Summary
يوفر هذا الاختبار تدفق التصاق بسيط، نموذج تأثير ارتفاع تي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية. ويستخدم ضخ حقنة لتوليد إجهاد القص، ومتحد البؤر المجهر يلتقط الصور لتقدير. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد فعالية الخلايا التائية التصاق باستخدام ظروف التدفق.
Abstract
وعموما، التصاق الخلايا التائية هو عنصر حاسم من وظيفة، والمساهمة في عمليات متميزة من تجنيد الخلايا إلى مواضع الالتهابات والتفاعل مع خلايا مقدمة للمستضد (APC) في تشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية. هذه السياقات اثنين من الخلايا التائية التصاق تختلف في أن تي التفاعلات خلية APC يمكن اعتبار ثابت، في حين تحدى التفاعلات سفينة تي خلية الدم عن طريق إجهاد القص الناتجة عن التداول نفسها. تصنف التفاعلات تي خلية APC ك ثابتة في هذا الشريكين الخلوية والثابتة بالنسبة لبعضها البعض. عادة ما يحدث هذا التفاعل داخل الغدد الليمفاوية. كما تفاعل الخلايا التائية مع جدار الأوعية الدموية، والخلايا تعتقل ويجب أن تقاوم إجهاد القص ولدت 1،2 هذه الخلافات تبرز الحاجة إلى فهم أفضل التصاق ثابت والتصاق في ظل ظروف تدفق كما عمليتين تنظيمية متميزة. تنظيم الخلايا التائية التصاق يمكن وصفها بصورة أكثر إحكاما كما يخدعالتصيد الدولة تقارب من إنتغرين الجزيئات أعرب على سطح الخلية، وبالتالي تنظيم تفاعل integrins مع بروابط جزيء التصاق أعرب على سطح الخلية التفاعل. فهمنا الحالي للتنظيم حالات تقارب إنتغرين يأتي من كثير من الأحيان التبسيط في نظم نموذج المختبر. مقايسة للالتصاق تستخدم ظروف تدفق الموصوفة هنا يسمح لتصور وتقدير دقيق للتي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي بعد التحفيز. التصاق تحت فحص التدفق يمكن تطبيقها على دراسات من الالتصاق مما يشير إلى داخل الخلايا T بعد العلاج مع المواد المثبطة أو تنشيطية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن توسيع خارج الخلايا التائية يشير إلى أية مجموعة من السكان لاصقة الكريات البيض وأي زوج جزيء إنتغرين التصاق.
Introduction
تي اللمفاويات التصاق يتوسط عددا من العمليات المتميزة في نظام صحي المناعي، 3 لعب أدوارا حاسمة في الاتجار الخلايا التائية وتقديم المستضد. سواء خلال مراقبة محصنة أو استجابة مناعية نشطة هذه دورين واسعة للالتصاق حاسمة. 4 أحداث الإشارات الفيزيولوجية للتي التفاعلات خلية خلية البطانية تختلف عن الخلايا التائية مستضد تقديم الخلية (APC) التفاعلات، وبالتالي تتطلب أساليب متميزة من دراسة لفهم أفضل السلاسل يشير المعنية. التصاق متين من الخلايا التائية لجدار الأوعية الدموية خلال تسرب لمفاوية يتطلب تفعيل إنتغرين سريع وديناميكي. التفاعل الوثيق بين نشط إنتغرين والتصاق جزيئات دولة على طول البطانة يؤدي إلى مقاومة لتدفق الدم التصاق، مما يسمح للخلايا T على الزحف على طول السطح بحثا عن مساحة متساهلة لمرور الخلية. 5 في الزحف من خلية ثنائية T -directionally ألونالجا جدار الأوعية الدموية وتعتمد على التصاق الاستقطاب، مع الواجهة الأمامية لاصقة متميزة من الخلايا التائية. 6 والأهم من ذلك، التصاق وطيد والتهجير تتطلب مقاومة لقوة القص الناتجة عن تعميم تدفق الدم.
عند تصميم التجارب لدراسة الخلايا اللمفاوية التصاق، وينبغي إيلاء الاهتمام لحافز معين من الاهتمام. في حين إنتغرين تفعيل هو عنصر مشترك وحاسم من كل أشكال الخلايا التائية الالتصاق، من المرجح أن تكون فريدة من نوعها المصب من مستقبلات الفردية وشارك في مستقبلات أجهزة الطرد المركزي من التنشيط. وعلى نحو مماثل، تعمل إنتغرين والتصاق جزيء أزواج في microenvironments المتخصصة وعلى القطعان محددة. وبهذه الطريقة، يمكن تنظيم هذه الأزواج بشكل مختلف تماما. والنموذج المقدم هنا هو المثالي لدراسة الإشارات شلالات مما يؤدي إلى إنتغرين تفعيل تجري في ظل ظروف إجهاد القص. 7 هذه التفاعلات لا يمكن أن يفهم على نحو كاف في اللصق ثابتعلى النظام بسبب تأثير وقد ثبت هذه القوات لديها مباشرة على سلوك الخلايا التائية. 8 وعلى الرغم من قدم هنا مع خلايا T وشو الخلايا (الصينية الهامستر المبيض) هندسيا للتعبير عن (خلايا CHO-ICAM) البشري ICAM-1 يمكن للنظام بسهولة يمكن تعديلها لدراسة مختلف السكان الكريات البيض أو جزيئات الالتصاق.
يوفر هذا الاختبار طريقة لتحديد تي الإلتصاق خلية وتفعيل إنتغرين باستخدام إجهاد القص، تقديم نموذج للمرحلة الالتصاق ثابتة من تسرب الكريات البيض. من خلال استخدام الخلايا CHO-ICAM تقارب من LFA-1 ليجند في الخلايا الحية يمكن فحص في الوقت الحقيقي في الاستجابة للمؤثرات مختلفة من الفائدة. هذا الأسلوب يتطلب الحصول عليها بسهولة، وهي متاحة تجاريا غرف تدفق الصغيرة في توليفة مع ضخ حقنة، وتبسيط كبير من المعدات اللازمة لنموذج تدفق الدم وإجهاد القص بالمقارنة مع النماذج الأخرى. 9 ميزة رئيسية أخرى من هذا الاختبار هو أن إشارات محددةشلالات وما يترتب عليها من الدولة تفعيل integrins الفردية يمكن دراسة نظيفة من خلال استخدام الخلايا CHO المهندسة التعبير عن جزيئات الالتصاق الإنسان من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين البيانات الكمية مع التصوير الخلية الحية هو ميزة كبيرة لهذا الأسلوب. وبشكل عام، في حين تم وصف عدد من المقايسات من ساكنة التصاق الخلايا التائية التي نموذج لطيف تفاعلات الخلايا التائية، APC، وهذه النماذج ليست كافية في الاستيلاء على عملية ديناميكية تي التصاق الخلايا الظهارية. لهذا السبب، عند اختيار مقايسة التصاق التحفيز في مسألة يجب النظر فيها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الطلاء خلايا CHO-ICAM
ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو لوحة الخلايا CHO-ICAM في غرف تدفق للنمو بين عشية وضحاها بهدف توليد أحادي الطبقة متموجة.
- الحفاظ على خلايا CHO-ICAM في الأنسجة الثقافة تعامل أطباق ثقافة 10 سم في 10 مل سائل الإعلام RPMI تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (CHO-ICAM وسائل الإعلام ثقافة كاملة) عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- لجمع الخلايا، إضافة 1 مل 0.5٪ التربسين-EDTA ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة مع اهتزاز لطيف. تحييد التربسين مع 4 مل من وسائل الاعلام.
- عد الخلايا CHO-ICAM باستخدام عدادة الكريات وحساب 0.75 × 10 5 خلايا لكل غرفة. ملاحظة: في هذه التجربة: سوف تكون هناك حاجة إلى 2.25 × 10 5 خلايا البذور 3 غرف.
- الطرد المركزي 0.75 × 10 5 خلايا CHO-ICAM في غرفة لمدة 5 دقائق في 500 x ج، درجة حرارة الغرفة و resuspend بيليه الخلية في 30 ميكرولتر في غرفة CHO-ICAM وسائل الإعلام ثقافة كاملة.
