Summary
Denne strømnings adhesjonsassayet tilveiebringer en enkel, høy slag modell av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner. En sprøytepumpe blir brukt til å generere skjærspenninger, og konfokal mikroskopi tar bilder for kvantifisering. Målet med disse studiene er å effektivt kvantifisere T-celle adhesjon ved hjelp av strømningsforhold.
Abstract
Totalt sett er T-celle adhesjon en kritisk komponent i funksjon, bidrar til de ulike prosessene i mobilnettet rekrutteringen til områder av betennelser og samhandling med antigenpresenterende celler (APC) i dannelsen av immunologiske synapser. Disse to sammenhenger av T-celle-adhesjon varierer i at T-celle-APC-interaksjoner kan betraktes som statiske, mens T-celle-interaksjoner blodkar blir utfordret av skjærspenningen generert av sirkulasjon i seg selv. T-celle-APC-interaksjoner er klassifisert som statisk ved at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hverandre. Vanligvis skjer dette samspillet i lymfeknutene. Som en T-celle samhandler med blodet åreveggen, cellene arrestere og må motstå generert skjærspenning. 1,2 Disse forskjellene markere behovet for å bedre forstå statisk feste og heft i henhold strømningsforhold som to forskjellige reguleringsprosesser. Reguleringen av T-celle adhesjon kan mest konsist beskrevet som controlling affiniteten tilstand av integrin-molekyler som uttrykkes på celleoverflaten, og derved regulere interaksjonen mellom integriner med adhesjonsmolekylet ligander som uttrykkes på overflaten av cellen i samspill. Vår nåværende forståelse av reguleringen av integrin affinitetstilstander kommer fra ofte forenklede in vitro modellsystemer. Analysen av adhesjon ved hjelp av strømnings-betingelser som er beskrevet her gjør det mulig for visualisering og nøyaktig kvantifisering av T-celle-epitelial-celle-interaksjoner i sann tid etter et stimulus. En adhesjon i henhold til strømnings analysen kan brukes til studier av adhesjon signalisering i løpet av T-celler etter behandling med hemmende eller stimulerende substanser. I tillegg kan denne analysen utvides utover T-celle-signalisering til en hvilken som helst klebemiddel leukocytt-populasjonen og eventuelle integrin-adhesjonsmolekyl par.
Introduction
T-lymfocytt adhesjon medierer en rekke forskjellige prosesser i et sunt immunsystem, 3 spiller viktige roller i T-celletrafikken og antigen presentasjon. Både ved immunovervåkning eller en aktiv immunrespons i disse to hovedroller for adhesjon er kritiske. 4 Den fysiologiske signaleringshendelser av T-celle-endotel-celle-interaksjoner er forskjellig fra T-celle-antigen-presenterende celle (APC) interaksjoner, og derfor krever forskjellige metoder for studie for å best forstå de signal kaskader involvert. Den faste adhesjon av en T-celle til en blodkarveggen under lymfocytt ekstravasasjon krever rask og dynamisk integrin-aktivering. Den stramme interaksjonen mellom en aktiv tilstand integrin og adhesjonsmolekyler langs endotelet fører til adhesjon motstandsdyktig mot strømmen av blod, slik at T-cellene til å krype langs overflaten på jakt etter et område som ettergivende til celle passasje. 5 den gjennomsøking av en T-celle-bi -directionally Alonga karveggen er avhengige på polarisert adhesjon, med en distinkt klebemiddel fremre ende av T-celle. 6 Viktigst, fast adhesjon og transmigrasjon krever motstand mot skjærkraften generert av sirkulerende blodstrøm.
