Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

mekanik simulants veya doku rejenerasyonu çalışmalarında olsun, beynin özelliklerine esinlenerek malzeme tasarımı ve mühendis için, beyin dokusu kendisi de çeşitli uzunluk ve zaman ölçeklerinde karakterize edilmelidir. Birçok biyolojik dokular gibi, beyin dokusu karmaşık, hiyerarşik bir yapı sergiler. Bununla birlikte, diğer dokuların tersine, beyin Pa 100'ün mertebesinde Young elastik modülleri E, çok düşük mekanik sertlik taşımaktadır. Bu düşük sertlik önemli mekanik özellikler deneysel karakterizasyonu için zorluklar ortaya çıkabilir. Burada, farklı uzunluk ölçeklerinde ve yükleme hızlarında beyin dokusu gibi sulandırılmış, uyumlu biyolojik malzemelerin elastik ve viskoelastik özelliklerini ölçmek için adapte edilmiş birçok mekanik karakterizasyon teknikleri göstermektedir. mikroölçeklerde, biz Atomik kuvvet mikroskobu etkin girinti kullanarak sürünme uyum ve kuvvet gevşeme deneyleri yaparlar. mesos atcale, bir sarkaç tabanlı aletli dişinin kullanarak darbe girinti deneyleri. makroölçekte, biz frekans bağımlı kayma elastik modüle ölçmek için paralel plakalı reometre yapıyoruz. Biz de her yöntemi ile ilişkili zorlukları ve sınırlamaları tartışmak. Birlikte bu teknikler daha iyi beynin yapısını anlamak ve biyo-esinlenmiş malzemeleri mühendisi için kullanılabilir beyin dokusunun derinlemesine bir mekanik karakterizasyonu sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biyolojik organları içeren en yumuşak dokular mineralize kemik ya da mühendislik malzemelerine göre, mekanik ve yapısal olarak karmaşık ve düşük sertliğe sahiptir ve doğrusal olmayan ve zamana bağlı deformasyon sergiler. Vücudun diğer dokulara kıyasla, beyin dokusu Pa 1 100'ler mertebesinde elastik modülü E, son derece uyumludur. Beyin dokusu farklı ve birbirine kenetlenmiş gri ve aynı zamanda işlevsel farklılık beyaz cevher bölgeleri ile yapısal heterojenliği sergiler. Anlamak beyin doku mekaniği, yaralanma sırasında beynin yanıtı taklit mekanik hasar tahmini kolaylaştırmak ve koruyucu stratejilerin mühendislik sağlamak için malzemeler ve hesaplama modelleri tasarımında yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, bu tür bilgiler doku rejenerasyonu için tasarım hedeflerini belirlemek için kullanılabilir ve daha iyi multipl skleroz ve otizm gibi hastalıklarla ilişkili beyin dokusunda yapısal değişiklikleri anlamak için. Here, biz tarif ve mezo, mikro de, beyin dokusu dahil mekanik uyumlu dokuların viskoelastik özelliklerini karakterize etmek için kullanılabilir birkaç deneysel yaklaşımlar göstermek ve makro-ölçekler.

mikroölçeklerde, biz sürünme-uyum yürütülen ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) etkinleştirilmiş girinti kullanarak gevşeme deneyleri zorlamak. Tipik haliyle, AFM etkin girinti örnek 2-4 arasında bir esneklik modülüne (ya da ani sertlik) tahmin etmek için kullanılır. Ancak, aynı enstrüman, aynı zamanda mikro viskoelastik (zaman veya oran bağlı) özelliklerini 5-10 ölçmek için kullanılabilir. Şekil 1'de gösterildiği bu deneylerden prensibi, zamanla, beyin dokusu içine probu dirsekli bir AFM girinti kuvvet veya girinti derinliği belirli bir büyüklüğü korumak ve sırasıyla girinti derinliği ve kuvvet, karşılık gelen değişiklikleri ölçmektir. Bu verileri kullanarak, biz sürünme kompozisyonu hesaplayabilirsinizsırasıyla liance J, C ve dinlenme modülü G R,.

orta ölçekli, biz bir sarkaç tabanlı aletli nanoindenter kullanarak, doku yapısı ve hidrasyon düzeylerini korumak sıvı su altı koşullarında darbe girinti deneyler yapılmıştır. Deney düzeneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Sarkaç doku ile temas salıncaklar gibi, salınan sarkaç doku içinde hareketsiz hale gelene kadar yer değiştirme, zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir prob. Prob ortaya çıkan sönümlü harmonik salınım hareketi, biz dokusunun 11,12 (enerji dağılımı oranına ilgilidir), maksimum penetrasyon derinlik x max, enerji sönümleme kapasitesi K, ve dağıtma kalite faktörü Q hesaplayabilirsiniz.

makroölçekte, biz, frekansa bağımlı kayma elastik modüle ölçmek için bir paralel plakalı reometre kullanıldı. dokusunun depolama modülü G 've zarar modülü G "olarak adlandırılan rheometrisi Bu tip, bir harmonik açısal gerginlik uygulamak (ve kayma gerginlik karşılık gelir) bilinen genlik ve frekanslarda ve tepkisel tork ölçmek (ve kayma gerilmesi karşılık gelir) Şekil 3 'de gösterildiği gibi. ölçülen tork elde edilen genlik ve faz gecikmesi ve sistemin geometrik değişkenlerden, çıkar 13,14 uygulamalı frekanslarda "G' ve G hesaplayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik Beyanı: Tüm deneysel protokoller Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uygun bulundu.

1. Fare Beyin Doku Toplama İşlemleri (AFM etkin girinti ve darbe girinti için)

  1. fareler uyutmak için bir ketamin / ksilazin karışımı hazırlayın. 5 mi ketamin (500 mg / ml), 1 mi ksilazin (20 mg / ml) ve 7 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi bir araya getirin.
  2. Fare (Breed:; Syn-Cre; TSC1'yi PLP-eGFP; Yaş: p21; Cinsiyet: erkek veya kadın) enjekte ketamin / ksilazin çözümünün gram vücut ağırlığı başına 7 ul.
  3. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, ayak ve kuyruk tutam yanıt eksikliği gösterdiği gibi, büyük diseksiyon makas kullanılarak boyunları vurularak fare euthanize.
  4. Daha küçük diseksiyon makas kullanılarak orta aşağı keserek kafatası çıkarın. beyincik başlayarak, remKavisli bir forseps kullanarak kafatasının ove adettir. kafatası çıkarıldıktan sonra, beyincik başlayan, beyin kaldırmak için düz bir spatula kullanarak beyin ayıklamak ve bir Petri kabı üzerine beyin yerleştirin. Bir jilet kullanarak beyin beyincik çıkarın.
  5. Buz üzerinde yetişkin nöral dokuda CO 2 bağımsız besin ortamı ile bir yuvarlak dipli tüpe taze doku transferi beyin üzerinde etkisi girinti testleri için tüm beyin kullanarak ve bölüm 4. geçin Aksi takdirde prosedürleri dilimleme için 1.6 adıma geçin.
  6. 0,7 mm / sn, 70 Hz titreşim frekansı ve 350 um bir dilim kalınlığının hız vibratome ayarlarını yapın. buz ile vibratome çanak Surround. Vibratome tabağa superglue bir dab koyun ve koronal dilim kesilmiş böylece beyin birinci dorsal tarafına kesmek yönelik olan, beyin monte edin.
  7. Sadece beyin batırmak için yeterli Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile vibratome çanak doldurun. YükseltmekBıçak sadece DPBS batmış böylece vibratome üzerinde çanak.
  8. Basın 350 mikron kalınlığında koronal beyin bölümleri dilimleme başlarsınız.
  9. Dokuya zarar görmesini önlemek vibratome DPBS banyosundan ve buz üzerinde yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besleyici ortam ile yuvarlak dipli tüp içine beyin dilimleri transferi ve 48 saat içinde, taze doku üzerinde ölçümler yapmak için fırçalar kullanılması. AFM etkin girinti deneyleri başlamak için, bölüm 3 geçin.

