamera, flytte laseren på cantilever.
      BEMÆRK: Tilpasningen af ​​laseren på udliggeren vil have ændret en smule på grund af forskellen i brydningsindeks for luft og medium.
    9. Vent 5 min til cantilever at tilpasse sig at blive nedsænket i en varm væske, skal du nulstille spejlet tilpasning til en gratis afbøjning af 0 V.
    10. Kør en termisk spektrum på AFM probe ifølge producentens anvisninger 16. Brug anfald af den første termiske top til genberegne AFM sondens InvOLS i medierne.
    11. Brug af det optiske mikroskop,flytte prøven fase sådan, at hjernen området af interesse under AFM probe.
      BEMÆRK: corpus callosum vises mørkt, da det er mere uigennemsigtig end den omgivende grå stof. Cortex er overlegen i forhold til corpus callosum.
    12. Nulstil spejlet tilpasning til en gratis afbøjning af 0 V.
    13. På Sum og Afbøjning Meter i AFM software, klik "Engage" at engagere AFM hovedet.
    14. Brug af position skiven på AFM hovedet, sænker hovedet, indtil kontakten mellem cantilever og prøven er lavet.
  3. (Valgfrit) Hvis det ønskes, måler elasticitetsmodul af prøven, som tidligere 4,17,18 beskrevet.
  4. Gennemføre krybe eksperimenter compliance.
    1. Konstruer en påført kraft funktion i softwarens funktion editor. Den kraft funktion består af en 0,1 sek rampe til et sæt punkt af 5 NN og hold den i 20 sekunder, efterfulgt af en 1 sek rampe ned til en påført kraft af 0 NN.
      1. På Indrykning Master PAnel, under indrykning, skal du vælge "Load" for indrykning tilstand; "N" for enheder; og "Function editor" for indrykning Function.
      2. I den funktion editor, på Segment parms Panel oprette en anvendt kraft funktion segment, der starter ved 0 NN, slutter ved fem NN, med en tid på 0,1 sek. Klik på "Indsæt ->".
      3. For det næste segment, sæt begynder at 5 NN, ende på fem NN, og tid til 20 sek. Klik på "Indsæt ->."
      4. For den endelige segment, sæt begynder at 5 NN, ende på 0 NN, og tid til 1 sek. Klik på "Uafgjort" og luk vinduet Function Editor.
    2. På Force Tab af Master Panel, check "indrykning rampe efter trigger" og sæt den påførte kraft funktionen til at udløse efter at have nået en tærskelværdi på 0,1 V.
    3. Klik på "Single force" i bunden af ​​Kraften Tab af Master Panel, hvilket vil udløse den beregnede-påførte kraft funktion for creep overholdelse.
    4. Efterenkelt kraft indrykning er færdig, hæve AFM hovedet, så den er ude af kontakt med prøven og derefter re-engagere hovedet og re-nul gratis afbøjning.
    5. Flyt prøven scenen for at finde et nyt område af interesse, og sænk AFM hovedet for at få kontakt. BEMÆRK: AFM hovedet skal trækkes tilbage fra prøvens overflade, når prøven scenen flyttes. I modsat fald kan resultere i skader på sarte AFM cantilever.
    6. Gentag trin 3.4.3-3.4.5 indtil den ønskede mængde data er blevet indsamlet.
  5. Gennemføre kraft afslapning eksperimenter.
    1. Konstruer en anvendt indrykning funktion i softwarens funktion editor. Den indrykning funktion består af en 0,1 sek rampe til et sæt punkt 3 um og hold den i 20 sekunder, efterfulgt af en 1 sek rampe ned til en fordybning dybde på 0 um.
      1. På Indrykning Master Panel under indrykning, skal du vælge "indrykning" for indrykning tilstand; "M" for enheder; og "; Funktion editor "for indrykning Function.
      2. I den funktion editor, på Segment parms Panel oprette en anvendt kraft funktion segment, der starter ved 0 um, slutter ved 3 pm, med en tid på 0,1 sek. Klik på "Indsæt ->".
      3. For det næste segment, sæt begynder at 3 um, ende på 3 um, og tid til 20 sek. Klik på "Indsæt ->."
      4. For den endelige segment, sæt begynder at 3 um, ende på 0 um, og tid til 1 sek. Klik på "Uafgjort" og luk vinduet Function Editor.
    2. På Force Tab af Master Panel, check "indrykning rampe efter trigger" og sæt den påførte kraft funktionen til at udløse efter at have nået en tærskelværdi på 0,1 V.
    3. Klik på "Single force" i bunden af ​​Kraften Tab af Master Panel, hvilket vil udløse den beregnede-anvendt indrykning funktion for force afslapning.
    4. Efter enkelt kraft indrykning er færdig, hæve AFM hovedet, så den erud af kontakt med prøven og derefter igen i indgreb med hovedet og re-nul afbøjning.
    5. Flyt scenen for at finde et nyt område af interesse, og sænk hovedet for at få kontakt.
    6. Gentag trin 5,3-5,5 indtil den ønskede mængde data er blevet indsamlet.
  6. Indgå eksperimenter og oprydning.
    1. Efter indgåelse eksperimenter, hæve AFM hovedet og fjerne det fra prøven.
    2. Brug en lab væv til forsigtigt at fjerne overskydende væske uden at røre cantilever.
    3. Rengør forsigtigt cantilever indehaveren AFM under anvendelse af en lille mængde ethanol. Udsæt ikke de fine elektronik på cantilever indehaveren til ethanol. Fjern AFM cantilever og sted i en opbevaringsbeholder.
    4. Bortskaf vævsprøven hjernen ved at følge passende biosikkerhed protokoller.
  7. Ved hjælp af Matlab, beregne krybe overholdelse og tvinge afslapning moduli hjælp indrykning geometri, i henhold til den løsning, der er afledt af Lee og Radok, 1960 19.
    1. Beregn kraften F og indrykning dybde ligning 1 fra data på cantilever position z, afbøjning d og fjederkonstanten, k c

      ligning 1 og ligning 1 .
    2. Find kontaktpunkt langs indrykning kurve ved hjælp af algoritmen beskrevet i Lin et al. 20.
    3. Definer et vindue af interesse til dataanalyse. Vinduet af interesse er den region, hvor enten kraft (for krybning compliance) eller fordybning dybde (for force afslapning) holdes ved en setpunkt værdi (dvs. Region 3 som vist i figur 1C, D).
    4. For krybe compliance eksperimenter, beregne den eksperimentelle krybning overholdelse modulus, J c (t) som svar på et trin belastningn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ligning 1 ,
      hvor H (t) er Heavyside trinfunktions og R er radius af den sfæriske probe.
    5. For force afslapning eksperimenter, beregne den eksperimentelle kraft afslapning modulus, G R (t) som svar på et trin indrykningsdybden ligning 1 :
      ligning 1 .

4. Virkningerne indrykning

  1. Kalibrer instrumenteret nanoindenter og justere standardindstillingerne for at muliggøre dynamiske effekt eksperimenter på hydrerede hjernevæv i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    1. Monter en sfærisk sonde ved at skubbe det ind pendulet med en pincet.
    2. Lim et smeltet kvarts prøve ned på prøven stolpe, som er skruet ind i den translationellescene.
    3. Gå til kalibrering menuen og vælg "Liquid Cell." Følg software anvisninger til at tage kontakt med smeltet kvarts prøve.
    4. Vælg "Normal" til indrykning Type og bruge standard værdi på 0,05 mN for indrykning Load. Klik på "Fortsæt" for at udføre kalibreringen for den normale indrykning konfiguration.
    5. Flyt prøveholderen tilbage med mindst 5 mm. Monter vægtstangsarmen, som tillader sonden at blive sænket ned i flydende celle, og gentag det flydende celle kalibrering i den nye konfiguration ved at vælge "Liquid Cell" til indrykning type. Klik på "Fortsæt" for at opnå den Liquid Cell Calibration Factor.
    6. Aktiver Liquid Cell software option ved at gå til Experiment menuen og vælge "Special Options". Brug den nyeste kalibreringsværdi.
    7. Øg kondensator plade afstand, da dette vil føre til en større maksimal målbar dybde, hvilket er nødvendigt, når der testes HIGHly kompatible materialer.
      1. Under System menuen vælges "Ikke Beskyttede Indstillinger" og "Machine parametre" for at ændre pendulet test belastning sats, nul belastning sats, og standby-rampe offset til 0,5 mN / sek, 0,1 mN / sek, og 3 V hhv.
      2. Med en skruenøgle, drej de tre møtrikker, der styrer kondensator plade afstand uret i små intervaller.
      3. Efter hver komplet med uret tur, skal du vælge "Bridge Box Adjustment" under menuen Vedligeholdelse og få en god pendul test, som vil kræve at flytte modvægt vægt væk fra pendulets.
      4. Gentag trin 4.1.7.2-4.1.7.3, indtil den omtrentlige dybde kalibreringen læser en værdi på 70.000 nm / V eller højere.
    8. Placer en ny endestop nederst pendulet, der kan slås til og fra via en strømforsyning. Træk den oprindelige anslag sidder bag pendulet til at fjerne en potentiel obstruktion af pendulet bevægelse og give mulighed for højereindvirkning hastigheder samt højere penetration dybder i overensstemmende prøver.
    9. Lad skabet for at nå termisk ligevægt (tager ca. 1 time).
    10. Mens kabinettet ligevægt, gå tilbage til System menuen og vælge "Ikke Beskyttede Indstillinger" og "Machine parametre." Indstil dybden kalibrering (dcal) kontakt hastighed til 1 um / sek, den primære indrykning kontakt hastighed til 3 um / sek, og den ultra lave kontakt load hastighed til 1 um / sek.
    11. Under Calibration menu, udføre en standard dybde kalibrering i denne nye konfiguration.
    12. Tænd for strømforsyningen til magnetventil og sæt den til 10 V. Gå til Experiment menuen og vælg "Impact" og "Justering Impulse Displacement." Følg software instruktioner (automatiske prompter) at kalibrere swing afstand af pendulet.