ملاحظة: في هذه التجربة سوف تكون هناك حاجة إلى 90 ميكرولتر البذور 3 غرف. - إضافة ببطء الخلايا في خزان واحد من غرفة التدفق. السماح للخلايا ليستقر لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة كاملة عبر اثنين من الخزانات من كل غرفة. إضافات بديلة بين البلدين لتجنب حركة الخلايا كما equilibrates النظام.
- احتضان الخلايا بين عشية وضحاها داخل الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
2. إعداد خلايا T
ملاحظة: يمكن أن يتم هذا الاختبار مع الخلايا البشرية تي الأولية أو خط الخلايا التائية. وقد وصفت بروتوكول للالخلايا التائية العزلة من الدم في وقت سابق. 10 إذا باستخدام خلايا T الإنسان الأساسي تستخدمه الخلايا المعزولة حديثا حصول على أفضل النتائج. في حالة استخدام خط الخلايا التائية، اتبع بروتوكول الثقافة التي يحددها مصدر للخلايا. من أجل الكشف عن الخلايا على microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة وصفت خلايا T مع كربوكسي استر succinimidyl فلوريسئين (CFSE).
- عد الخلايا T باستخدام عدادة الكريات وحساب 2 × 10 6 خلايا لكل غرفة. ملاحظة: في هذه التجربة، سوف تكون هناك حاجة إلى 6 × 10 6 خلايا لمدة 3 غرف.
- الطرد المركزي 2 × 10 6 خلايا تي في غرفة لمدة 5 دقائق في 500 x ج، درجة حرارة الغرفة وresuspend الخلايا في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ جلوكوز أو 2٪ FBS.
- إضافة CFSE في 1: 1000 تخفيف (الأسهم تبذل ل5 ملم). تغطية من الضوء واحتضان لمدة 8 دقائق على RT
- تدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق، RT.
- و resuspend الخلية بيليه مع 240 ميكرولتر في حالة (انظر القسم 4 "لاحظ") من RPMI وسائل الإعلام التي تفتقر إلى مصل. في هذه التجربة، resuspend الكرية الخلية في 720 ميكرولتر من عادي RPMI. تقسيم الخلايا في فارغة 1.5 مل أنابيب المسمى لكل غرفة، 240 ميكرولتر في أنبوب. إبقاء الخلايا في كتلة C الحرارة 37 درجة حتى الاستخدام.
3. إعداد اله الإدخال / الإخراج السقاية ومضخة الحقنة
- تدفئة المجهر غرفة التصوير الحية إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد الخراطيم المدخلات:
- ملء زجاجة 500 مل بالماء وجعل 2 ثقوب في غطاء. تسمية الثقوب "في" و "الخروج". وهذا بمثابة حمام تسخين المياه لوسائل الإعلام الإدخال.
- تشغيل المدخلات الخراطيم من خلال الفتحات الموجودة في غطاء وفي حمام مائي. تأكد من أن جانب من الخراطيم التي تصل إلى حقنة يأتي من خلال "في" حفرة والجانب الذي سيربط إلى الخزان مدخلات يأتي من خلال ثقب "للخروج".
- تدفق المدخلات الخراطيم مع 60 مل من الماء لإزالة أي الهواء من النظام.
- رئيس إدخال الخراطيم مع وسائل الاعلام RPMI تفتقر المصل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. حقنة ملء 60 مل، ودفع من خلال وسائل الإعلام حتى الخراطيم وتستعد تماما وتفتقر إلى أي فقاعات الهواء.
ملاحظة: اعتمادا على lengtح من الأنابيب المستخدمة الحجم المطلوب لرئيس الوزراء سوف تختلف.- حساب حجم وسائل الإعلام اللازمة للتجربة عن طريق ضرب معدل التدفق (هنا 0.3 مل / دقيقة) من قبل عدد من دقائق (5 دقائق) من قبل عدد من الغرف في التجربة (هنا 3)؛ في هذه التجربة، استخدم 4.5 مل سائل الإعلام. ملاحظة: نوصي بعد 5 مل حجم إضافي (هنا مجموعها 9.5 مل) المتبقية في المحاقن بعد فتيلة.
- وضع الإعداد مدخلات بأكمله في العلبة التصوير المباشر لالمجهر للحفاظ على 37 درجة مئوية. تشغيل الخراطيم والمحاقن للخروج من القوقعة وتحميل حقنة في ضخ حقنة.
- إعداد الخراطيم الإخراج:
- جعل ثقب في غطاء زجاجة 250 مل لاستخدام النفايات الانتاج.
- تشغيل أنابيب الانتاج من خلال ثقب وفي زجاجة. تأمين فضفاضة غطاء، لا تغلق على طول الطريق.
- وضع الإعداد الإخراج إلى العلبة التصوير المباشر لميلcroscope.
- حساب معدل تدفق (مل / دقيقة) الضروري لتوليد إجهاد القص المطلوب (داين / سم 2). يختلف إجهاد القص في مقصورات الأوعية الدموية المختلفة، وبالتالي تأخذ بعين الاعتبار نموذج شامل بما في ذلك أنواع الخلايا لدراستها والعلاجات عند اتخاذ قرار بشأن مستوى إجهاد القص.
ملاحظة: يتم إجراء هذه التجارب على 0.4 داين / سم 2 لتقليد بشكل وثيق إعداد الوريد صغير.- تأخذ أبعاد غرفة في الاعتبار عند حساب إجهاد القص. استخدام الصيغة التالية (المقدمة من قبل الشركة المصنعة 11) لغرف تدفق المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد): T = η * 176.1 * ø حيث الإجهاد T = القص، η = اللزوجة الديناميكية، O = معدل التدفق. ملاحظة: اللزوجة الديناميكية وسائل الإعلام RPMI عند 37 درجة مئوية هو 0.007.
4. تحميل الدوائر التدفق، وتحفيز خلايا
ملاحظة: من أجل الشروع في التصاق،يجب أن يكون حافزا خلايا تي. في التجربة التالية الخلايا إما أن تبقى unstimulated أو يتم تحفيز مع قوات الدفاع الذاتى 1α 12 أو خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية، والسيطرة الإيجابية) 13. لعرض السليم للchemokine إلى الخلايا التائية، وpreincubated خلايا CHO-ICAM مع SDF-1α (تليها يغسل التسلسلية)، مما يسمح للعرض على سطح الخلية. سلطة النقد الفلسطينية هو استر phorbol مشابه هيكليا لالجلسرين الثانية رسول diacyl (داج)؛ هنا يتم استخدامه كعنصر تحكم إيجابية. يتم التعامل مع الخلايا التائية مباشرة مع سلطة النقد الفلسطينية قبل تحميل في غرفة التدفق.
- ضع الشريحة غرفة التدفق على المجهر وضبط البؤري على أحادي الطبقة CHO-ICAM باستخدام الهدف 20X.
- حفاظ على الخلايا T الملون CFSE لجميع الشروط الأخرى في كتلة C الحرارة 37 درجة. إعداد الخلايا CHO-ICAM أو تي النحو التالي مباشرة قبل الفحص عن هذا الشرط:
- للشرط unstimulated (الغرفة 1)، والحفاظ على أنبوب واحد / الفصل تدفقالعنبر غير المعالجة، لخدمة سيطرة سلبية لتحفيز.
- لسلطة النقد الفلسطينية التحفيز (الغرفة 2)، وتحفيز أنبوب واحد من الخلايا T مع سلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) لخدمة السيطرة الإيجابية. علاج على الفور قبل تحميل إلى غرفة التدفق.
- لتحفيز SDF-1α، (غرفة 3)، وتحفيز غرفة التدفق الثالثة مع SDF-1α (100 نانوغرام / مل) عن طريق إزالة 70 ميكرولتر في وقت 3 مرات من الخزان العلوي (الانتاج الخزان) ثم إضافة 70 ميكرولتر من قوات الدفاع الذاتى -1α (100 نانوغرام / مل) في أقل خزان (المدخلات الخزان). احتضان لمدة 5 دقائق.
- إزالة والتخلص من 70 ميكرولتر في وقت 3 مرات من الخزان الناتج من غرفة واحدة.
- إضافة 70 ميكرولتر من قبل المعالجة (حسب مقتضى الحال) تعليق الخلايا التائية إلى الخزان المدخلات 3 مرات. انتظر 5 دقائق للسماح للخلايا للانتقال من مدخل الغرفة ( "وفي")، والوصول إلى منفذ الداني ( "خارج") من الغرفة.
- خلال هذا الوقت، صورة 5الحقول للخلايا T الملون CFSE. اختيار الحقول المنتشرة في جميع أنحاء وسط الغرفة (الشكل 1). استخدام الظروف الإثارة / الانبعاثات التالية: الإثارة الليزر الطول الموجي: 488 نانومتر. جمع الانبعاثات مرشح: 500-540 نانومتر. وستكون هذه الصور بمثابة تعداد خلايا ما قبل التدفق.
- نعلق المدخلات والمخرجات الأنابيب في الوقت نفسه إلى الخزانات غرفة التدفق.
ملاحظة: إرفاق أنابيب في وقت واحد أمر بالغ الأهمية وذلك لعدم إدخال فقاعات الهواء في الغرفة والحفاظ على التوازن العام داخل الغرفة. - بدء تدفق في 0.3 مل / دقيقة (0.4 داين / سم 2) في حين تصور الخلايا T الملون CFSE. مع بدء تدفق، وخاصة مع الغرفة الأولى، غالبا ما يكون هناك فجوة بين بدء تدفق ومراقبة المتداول الخلايا التائية، وبالتالي يبدأ توقيت 5 دقائق على بداية حركة الخلايا التائية.
- إنهاء تدفق بعد 5 دقائق، وصورة 5 الحقول في قناة CFSE. اختيار الميادين فرقت عشوائيا تروughout وسط غرفة التدفق (الشكل 1). وستكون هذه الصور بمثابة تعداد خلايا بعد تدفق.
5. تحديد النسبة المئوية للخلايا منتسب
ملاحظة: تحديد عدد الخلايا في الصور المكتسبة تتم بموضوعية مع برامج الحاسوب الآلي. لدراستنا استخدمنا Volocity البرنامج (الإصدار 6.2.1)، ولكن البرامج الأخرى مثل يماغيج (النسخة 1.48V) تنطبق أيضا.
- تحديد عدد الخلايا في الحقل قبل التدفق لكل حالة. متوسط 5 مجالات هي "ما قبل تدفق متوسط عدد الخلايا." (7)
- تحديد عدد الخلايا في الحقل بعد تدفق لكل حالة. متوسط 5 مجالات هي "مرحلة ما بعد تدفق متوسط عدد الخلايا." (7)
- حساب النسبة المئوية للخلايا ملتصقة باستخدام الصيغة التالية: النسبة المئوية للخلايا ملتصقة = (بعد تدفق متوسط عدد الخلايا) / (قبل تدفق متوسط عدد خلايا) × 100٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر نتائج ممثلة من فحص تدفق التصاق باستخدام Jurkat والإنسان الأساسي خلايا CD3 + T، كما هو مبين، وحفز مع SDF-1α. الضوابط السلبية في كل التجارب المعروضة هي الخلايا unstimulated. والالتصاق عتبة القاعدية في المئة من الخلايا unstimulated ما بين 5-10٪. التصاق قاعدة اسيما فوق هذا النطاق يشير إلى تجربة إشكالية ويشير السكان بداية من خلايا تي وnonspecifically قبل تفعيلها في طور الإعداد. أضعاف الزيادة في عدد الخلايا الملتصقة يمكن حساب بعد تدفق في كل حالة على أن الخلايا unstimulated بالإضافة إلى حساب في المئة التصاق. البيانات التي تمثل هذه الأساليب الحساب جهازي يتم تضمين هنا.
ويبين الشكل 2A صور تمثيلية من المجالات داخل غرفة التدفق لكل مرحلة ما قبل الشرط وبعد التدفق. قبل التجربة، Jurkat (عرضن في الشكل 2A) أو الإنسان الأساسي خلايا CD3 + T لتنقيته، عدها، والمسمى مع CFSE. لكل حالة تجريبية وصفت 2 × 10 6 خلايا. تم تحميل خلايا T Unstimulated إلى غرف تدفق تحتوي على خلايا CHO-ICAM في وجود أو عدم وجود قوات الدفاع الذاتى-1α. سمح للخلايا T للتحرك وتتراكم في غرفة لمدة 5 دقائق، وخلال هذه الفترة تم التقاط الصور لتحديد التهم قبل التدفق. وهناك عدد مماثل من الخلايا ما قبل تدفق بين التحفيز المختلفة أمر ضروري لضمان ظروف تجريبية موحدة. وبعد 5 دقائق من إجهاد القص المستمر الناتجة عن تدفق، تم القبض على الصور مرة أخرى لتحديد التهم بعد تدفق. ومن الواضح من خلال هذه الصور التمثيلية التي SDF-1α يزيد من عدد خلايا T قادرة على الانضمام إلى خلايا CHO-ICAM تحت إجهاد القص.
ويبين الشكل 2B التغيير أضعاف في الخلايا التائية التصاق كما كالculated بناء على عدد من الخلايا Jurkat T قبل وبعد تدفق إما unstimulated أو في وجود قوات الدفاع الذاتى-1α. لكل حالة يتم استخدام متوسط عدد الخلايا من 5 حقول ما قبل تدفق و 5 حقول تم تحديد بعد تدفق، والمقارنة بين التحفيز SDF-1α إلى unstimulated لحساب التغير أضعاف في تي التصاق الخلية. كما هو موضح هنا، SDF-1α يؤدي الى قرب زيادة بنسبة 2 أضعاف في التصاق مقارنة unstimulated.
الشكل 2C يدل على طريقة بديلة لحساب البيانات. هنا يتم تحديد التصاق في المئة من خلايا الإنسان الأولية CD3 + T في وجود أو عدم وجود قوات الدفاع الذاتى-1α من خلال تحديد أول متوسط التهم قبل وبعد تدفق الخلايا التائية، ثم تقسيم المتوسط بعد تدفق من متوسط ما قبل تدفق وضرب من قبل 100. ومن خلال هذا الحساب جميع السكان قبل تدفق يمثل 100٪ التصاق. كما هو موضح هنا، و 15٪ من خلايا تي unstimulated تلتزم تحت القص تعزيز بنية الشعSS بالمقارنة مع 50٪ من خلايا تي حفز مع SDF-1α.
الشكل 1. من المهم لتحليل المناطق الوحيدة تتعرض لتدفق متجانسة. تمثيل تخطيطي للغرف تدفق المستخدمة مع الإشارة إلى حيث يجب أن يتم تصويرها المجالات. حسب المعلومات المقدمة من قبل الشركات المصنعة غرفة، وحقق معدل تدفق محددة مسبقا إلا من خلال مركز دائرة من الدوائر، وأشار البرتقال في هذا التخطيطي. أقرب إلى حدود غرفة وانخفاض معدل تدفق ولا ينبغي أن تدرج في التصوير التجريبي أو تحليل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. <قوي> SDF-1α يدفع الخلايا التائية الانضمام إلى ICAM-1 تحت إجهاد القص. وصفت خلايا A. Jurkat T مع CFSE بتركيز 5 ميكرومتر. بعد ذلك، تم تحميل الخلايا في غرف تدفق التي كانت سابقة التجهيز مع SDF-1α (100 نانوغرام / مل) أو unstimulated وضعت على المجهر متحد البؤر ويسمح للتحرك وتتراكم في غرفة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، وكانت سابقة التجهيز خلايا Jurkat T مع سلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) قبل إضافة إلى غرف التدفق. طوال تلك الصور 5 دقائق قبل تدفق تم القبض عليه. وبعد ذلك بدأ تدفق في 0.4 داين / سم 2 لإنشاء إجهاد القص لمدة 5 دقائق. عند الانتهاء، تم القبض على الصور بعد تدفق. وتظهر الصور التمثيلية للخلايا Jurkat T، شريط مقياس 50 ميكرون. B. تم احتساب التغير أضعاف في التصاق الخلايا Jurkat T من تحديد أول متوسط التهم قبل وبعد تدفق خلية لكل حالة وتقسيم متوسط عدد ما بعد تدفق على المتوسط شارك قبل تدفقالاتحاد الوطني للعمال بشكل فردي لكل حالة. هذا حاصل التصاق لكل حالة التحفيز، وهنا SDF-1α أو سلطة النقد الفلسطينية، وبعد ذلك مقسوما على حاصل التصاق unstimulated لتحديد التغير أضعاف في التصاق. تمثل الحانات بمعدل 3 تجارب ± SEM. C. نسبة التصاق الإنسان الأساسي خلايا CD3 + T حسبت عن طريق تحديد أول المتوسط قبل وبعد تدفق عدد خلايا لكل حالة. لكل حالة، وينقسم متوسط عدد ما بعد تدفق على متوسط عدد ما قبل تدفق ومضروبا 100. ويستند التصاق في المئة الناتج على عدد خلايا ما قبل تدفق يجري 100٪ التصاق. الحانات تمثل المتوسط من 5 تجارب ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. Tخلايا أولا تتراكم ثم تتدفق على أحادي الطبقة CHO-ICAM. وصفت خلايا Jurkat T مع CFSE بتركيز 5 ميكرومتر. بعد ذلك، تم تحميل الخلايا في غرف تدفق التي كانت سابقة التجهيز مع SDF-1α (100 نانوغرام / مل)، وضعت على المجهر متحد البؤر ويسمح للتحرك وتتراكم في غرفة لمدة 5 دقائق. طوال هذه الصور 5 دقائق تم القبض على شكل سلسلة مرور الزمن. لا يزال الإطارات (A). وبعد ذلك بدأ تدفق في 0.4 داين / سم 2 لإنشاء إجهاد القص لمدة 5 دقائق. طوال هذه الصور 5 دقائق تم القبض على شكل سلسلة مرور الزمن. لا يزال الإطارات (B). اتجاه التدفق في هذه الصور هو من أسفل إلى أعلى، ويتم تعيين البؤري في أحادي الطبقة CHO-ICAM. خلايا تي ويمكن تصنيفها إلى 3 مجموعات هي: (1) وتصور خلايا T المتداول على طول أحادي الطبقة في معدل التدفق، خطوط أفقية قصيرة كما يتحرك من أسفل إلى أعلى في هذا المجال منذ انهم يتحركون بسرعة في حين يجري تصويره. (2) خلايا تي crawlinز على طول أحادي الطبقة. وانضمت هذه الخلايا بحزم على أساس المقاومة في التدفق، والزحف المرجح بحثا عن مساحة متساهلة للمرور الخلوي، والتي لا يلاحظ في هذا النموذج. (3) خلايا تي أن تتمسك بشدة أحادي الطبقة، تقاوم التدفق، ولكنها قادرة على الحركة. هذه الخلايا لا تدور بنشاط أو الزحف على طول أحادي الطبقة. ويمكن أن يتم تحليل أكثر تطورا، استنادا إلى أهداف الدراسة، من خلال استخدام برنامج نصي يماغيج صممت لتشريح هؤلاء السكان الخلية لمزيد من التحديد الكمي أو التوصيف. على نطاق ويمنع 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. يجب على الخلايا CHO-ICAM تشكيل أحادي الطبقة متموجة. صورة الممثل من متكدسة CHO-ICAM monolayإيه داخل غرفة التدفق. مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل تحليل الخلايا التائية الالتصاق بشكل صحيح، ومنبه ليتم تضمينها في الدراسة يجب مراعاتها عند اختيار طريقة في المختبر. في حين أن هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات المؤدية إلى LFA-1 التنشيط وICAM-1 ملزمة كل الأساليب ليست قابلة للتبديل. والتصاق فحص ثابت 10 هو الأنسب لدراسة التفاعلات تي خلية APC. بدلا من ذلك، فإن هذه الطريقة إجهاد القص مفصلة هنا هو المثالي لنموذج T-الخلايا الظهارية التفاعلات الخلية. في الجسم الحي، كما يتم عرض كيموكينات على طول البطانة، المتداول خلايا T يجب أن تستجيب من خلال الالتزام بحزم ومقاومة إجهاد القص من تدفق الدم 14،15. لهذا السبب، ودراسة الإشارات chemokine هو الانسب لدراستها في فحص يتضمن إجهاد القص. والميزة الرئيسية لهذا الالتصاق باستخدام ظروف تدفق هو بساطته في نمذجة التفاعلات بين الخلايا T وintegrins. هذا الاختبار يجمع بين وظيفة وميكانيكي فريد جدادراسات النمذجة بيئة لدراسة واحدة إنتغرين التصاق الزوج جزيء. قوة أخرى من هذا الأسلوب هو قدرتها على التكيف. ويمكن استخدام هذه الطريقة لقياس التصاق الكريات البيض أي إلى أي جزيء التصاق. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحص تأثير أدوية متعددة أو التلاعب الجيني المتوقع أن يغير تي تجنيد خلية والتسرب من خلال تفعيل إنتغرين تغييرها.
كما هو الحال مع أي طريقة في المختبر، وهناك بعض القيود المفروضة على هذا الاختبار. هذا النموذج يستخدم هندسة الخلايا CHO بدلا من الخلايا البطانية الأولية حفز كما استخدمت نماذج أخرى. 16 في حين أن هذا يعطينا القدرة على فهم الأحداث يشير الى التأثير على الدولة تفعيل لإنتغرين واحد، وهذا يمكن أيضا أن يعتبر ضعف النموذج. كما لا توجد selectins أعرب من قبل خلايا CHO، ويتم فحص في خطوتين. خلال الخطوة الأولى (مرحلة تراكم)، يتم حقن الخلايا تي في RESERV المدخلاتOIR في جانب واحد من الغرفة والسفر إلى الجانب الآخر من الحد الأدنى من ضغط وقوات الشعرية. سلوك الخلايا T طوال هذه مدة 5 دقائق ويمكن ملاحظة في الشكل 3A. بعد 5 دقائق، وخلال المرحلة الثانية (مرحلة التدفق) يتم زيادة معدل تدفق والخلايا سوف تبدأ للفة والالتزام. من المهم أن نلاحظ أن ليس كل خلايا T حقنها في خطوة المدخلات الخزان عبر الغرفة خلال مرحلة التراكم، وهذه الخلايا لا لفة طول أحادي الطبقة كما هو زيادة تدفق (الشكل 3B). وبهذه الطريقة، فقد تم تطوير المرحلة المتداول من التسرب بشكل مصطنع، ولكن ليس القضاء عليها، في هذا النموذج.
منذ الحد الأقصى لعدد الخلايا الملتصقة هو تعبير عن عدد من الخلايا المدخلات التي تدخل إلى الغرفة هناك احتمال لتقلبات عدد الخام بين التجارب. في حين أن الصور preflow لا تمثل تماما كحد أقصى T السكان الخلية 100٪ لأنها لا تأخذ بعين محاسباتر الخزان المدخلات، فمن رقابة هامة أن تدرج في حسابات خاصة عندما اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا عدها بشكل فردي وينبغي مقارنة. بالإضافة إلى ذلك، فمن غير المستحسن أن يتم استخدام الخلايا الليمفاوية الانفجار الأساسي في تحليل واحد التصاق متغير. وهذا يعني، قبل تنشيط خلايا تي من خلال مستقبلات الخلايا التائية (TCR) و / أو شارك في مستقبلات قد يربك تأثير العلاج من الفائدة على الالتصاق. وينبغي النظر في هذه المتغيرات خلال التصميم التجريبي. وبالمثل، دراسات وظيفية مع PBMCs المجمدة سابقا في كثير من الأحيان تؤدي إلى نتائج التباس، ولهذا السبب خطوط الخلايا أو PBMCs الأولية المعزولة حديثا تعمل بشكل أفضل مع هذا الاختبار. فهم مستوى الأساس الطبيعي للالتصاق unstimulated لPBMC التي شملتها الدراسة أمر بالغ الأهمية في تحديد السكان الخلية التي تم nonspecifically قبل تفعيلها مما يؤدي إلى نتائج مربكة.
لتكرار هذا الاختبار مع دقة، فإنه من الضروري أن بعض خطوةالصورة في البروتوكول، بما في ذلك تسوية وحضانة تدفق مرات، يكون دقيقا وموحد بين جميع الظروف. في هذا الضوء نفسه، وخلايا CHO-ICAM يجب متموجة بشكل موحد في جميع الدوائر تدفق (الشكل 4) وعدد خلايا T يجب أن يكون دقيقا. 17 الاختلافات حتى الصغيرة في هذه العوامل قد تؤثر دقة عدد الخلايا في نهاية المطاف. تطبيق في المستقبل من هذا الاختبار هو تطوير سلسلة من خطوط الخلايا معربا فردي selectins وجزيئات الالتصاق لتوسيع تأثير هذا الأسلوب لأجهزة الطرد المركزي يشير أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