2. Domuz Beyin Dokusu Edinme Prosedürleri (reoloji için)

  1. Yerel bir kasap kurban ~ 1 saat içinde sagittally dilimlenmiş domuz yarım beyin edinin. Yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besin ortamında yarım beyin yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
  2. Yetişkin nöral doku için CO 2 bağımsız besin ortamında bir ~ 5 mm kalınlığında koronal beyin dilim ve mağaza yapmak için bir jilet veya neşter kullanabilirsiniz. Emin olun dilim Surface mümkün olduğunca düz. kesit sırasında jilet / neşter dikkatli yanal hareketleri kullanın.
  3. Mağaza domuz beyin buz üzerinde yetişkin nöral dokuda CO 2 bağımsız besin ortamında doku ve 48 saat içinde taze doku üzerinde reometre ölçümleri (bölüm 5) gerçekleştirin.

3. Atomik Kuvvet Mikroskobu Girinti özellikli

  1. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir midye-türevi biyolojik yapıştırıcı 60 mm çapında Petri (P60) yemekler hazırlayın.
    1. 8.0 optimal pH, steril su içinde 0.1 M sodyum bikarbonattan oluşan nötr tampon çözeltisi stoku hazırlayın. Filtre sterilize (0.2 mikron), 4 ° C de, sodyum bikarbonat tamponu ve saklayın.
    2. bir laminar akış başlığı içinde, sodyum bikarbonat tamponu içinde% 6.25 midye-türevi biyolojik olarak yapışan ve 3.125,% NaOH karıştırın.
    3. sol yaymak için 60 mm çaplı Petri (P60) çanak ve kullanım pipet üzerine 3.1.2 biyo-yapışkan çözümün pipet 100 ul3-5 cm çapında çember içine Katkı.
    4. Çözelti kuru (~ 30 dk) laminer akış kaputu ortaya P60 yemekleri bırakın ve izin verin. Yıkama yemekleri PBS ve steril su ile 2x ile 1x. kadar 1 ay boyunca 4 ° C'de kapalı bir plastik torba içinde laminer akış kaputun ve mağaza yemekler hava kurumasını bekleyin.
  2. AFM olarak AFM ve set-up beyin örneği ayarlayın.
    NOT: Üretici olarak başına AFM kalibrasyon talimatları uygulayın.
    1. Dikkatle 0.03 N / m nominal yay sabiti ve prob tutucu içine 20 mikron çaplı borosilikat boncuk ile bir AFM prob yükleyin.
    2. Termal ayar yöntemi 15,16 ile AFM konsol yay sabiti ve ters optik kolu duyarlılığı (InvOLS) kalibre.
      NOT: AFM prob için yay sabiti hesaplanır sonra, tekrarlanan kullanımı ile sabit kalmalıdır. Ancak, konsol InvOLS lazer konsol ile realigned her zaman yeniden kalibre edilmesi gerekir. Buna ek olarak, kalibrasyonpolistiren gibi konsol, daha sert büyüklükte bir alt-tabaka birçok düzenine karşı gerçekleştirilmelidir.
    3. 37 ° C sahne monte ısıtıcı ve ayarlanan sıcaklığa açın.
    4. Bölüm 3.1'de hazırlanan P60 yemekleri üzerine beyin dilim monte edin.
      1. Yavaşça 350 mikron kalınlığında beyin dilim, hem de midye-türevi biyolojik yapıştırıcı ile kaplanmış bir P60 çanak içine tabanı yuvarlak bir şişe ile ilgili CO2 bağımsız orta dökün.
      2. nazikçe P60 çanak eğerek, çanak merkezi beyin dilim yerleştirin. Gerekirse, yavaş yavaş yemeğin ortasında tek başına ya da daha iyi bir pozisyonda beyin dilim üzerinde katlanmış bir beyin dilim açılmak için bir manuel pipetter gelen orta pipetle.
      3. Dikkatle P1000 pipetter (vakum kullanmayın) kullanarak fazla ortamı çıkarın.
      4. P60 tabağına kapağı yerleştirin ve beyin dilim 20 dakika uymak edelim.
    5. P60 monte beyin dilim, AFM baş kaldırmak koyunAFM sahnede çanak ve 2 ~ eklemek ml CO 2 bağımsız orta önceden ısıtılmış.
    6. Dikkatle beyin dilim çevreleyen ortama indirildiğinde yüzey gerilimi nedeniyle kırılma korumak için AFM prob üzerine medyanın bir damla ekleyin.
    7. sahneye AFM baş konumlandırmak ve medya batırılır kadar kafa düşürücü başlar.
    8. üst görünüm CCD kamera kullanılarak, konsol üzerine lazer yeniden konumlandırmak.
      NOT: konsolun üzerinde lazer hizalama nedeniyle hava ve ortamın kırılma indeksi farkı biraz değişmiş olacaktır.
    9. konsol sıcak sıvıya olmanın ayarlamak için 5 dakika bekleyin ve sonra 0 V ücretsiz bir sapma ayna hizalama sıfırlama
    10. Üreticinin talimatlarına 16 göre AFM probu üzerinde termal spektrum çalıştırın. Medyada AFM sondanın InvOLS yeniden hesaplamak için ilk termal tepe uygun kullanın.
    11. optik mikroskop kullanılarak,örnek sahne hareket öyle ki AFM probu altında ilgi beyin bölgesi.
      NOT: çevreleyen gri madde daha opak olarak korpus kallosum karanlık görünür. korteks korpus kallosum üstündür.
    12. 0 V. ücretsiz sapma ayna hizalama sıfırlayın
    13. AFM yazılımı Sum ve Eğilme Meter üzerinde, AFM baş meşgul "Engage" tıklayın.
    14. konsol ve örnek arasındaki temas yapılana kadar AFM kafasına pozisyon kadranı kullanarak, kafasını indirin.
  3. İstenirse daha önce 4,17,18 tarif edildiği gibi (İsteğe bağlı), numunenin elastik modülü ölçün.
  4. sürünme uyum deneyler.
    1. yazılımın işlevi editörü uygulanan kuvvet fonksiyonu Construct. kuvvet fonksiyonu 5 nN bir dizi noktasına 0.1 saniye rampa oluşur ve 0 nN bir uygulanan kuvvet aşağı rampa bir 1 saniye ardından 20 saniye boyunca tutun.
      1. Girinti Usta PAnel, girinti yöntemi kapsamında, Indenter Modu için "Load" seçeneğini seçin; birimleri için "N"; Indenter İşlevi ve "Fonksiyon editörü".
      2. fonksiyon düzenleyicisinde, Segment Parms Paneli, 0.1 sn süre ile, 0 nN başlar 5 nN biter bir uygulanan kuvvet fonksiyonu segmenti oluşturun. "-> Ekle" yi tıklayın.
      3. Bir sonraki bölüm için 5 nN, 20 sn 5 nN uca ve zaman başlar ayarlayın. "-> Ekle" yi tıklayın.
      4. Son segment için, 5 nN, 1 sn 0 nN uca ve zaman başlar ayarlayın. Click "Draw" ve Fonksiyon Düzenleyici penceresini kapatın.
    2. Usta Panel Kuvvet sekmesinde, "tetik sonra batıcı rampa" kontrol ve 0,1 V tetik noktasına ulaştıktan sonra tetiklemek için uygulanan kuvvet fonksiyonu ayarlamak
    3. sürünme uyumu için inşa uygulanan kuvvet fonksiyonu tetikler Usta Panel Kuvvet Tab altındaki, "Tek Gücü" tıklayın.
    4. SonraTek kuvvet girinti bittiğinde, kafa ilgisini yeniden ve yeniden sıfır ücretsiz sapma sonra numune ile temas dışında olduğunu böylece AFM başını yükseltmek ve.
    5. ilgi yeni bir alan bulun ve temas kurmaya AFM baş düşürmek için örnek sahne yerleştirin. NOT: Örnek aşaması taşındığında AFM kafa numune yüzeyinden çekilmelidir. Bunu yapmamak hassas AFM konsol hasara neden olabilir.
    6. Adımları tekrarlayın 3.4.3-3.4.5 veri istenilen miktarda tahsil edilinceye kadar.
  5. kuvvet gevşeme deneyleri yaparlar.
    1. yazılımın işlevi editörü uygulanan girinti fonksiyonu Construct. girinti fonksiyonu 3 mikron bir dizi noktasına 0.1 saniye rampa oluşur ve 0 mikron bir girinti derinliğe kadar rampa bir 1 saniye ardından 20 saniye boyunca tutun.
      1. Girinti Usta Panelinde, girinti yöntemi kapsamında, Indenter Modu için "girinti" seçeneğini seçin; birimleri için "m", ve "; Indenter Function Fonksiyon editörü ".
      2. fonksiyon düzenleyicisinde, Segment Parms Paneli, 0.1 sn süre ile, 0 um başlar 3 mikron biter bir uygulanan kuvvet fonksiyonu segmenti oluşturun. "-> Ekle" yi tıklayın.
      3. Bir sonraki bölüm için, 3 um 3 um, son başlar ayarlayın ve 20 saniye zamanı. "-> Ekle" yi tıklayın.
      4. Son segment için, 0 um 3 um, son başlar ayarlayın ve 1 sn zaman. Click "Draw" ve Fonksiyon Düzenleyici penceresini kapatın.
    2. Usta Panel Kuvvet sekmesinde, "tetik sonra batıcı rampa" kontrol ve 0,1 V tetik noktasına ulaştıktan sonra tetiklemek için uygulanan kuvvet fonksiyonu ayarlamak
    3. kuvvet rahatlama için inşa uygulanan girinti fonksiyonunu tetikler Usta Panel Kuvvet Tab altındaki, "Tek Gücü" tıklayın.
    4. Tek kuvvet girinti bittikten sonra, böylece, AFM baş kaldırmakDaha sonra numune ile temas dışında baş ve yeniden sıfır sapmasını yeniden meşgul.
    5. ilgi yeni bir alan bulmak için sahne yeniden getirin ve temas kurmaya kafasını indirin.
    6. veri istenilen miktarda tahsil edilinceye kadar tekrarlayın 5,3-5,5 adımları.
  6. deneyler ve temiz-up sonlandırın.
    1. deneyler tamamladıktan sonra, AFM başını yükseltmek ve örnek çıkarın.
    2. dikkatle konsol dokunmadan fazla sıvıyı çıkarmak için bir laboratuar doku kullanın.
    3. Dikkatle etanol küçük bir miktar kullanarak AFM konsol tutucu temizleyin. etanole konsol tutucu hassas elektronik maruz bırakmayın. Bir saklama kabı AFM konsol ve yer çıkarın.
    4. Uygun biyogüvenlik protokollerini takip ederek beyin doku örneğinin atınız.
  7. Lee ve Radok 1960 tarafından türetilen çözüme göre, MATLAB, sürünme uyumu hesaplamak ve batıcı geometrisini kullanarak gevşeme modülüne kuvvet kullanarak 19.
    1. Kuvvet F ve girinti derinliği hesaplamak denklem 1 konsol pozisyon z verileri, sapma d, ve yay sabiti, k c

      denklem 1 ve denklem 1 .
    2. Lin ve ark., 20'de tarif algoritmayı kullanarak girinti eğrisi boyunca temas noktasını bulun.
    3. Veri analizi için ilgi bir pencere tanımlayın. Çevrede pencere veya (kuvvet dinlenmek için) girinti derinliği (sürünme uyum için) kuvvet ya da nominal değer tutulur bölge (yani, Şekil 1C, D gösterildiği gibi bölge 3).
    4. Bozulma uyumu deneyleri için bir basamak yüke cevaben deneysel bozulma uyumu modülü, J, C (t), hesaplarn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      denklem 1 ,
      H (t) Heavyside aşama fonksiyonudur ve R küresel prob yarıçapıdır.
    5. Kuvvet gevşemesi deneyleri için bir basamak girinti derinliği cevaben deneysel kuvvet gevşemesi modülü, G R (t), hesaplar denklem 1 :
      denklem 1 .