  2. Monter muse hjernevæv i den flydende celle.
    1. Efter høst af hele hjernen fra step 1,5, gemme det straks i CO 2 -uafhængig næringssubstrat for voksne nervevæv medier på is.
    2. Når virkningen indrykning opsætningen er helt færdig, omhyggeligt overføre hjernen i en petriskål sammen med CO 2 -uafhængig medium. Skær hjernen til 6 mm tykke sektioner med flade overflader på begge sider.
    3. Overhold den skåret væv til aluminium prøve post med et tyndt lag af cyanoacrylat lim.
    4. Skub flydende celle over den anden O-ring på prøven indlæg, og fylde flydende celle med 5 ml CO 2 -uafhængig medium til fuldt ud at fordybe vævet. Denne prøve indlæg er derefter omhyggeligt monteret på translationel scene inde i instrumenteret nanoindenter.
  3. Måling af, hjernevævet virkninger.
    1. Fjern om nødvendigt den sfæriske sonde og erstatte det med sonden af ​​interesse uden at fjerne vippearmen.
    2. Under System menuen, vælg "Non BeskyttetIndstillinger "og" Machine parametre. "Ændre den primære kontaktperson anslagshastigheden til 5 um / sek.
    3. Med prøven bad lav (-z retning) og langt væk fra pendulets (+ x-retningen), bevæger sig i -x retning indtil spidsen på vægtstangsarmen er korrekt placeret over badet. Bevæge sig i + z-retningen, indtil spidsen er fuldt neddykket i badet og foran prøven.
    4. Brug fase kontrol vinduet prøven, kontakt omhyggeligt og derefter tilbage på scenen væk fra prøven overfladen med ca. 30 um.
    5. Under eksperimentet menuen, klik på "Impact" for at oprette en indvirkning eksperiment. Vælg en specifik impuls belastning, der vil relatere direkte til den resulterende anslagshastighed baseret på swing afstand kalibrering. Kør den planlagte eksperiment.
    6. Når pendulet svinger tilbage og prøven overfladen fortsat at flytte til målingen flyet, drej det nederste anslag sluk.
    7. Overhold som pendulet svinger viderestilard at påvirke prøven. Forskydningen af ​​proben som funktion af tiden vil blive optaget af softwaren.
    8. Når xyz etape vinduet vises, drej grænsen stopkontakt igen.
    9. Gentag trin 3,4-3,8 at teste så mange forskellige belastninger og steder efter behov.
  4. Analyser den erhvervede forskydning vs. tid respons af pendulet hjælp tilpassede MATLAB scripts til at bestemme den maksimale indtrængningsdybde x max, energi dissipation kapacitet K, og spredning kvalitetsfaktor Q. 11
    1. Gå til Analyse menu og eksportere data i en tekstfil.
    2. Tage tid derivat af forskydningen profil for at opnå hastigheden som funktion af tiden. Sæt nul forskydning som kontaktpunkt x o1.
      BEMÆRK: Impact hastighed v i er den maksimale hastighed umiddelbart før kontakt x max svarer til deformation ved hvilken sonden.hastighed først falder til nul. x o2, hvilket svarer til x r, er positionen kræves for at reinitiere kontakt med den deformerede prøve i den næste cyklus. Rebound hastighed v ud er hastigheden ved forskydning x r.
    3. Definer K (uden enhed) som den energi spredes af prøven normaliseret ved summen af de genvundne og spredes prøve energier under det første slag cyklus. Beregn K baseret på iboende egenskaber pendulet 21 (såsom rotationsstivhed og dæmpning koefficient), x o1, x max, x r, v i, og v ud.
      BEMÆRK: For mere information, kan man konsultere arbejde Kalcioglu et al, 2011..
    4. Da forskydning kan beskrives som en dæmpet harmonisk oscillerende bevægelse, passe en eksponentiel henfald funktion til maksima af displacering versus tidskurve.
    5. Beregn Q (uden enhed) som π multipliceret med antallet af cykler, der kræves for svingningsamplituden at falde med en faktor e. En højere Q værdi betyder et lavere energi dissipation sats.