Ved utforming eksperimenter for å studere lymfocytt heft, bør det tas hensyn til den spesifikke stimulans av interesse. Mens inte aktivering er en vanlig og viktig del av alle former for T-celle adhesjon, kaskader av aktivering er sannsynlig å være unik nedstrøms av individuelle reseptorer og co-reseptorer. Likeledes inte og adhesjonsmolekyl parene fungere i spesialiserte microenvironments og på bestemte subpopulasjoner. På denne måte kan disse parene reguleres ganske annerledes. Modellen som presenteres her er ideell for studiet av signaleringskaskader som fører til integrin-aktivering fant sted under skjærspenningsbetingelser. 7. Disse interaksjonene ikke kan være tilstrekkelig forstås i en statisk lim;på systemet på grunn av virkningen disse styrkene har vist seg å ha rett på T-celle atferd. 8 Selv presenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamster) celler konstruert for å uttrykke menneskelige ICAM-1 (CHO-ICAM celler) den kan systemet enkelt modifiseres til å studere forskjellige leukocyttpopulasjonene eller adhesjonsmolekyler.
Denne analysen tilveiebringer en fremgangsmåte for å kvantifisere T-celle-klebrighet og integrin-aktivering ved hjelp av skjærspenning, som gir en modell for den faste adhesjon fasen av leukocytt-ekstravasasjon. Gjennom bruk av CHO-ICAM-celler affiniteten av LFA-1 til dets ligand i levende celler kan undersøkes i sanntid som respons på forskjellige stimuli av interesse. Denne teknikken krever lett oppnås, kommersielt tilgjengelige mikro-ningskammere i kombinasjon med en sprøytepumpe, mye enklere utstyr som er nødvendig for å modellere blodstrøm og skjærspenning i forhold til andre modeller. 9 En annen stor fordel med denne analysen er den bestemte signalkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden av de enkelte integriner kan være rent studeres ved anvendelse av modifiserte CHO-celler som uttrykker humane adhesjonsmolekyler av interesse. Dessuten er kombinasjonen av kvantitative data med levende celle avbildning er en betydelig fordel ved denne metoden. Alt i alt, mens en rekke analyser av statisk T-celle-adhesjon, er blitt beskrevet som pent modell T-celle-APC-interaksjoner, disse modellene er utilstrekkelige for å fange den dynamiske prosessen med T-celle-epitelial adhesjon. Av denne grunn ved valg av adhesjonsanalysen stimulus aktuelle må vurderes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plating den CHO-ICAM Cells
Merk: Målet med dette trinnet er å plate CHO-ICAM celler i strømnings kamre for vekst over natten med mål om å generere en konfluent monolag.
- Opprettholde CHO-ICAM-celler i 10 cm vev-kultur-behandlet kulturskåler i 10 ml RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplett kulturmedium) ved 37 ° C med 5% CO 2.
- For å samle cellene, tilsett 1 ml 0,5% trypsin-EDTA og inkuber ved værelsestemperatur i 1 min med forsiktig risting. Nøytralisere trypsin med 4 ml media.
- Tell CHO-ICAM celler ved hjelp av en hemacytometer og beregne 0,75 x 10 5 celler per kammer. Merk: I dette eksperimentet: 2,25 x 10 5 celler vil være nødvendig for å seede 3 kamre.
- Sentrifuger 0,75 x 10 5 CHO-ICAM celler per kammer i 5 minutter ved 500 xg, romtemperatur, og cellepelleten suspenderes i 30 ul pr kammer av CHO-ICAM Komplett kulturmedier.
Merk: I dette eksperimentet 90 mL vil være nødvendig for å seede 3 kamre. - Tilsett langsomt cellene inn i en reservoar av strømningskammeret. La cellene til takke med 5 min i 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- Tilsett 200 ul komplett kulturmediet på tvers av de to reservoarer av hvert kammer. Alternativ tilsetninger mellom de to for å unngå bevegelse av cellene som systemets likevekt.
- Cellene inkuberes over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
2. Fremstilling av T-cellene
Merk: Denne analysen kan utføres med primære humane T-celler eller en T-cellelinje. En protokoll på T-celle isolert fra blod har blitt beskrevet tidligere. 10 Ved bruk av primære humane T-celler bruker nylig isolerte celler for best resultat. Ved hjelp av en T-cellelinje, følger kulturen protokollen spesifisert av kilden til cellene. For å påvise at cellene på et fluorescerende mikroskop,pe T-cellene blir merket med fluorescein-karboksy succinimidylester (CFSE).
- Telle T-celler ved hjelp av en hemacytometer og beregne 2 x 10 6 celler per kammer. Merk: I dette eksperimentet, vil 6 x 10 6 celler være nødvendig i 3 kammere.
- Sentrifuger 2 x 10 6 T celler pr kammer i 5 min ved 500 x g, romtemperatur og resuspender cellene i 1 ml fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 1% glukose eller 2% FBS.
- Legg CFSE på 1: 1000 fortynning (lager laget til 5 mm). Dekk mot lys og inkuberes i 8 minutter ved romtemperatur
- Rotere ved 500 x g i 5 min, RT.
- Resuspender cellepelleten med 240 ul pr tilstand (se kapittel 4 "Note") RPMI media mangler serum. I dette eksperimentet, cellepelleten suspenderes i 720 ul av RPMI ren. Fordel cellene inn i tomme 1,5 ml rør som er merket for hvert kammer, 240 ul per rør. Holde celler i en 37 ° C varmeblokk inntil bruk.
3. Sette opp the Input / Output spyling og Sprøytepumpe
- Varm mikroskop levende bilde kammer til 37 ° C.
- Forbered inngangs spyling:
- Fyll en 500 ml glassflaske med vann og gjøre 2 hull i lokket. Merk hullene "i" og "ut". Dette vil fungere som en oppvarming vannbad for innspill media.
- Kjør inngangs spyling gjennom hullene i lokket og inn i vannbadet. Pass på at den siden av spyling som kobles til sprøyten kommer gjennom "i" hull og den siden som skal kobles til inngangen reservoaret kommer gjennom "ut" hull.
- Spyl inngangs spyling med 60 ml vann for å fjerne eventuell luft fra systemet.
- Prime inngangs spyling med RPMI media mangler serum varmet til 37 ° C. Fyll en 60 ml sprøyte og presse gjennom media til spyling er helt primet og mangler eventuelle luftbobler.
Merk: Avhengig av length av røret brukes volumet som kreves for å prime vil variere.- Beregn volum av mediet som er nødvendig for forsøket ved å multiplisere strømningshastigheten (her 0,3 ml / min) med antall minutter (5 min) ved antall kamre i forsøket (her tre); i dette eksperimentet ved å bruke 4,5 ml media. Merk: Vi anbefaler å ha 5 ml ekstra volum (her sammen 9,5 ml) er igjen i sprøyten etter grunning.
- Plasser hele inngangsoppsett i live avbildning kabinett av mikroskop for å opprettholde 37 ° C. Kjør spyling og sprøyten ut av kabinettet og legg sprøyten inn i sprøytepumpen.
- Forbered utgang spyling:
- Lag et hull i lokket på en 250 ml flaske som skal brukes som utgangs avfall.
- Kjør produksjonsrøret gjennom hullet og inn i flasken. Løst feste lokket, ikke lukker helt.
- Plasser utskriftsoppsett i live avbildning kabinett av microscope.
- Beregn strømningshastighet (ml / min) som er nødvendig for å generere den ønskede skjærspenning (dyn / cm2). Skjærspenning varierer i ulike vaskulære avdelinger, derfor ta hensyn til den generelle modellen inkludert celletyper som skal studeres og behandlinger når de bestemmer seg for en skjærspenning nivå.
Merk: Disse eksperimentene ble utført ved 0,4 dyn / cm 2 til tett etterligne en liten blodåre innstilling.- Ta kammerdimensjoner hensyn til ved beregning skjærspenning. Bruk følgende formel (gitt av produsenten 11) for strømnings kamre brukt her (se tabell for material): T = η * 176,1 * ø hvor T = skjærspenning, η = dynamisk viskositet, ø = strømningshastighet. Merk: dynamisk viskositet RPMI-medium ved 37 ° C er 0,007.
4. Lasting av Flow Chambers og stimulering av cellene
Merk: For å initiere heft,T-celler må stimuleres. I det følgende eksperiment cellene vil enten forbli ustimulert eller stimulert med SDF-1α 12 eller forbolmyristatacetat (PMA, positiv kontroll) 13. For riktig presentasjon av chemokin til T-celle, er CHO-ICAM-celler preinkubert med SDF-1α (etterfulgt av serielle vaskinger), slik at for presentasjon på celleoverflaten. PMA er en forbolester som er strukturelt lik den andre messenger diacyl glycerol (DAG); her er det brukt som en positiv kontroll. T-celler blir direkte behandlet med PMA forut for lasting inn i strømningskammeret.
- Plasser flyten kammeret lysbildet på mikroskopet og sette fokusplanet på CHO-ICAM enkeltlag med 20X objektiv.
- Hold CFSE-fargede T-celler for alle andre forhold i 37 ° C varme blokk. Fremstille de CHO-ICAM eller T-celler som følger umiddelbart før analysen for denne betingelsen:
- For unstimulated tilstand (kammer 1), holde en slange / flyt chrav ubehandlet, for å tjene som negativ kontroll for stimulering.
- For PMA stimulering (kammer 2), stimulere en tube av T-celler med PMA (10 ng / ml) for å tjene som positiv kontroll; behandle umiddelbart før du legger inn flyt kammer.
- For SDF-1α stimulering, (kammer 3), stimulerer det tredje strømningskammeret med SDF-1α (100 ng / ml) ved fjerning av 70 ul på en gang 3 ganger fra det øvre reservoaret (output reservoar) og deretter tilsetning av 70 ul av SDF -1α (100 ng / ml) inn i det nedre reservoar (inngang reservoar). Inkuber i 5 min.
- Fjern og kast 70 ul på en gang 3 ganger fra utgangs reservoar av et kammer.
- Legg 70 mL av pre-behandlet (eventuelt) T cellesuspensjon inn inngangs reservoaret 3 ganger. Vent i 5 min for å tillate cellene å bevege seg fra innløpet av kammeret ( "In"), og for å nå den proksimale utløp ( "ut") av kammeret.
- I løpet av denne tiden, bilde 5felt for CFSE-fargede T-celler. Velge felt som er dispergert i midten av kammeret (figur 1). Bruk følgende eksitasjon / utslippsforhold: eksitasjon laser bølgelengde: 488 nm; utslipp samling filter: 500-540 nm. Disse bildene vil tjene som pre-flow celle teller.
- Fest inngang og utgang rør samtidig til strømningskammer reservoarene.
Merk: Feste av røret samtidig, er kritisk slik at det ikke innføre luftbobler inn i kammeret og opprettholde den generelle likevekt i kammeret. - Begynner strømning ved 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), mens visualisere CFSE-fargede T-celler. Som strømning begynner, spesielt med det første kammer, er det ofte en forsinkelse mellom initiere strømning og observere T-celle rullende derfor begynne timing 5 min ved angrep av T-celle-bevegelse.
- Avslutte strømningen etter 5 min, og bilde 5 felt i CFSE kanalen. Velg felt tilfeldig spredt throughout midten av strømningskammeret (figur 1). Disse bildene vil tjene som post-flow celle teller.
5. Bestemme Prosent av heftende celler
Merk: Bestemmelse av antallet av celler i de innsamlede bilder er gjort objektivt med automatisert programvare. For våre studier vi brukt programvaren Volocity (versjon 6.2.1), men annen programvare som ImageJ (versjon 1.48V) er også aktuelt.
- Bestemme antall celler pr felt forhåndsstrøm for hver betingelse. Gjennomsnittet av de 5 felter er den "pre-strømnings gjennomsnittlig celletall." 7
- Bestem antall celler per felt etter strømmen for hver tilstand. Gjennomsnittet av de 5 feltene er "post-flyt gjennomsnittlig celletall." 7
- Beregn prosentandelen av adherente celler ved anvendelse av følgende formel: Prosent av adherente celler = (etterstrømning gjennomsnittlig celle count) / (pre-strømnings gjennomsnitt celler) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater er vist fra strømnings adhesjonsassayet ved hjelp av Jurkat og primære humane CD3 + T-celler, som angitt, stimulert med SDF-1α. De negative kontrollene i alle vist eksperimenter er ustimulerte celler. En terskel basal prosent adhesjon av ustimulerte celler ligger mellom 5 - 10%; basen adhesjon særlig over dette området indikerer en problematisk eksperiment og foreslår starten populasjon av T-celler ble ikke-spesifikt pre-aktivert under forberedelse. Ganger økning i antallet adherente celler etter strømmen i hver tilstand lignet med ustimulerte celler kan beregnes i tillegg til beregningen av vedheft prosent. Data som representerer disse to beregningsmetodene er inkludert her.
Figur 2A viser representative bilder av feltene i flyten kammer for hver tilstand før og etter flyt. Før forsøket, Jurkat (visn i figur 2A) eller primære humane CD3 + T-celler er renset, telles, og merket med CFSE. For hver eksperimentell betingelse 2 x 10 6 celler ble merket. Ikke-stimulerte T-celler ble anbrakt i strømnings-kammer som inneholdt CHO-ICAM-celler i nærvær eller fravær av SDF-1α. T-cellene ble tillatt å bevege seg og samle seg i kammeret i 5 minutter, og i løpet av denne tiden bilder ble tatt for å bestemme de pre-flow teller. Et tilsvarende antall celler pre-strømning mellom de forskjellige stimuleringer er nødvendig for å sikre ensartede forsøksbetingelser. Etter 5 min med kontinuerlig skjærspenning som genereres av flyt, ble bildene igjen tatt for å bestemme post-flyt teller. Det er tydelig gjennom disse representative bilder som SDF-1α høyere antall T-celler i stand til å overholde de CHO-ICAM celler under skjæring stress.
Figur 2B viser ganger endring i T-celle adhesjon som calnet basert på antall Jurkat T-celler før og etter-flow enten unstimulated eller i nærvær av SDF-1α. For hver tilstand de gjennomsnittlige legemer på 5 felt pre-strømning og 5 felt etter strømmen ble bestemt, og en sammenligning av SDF-1α stimulering til ustimulerte brukes til å beregne ganger endring i T-celle-adhesjon. Som vist her, induserer SDF-1α en nær to ganger økning i adhesjon sammenlignet med ikke-stimulert.
Figur 2C viser en alternativ metode for databeregning. Her den prosentvise adhesjon av primære humane CD3 + T-celler i nærvær eller fravær av SDF-1α bestemmes ved først å bestemme den gjennomsnittlige pre- og post-strømnings T-celler, deretter dividere etter strømmen gjennomsnitt av den pre-flow gjennomsnitt og multiplisere med 100. Gjennom denne beregningen hele pre-flow befolkningen representerer 100% vedheft. Som vist her, 15% av ikke-stimulerte T-cellene holder seg under skjæring stress, sammenlignet med 50% av T-celler stimulert med SDF-1α.
Figur 1. Det er viktig å analysere bare områder som er utsatt for homogen strømning. Skjematisk fremstilling av strømningskamrene som brukes med angivelse av hvor felter skal avbildes. I henhold til informasjon fra de kammer produsenter, er det innstilte strømningshastighet bare oppnås gjennom sentrum av kamrene, angitt med orange i denne skjematiske. Nærmere grensene av kammeret strømnings avtar og skal ikke inngå i eksperimentell avbildning eller analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. <strong> SDF-1α induserer T-celle-adhesjon til ICAM-1 i henhold til skjærspenning. A. Jurkat T-celler ble merket med CFSE ved en konsentrasjon på 5 uM. Deretter ble cellene lastet inn i strømnings-kammer som var forbehandlet med SDF-1α (100 ng / ml) eller ustimulert og satt opp på det konfokale mikroskop og lov til å bevege seg og samle seg i kammeret i 5 min. Alternativt ble Jurkat T-celler forbehandlet med PMA (10 ng / ml) før tilsetning til strømningskamrene. Gjennom de 5 min pre-flow bildene ble tatt. Strømmen ble deretter initiert ved 0,4 dyn / cm 2 for å skape skjærspenning i 5 minutter. Ved ferdigstillelse, ble post-strømningsbilder tatt. Representative bilder av Jurkat T-celler er vist, skala bar 50 mikrometer. B. Fold endring i adhesjon av Jurkat T-celler ble beregnet ved først å bestemme den gjennomsnittlige pre- og post-flyt celle teller for hver tilstand og dividere gjennomsnittlig post-flyt count ved den gjennomsnittlige pre-strømning count individuelt for hver tilstand. Denne adhesjon kvotient for hver stimulering tilstand, her SDF-1α eller PMA, blir deretter dividert med den ikke-stimulert adhesjon kvotienten for å bestemme ganger endring i adhesjon. Barer representerer gjennomsnittet av 3 eksperimenter ± SEM. C. Prosent vedheft av primære menneskelige CD3 + T-celler ble beregnet ved først å bestemme gjennomsnittlig pre- og post-flyt celle teller for hver tilstand. For hver tilstand, blir den gjennomsnittlige etter strømmen telle dividert med den gjennomsnittlige pre-strømningstall og multiplisert med 100. Den resulterende prosent adhesjon er basert på den forhåndsstrømningscelletall er 100% adhesjon. Barer representerer gjennomsnittet av 5 eksperimenter ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. TCeller første akkumulere deretter strømme over CHO-ICAM monolaget. Jurkat T-celler ble merket med CFSE ved en konsentrasjon på 5 uM. Deretter ble cellene lastet inn i strømnings-kammer som var forbehandlet med SDF-1α (100 ng / ml) og satt opp på det konfokale mikroskop og lov til å bevege seg og samle seg i kammeret i 5 min. Gjennom disse 5 min bildene ble tatt som en time-lapse-serien; stillbilder (A). Strømmen ble deretter initiert ved 0,4 dyn / cm 2 for å skape skjærspenning i 5 minutter. Gjennom disse 5 min bildene ble tatt som en time-lapse-serien; stillbilder (B). Strømningsretningen i disse bildene er fra bunn til topp, og at fokusplanet er innstilt i CHO-ICAM monolaget. T-cellene kan inndeles i 3 grupper: (1) T-celler rulle langs den monolaget ved en strømningshastighet er visualisert som korte, horisontale linjer som beveger seg fra bunn til topp på tvers av feltet ettersom de beveger seg raskt samtidig som avbildes. (2) T-celler Crawling langs monolaget. Disse cellene er fast klebet på grunnlag av strømningsmotstanden, og gjennomgår sannsynligvis på jakt etter et område som ettergivende til cellulær passasje, som ikke er observert i denne modellen. (3) T-celler som fester seg fast til den monolaget, er motstandsdyktig til å flyte, men er immobile. Disse cellene er ikke aktivt å rulle eller krabbe langs monolaget. En mer sofistikert analyse kan gjøres, basert på målene i studien, ved bruk av en ImageJ script utformet for å dissekere disse cellepopulasjoner for ytterligere kvantifisering eller karakterisering. Scale barer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. CHO-ICAM celler må danne en konfluent monolag. Representant bilde av en konfluent CHO-ICAM monolayer i en flyt kammer. Scale bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å kunne analysere T-celle-adhesjon, sentralstimulerende å bli inkludert i studien må tas i betraktning ved valg av en in vitro-metode. Mens det er flere analyser for å studere signaler som fører til LFA-1-aktivering og ICAM-1-bindende alle metoder er ikke utskiftbare. En statisk vedheft analysen 10 er best egnet til å studere T-celle-APC interaksjoner; alternativt skjærspenningen metoden beskrevet her gjør det enkelt å modellere T-celle-epitelial celle-interaksjoner. In vivo, som chemokiner blir presentert sammen endotelet, rullende T-celler må svare ved å ta godt følge og motstå skjærspenning av blod flyte 14,15. Av denne grunn, er studiet av chemokin-signalering er best egnet til å bli undersøkt i en analyse som innbefatter skjærspenning. Den primære fordelen med denne adhesjon ved hjelp av strømningsforholdene er dens enkelhet i modellering av interaksjonene mellom T-celler og integriner. Denne analysen kombinerer ganske unikt funksjon og mekanistiskstudier av å modellere et miljø for studiet av en integrin-adhesjonsmolekyl par. En annen styrke med denne metoden er dens tilpasningsevne; denne metoden kan brukes til å kvantifisere adhesjonen i alle leukocytt til enhver adhesjonsmolekyl. Denne metoden kan bli anvendt for å screene effekten av flere narkotiske stoffer eller genetiske manipulasjoner som forventes å endre T-celle-rekruttering og bloduttredelse gjennom endret integrin-aktivering.
Som med en hvilken som helst in vitro-metode, er det noen begrensninger av denne analysen. Denne modellen bruker konstruerte CHO-celler i stedet stimulerte primære endotelceller som andre modeller har brukt. 16 Selv om dette gir oss muligheten til å forstå signal hendelser som påvirker aktivering tilstand av en enkelt grin, dette kan også betraktes som en svakhet av modellen. Ettersom det ikke er noen selectins uttrykt ved CHO-celler, blir analysen utført i to trinn. Under det første trinnet (akkumulering fase), blir T-celler injisert inn i inngangs comeoir i den ene side av kammeret og reise til den andre siden ved minimalt trykk og kapillære krefter. Oppførselen av T-cellene gjennom disse 5 min kan observeres i figur 3A. Etter 5 minutter, og i løpet av det andre trinn (strømnings fase) strømningshastigheten økes, og cellene vil begynne å rulle og følge. Det er viktig å merke seg at ikke alle T-celler injisert inn i inngangen reservoaret beveger seg over kammeret under akkumulering fasen, og disse cellene rulle langs den monolaget som strømningen økes (figur 3B). På denne måten blir valsetrinn av ekstravasasjon kunstig forbedret, men ikke elimineres, i denne modellen.
Siden det maksimale antallet adherente celler er et uttrykk for antall inngangs celler som går inn i kammeret er det mulighet for rå antall variabilitet blant eksperimenter. Mens etterstrømnings bildene ikke fullt ut representerer 100% maksimal T-cellepopulasjon, fordi de ikke tar hensyn regnskapst input reservoaret, er det en viktig kontroll for å ta med i beregningene, spesielt når to forskjellige celletyper telles hver for seg skal sammenlignes. I tillegg er det ikke anbefalt at primærspreng lymfocytter bli brukt i en enkelt variabel adhesjon analyse. Det vil si, pre-stimulering av T-celler via T-cellereseptorer (TCR) og / eller ko-reseptorer kan forvirre effekten av behandling av interesse på adhesjon. Disse variablene bør vurderes ved eksperimentell design. Likeledes, funksjonelle studier med tidligere frosset PBMC ofte gir konfunderende resultater, og på grunn av dette cellelinjer eller nylig isolerte primære PBMC fungerer best med denne analysen. Forstå det normale base nivå av unstimulated heft for PBMC inkludert i studien er viktige for å identifisere en cellepopulasjon som er spesifikt forhåndsaktivert fører til konfunderende resultater.
For å gjenskape denne analysen med nøyaktighet, er det viktig at noen skritts i protokollen, inkludert sedimenterings og strømnings inkubasjonstider, være nøyaktig og ensartet blant alle forhold. I denne samme lys, må CHO-ICAM-celler bli jevnt sammenflytende gjennom alle strømnings kamrene (figur 4) og T-celletellinger må også være nøyaktig. 17 Selv små forskjeller i disse faktorene kan påvirke nøyaktigheten av celletall til slutt. En fremtidig anvendelse av denne analysen er utviklingen av en rekke cellelinjer som uttrykker individuelt selektiner og adhesjonsmolekyler for å utvide effekten av denne fremgangsmåten til andre signaleringskaskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