4. Darbe Girinti

  1. aletli nanoindenter kalibre ve üreticinin talimatlarına göre sulandırılmış beyin dokuları üzerinde dinamik darbe deneyleri etkinleştirmek için varsayılan ayarlarını.
    1. cımbız kullanarak sarkacın üzerine kaydırarak küresel prob monte edin.
    2. translasyonel vidalanır örnek yazı üzerine bir erimiş kuvars örneği Tutkalsahne.
    3. Kalibrasyon menüsüne gidin ve "Sıvı Hücre." erimiş kuvars numune ile temas kurmaya yazılımın yönergeleri izleyin.
    4. Indenter Türü için "Normal" seçeneğini seçin ve Indenter Yük 0.05 mN varsayılan değerini kullanın. Normal batıcı yapılandırması için kalibrasyon gerçekleştirmek için "Devam" düğmesine tıklayın.
    5. en az 5 mm geri numune sahne taşıyın. Sonda sıvı hücreye indirdi sağlar manivela kolu, montaj ve Indenter Tipi "Sıvı Cell" seçerek yeni yapılandırmada sıvı hücre kalibrasyonu tekrarlayın. Sıvı Hücre Kalibrasyon Factor elde etmek için "Devam" düğmesine tıklayın.
    6. Deney menüsüne gidip seçerek Sıvı Hücre yazılımı seçeneğini etkinleştirin "Özel Seçenekler." En son kalibrasyon değerini kullanın.
    7. Bu HIG test ederken gerekli olan daha büyük bir maksimum ölçülebilir derinliği, yol gibi kondansatör plakası aralığını artırmakhly uyumlu malzemeler.
      1. Sistem menüsü altında sırasıyla 0.5 mN / sn, 0.1 mN / sn, ve 3 V, ofset sarkaç test yükü oranı, sıfır yük oranı ve bekleme rampa değiştirmek için "Non Koruma Ayarları" ve "Makine Parametreleri" seçeneğini seçin.
      2. Bir anahtarla, küçük artışlarla kondansatör plakası aralığı saat yönünde kontrol eden üç fındık açın.
      3. her tam saat yönünde açtıktan sonra, bakım menüsü altında "Köprü Kutusu Ayarı" seçmek ve hemen sarkaç gelen karşı denge ağırlığı hareket gerektiren bir iyi sarkaç testi, edinin.
      4. adımları tekrarlayın 4.1.7.2-4.1.7.3 yaklaşık derinlik kalibrasyon 70,000 nm / V veya daha yüksek bir değere okur kadar.
    8. Bir güç kaynağı ile açılıp kapatılabilir olabilir sarkacın altındaki yeni bir dayanağa yerleştirin. sarkaç hareketi potansiyel bir tıkanıklığı gidermek için sarkaç arkasında oturan orijinal dayanağa geri çekin ve üstü için izindarbe hızları yanı sıra uyumlu örneklerin içine yüksek penetrasyon derinlikleri.
    9. Kabine termal dengeye ulaşmasına izin (yaklaşık 1 saat sürer).
    10. Kabine equilibrates ederken, Sistem menüsüne geri dönün ve "Non Korumalı Ayarlar" seçin ve "Makine Parametreler." 1 mm / sn derinlik kalibrasyonu (dcal) temas hızı ayarlayın, 3 mm / sn birincil girinti iletişim hızı ve 1 mm / sn ultra düşük yük iletişim hızı.
    11. Kalibrasyon menüsü altında bu yeni yapılandırmada standart derinlik kalibrasyonu yapın.
    12. "Impulse Hacmi ayarlayın." Solenoid için güç kaynağı açın ve Deney menüsüne 10 V. git ayarlayın ve "Etki" seçin ve sarkacın salınım mesafesini kalibre etmek için yazılım talimatları (otomatik istemleri) izleyin.
  2. Sıvı hücreye fare beyin dokusunu monte edin.
    1. ste gelen bütün beyin hasat sonrasıp 1.5, CO hemen buz üzerinde yetişkin nöral doku medya için 2 bağımsız besin ortamı saklayın.
    2. Etki girinti kurulum tam tamamlandığında, dikkatli bir şekilde CO 2 bağımsız araç ile bir petri çanağı içine beyin aktarın. iki tarafında düz yüzeylerde 6 mm kalınlığında kesitler halinde beyin dilimleyin.
    3. siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir tabaka ile alüminyum örnek mesaja dilimlenmiş doku uyun.
    4. Örnek yazı üzerine ikinci O-ring üzerinde sıvı hücreyi kaydırın ve tam doku batırmak için CO 2 bağımsız ortamın 5 ml sıvı hücreyi dolduracak. Bu örnek sonrası daha sonra dikkatlice aletli nanoindenter içinde öteleme sahneye monte edilir.
  3. beyin dokusu etkisi yanıtı ölçmek.
    1. Gerekirse, küresel prob kaldırmak ve kol çıkarmadan ilgi prob ile değiştirin.
    2. Sistem menüsü altında olmayan Korumalı "seçeneğiniAyarlar "ve" Makine Parametreleri. "5 mikron / sn primer darbeli kontak hızını değiştirin.
    3. manivela kolu üzerinde ucu düzgün banyo yukarıda bulunana kadar uzakta sarkaç (+ x yönü) örnek düşük banyosuna (-z yönünde) ve, x yönünde hareket ettirin. ucu tam banyo ve numune önünde batık kadar + z yönünde hareket ettirin.
    4. Örnek kademe kontrol penceresini kullanarak, dikkatle temas ve daha sonra yaklaşık 30 mikron ile numune yüzeyinden uzağa sahne geri.
    5. Deney menüsü altında bir darbe deneyi kurmak için "Etkisi" butonuna tıklayınız. salıncak mesafe kalibrasyon dayalı ortaya çıkan darbe hızı doğrudan ilişkili olacak özel bir dürtü yükü seçin. planlanan deneme çalıştırın.
    6. sarkaç geri sallanır ve örnek yüzey ölçüm düzlemine hareket etmeye devam ederse, alt limit stop anahtarını kapatın.
    7. sarkaç forw salıncaklar olarak gözlemleyinörnek etkileme ard. zamanın bir fonksiyonu olarak prob değiştirme yazılımı tarafından kaydedilecektir.
    8. xyz sahne penceresi göründüğünde, tekrar sınır durdurma anahtarını çevirin.
    9. Tekrarlayın gerektiği gibi birçok farklı yükler ve konumları test etmek için 3.4-3.8 adımları tekrarlayın.
  4. Maksimum penetrasyon derinlik x max, enerji sönümleme kapasitesi K, ve dağıtma kalite faktörü Q belirlemek için özelleştirilmiş MATLAB komut dosyalarını kullanarak sarkacın zaman tepki vs edinilen deplasmanı analiz edin. 11
    1. Analiz menüsüne gidin ve bir metin dosyasına veri ihracat.
    2. zamanın bir fonksiyonu olarak hızı elde etmek için deplasman zaman türevinin al. Temas noktası x o1 sıfır deplasman ayarlayın.
      NOT: Etki hızı v irtibata maksimum hız hemen önce olan x max deformasyon tekabül eden sonda da.hızı, ilk sıfıra iner. X, O2, X r eşdeğer olan bir sonraki döngüde deforme numune ile temas yeniden başlatmak için gerekli olan konumdur. Rebound hız v dışarı deplasman x r hızıdır.
    3. İlk darbe döngüsü sırasında kurtarıldı ve dağıtılan örnek enerjilerinin toplamı ile normalize örnek tarafından yayılan enerji olarak K (birimsiz) tanımlayın. Sarkacın 21 içsel özelliklerine göre K hesaplamak x o1 (örneğin dönme sertliği ve sönümleme katsayısı gibi), v max x r, x, ve v dışarı.
      NOT:. Daha fazla bilgi için, bir Kalcioglu ark, 2011 yılının çalışmalarını danışabilirsiniz.
    4. deplasman bir sönümlü harmonik salınım hareketi olarak tarif edilebilir olduğundan, dis ve maksimumlar bir üstel çürüme işlevi uygunzaman eğrisi yerleştirme.
    5. E faktörü ile azaltmak için titreşim genliği için gerekli döngü sayısı ile çarpılır π olarak Q (birimsiz) hesaplayın. Daha yüksek Q değeri daha düşük bir enerji yitirme oranı anlamına gelir.

5. Reoloji

  1. Set-up ve üreticinin talimatlarına göre reometre kalibre.
    1. Cihaz / kontrol panelini açarak reometre başlatılamıyor. Kontrol paneli sekmesinde, "başlatılamadı." tıklayın
    2. 25 mm çap ölçümü plakasını (PP25) ve termal sistemini monte edin.
    3. , Reometresi plakaları ve doku arasındaki kayma azaltmak için (İsteğe bağlı) üst reometre plakanın şekli maç ve üst ve alt plaka zımpara kağıdı uygun yapışkan zımpara dilimleri kesip.
    4. Kontrol paneli üzerindeki "sıfır boşluk set" linkine tıklayarak alt ve üst plaka arasındaki teması olun.
    5. cli normal kuvvet dönüştürücüyü sıfır"Normal kuvvet sıfırlayın." Cking
    6. "Ölçüm sistemi" linkine tıklayarak, kontrol paneli üzerindeki hizmet sekme açma ve ardından "atalet testi" tıklayarak bir atalet testi yürütün. Eski ve yeni atalet kaydedin. üretici tarafından listelenen atalet, prob için izin verilen sınırlar içinde olduğundan emin olun.
  2. reometre yükleyin örnek.
    1. Doku hasat ve ~ 5 mm kalınlığında domuz beynin koronal segmenti dilimleme, CO 2 bağımsız orta buz üzerinde saklayın sonra.
    2. İki plaka arasındaki beyin yerleştirin. kaymayı önlemek amacıyla numunenin üst ve alt yüzeyden büyük su damlacıklarını kaldırmak, ancak örnek kuru değildir.
    3. Plaka doku ve ölçülen normal kuvvetin üst yüzeyi ile tam temas edene kadar yavaşça ölçü plakası alt 5-10 dakika dinlenme süresinden sonra 0,01 mn tutarlıdır.
      1. Kontrol panelinde, gittikçe daha düşük yükseklikleri girmek in ölçüm pozisyonu kutusu ve yavaş yavaş ölçüm plaka düşürmek için "ölüm pozisyonu" tıklayın.
      2. Plaka tam doku üst yüzeyi ile temas edene kadar doku ile temas milimetre olan, 0.1 mm'lik artışlarla ölçü plakası alt zaman. ölçülen normal kuvvet 5-10 dk dinlenme döneminden sonra 0.01 mN tutarlı olduğundan emin olun.
      3. İlk ölçülen normal kuvveti kaydedin. Tekrarlanan ölçümler aynı basınç gerilmeleri / soylarının alınmalıdır.
    4. Numune plaka çapını aşıyorsa plastik bıçak ile örnek Trim. doku hidrat numunenin kenarlarında küçük bir ortam hacmi (~ 1-2 mi) pipetle.
    5. (İsteğe bağlı) termal kaputu indirin. Kontrol paneli üzerinde, 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve "set" butonuna tıklayınız.
  3. Malzemenin lineer viskoelastik aralığını (yani, kesme kurmak için bir genlik süpürmeyi yapmakhangi G 've G' faiz (örneğin, 1 rad / sn) frekanslarda) sabittir 'suşları.
    1. Seç "Dosya / yeni". Jel sekmesi altındaki "Genlik süpürme: LVE-aralık" i seçin. pencereyi seçin ve tıklayın "Ölçüm 1:. Genlik süpürme" salınım kutusunun üzerine çift tıklayın. Ilk ve son gerginlik girin (örneğin, 105 0,01), frekans (örneğin, 1 rad / sn) ve on noktaların sayısı (örneğin, 6 puan / Aralık). "Tamam" ı seçin ve başlangıç ​​tıklayın. "
    2. doğrusal elastik sınırın tutarlılığı sağlamak için tekrarlanan denemeler ile birkaç dilim için bu yordamı yineleyin. numunenin eksensel sıkıştırma numuneleri arasındaki sabit kalmalıdır.
  4. Doku (örneğin,% 1 suşu) 22 lineer viskoelastik aralığındaki bir gerilimde doku bir frekans taraması yürütmek ve de (örneğin, 0.1-100 rad / sn) arasında bir frekans aralığında.
    1. tıklayın "Dosya / yeni" ve jel sekmesi altında "Frekans süpürme" i seçin. pencere / Ölçüm 1 tıklayın: Frekans süpürme. salınım kutusunun üzerine çift tıklayın. Frekans aralığını (örneğin, 0,1-100 rad / sn), gerginlik (örneğin,% 1 suşu) ve on yıl başına noktalarının sayısını girin (örneğin, 6 puan / Aralık). "Tamam" ı seçin ve frekans taraması başlatmak için "start" düğmesine tıklayın.
  5. çoğaltır veya üç kez tekrarlayın frekans tarama (adım 5.4).
  6. G 'frekans (frekans süpürme) bir fonksiyonu olarak ve G "veya kesme gerginlik (genlik süpürme) NOT:. G' otomatik olarak hesaplanır ve reometre tarafından ihraç edilen verileri gözden ve G numunenin (maksimum hesaplanır '' ) tepkisel tork genlik T '0 ve dönme deplasman açısı (veya sapma açısı) denklem 1 Ve faz gecikmesiDenklem 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, uygulamalı salınımlı suşuna numunenin yanıtın (Şekil 3):
    denklem 1
    denklem 1
    R ve H örnek yarıçapı ve yüksekliği olduğu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 4, sırasıyla uygulanan bir kuvvet veya girinti derinliği (Şekil 4A, D), verilen, sürünme uyumu için zaman yanıtları (Şekil 4B, E) vs temsili girinti ve kuvvetini göstermektedir ve dinlenme deneyleri zorlamak. Bu veri ve sistemin geometrisini kullanarak, sürünme uyum J c (t) ve gevşeme modülü G R (t) zorlamak beyin (Şekil 4C, F) farklı bölgeler için hesaplanabilir. Daha önceki çalışmalar, beyin 23 farklı alanlarının elastik modülünün arasında bir fark göstermiştir birlikte, viskoelastik özellikleri, belirli bir doku dilimi içinde arası varyasyon gösterme fare beyin dokusu dilimleri için bu yolla ölçülür.

Darbe girinti mekansal ve zamansal konsantrasyon yüksek hızlarda doku mekanik özelliklerini ölçented yükleniyor. Bu deneylerin sonuçları doku travmatik yaralanma veya ameliyat ile ilgili kasıtlı deformasyon yanıt olarak enerji yayılır hakkında bilgi sağlar. Darbe girinti prob sönümlü salınım hareketi (Şekil 2B) maksimum penetrasyon derinlik x max (Şekil 5A), enerji dağıtımı kapasitesi K (Şekil 5B) ve doku enerji sönümleme oranı Q (Şekil 5C) hesaplamak için bilgi sağlar. Penetrasyon derinliği güçlü dokusunun elastik modülü ile ilişkilidir deformasyon direnci ölçer: katı dokular, belirli bir darbe hızı ve darbe enerjisi için daha küçük penetrasyon derinlikleri sergilerler. , Enerji dağılımı kapasitesini dokusu ilk etkisi döngüsü sırasında darbe enerjisini dağıtır hangi ölçüde bir birimsiz bir ölçüsüdür. Yayımı kalite faktörü önlemleri kaç döngüleri i gelen salınımlar önce meydanaMPACT önemli ölçüde bastırılır - Bu enerji dağılımı oranı ile doğrudan ilişkili bu zaman birimleri cinsinden ifade olmasa da. Bu üç etkisi karşılık parametreleri doku hızı bağımlı özelliklerini incelemek için bir araç sağlar, farklı etki hızı, önceki belirlenebilir.

Şekil 6 0.1 rad / sn 50 rad / sn arasında değişen frekanslar için macroscale G 've G "gösterir. Depolama modülü neredeyse düşük frekanslarda kayıp modülü daha büyük büyüklükte bir emirdir. Ancak, depolama ve zarar modüllerine arasındaki oran frekans arttıkça azalmaktadır. Bu depolama modülü elastik özelliklere açıklar ve kayıp modülü malzemenin viskoz kaybını tarif etmektedir elastik özellikler, beyin dokusunun davranışı hakim olduğunu göstermektedir. yeteri kadar yüksek bir yükleme frekansında, depolama ve kayıp modülü eşit olacak, noktayı belirten hangimalzeme (yani, viskoz özellikleri örnek davranış hakim) akmaya başlar. Bu tarifnamede açıklandığı gibi ölçülen beyin dokusu durum için, enstrümantasyon fiziksel kısıtlamalar daha yüksek bir frekansa da malzeme özelliklerini ölçmek için izin yoktur.

Şekil 1
Şekil AFM etkin bozulma uyumu 1. İllüstrasyon ve kuvvet gevşeme deneyleri. (A) AFM etkin girinti serbest ucuna bağlanmış mikro yarıçapı nano bir küresel boncuk ile esnek bir konsol kullanılarak yapılır. Girinti sırasında (B), konsol sapma lazer konsol ve bir fotodiyot üzerine sonunu yansıyan kullanılarak ölçülür. (C) Kuvvet gevşeme deneyleri, sürekli uygulanan derinliğe kadar konsol girinti tarafından yürütülen ise res kuvvet çürümezamana pect ölçülür. (D) Sürünme uyum tedbirleri sürekli uygulanan kuvvet ile konsolun değişen girinti derinliği. (C) ve (D) beş bölgede (yeşil metin) ayrılmıştır: Örnek yüzeye AFM probu (1) Yaklaşım, (2) numune ile temas ve set girinti / kuvvet kadar rampa, (3) set girinti / kuvvet bakım, (4) rampa aşağı ve numune yüzeyinden AFM prob (5) geri çekilme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Darbe girinti deneyleri Şekil 2. İllüstrasyon. Darbe girinti (A) şematik, tamamen hidratlanmış koşullarda deneyler yeteneğini gösteren. (B) repres Bir fare beyin dilim ve karşılık gelen hız profilinden toplanmıştır zamanın bir fonksiyonu olarak entative prob değiştirme profili. Anahtar ölçülen deplasman ve gösterilir enerji dağılımını ölçmek için kullanılan hesaplanmış hız parametreleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Paralel plaka reometre deneyleri Şekil 3. İllüstrasyon. Paralel plakalı reometre deney ve uygulamalı osilatör kesme suşu ile ilgili tanımların (A) şematik. (B) Örnek zamanın bir fonksiyonu olarak gerginlik ve elde edilen stres uygulanmış. Kayma depolama modülü G 've kesme kayıp modülü G "gerilme genliği ile hesaplanır54201 / 54201eq12.jpg "/>, tork genlik T '0, faz gecikmesi denklem 1 Prob ve örnek yarıçapı R, ve örnek yüksekliği h. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Temsilcisi sürünme uyum veri ve kuvvet gevşeme deneyleri. (A, B) Şekil 1'de ham verilerden, ilgi bir bölge uygulanan kuvveti süresi gibi sürünme uyumu için tanımlanan sabit (A) kalır girinti derinliği ise (B) ölçülür. (A) ilave AFM piezo açamadı başarısız bir deney verileri gösteriruygulanan kuvveti ve (B) 'de girintisini sağlamak için (B)' de gösterildiği başarılı deney verileri ile benzer olan karşılık gelen girinti tepkisini gösterir. Uygulanan kuvvet veri ölçülen girinti ve prob geometrisi bilgisi ile (C), bozulma uyumu J, C (t) hesaplanır. Zamana karşı kuvveti (E) ölçülür kuvvetin gevşeme (D, E), girinti derinliği, sabit (D) yapılır. Bu veriler kullanılarak (F), kuvvet gevşeme modülü G R (t) hesaplanabilir. Sünme uyum ve kuvvet gevşeme deneyleri gibi korpus kallosum (kırmızı) ve korteks (mavi) olarak beynin anatomik farklı bölgelerinde, üzerinde yapılabilir. (C, F) veri n = 5 fareden ölçümün bir ortalamasıdır. Tiklayiniz lütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya k.

Şekil 5,
Fare beyin dokusu Şekil etkisi girinti deneylerinden 5. Temsilcisi verileri. Maksimum penetrasyon derinlik x max, enerji sönümleme kapasitesi K, ve dağıtma kalite faktörü Q farklı etki hızlarda elde edilen ham deplasman profilleri hesaplanır. Veriler (n = nokta başına 18 çoğaltmak ölçümleri) olarak ortalama ± standart sapma temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Reometre deneylerinden elde edilen Şekil 6. Temsilcisi verileri. Depolama G 'vekayıp G '' domuz beyinleri koronal dilim miyarları. miktar tanδ depolama modülü kayıp oranı olarak hesaplanır. Veriler (n = nokta başına 4 suret ölçümler) olarak ortalama ± standart sapma temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmada sunulan her teknik beyin dokusunun mekanik özellikleri farklı yönlerini ölçer. Bozulma uyumu ve stres gevşeme modülleri zamana bağlı mekanik özelliklerinin bir ölçüsüdür. Depolama ve kayıp modülleri oranı bağımlı mekanik özellikleri temsil eder. Darbe girinti ayrıca oran bağımlı mekanik özelliklerini ölçen, ancak enerji dağılımı bağlamında. Doku mekanik özelliklerini karakterize ederken, hem AFM etkin girinti ve reolojisi yaygın kullanılan yöntemlerdir. Daha önce tarif edildiği gibi zamana bağlı malzeme özelliklerini sağlamaya ek olarak, farklı deney parametreleri, hücre ve doku elastik modül 4 ve hatta frekansa bağımlı özellikler 24 ölçmek için kullanılabilir, çünkü AFM etkin girinti özellikle yararlıdır. Ancak, deney verilerinin ve tasarım doğru yorumlanması uyumlu, hidratlı dokular için zor olabilir. reometre önlemleri uygun ambalajsız ikendoku bağları, AFM etkin girinti hücrelerin mikroçevresinin ilgili mikro hacimleri araştırıyor. Etki Girinti malzemenin fokal etkisi nedeniyle, travmatik beyin hasarı okuyan gibi uygulamalarda yararlı olan bir konsantre, dinamik darbe yükü bağlamında deforme nasıl özellikle ölçmek için bir araç sağlar. Her tekniğin sonuçları doğrudan karşılaştırılabilir olmasa da aşağıda tartışıldığı gibi, darbe girinti aracılığıyla ölçülen enerji sönümleme özellikleri, reoloji üzerinden ölçülen kayma kayıp modülü aynı trendleri takip.

Burada gösterilen beyin dokusu AFM etkin girinti, biz sürünme uyumu ve gevşeme kuvvet kullanarak viskoelastik özelliklerini ölçülür. Çünkü AFM prob küçük ölçekli, bu tekniğin, sırasıyla korpus kallosum ve korteks (Şekil beyaz ve gri madde bölgeleri olarak beynin anatomik farklı alanlarda, mekanik özelliklerini ölçebilir. 4

Bu şekilde ölçülen beyin dokusunun viskoelastik davranış önce Thurmond ve Morrison 26, sonuçları rapor ile benzer olduğu bulunmuştur. gevşeme modülü için ölçülen değerlerin büyüklüğü kabul değilse de, bu durum, deney koşullarında fark muhtemeldir. Elkin & Morrison bizim 20 mikron çapında küre ile karşılaştırıldığında, 250 mikron çapında düz yumruk kullanın. Biz farelerden elde edilen beyin dokusu üzerinde ölçümler yapılmıştır iken Ayrıca, Elkin & Morrison, sıçanların beyin dokusu üzerinde ölçümler yapmak. Bu farklılıkların, teknikler her iki ölç rağmenKorpus kallosum beyaz cevher koronal düzlemde korteksin gri cevherde daha düşük gevşeme modülü sergiler, özellikle beyin dokusu içinde heterojen mekanik özelliklere değe- ya.

Biz sürünme uyumu hesaplanır ve istenen basamak yük veya adım girinti cevaben gevşeme modülüne kuvvet ise, sırasıyla, deneysel uygulanan yük ve girinti idealdir (anlık) basamak fonksiyonları olmadığını not etmek önemlidir. Yükler ve girintiler kısa zaman ölçekleri (<1 sn) üzerine uygulanır ve bu yükleme geçmişleri ölçülen sürünme ve rahatlama yanıtları 7,25 etkileyebilir. sürünme uyum modülü hafif aşırı tahmininde uygulanan basamak yük sonuçlarını varsayarak ederken Özellikle, altında tahmin gevşeme modülü hafif bir uygulamalı adım girinti sonuçlarını varsayarak. Gerçek ve hesaplanan elastik modülünün arasındaki farklılıklar rampa oranları azalacakuygulanan yüklere ve girinti artış.

Yük gevşeme yürütülmesinde önemli bir adım tutulan kuvvetin doğru büyüklüğünü seçerek (yani, uygulanan kuvvet ile doğrudan ilişkili fotodiyot gerilimine karşılık gelen nominal değer). bozulma uyumu için istenen bir güç seçilmelidir ki: (1) müdahale girinti derinliği kolayca ölçülebilir bir değişiklik oluşturmak için yeterince büyük olduğu; ve (2) ayar noktası kuvveti korumak için gerekli olan girinti derinliği AFM konsol baz dikey konumunu modüle AFM piezoelektrik aktüatörün aralığı dışında kayması için çok büyük hale gelmez kadar küçük delikler. sunulan protokol, bizim deney düzeneği için çalıştı 5 nN, bir set gücünü ileri sürmüşlerdir. AFM piezo nedeniyle hareket sınırlı aralıkta (Şek. 4A, içerlek bakınız) bu kuvvet koruyamazsa Ancak, bu değeri düşürülebilir. Bu deneysel sorun karşılaşırsanız değilBir geri besleme döngüsü boyunca sabit hesaplanan girinti derinliği sürdürmek kuvvet gevşeme deneyleri ile göz önünde bulundurmuştur.

nanoNewton (NN) de yarı-statik AFM etkin girinti aksine kuvvetleri ve mikron ölçekli derinliklerini ölçek olarak, darbe girinti mN ölçekli güçlerin konsantre dinamik yük uygular ve milimetre çaplı yaklaşan derinliklere kadar numune en deformasyon tepkisini ölçer. Biz daha önce kalp ve karaciğer 9,11,12 davranışını ölçmek için darbe girinti kullanılır ve bu organların dokular için yükleme hızına enerji dağılımı tepkisinin benzer bir bağımlılık gözlemledik.

Darbe girinti um den mm arasında değişen sonda yarıçapı barındırabilir. Buna ek olarak, darbe girinti deneyleri hidratlı dokuları, 21 mekanik özelliklerinin sağlar tamamen daldırılmış ortamlarda gerçekleştirilebilir. beyin dokusu gibi son derece uyumlu örnekleri test ederken, important hususlar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, malzeme içine en ölçülebilir derinliği yaklaşık 1 mm, enstrümanın ölçeklerde tarafından belirlenen bir sınırlama olduğu; başka sarkaç deplasman fiziksel sarkaç üst ve durağan manyetik plaka bulunan elektromanyetik bobinin arasındaki çarpışmanın tarafından durduruldu edilecektir. beyin dokusu, bu başarılı bir şekilde yaklaşık 5 mm / sn uygulanabilir yüksek çarpma hızı sınırlar. Darbe hızları sipariş mm / s üzerinde iken, ilgili zorlanma enerjisi yoğunlukları nedeniyle sonda yarıçapı 11 küçük boyutları, balistik koşulları yaklaşımları kJ / m 3 mertebesinde, üzerinde olduğunu unutmayın. alet probu ve doku yüzeyi arasındaki teması tespit etmek için İkincisi, potansiyel zor olabilir. Örnek sahne probu doğru ilerlerken sarkaç hareketli numunesi geri itildiğinde, iletişim tespit edilir. Ancak, için son derece complianprobun numuneye nüfuz ederken T örnekleri, sarkaç algılanabilir saptırılabilir olabilir.

Bu sorunu çözmek için, biz örnek sahne geri sarkaç götürmek için temas sırasında büyük bir ivme olacak şekilde hareket hızını artırabilir. Örnek, bundan başka, uygun bir temas noktası tespit hataları en aza indirmek için mümkün olduğu kadar düz olması gerekir. Son olarak, darbe yükü sarkaç üstündeki elektromanyetik akım ilk darbe olayından sonra penetrasyon için bir itici güç sağlamak için devam ettiğini gerçek bir darbe yükü, olmadığını unutmayın. Bunun bir sonucu olarak, katlama, özellikle enerji yitirme özelliklerinin analizi karmaşıklaştıran yüksek yükleme koşulları, oluşabilir. Bu teknikle ilgili daha fazla çalışma miroskop yoluyla doku örneği yüzeyinin görselleştirme vücut sıcaklığında çalışmalarını sağlamak için ısı kontrolü tanıtan ve dahil olmak üzere, darbe yanıtından sürünme yanıtını ayırma içerebilirSıvı hücre ile uyumlu e.

Reometre macroscale düzeyde viskoelastik katıların frekansa bağlı mekanik özelliklerini ölçmektedir. Kesme modülü parçalar, depolama G 've zarar G ", tipik olarak alet, prob geometrisi, ve örnek 13 bağlı olarak, 10-100 rad / sn 0,001-0,1 rad / sn kapsayan frekans aralığını ölçülebilir. Doğru ölçüm için , bir genlik süpürme malzemenin doğrusal elastik aralığını belirlemek için bir frekans taraması öncesinde yapılmalıdır, bu 14,27 sabit kalır 'hangi G' ve G 'için gerginlik aralığı frekansı için seçilen kayma gerginlik. süpürme yeterli tork ölçümü sırasında elde edildiği (tipik olarak% 1-2 kesme zorlanması) bu tür doğrusal viskoelastik sınırı içinde mümkün olduğunca yüksek olmalıdır. ölçümler sırasında tork her zaman olduğu gibi sağlamak için üretici tarafından sağlanan izin verilen aralığın içinde olmalıdırgürültü oranı ufficient sinyali.

Buna ek olarak, reometre prob torku en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğu kadar büyük olmalıdır kullanılır, ancak örnek tamamen 13 paylaşımlı gerekir. örnek hazırlama, doku plakaları arasında yapıldığında eğimlerini en aza indirmek için mümkün olduğu kadar düz dilimlenmiş edilmelidir. iletişim örneği ile yapıldığında, doku o arayüzde kayma en aza indirmek için üzerinde herhangi bir su damlacıkları olmamalıdır. Bu doku yapısı 13 düşer Ancak, aynı zamanda doku önce ya da ölçüm sırasında kurutulmuş edilmemelidir. doku tamamen her iki plaka arasındaki temastan sonra medya ile hidrate edilmeli. Yapıştırıcı, su geçirmez zımpara da kayma 28 en aza indirmek için plakalara bağlı olabilir. Buna ek olarak, eksenel basınç beyin dokusu 29 G 'büyüklüğünü değiştirmek için gösterilmiştir. reoloji örnekleri, yüksekliği küçük değişiklikler (~ 500 (~ 5 mm), tipik olarak ince olduğuum) büyük bir sıkıştırıcı (örneğin, ±% 10) ve kayma modülü bu nedenle belirgin bir değişiklik olabilir. Örnek viskoelastik olduğu Dahası, malzeme nedeniyle ölçümlerini etkileyebilecek eksenel basınç 28 stres gevşeme uğrayacaktır. Bu nedenle, tekrar ölçümleri içindeki çalışma eksenel suşlar yapılmalıdır, ve örnek ölçümden önce (örneğin, 5-10 dakika) gevşemesine izin verilmelidir. bu fenomen ile alakalı hata tekniğinin bir sınırlama yoktur. Rheometrisi Diğer sınırlamalar genellikle doku örnekleri 13 doğru değildir malzeme homojen ve izotrop olduğu varsayımını içerir. Buna ek olarak, sıcaklık, G etkiler gibi fizyolojik koşullarda muhafaza edilmelidir güç kanunu Beha değiştirmeden mütevazi ve G " '' ve G" 22. Beyin dokusunda özel olarak ise, arttırılmış bir sıcaklık hem de G azalttığı gösterilmiştir 'frekansta vior böylece zaman-sıcaklık üst üste asil 22,30 et. Bizim verilerimiz G 've G' benzer büyüklüklerini yanı sıra hem G 've G "zayıf bir güç yasası frekans bağımlılığı gözlenen domuz beyninde önceki çalışmalarda 22,27, iyi bir uyum içindedir.

Hesaplanan oran tanδ = G "/ G '(Şek. 6) rheometrisi ve darbe girinti arasındaki karşılaştırma bir temel sağlar. Darbe girinti, biz beyin dokusunun enerji sönümleme kapasitesi artırılacak yükleme oranları ile arttığını gördük. Reometre kullanarak, bulundu frekans arttıkça tanδ, diğer bir deyişle, malzeme yüksek frekanslarda daha yutucu oldu. artmıştır. Buna ek olarak, darbe girinti ölçümler, doğrudan bir elastik modülüne miktarını yok ederken, doğrudan nüfuz derinliklerini X maks increasin ileg elastik modüle sahiptir.

Birlikte, bu yazıda anlatılan yöntemleri mikro, mezo ve makro uzunluk ölçeklerinde beyin dokusunun mekanik karakterizasyonu etkinleştirmek ve farklı yükleme hızlarında. Bu tarifnamede sunulan yöntemler, biyolojik doku ve mühendislik hidrojeller de dahil olmak uygun malzeme, bir dizi de kullanılabilir. Beyin dokusu multiscale viskoelastik özelliklerinin derinlemesine bir anlayış ile, beynin mekanik yanıtını taklit için tasarlanmış tasarım malzemeleri daha iyi yapamaz. Bu doku Uyarıcı maddeler mekanik hasar ve koruyucu stratejilerin mühendislik tahmini kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, beyin malzeme özellikleri daha özellikle, otizm ve multipl skleroz gibi nörolojik hastalıklar bağlamında, merkezi sinir sistemindeki hücrelerin büyümesini ve bağlantı anlaşılması için in vitro ve in vivo çalışmalar Biyolojik Tabanlı Akıllı malzeme tasarımı için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter