Summary
Denne strøm adhæsion assay tilvejebringer en enkel, høj slagstyrke model af T-celle-epitel celle-interaktioner. En sprøjte pumpe anvendes til at generere forskydningsspænding, og konfokal mikroskopi tager billeder til kvantificering. Målet med disse undersøgelser er at effektivt kvantificere T-celle adhæsion ved hjælp strømningsforhold.
Abstract
Samlet, T-celle-adhæsion er et afgørende element i funktion, bidrager til de forskellige processer af cellulær rekruttering til steder med inflammation og interaktion med antigenpræsenterende celler (APC) i dannelsen af immunologiske synapser. Disse to sammenhænge T-celle-adhæsion forskellige med, at T-celle-APC-interaktioner kan betragtes statisk, mens celle T-blodkarrenes interaktioner udfordres af forskydningsspændingen genereret af selve cirkulation. T-celle-APC-interaktioner er klassificeret som statisk ved, at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hinanden. Sædvanligvis er denne interaktion sker inden lymfeknuderne. Som T-celle interagerer med blodet karvæggen, cellerne anholde og skal modstå den genererede forskydningsspænding. 1,2 Disse forskelle understreger behovet for bedre at forstå statisk klæbeevne og vedhæftning under strømningsforhold som to distinkte regulatoriske processer. Reguleringen af T-celle adhæsion kan mest rammende beskrives som controlling affinitet tilstand af integrin-molekyler udtrykt på celleoverfladen og derved regulere interaktionen af integriner med adhæsionsmolekylet ligander udtrykt på overfladen af det interagerende celle. Vores nuværende forståelse af reguleringen af integrin affinitet stater kommer fra ofte forsimplede in vitro modelsystemer. Assayet af adhæsion under anvendelse af strømningsforhold beskrevet her tillader visualisering og nøjagtig kvantificering af T-celle-epitel celle-interaktioner i realtid efter en stimulus. En adhæsion under flow assay kan anvendes til studier af adhæsion signalering inden T-celler efter behandling med inhiberende eller stimulerende stoffer. Derudover kan dette assay udvides ud over T-celle-signalering til enhver klæbende leukocytpopulationen og enhver integrin-adhæsionsmolekyle par.
Introduction
T-lymfocyt vedhæftning medierer en række forskellige processer i et sundt immunsystem, 3 spiller kritiske roller i T-celle menneskehandel og antigen præsentation. Hvad enten under immunovervågning eller et aktivt immunrespons disse to brede roller for adhæsion er kritiske. 4 De fysiologiske signaleringsbegivenheder af T-celle-endotelcelle-interaktioner er forskellige fra T-celle-antigen-præsenterende celle (APC) interaktioner, og derfor kræver helt forskellige måder undersøgelse til bedst forstår signaleringskaskader involveret. Den faste adhæsion af en T celle til et blodkar væg under lymfocyt ekstravasation kræver hurtig og dynamisk aktivering integrin. Den stramme interaktion mellem en aktiv tilstand integrin og adhæsionsmolekyler langs endotel fører til adhæsion resistent over for strømmen af blod, hvilket tillader T-celler at kravle langs overfladen i søgning af et område permissiv til celle passage. 5 gennemgang af en T celle bi -directionally alonga blodkarvæggen er afhængige af polariseret adhæsion, med et særskilt klæbende forende af T-cellen. 6 Vigtigst faste adhæsion og transmigration kræver resistens over for forskydningskraften frembragt ved cirkulerende blod flow.
Når du designer eksperimenter for at studere lymfocyt vedhæftning, bør man være opmærksom på den specifikke stimulus af interesse. Mens integrinaktivering er en almindelig og kritisk komponent af alle former for T-celle-adhæsion, de kaskader af aktivering vil sandsynligvis være unik nedstrøms for individuelle receptorer og co-receptorer. Ligeledes integrin og vedhæftning molekyle par fungerer i specialiserede mikromiljøer og om særlige subpopulationer. På denne måde kan disse par reguleres ganske forskelligt. Modellen præsenteret her er ideel for studiet af signalering kaskader fører til integrinaktivering finder sted under forskydning stressbetingelser. 7 Disse interaktioner kan ikke i tilstrækkelig forstås i en statisk adhesion system på grund af virkningen af disse kræfter er blevet vist at have direkte på T-celle adfærd. 8 Selvom præsenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamsterovarie) celler konstrueret til at udtrykke human ICAM-1 (CHO-ICAM-celler) dåsen systemet let modificeres til at studere forskellige leukocytpopulationer eller adhæsionsmolekyler.
Dette assay tilvejebringer en fremgangsmåde til at kvantificere T-celle klæbeevne og integrin-aktivering ved hjælp af shear stress, hvilket giver en model for faste adhæsion fase af leukocyt-ekstravasation. Gennem brug af CHO-ICAM-celler kan undersøges affiniteten af LFA-1 til liganden med levende celler i realtid som respons på forskellige stimuli af interesse. Denne teknik kræver let opnås kommercielt tilgængelige mikro-flow kamre i kombination med en sprøjtepumpe, i høj grad forenkler det nødvendige udstyr til at modellere blodgennemstrømning og forskydningsspænding i forhold til andre modeller. 9 En anden stor fordel ved dette assay er, at signaleringkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden af individuelle integriner kan rent undersøgt ved anvendelse af gensplejsede CHO-celler udtrykker humane adhæsionsmolekyler af interesse. Derudover kan kombinationen af kvantitative data med levende celler er en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde. Samlet, medens en række assays af statisk T-celle adhæsion er blevet beskrevet, at pænt Model T-celle-APC interaktioner, disse modeller er utilstrækkelig til at fange den dynamiske proces med T-celle-epitel vedhæftning. Af denne grund, når de vælger en adhæsion assay må betragtes som den stimulus pågældende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udpladning af CHO-ICAM Cells
Bemærk: Målet med dette trin er at plettere CHO-ICAM-celler i strømningskamre for vækst natten over med det mål at frembringe et sammenflydende monolag.
- Oprethold CHO-ICAM-celler i cellekultur behandlet 10 cm dyrkningsskåle i 10 ml RPMI-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplet dyrkningsmedium) ved 37 ° C med 5% CO2.
- At indsamle celler, tilsættes 1 ml 0,5% trypsin-EDTA og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min med forsigtig rystning. Neutraliser trypsinet med 4 ml medier.
- Tæl CHO-ICAM celler ved hjælp af et hæmacytometer og beregne 0,75 x 10 5 celler pr kammer. Bemærk: I dette eksperiment: 2,25 x 10 5 celler vil være behov at pode 3 kamre.
- Centrifuge 0.75 x 10 5 CHO-ICAM celler pr kammer i 5 minutter ved 500 xg, stuetemperatur og resuspender cellepelleten i 30 pi pr kammer CHO-ICAM Komplette dyrkningsmedier.
Bemærk: I dette eksperiment vil blive behov for 90 pi til frø 3 kamre. - Tilsæt langsomt celler til en reservoir af strømningskammeret. Lade cellerne nøjes med 5 min i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Tilsæt 200 pi komplette dyrkningsmedier tværs af de to reservoirer af hvert kammer. Alternative tilføjelser mellem de to for at undgå bevægelse af cellerne som systemet i ligevægt.
- Inkuber cellerne natten over i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
2. Fremstilling af T-cellerne
Bemærk: Dette assay kan gøres med primære humane T-celler eller en T-cellelinie. En protokol om T-celle isoleret fra blodet er tidligere blevet beskrevet. 10. Hvis du bruger primære humane T celler bruger frisk isolerede celler for de bedste resultater. Hvis der anvendes en T-cellelinie, følg kultur protokollen angivet af kilden af cellerne. For at detektere cellerne på en fluorescerende microscope T-cellerne er mærket med carboxy fluorescein succinimidylester (CFSE).
- Tæl T-celler ved anvendelse af et hæmacytometer og beregne 2 x 10 6 celler pr kammer. Bemærk: I dette eksperiment, vil der være behov 6 x 10 6 celler i 3 kamre.
- Centrifuger 2 x 10 6 T celler pr kammer i 5 minutter ved 500 xg, stuetemperatur og cellerne resuspenderes i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% glucose eller 2% FBS.
- Tilføj CFSE ved 1: 1000 fortynding (lager lavet til 5 mM). Dæk mod lys og inkuberes i 8 minutter ved stuetemperatur
- Spin på 500 xg i 5 minutter, RT.
- Resuspender cellepelleten med 240 pi pr tilstand (se afsnit 4 "Bemærk") i RPMI medier mangler serum. I dette eksperiment resuspender cellepelleten i 720 pi almindeligt RPMI. Opdel celler i tomme 1,5 ml rør mærket for hvert kammer, 240 pi pr rør. Holde cellerne i et 37 ° C varmeblok indtil anvendelse.
3. Opsætning af the Input / Output slangeføring og Syringe Pump
- Varm mikroskopet direkte billedvisning kammer til 37 ° C.
- Forbered input spuling:
- Fyld en 500 ml glasflaske med vand og gøre 2 huller i låget. Mærk hullerne "i" og "out". Dette vil virke som en opvarmning vandbad i inputmedieformatet.
- Kør input spuling gennem hullerne i låget og ind i vandbad. Sørg for, at den side af spuling, der forbinder til sprøjten kommer gennem "i" hul og den side, der vil forbinde til input reservoir kommer gennem "out" hul.
- Skyl input spuling med 60 ml vand for at fjerne eventuel luft fra systemet.
- Prime input spuling med RPMI-medium mangler serum opvarmet til 37 ° C. Fyld en 60 ml sprøjte og skub gennem medierne, indtil spuling er helt primet og mangler eventuelle luftbobler.
Bemærk: Afhængigt af length af slange, der anvendes rumfang til at prime, vil variere.- Beregn mængden af medier, der er nødvendige til forsøget ved at gange strømningshastigheden (her 0,3 ml / min) ved det antal minutter (5 min) med antallet af kamre i eksperimentet (her 3); i dette eksperiment, bruge 4,5 ml medie. Bemærk: Vi anbefaler at have 5 ml ekstra volumen (her i alt 9,5 ml) tilbage i sprøjte efter priming.
- Placere hele input opsætningen i direkte billedvisning indkapsling af mikroskopet for at opretholde 37 ° C. Kør spuling og sprøjten ud af kabinettet og indlæse sprøjten i sprøjtepumpen.
- Forbered output spuling:
- Lave et hul i låget på en 250 ml flaske til brug som output affald.
- Kør output slangen gennem hullet og ind i flasken. Løst fast låget, ikke lukke hele vejen.
- Placer output setup i live imaging kabinet af microscope.
- Beregn strømningshastighed (ml / min) for at generere den ønskede forskydningsspænding (dyn / cm2). Shear stress varierer i forskellige vaskulære rum, derfor tage hensyn til den samlede model, herunder celletyper, der skal undersøges og behandlinger, når det besluttes på en forskydningsspænding niveau.
Bemærk: udføres Disse eksperimenter ved 0,4 dyn / cm2 til nøje efterligner en lille vene indstilling.- Tag kammer dimensioner i betragtning ved beregning shear stress. Brug følgende formel (fra producenten 11) til flow kamre anvendes her (se tabel Materialer): T = η * 176,1 * ø, hvor T = forskydningsspænding, η = dynamisk viskositet, ø = flowhastighed. Bemærk: Den dynamiske viskositet af RPMI-medium ved 37 ° C er 0,007.
4. Ilægning af Flow Chambers og stimulering af cellerne
Bemærk: For at initiere vedhæftning,T-celler skal stimuleres. I det følgende forsøg vil cellerne enten forblive ustimuleret eller stimuleret med SDF-1α 12 eller phorbolmyristatacetat (PMA; positiv kontrol) 13. For korrekt præsentation af chemokin til T-celle, er CHO-ICAM celler præinkuberet med SDF-1α (efterfulgt af serielle vaske), der giver mulighed for præsentation på celleoverfladen. PMA er en phorbolester, der er strukturelt ligner det andet messenger diacylglycerol (DAG); her det anvendes som en positiv kontrol. T-celler er direkte behandlet med PMA før de lægges i strømningskammeret.
- Placer flow kammer slide på mikroskopet og indstille fokusplanet på CHO-ICAM monolag ved hjælp 20X mål.
- Hold CFSE-farvede T-celler for alle andre forhold i 37 ° C varme blok. Forbered CHO-ICAM eller T-celler som følger umiddelbart før analysen for denne betingelse:
- For ikke-stimulerede tilstand (kammer 1), holder et rør / flow chrav ubehandlet for at tjene som negativ kontrol for stimulering.
- For PMA-stimulering (kammer 2), stimulerer et rør af T-celler med PMA (10 ng / ml) for at tjene som positiv kontrol; behandle umiddelbart før læsning i flow kammer.
- For SDF-1α stimulering, (kammeret 3), stimulere tredje strømningskammeret med SDF-1α (100 ng / ml) ved at fjerne 70 ul af gangen 3 gange fra den øvre reservoir (output reservoir) og derefter tilsætte 70 pi SDF -1α (100 ng / ml) i den nedre reservoir (input reservoir). Der inkuberes i 5 min.
- Fjern og kassér 70 pi ad gangen 3 gange fra udgangen reservoir af et kammer.
- Tilføj 70 pi forbehandlet (som relevant) T-celle suspension i input reservoiret 3 gange. Vent 5 minutter for at tillade cellerne at bevæge sig fra indløbet af kammeret ( "In"), og for at nå den proksimale udløb ( "Out") af kammeret.
- I løbet af denne tid, billede 5felter for CFSE-farvede T-celler. Vælg felter, der er spredt i hele midten af kammeret (figur 1). Brug følgende excitation / emission betingelser: excitation laser bølgelængde: 488 nm; emission samling filter: 500 - 540 nm. Disse billeder vil tjene som pre-flow celletal.
- Fastgør input og output slanger samtidigt til strømningskammeret reservoirer.
Bemærk: Montering af slangen samtidig er kritisk for således ikke at indføre luftbobler ind i kammeret og at det generelle ligevægt inde i kammeret. - Begynd flow ved 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), mens visualisere CFSE-farvede T-celler. Som flow begynder, især med det første kammer, er der ofte en tidsforskydning mellem initiering flow og observere T-celle rullende derfor begynde timing 5 minutter ved indtræden af T-celle bevægelighed.
- Afslut flow efter 5 min, og image 5 felter i CFSE kanal. Vælg felter tilfældigt spredte throughout centrum af strømningskammeret (figur 1). Disse billeder vil tjene som de post-flow celletal.
5. Bestemmelse af Andel af klæbende celler
Bemærk: Bestemmelse af antallet af cellerne i de erhvervede billederne sker objektivt med automatiseret software. For vores studier brugte vi software Volocity (Version 6.2.1), men anden software såsom ImageJ (Version 1.48V) kan også anvendes.
- Bestemme antallet af celler pr pre-flow for hver betingelse. Gennemsnittet af de 5 felter er "præ-flow gennemsnitlige celletal." 7
- Bestem antallet af celler pr post-flow for hver betingelse. Gennemsnittet af de 5 felter er "post-flow gennemsnitlige celletal." 7
- Beregn procentdelen af adhærerende celler ved anvendelse af følgende formel: Procent af adhærente celler = (post-flow gennemsnitlige celletal) / (pre-flow gennemsnitlige celletal) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater er vist fra strømmen adhæsion assay ved anvendelse Jurkat og primære humane CD3 + T-celler, som indikeret, stimuleret med SDF-1α. De negative kontroller i alle viste eksperimenter er stimulerede celler. En tærskel basal procent vedhæftning af stimulerede celler er mellem 5 - 10%; basen adhæsion navnlig over dette interval angiver en problematisk eksperiment og foreslår starten population af T-celler blev ikke-specifikt præaktiveret under forberedelse. Fold stigning i antallet af adhærente celler efter strømning i hver tilstand forhold til den for ikke-stimulerede celler kan beregnes på over beregningen af procent adhæsion. Data, der repræsenterer disse to beregningsmetoder er medtaget her.
Figur 2A viser repræsentative billeder af felter i strømningskammeret for hver betingelse præ- og post-flow. Forud for forsøget, Jurkat (visn i figur 2A) eller primær humane CD3 + T-celler oprenses, talt og mærket med CFSE. For hver eksperimentel betingelse blev 2 x 10 6 celler mærkes. Ustimulerede T-celler blev fyldt i strømningskamre indeholdende CHO-ICAM-celler i nærvær eller fravær af SDF-1α. T-cellerne fik lov til at bevæge sig og akkumuleres i kammeret i 5 minutter, og i denne periode billeder blev fanget at bestemme de præ-flow tæller. Et tilsvarende antal celler præ-flow mellem de forskellige stimuleringer er afgørende for at sikre ensartede forsøgsbetingelser. Efter 5 min på kontinuerlig forskydningsspænding frembringes af flow, blev billederne igen fanget at bestemme post-flow tæller. Det er tydeligt gennem disse repræsentative billeder, som SDF-1α forøger antallet af T-celler i stand til at overholde de CHO-ICAM celler under forskydningsspænding.
Figur 2B viser gange ændring i T-celle-adhæsion som caltisk baseret på antallet af Jurkat T-celler før og efter flow enten ustimuleret eller i nærvær af SDF-1α. For hver betingelse de gennemsnitlige celletal på 5 felter pre-flow og 5 felter post-flow blev bestemt, og en sammenligning af SDF-1α stimulation til ikke-stimuleret bruges til at beregne gange ændring i T-celle-adhæsion. Som vist her, SDF-1α inducerer en nær 2-fold stigning i adhæsion sammenlignet med ustimuleret.
Figur 2C demonstrerer en alternativ beregningsmetode data. Her procent adhæsion af primære humane CD3 + T-celler i nærvær eller fravær af SDF-1α bestemmes ved først at bestemme de gennemsnitlige præ- og post-flow T-celletal, derefter dividere post-flow gennemsnit af gennemsnittet for-flow og gange med 100. Gennem denne beregning hele præ-flow befolkning udgør 100% adhæsion. Som vist her, 15% af ikke-stimulerede T-celler klæber under forskydning stress sammenlignet med 50% af T-celler stimuleret med SDF-1α.
Figur 1. Det er vigtigt at analysere kun områder der er udsat for homogen strømning. Skematisk repræsentation af strømningskamre anvendes med angivelse af, hvor felter skal afbildes. Pr oplysninger fra kammeret fabrikanter, er præ-indstillede strømningshastighed kun opnås gennem midten af kamrene, angivet med orange i denne skematiske. Tættere på grænsen af kammerets flow rate falder, og bør ikke indgå i eksperimentel billeddannelse eller analyse de. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. <strong> SDF-1α inducerer T-celle-adhæsion til ICAM-1 under forskydningsspænding. A. Jurkat T-celler blev mærket med CFSE ved en koncentration på 5 uM. Derefter blev cellerne fyldt i strøm-kamre, der blev forbehandlet med SDF-1α (100 ng / ml) eller ustimulerede og oprettet på konfokalt mikroskop og må omsættes og akkumuleres i kammeret i 5 minutter. Alternativt blev Jurkat T-celler forbehandlet med PMA (10 ng / ml) forud for tilsætning til strøm-kamre. Igennem disse 5 min pre-flow billeder blev taget. Flow blev derefter initieret ved 0,4 dyn / cm2 til skabe forskydningsspænding i 5 min. Ved afslutningen blev post-flow billeder taget til fange. Repræsentative billeder af Jurkat T-celler er vist, skala bar 50 pm. B. gange ændring i adhæsion af Jurkat T-celler blev beregnes ved først at bestemme de gennemsnitlige præ- og post-flow celletal for hver tilstand og dividere den gennemsnitlige post-flow count af den gennemsnitlige pre-flow count individuelt for hver tilstand. Denne adhæsion kvotienten for hver stimulering tilstand, her SDF-1α eller PMA, divideres derefter med den ustimulerede vedhæftning kvotienten at bestemme gange ændring i vedhæftning. Søjler repræsenterer gennemsnittet af 3 eksperimenter ± SEM. C. Procent adhæsion af primære humane CD3 + T-celler blev beregnet ved først at bestemme de gennemsnitlige præ- og post-flow celletal for hver tilstand. For hver tilstand, er den gennemsnitlige post-flow count divideret med den gennemsnitlige pre-flow count og ganget med 100. Den resulterende procent vedhæftning er baseret på den præ-flow celletal var 100% vedhæftning. Barer repræsenterer gennemsnittet af 5 eksperimenter ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. TCeller først ophobes derefter flyde over CHO-ICAM monolag. Jurkat T-celler blev mærket med CFSE ved en koncentration på 5 uM. Derefter blev cellerne fyldt i strøm-kamre, der blev forbehandlet med SDF-1α (100 ng / ml) og oprettet på konfokalt mikroskop og må omsættes og akkumuleres i kammeret i 5 min. Gennem disse 5 min billeder blev taget til fange som en time-lapse-serien; stillbilleder (A). Flow blev derefter initieret ved 0,4 dyn / cm2 til skabe forskydningsspænding i 5 min. Gennem disse 5 min billeder blev taget til fange som en time-lapse-serien; stillbilleder (B). Retningen af flow i disse billeder er fra bund til top, og fokusplanet er indstillet på CHO-ICAM monolag. T-celler kan opdeles i 3 grupper: (1) T-celler rullende langs monolaget ved strømningshastigheden synlige som korte, vandrette linjer, der flytter fra bund til top på marken, da de hurtigt bevæger mens der afbildes. (2) T-celler crawling langs monolaget. Disse celler er fast klæbet baseret på modstanden mod strømning, og kravler sandsynligvis i søgning af et område permissiv for cellulær passage, som ikke er observeret i denne model. (3.) T-celler, fast klæber til monolaget, er modstandsdygtige over for flow, men er immobile. Disse celler er ikke aktivt at rulle eller kravle langs monolag. En mere sofistikeret analyse kan udføres på grundlag af målene i undersøgelsen, ved anvendelse af en ImageJ script designet til at dissekere disse cellepopulationer til yderligere kvantificering eller karakterisering. Scale bars 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. CHO-ICAM celler skal danne et sammenflydende monolag. Repræsentant billede af en sammenflydende CHO-ICAM monolayis i et flow kammer. Scale bar 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at kunne analysere T-celle adhæsion, at det stimulerende middel være inkluderet i undersøgelsen skal overvejes ved valg af en in vitro-fremgangsmåde. Mens der er flere analyser for at studere signaler, der fører til LFA-1 aktivering og ICAM-1 binding alle metoder ikke er indbyrdes udskiftelige. En statisk vedhæftning assay 10 er bedst egnet til at studere T-celle-APC-interaktioner; alternativt forskydningsspændingen metode beskrevet her er ideel til model T-celle-epitel celle-interaktioner. In vivo, som chemokiner er præsenteret langs endotelet, rullende T-celler skal reagere ved fastsiddende og modstå forskydningsspænding på blodgennemstrømningen 14,15. Derfor studiet af kemokinsignalering er bedst egnet til at blive undersøgt i et assay, der inkorporerer forskydningsspænding. Den primære fordel ved denne adhæsion ved hjælp strømningsforhold er dets enkelhed i modellering af interaktioner mellem T-celler og integriner. Dette assay helt unikt kombinerer funktion og mekanistiskundersøgelser af modellering et miljø for undersøgelse af en integrin-adhæsionsmolekyle par. En anden styrke ved denne metode er dens tilpasningsevne; denne metode kan anvendes til at kvantificere adhæsion af enhver leukocyt ethvert adhæsionsmolekyle. Denne metode kan anvendes til at screene virkningen af flere lægemidler eller genetiske manipulationer forventes at ændre T-celle rekruttering og ekstravasation gennem ændret integrin aktivering.
Som med enhver in vitro-metode, der er nogle begrænsninger i dette assay. Denne model bruger manipuleret CHO celler snarere end stimulerede primære endotelceller som andre modeller har brugt. 16 Mens dette giver os evnen til at forstå de signalsystemer begivenheder påvirker aktiveringen tilstand af et enkelt integrin, kan det også betragtes som en svaghed ved modellen. Da der ikke er nogen selectiner udtrykkes af CHO-celler, er assayet udført i to trin. Under det første trin (akkumuleringsfasen), er T-cellerne injiceret i input reservoir ved én side af kammeret og rejser til den anden side ved minimalt tryk og kapillarkræfter. Opførslen af T-cellerne i hele disse 5 min kan observeres i figur 3A. Efter 5 minutter og under det andet trin (flow fase) strømningshastigheden forøges, og cellerne begynder at rulle og klæbe. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle T-celler injiceret i input reservoiret bevæge sig hen over kammeret under ophobning fase, og disse celler har rulle langs monolaget som strømmen forøges (figur 3B). På denne måde er det rullende fase af ekstravasation kunstigt forstærket, men ikke elimineret, i denne model.
Da det maksimale antal vedhæftende celler er et udtryk for antallet af input celler, der indgår i kammeret er der mulighed for rå tal variation blandt eksperimenter. Mens førstrømningstiden billederne ikke fuldt repræsenterer den maksimale T-celle population 100%, fordi de ikke tager hensyn account input reservoir, er det en vigtig kontrol at medtage i beregningerne, især når to forskellige celletyper tælles enkeltvis skal sammenlignes. Derudover er det ikke anbefales, at primær blast lymfocytter anvendes i en enkelt variabel vedhæftning analyse. Det vil sige, pre-stimulering af T-cellerne gennem T-celle receptorer (TCR) og / eller co-receptorer kan forvirre effekten af behandlingen af interesse på adhæsion. Disse variabler bør overvejes i løbet af eksperimentel design. Ligeledes funktionelle studier med tidligere frosne PBMC'er ofte give forstyrrende resultater, og derfor cellelinjer eller frisk isolerede primære PBMC'er fungerer bedst med denne analyse. Forståelse af normale basisniveau ustimuleret limning til PBMC inkluderet i undersøgelsen er kritisk i at identificere en celle population, der er blevet ikke-specifikt præaktiveret fører til forstyrrende resultater.
At gentage dette assay med nøjagtighed, er det vigtigt at nogle trins i protokollen, herunder bilæggelse og flow inkubationstiderne, være præcis og ensartet blandt alle forhold. I samme lys, skal CHO-ICAM celler ensartet sammenflydende gennem alle flow kamre (Figur 4) og T celletal skal også være præcist. 17 Selv små forskelle i disse faktorer kan påvirke nøjagtigheden af celletal i sidste ende. En fremtidig anvendelse af dette assay er udviklingen af en række cellelinier individuelt udtrykker selectiner og adhæsionsmolekyler at udvide virkningerne af denne metode til andre signaleringskaskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