5. Reologi

  1. Set-up og kalibrere rheometer i henhold til fabrikantens anvisninger.
    1. Initialiser rheometer ved at åbne enheden / kontrolpanel. På fanen kontrolpanelet, klik på "initialisere".
    2. Montere 25 mm-diameter måling plade (PP25) og den termiske system.
    3. (Valgfrit) At reducere slip mellem rheometer plader og vævet skåret ud selvklæbende sandpapir skiver, der matcher formen af ​​den øverste rheometerpladen og klæber sandpapir til de øverste og nederste plade.
    4. Gør kontakt mellem top og bund plade ved at klikke på "set nul hul" på kontrolpanelet.
    5. Nul normalkraften transducer ved cliCking "reset normalkraften."
    6. Foretage en inerti test ved at åbne fanen tjeneste på kontrolpanelet, klikke på "målesystem" og derefter klikke på "inerti test". Optag det gamle og nye inerti. Kontroller, at inerti er inden for det tilladelige grænse for sonden, som anført af fabrikanten.
  2. Load prøven i rheometer.
    1. Efter høst vævet og udskæring en koronale segment af gris hjernen til ~ 5 mm tykkelse, skal det opbevares på is i CO 2 -uafhængig medium.
    2. Placer hjernen mellem de to plader. Fjerne store vanddråber fra toppen og bunden overfladen af ​​prøven for at forhindre glidning, men ikke tørrer ud prøven.
    3. Langsomt sænke pladen målingen indtil pladen er i fuld kontakt med den øverste overflade af vævet og den målte normalkraften er konsistent 0.01 mN efter en lempelse periode 5-10 min.
      1. I kontrolpanelet, skal du indtaste en stadig lavere højder in målingen position boksen og klik "måling position" til langsomt sænke pladen måling.
      2. Når inden for en millimeter af kontakt med vævet, sænke pladen måling i intervaller på 0,1 mm, indtil pladen er i fuld kontakt med den øvre overflade af vævet. Sørg for, at det målte-normalkraften er konsekvent 0.01 mN efter en lempelse periode 5-10 min.
      3. Optag den oprindelige målte normalkraft. Gentagne målinger bør tages på samme trykspændinger / stammer.
    4. Trim prøven med en plast kniv, hvis prøven er mere end diameteren af ​​pladen. Afpipetteres en lille volumen (~ 1-2 ml) af medier på kanterne af prøven til hydratisering af vævet.
    5. (Valgfrit) Sænk termiske hætte. På betjeningspanelet, indstille temperaturen til 37 ° C, og klik på "sæt".
  3. Udfør en amplitude sweep at etablere det lineære viskoelastiske område af materialet (dvs. forskydningenstammer ved hvilken G 'og G "" er konstant) ved frekvenser af interesse (fx 1 rad / sek).
    1. Vælg "file / ny". Under fanen gel vælge "Amplitude sweep: LVE-range." Vælg og klik "Måling 1:. Amplitude sweep" Dobbeltklik på svingningerne kassen. Indtast det første og sidste stamme (f.eks 0,01 til 105), frekvensen (fx 1 rad / sek), og antallet af point pr årti (f.eks 6 point / dec). Vælg "ok", og klik på Start. "
    2. Gentag denne procedure for flere skiver med gentagne forsøg på at sikre sammenhæng i det lineære elastiske område. Den aksiale kompression af prøven skal være konstant mellem prøverne.
  4. Gennemføre en frekvens sweep af vævet ved en belastning i det lineære viskoelastiske område af væv (fx 1% deformation) 22, og på et frekvensområde af interesse (f.eks 0,1-100 rad / sek).
    1. Klik "Fil / nye" og under fanen gel vælge "Frequency sweep". Klik på vinduet / Måling 1: Frekvens sweep. Dobbeltklik på svingningerne kassen. Indtast frekvensområdet (f.eks 0,1 til 100 rad / sek), stammen (fx 1% stamme), og antallet af point pr årti (f.eks 6 point / dec). Vælg "ok" og klik på "start" for at starte frekvens sweep.
  5. Gentag frekvens sweep (trin 5.4) i duplikater eller tre eksemplarer.
  6. Gennemgå de data, der beregnes automatisk og eksporteret af rheometer: G 'og G "som en funktion af frekvensen (frekvens sweep) eller snitte stamme (amplitude sweep). BEMÆRK: G' og G '' beregnes ud fra prøvens (maksimum ) Reaktionshypnose drejningsmoment amplitude T '0, og drejningsforskydning vinkel (eller afbøjningsvinkel) ligning 1 Og faseforsinkelseLigning 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, af prøven svar på den påførte oscillerende stamme (figur 3):
    ligning 1
    ligning 1
    hvor R og h er henholdsvis radius og højde af prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 4 viser repræsentative indrykning og kraft vs. tid responser (figur 4B, E) for krybning overholdelse og tvinge afslapning eksperimenter, givet en påført kraft eller fordybning dybde (figur 4A, D) hhv. Ved hjælp af disse data og geometrien af systemet, kan krybning overholdelse J c (t) og tvinge afslapning moduli G R (t) beregnes for forskellige regioner af hjernen (figur 4C, F). Mens tidligere undersøgelser har vist en forskel mellem den elastiske moduli af forskellige områder af hjernen 23, de viskoelastiske egenskaber måles på denne måde for muse hjernevæv skiver viser ikke interregionalt variation inden for et givet væv skive.

Impact indrykning måler de mekaniske egenskaber af vævet ved høje rumligt og tidsligt koncented belastning. Resultaterne af disse eksperimenter giver oplysninger om, hvordan vævet spreder energi som reaktion på traumatisk skade eller tilsigtet deformation forbundet med kirurgi. Den dæmpede oscillerende bevægelse af virkningen indrykning sonde (figur 2B) giver oplysninger til at beregne den maksimale indtrængningsdybde x max (figur 5A), energi dissipation kapacitet K (figur 5B) og energi dissipation Q (figur 5C) af vævet. Penetration dybde måler deformation modstand, som i høj grad korrelerer med vævets elasticitetsmodul: stivere væv udviser mindre penetration dybder for en given anslagshastighed og slagenergi. Energidissipation kapacitet er en uden enhed mål for, i hvilket omfang vævet spreder slagenergien under det første slag cyklus. Dissipation kvalitetsfaktor måler, hvor mange cyklusser ske før svingningerne fra iVIRKNINGER er dæmpet betydeligt - dette relaterer direkte til hastigheden af ​​energi dissipation, selv om dette ikke er udtrykt i tidsenheder. Disse tre impact respons parametre kan kvantificeres ved forskellige virkninger hastigheder, hvilket tilvejebringer et middel til at studere sats-afhængige egenskaber af vævet.

Figur 6 viser makroskala G 'og G "for frekvenser i området fra 0,1 rad / sek til 50 rad / sek. Den opbevaringsmodul er næsten en størrelsesorden større end tabet modulus ved lave frekvenser. Imidlertid er forholdet mellem oplagrings- og tab moduli falder som frekvensen stiger. Dette indikerer, at elastiske egenskaber dominerer opførsel af hjernevæv, eftersom opbevaringsmodulet beskriver elastiske egenskaber og tabsmodulet beskriver viskøse tab af materialet. Ved en tilstrækkelig høj belastning frekvens, vil oplagring og tab moduli sidestille, indikerer det punkt, hvormaterialet begynder at strømme (dvs. viskøse egenskaber dominerer opførsel af prøven). For tilfældet med hjernevæv målt som illustreret heri, har fysiske begrænsninger af instrumentering ikke tillade os at måle materialeegenskaber ved højere frekvenser.

figur 1
Figur 1. Illustration af AFM-aktiverede krybe overholdelse og tvinge afslapning eksperimenter. (A) AFM-aktiveret indrykning udføres ved hjælp af en fleksibel cantilever med en sfærisk kugle af nano- til mikroskala radius knyttet til den frie ende. (B) Under fordybning, er cantilever deformation målt under anvendelse af en laser reflekteres fra enden af udliggeren og på en fotodiode. (C) Kraft afslapning forsøg gennemføres ved at indrykke udliggeren til en konstant anvendt dybde, mens den kraft henfald med resventer at tiden måles. (D) Creep compliance foranstaltninger skiftende indrykning dybde af cantilever med en konstant påført kraft. (C) og (D) er blevet opdelt i fem regioner (grøn tekst): (1) Tilgang af AFM probe til prøven overflade, (2) Kontakt med prøven og rampe op til et setpunkt indrykning / kraft, (3) vedligeholdelse af setpunkt indrykning / kraft, (4) rampe ned og (5) tilbagetrækning af AFM probe fra prøven overflade. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Illustration af impact indrykning eksperimenter. (A) Skematisk af virkningen indrykning, som illustrerer evnen til at udføre eksperimenter i fuldt hydrerede forhold. (B) repræsen tant probedeplacering profil som funktion af tiden er indsamlet fra en musehjerne skive og den tilsvarende hastighedsprofil. Key målte forskydning og beregnede hastighed parametre, der anvendes til at kvantificere energi dissipation er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Illustration af parallelle plade rheometer eksperimenter. (A) Skematisk af parallel plade rheometer eksperiment og definitioner i forbindelse med anvendt oscillerende belastning forskydning. (B) repræsentant påført belastning og deraf følgende stress som en funktion af tiden. Shear lagermodul G 'og shear tabsmodul G "beregnes via stammen amplitude54201 / 54201eq12.jpg "/>, drejningsmoment amplitude T '0, fase forsinkelse ligning 1 , Sonde og prøve radius R, og prøve højde h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentative data fra krybning overholdelse og tvinge afslapning eksperimenter. (A, B) Fra de rå data i figur 1, er en region af interesse defineret for krybning overholdelse som den tid, hvor påførte kraft forbliver konstant (A), mens indrykning dybde måles (B). Indsættelsen i (A) viser data fra et mislykket forsøg, hvor AFM piezo var ikke i standat opretholde den påførte kraft og inset i (B) viser den tilsvarende fordybning respons, som er kvalitativt svarer til dataene i en vellykket eksperiment vist i (B). (C) Med data fra den påførte kraft, målt indrykning og viden om geometri af sonden, er krybning overholdelse J c (t) beregnes. (D, E) I kraft afslapning, er indrykning dybde holdt konstant (D), medens kraft vs. tid måles (E). (F) anvendelse af disse data, kan force afslapning modulus G R (t) beregnes. Creep overholdelse og tvinge afslapning eksperimenter kan udføres på anatomisk forskellige regioner af hjernen, såsom corpus callosum (rød) og cortex (blå). Data i (C, F) er et gennemsnit af målinger fra n = 5 mus. Venligst klikk her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Repræsentative data fra virkningen indrykning eksperimenter. Maksimal indtrængningsdybde x max, energi dissipation kapacitet K, og spredning kvalitetsfaktor Q i mus hjernevæv beregnes ud fra rå forskydning profiler opnået ved forskellige indvirkning hastigheder. Data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (n = 18 gentagne målinger pr punkt). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Repræsentative data fra rheometri eksperimenter. Opbevaring G 'ogtab G '' moduli på fra koronale skiver af svin hjerner. Mængden tanδ beregnes som forholdet mellem tab til lagermodul. Data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (n = 4 gentagne målinger pr punkt). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hver teknik i dette papir måler forskellige facetter af hjernevæv mekaniske egenskaber. Creep overholdelse og stress afslapning moduli er et mål for tidsafhængige mekaniske egenskaber. Opbevaring og tab moduli repræsenterer rate-afhængige mekaniske egenskaber. Impact indrykning måler også rate-afhængig mekaniske egenskaber, men i forbindelse med energispredning. Ved karakterisering væv mekaniske egenskaber, er både AFM-aktiveret indrykning og reologi almindeligt anvendte metoder. AFM-aktiveret indrykning er særlig nyttig, fordi ud over at give tidsafhængig materialeegenskaber, kan forskellige eksperimentelle parametre anvendes til at måle celle og væv elastisk modulus 4 og endda frekvensafhængige egenskaber 24, som tidligere beskrevet. Dog kan nøjagtig fortolkning af data og design af eksperimenter være udfordrende for kompatible, hydrerede væv. Mens Rheometry foranstaltninger bulke korrektbånd af væv, AFM-aktiveret indrykning prober mikroskala mængder relevante for cellernes mikromiljø. Impact fordybning tilvejebringer et middel til at kvantificere specifikt, hvordan et materiale deformerer i forbindelse med en koncentreret, dynamisk indvirkning belastning, hvilket er nyttigt i applikationer som studere traumatisk hjerneskade forårsaget af fokal påvirkning. Mens resultaterne fra hver teknik er ikke direkte sammenlignelige, de energi-dissipation karakteristika målt via virkningen indrykning følge de samme tendenser som tabet shear modul målt via reologi, som beskrevet nedenfor.

I AFM-aktiverede indrykning af hjernevæv illustreret heri målte vi viskoelastiske egenskaber ved hjælp krybe overholdelse og tvinge afslapning. På grund af den lille målestok af AFM probe, kan denne teknik måle mekaniske egenskaber af anatomisk særskilte områder af hjernen, såsom de hvide og grå substans regioner af corpus callosum og cortex, (fig. 4

Vi fandt, at den viskoelastiske opførsel af hjernevæv målt på denne måde er kvalitativt til tidligere rapporterede resultater efter Elkin & Morrison 26. Mens størrelsen af ​​de målte værdier for afslapning modul ikke er enig, dette skyldes sandsynligvis forskellen i eksperimentelle betingelser. Elkin & Morrison bruger en 250 um diameter flad punch, i forhold til vores 20 pm diameter sfære. Derudover Elkin & Morrison udføre målinger på hjernevæv fra rotter, mens vi gennemførte målinger på hjernevæv opnået fra mus. På trods af disse forskelle, både teknikker MMAmåles heterogene mekaniske egenskaber inden hjernevæv, eller mere specifikt, at den hvide substans af corpus callosum udviser en lavere afslapning modulus end den grå substans i cortex i koronale plan.

Det er vigtigt at bemærke, at mens vi beregnet krybe overholdelse og tvinge afslapning moduli som reaktion på en anmodet skridt belastning eller trin indrykning henholdsvis eksperimentelt påførte belastning og indrykning er ikke ideelle (øjeblikkelige) trin funktioner. Belastninger og fordybninger anvendes over korte tidshorisonter (<1 sek), og disse lastning historier kan påvirke den målte krybe og afslapning svar 7,25. Konkret antager en anvendte trin indrykning resultater i svag undervurdering af afslapning modul, mens antage en anvendte trin belastning resulterer i svag overvurdering af krybning overholdelse modul. Uoverensstemmelserne mellem de faktiske og beregnede elastiske moduli vil falde som rampe satseraf de anvendte belastninger og indrykning stigning.

Et vigtigt skridt i at gennemføre afslapning belastning er at vælge den rigtige størrelse af opretholdt kraft (dvs. sætpunktet svarende til fotodiode spænding, der relaterer direkte til den påførte kraft). Sætpunktet kraft for krybning overholdelse skal vælges således, at: (1) svaret er stor nok til at producere let målbare ændringer i indrykning dybde; og (2) små nok, at indrykningen dybde, der kræves for at opretholde den nominelle kraft ikke bliver så stor, at glide uden for intervallet AFM piezoelektriske aktuator, som modulerer den lodrette position af AFM cantilever base. I det præsenterede protokol, har vi foreslået et setpunkt kraft 5 NN, som arbejdede godt for vores forsøgsopstillingen. Men hvis AFM piezo ikke er i stand til at fastholde, at kraft på grund af sin begrænsede vifte af bevægelse (se fig. 4A, indsat), at værdien kan sænkes. Denne eksperimentelle spørgsmål er ikke encountob- med kraft afslapning eksperimenter, der opretholder en konstant, beregnet indrykning dybde gennem en feedback-sløjfe.

I modsætning til den kvasistatiske AFM-aktiveret indrykning på nanonewton (NN) skalere kræfter og um skala dybder, indvirkning indrykning anvender en koncentreret dynamisk belastning på mN skala kræfter og måler prøvens deformation reaktion på dybder nærmer millimeter-skala. Vi har tidligere brugt effekt indrykning at kvantificere adfærd hjerte og lever 9,11,12, og observeret en tilsvarende afhængighed af energi dissipation respons på belastning sats for væv fra disse organer.

Impact indrykning kan rumme probe radier spænder fra um til mm. Derudover kan udføres virkninger indrykning eksperimenter i fuldt nedsænket miljøer, hvilket giver mulighed for den mekaniske karakterisering af hydratiserede væv 21. Ved testning prøver stærkt overensstemmende såsom hjernevæv, impDer skal tages hensyn ortant overvejelser. Først den maksimale målelige dybde i materialet er ca. 1 mm, en begrænsning fastsat af længdeskalaer af selve instrumentet; yderligere pendul forskydning vil være fysisk standset af kollision mellem den elektromagnetiske spole placeret på toppen af ​​pendulet og den stationære magnetiske plade. For hjernevæv, dette begrænser den højeste anslagshastighed der kan udmærket anvendes på ca. 5 mm / sek. Bemærk, at mens hastighederne virkninger er af størrelsesordenen mm / s, de tilsvarende stamme energitætheder er af størrelsesordenen kJ / m 3, hvilket nærmer ballistiske betingelser, på grund af de små dimensioner af sonden radius 11. For det andet kan det potentielt blive vanskeligt for instrumentet at detektere kontakten mellem proben og vævsoverfladen. Som prøven etape bevæger mod sonden, er kontakt opdages, når pendulet er skubbet tilbage af bevægelige prøven. For stærkt complianT sampler, kan pendulet ikke afbøjes detekterbart mens proben trænger ind i prøven.

For at løse dette problem, kan vi øge den hastighed, hvormed prøven fase bevæger sådan, at der vil være en større fart i kontakt til at drive pendulet tilbage. Prøven bør også være så fladt som muligt, for yderligere at minimere eventuelle fejl i detektering af korrekte kontaktpunkt. Endelig bemærkes, at belastningen virkningen er ikke en sand impuls belastning, idet den elektromagnetiske strøm ved pendulet øverst fortsætter med at levere en drivkraft for penetration efter den første effekt begivenheden. Som et resultat heraf kan krybning forekomme specielt ved de højere belastningstilstande, hvilket komplicerer analysen af ​​energi dissipation karakteristika. Det videre arbejde med denne teknik kan involvere afkoble krybe svar fra virkningen respons, indførelse temperaturkontrol for at aktivere studier ved kropstemperatur, og herunder visualisering af vævsprøven overflade via en mikroskopete forenelig med det flydende celle.

Rheometry måler den frekvensafhængige mekaniske egenskaber af viskoelastiske faststoffer på Makroskalaplacering niveau. De shear moduli komponenter, opbevaring G 'og tab G ", kan måles i frekvens ligger typisk spænder 0,001-0,1 rad / sek til 10-100 rad / sek, afhængigt af instrumentet, probe geometri, og prøve 13. Til nøjagtig måling , bør en amplitude sweep udføres før en frekvens feje til at bestemme den lineære elastiske område af materialet, og dette er den række af stammen, for hvilken G 'og G' 'forbliver konstante 14,27 den forskydningsdeformation er valgt til frekvensen. sweep skal være så højt som muligt inden for det lineære viskoelastiske grænse (typisk 1-2% shear belastning), således at tilstrækkelig moment opnås under målingen. drejningsmomentet under målingerne bør altid være i det tilladte område fra producenten at sikre såufficient signal-støj-forhold.

Derudover rheometri probe anvendes, bør være så stor som muligt for at maksimere det drejningsmoment, men skal overlay med prøven fuldstændigt 13. Ved udarbejdelsen af ​​prøven, skal vævet skiver så flade som muligt for at minimere stress gradienter ved kontakt er lavet mellem pladerne. Når kontakten er lavet med prøven, må vævet ikke har nogen vanddråber på det for at minimere slip på denne grænseflade. Dog skal vævet også ikke tørres ud før eller under målingen, da dette vil forringe vævet struktur 13. Vævet bør være fuldt hydreret med medier efter kontakt mellem de to plader. Klæbemiddel, vandtæt sandpapir kan også være knyttet til pladerne for at minimere slip 28. Desuden har aksial kompression vist sig at ændre størrelsen af G 'af hjernevæv 29. Da rheologi prøver er typisk tynde (~ 5 mm), små ændringer i højden (~ 500um) kan producere store kompressionskræfter stammer (f.eks ~ 10%) og derfor signifikante ændringer i forskydningsmodulet. Da prøven er viskoelastiske, vil materialet undergår stress afslapning grundet aksial kompression 28, hvilket kan påvirke målingerne. Således bør gentagne målinger udføres ved tilsvarende drift aksiale stammer, og prøven bør kunne slappe (f.eks 5-10 min) før måling. Fejl i forbindelse med disse fænomener er en begrænsning i teknikken. Andre begrænsninger af rheometri omfatter den antagelse, at materialet er homogent og isotropt, som ofte ikke er tilfældet i vævsprøver 13. Derudover bør opretholdes temperaturen ved fysiologiske betingelser, som det vil påvirke G 'og G "22. I hjernevæv specifikt har øget temperatur vist sig at nedsætte både G' og G '' beskedent uden at ændre styrkelov Behavior med frekvens, og dermed efter den tid og temperatur superposition principal 22,30. Vores data er i god overensstemmelse med tidligere undersøgelser 22,27 i svin hjernen, som observerede lignende størrelser af G 'og G' ', samt en svag magt lov frekvens afhængighed i både G' og G ".

Den beregnede forhold tanδ = G "/ G '(fig. 6) indeholder en basis af sammenligning mellem rheometri og virkningen indrykning. I indvirkning indrykning fandt vi, at hjernevæv energi dissipation steg med øget lastning satser. Brug rheometri, fandt vi, at som frekvensen øges, tanδ også steget. med andre ord var materialet mere dissipative ved højere frekvenser. Og mens virkningen indrykning målinger ikke kvantificere et elasticitetsmodul direkte, den indtrængningsdybder x max fald direkte med increasing elasticitetsmodul.

Sammen er beskrevet i dette papir metoder muliggøre mekanisk karakterisering af hjernevæv på mikro-, meso- og makro- længdeskalaer, og på forskellige lastning satser. De metoder, der præsenteres heri kan bruges på en række kompatible materialer, herunder både biologiske væv og manipuleret hydrogeler. Med en dybdegående forståelse af de multiscale viskoelastiske egenskaber af hjernevæv, kan vi bedre design materialer manipuleret til at efterligne den mekaniske respons i hjernen. Disse væv simulator materialer kan lette forudsigelse af mekaniske skader og teknik af beskyttende strategier. Derudover kan materialeegenskaber hjernen anvendes til at udforme bioinspirerede materialer til in vitro- og in vivo-undersøgelser for bedre at forstå vækst og tilslutning af celler i centralnervesystemet, især i forbindelse med neurologiske sygdomme, såsom autisme og multipel sklerose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Karakterisering multiscale Mekaniske egenskaber af hjernevæv Brug Atomic force mikroskopi, Impact Indrykning, og Rheometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter