Summary
assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.
Abstract
בסך הכל, הידבקות תא T היא מרכיב קריטי של פונקציה, תורם תהליכים השונים של גיוס הסלולר לאתרים של דלקת ואינטראקציה עם תאי מציגי אנטיגן (APC) להיווצרות של סינפסות חיסונית. שני אלה בהקשרים של הידבקות התא T נבדלים כי T אינטראקציות תא-APC יכול להיחשב סטטי, ואילו אינטראקציות כלי תא-דם T מאותגרים על ידי מאמץ הגזירה שנוצר כתוצאה מזרימת עצמה. אינטראקציות T תא-APC מסווגים סטטי ששני השותפים הסלולר ביחס סטטי זה לזה. בדרך כלל, האינטראקציה הזו מתרחשת בתוך בלוטות הלימפה. כתא T אינטראקציה עם דפנות כלי דם, תאי המעצר חייב להתנגד מאמץ גזירה שנוצר. 1,2 הבדלים אלו מדגישים את הצורך להבין טוב יותר את הידבקות הידבקות סטטית בתנאי זרימה כשני תהליכים רגולטוריים ברורים. הסדרת הידבקות תא T ניתן לתאר באופן תמציתי ביותר כמו conחכות מדינת הזיקה של integrin מולקולות לידי ביטוי על פני התא, ובכך המסדיר את יחסי הגומלין של integrins עם ליגנדים מולקולת הידבקות ביטוי על פני השטח של תא האינטראקציה. ההבנה הנוכחית שלנו של הרגולציה של מדינות זיקת integrin מגיעה לעתים קרובות פשטני במערכות מודל במבחנה. את assay של הידבקות באמצעות תנאי הזרימה המתואר כאן מאפשר הדמיה וכימות מדויק של אינטראקציות תא אפיתל T בזמן אמת בעקבות גירוי. הידבקות תחת assay זרימה יכולה להיות מיושמת על מחקרים של הידבקות איתות בתוך תאי T לאחר טיפול עם חומרים מעכבים או גירוי. בנוסף, assay הזה ניתן להרחיב מעבר T תא איתות לכל אוכלוסייה לויקוציטים הדבק וכל זוג מולקולת integrin-הידבקות.
Introduction
T הידבקות הלימפוציטים מתווכת מספר תהליכים שונים במערכת חיסונית בריאה, 3 ממלאים תפקידים מהותיים בסחר תא T והצגת אנטיגן. בין אם במהלך מעקב חיסוני או תגובה חיסונית פעילה שני תפקידים רחבים אלו הידבקות הם קריטיים. 4 אירועי האיתות הפיסיולוגיים של אינטראקציות תא האנדותל T נבדלים אנטיגן לתא T הצגת תא אינטראקציות (APC), ולכן דורשים שיטות שונות של מחקר כדי להבין בצורה הטובה ביותר מפלי איתות מעורבים. הידבקות המשרד של תא T לקיר כלי דם במהלך extravasation לימפוציטים דורשת הפעלת integrin מהירה ודינמית. האינטראקציה ההדוקה בין מולקולות integrin הידבקות מצב פעילות לאורך האנדותל מובילה הידבקות עמידה לזרימת דם, מה שמאפשר לתאי T לזחול על פני השטח בחיפוש אחרים שטח מתירנית למעבר תא. 5 הזחילה של המדינה דו תא T -directionally אלוןדפנות כלי דם ga הן סומכות על הידבקות מקוטבת, עם כחזית דבק נבדל של תאי T. 6 והחשוב מכל, הדבקה איתן גלגול דורשים התנגדות לכוח הגזירה שנוצר על ידי מחזורי את זרימת דם.
בעת תכנון ניסויים כדי ללמוד הידבקות לימפוציטים, יש לשים לב לגירוי מסוים של עניין. בעוד integrin הפעלה הוא מרכיב נפוץ וביקורתי של כל הצורות של הידבקות תא T, במפלי ההפעלה צפויים להיות ייחודי במורד זרם של קולטנים פרט-קולטנים שיתוף. כמו כן, integrin וזוגות מולקולת ההידבקות לתפקד microenvironments מיוחד על תת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך זו, זוגות אלה עשויים להיות מוסדרים בצורה שונה לגמרי. המודל המוצג כאן הוא אידיאלי לחקר איתות מפלי מוביל integrin הפעלה מתרחשת בתנאי מאמץ גזירה. 7 אינטראקציות אלה לא ניתן להבין כראוי בתוך מודבק סטטיבמערכת עקב השפעת הכוחות הללו הוכחו יש ישירות על התנהגות התא T. 8 למרות שהן מוצגות כאן עם תאי T ו CHO תאים (שחלה של אוגר סיני) שהונדסו (תאים CHO-ICAM) האדם ICAM-1 במערכת יכול בקלות להיות שונה כדי ללמוד אוכלוסיות לויקוציטים שונים או מולקולות דבקות.
assay זה מספק שיטה לכמת דביקות תא T והפעלה integrin באמצעות מאמץ הגזירה, מתן מודל לשלב הידבקות המשרד של extravasation לויקוציטים. באמצעות שימוש בתאי CHO-ICAM הזיקה של LFA-1 עבור ליגנד שלה בתאים חיים ניתן לבדוק בזמן אמת בתגובה לגירויים שונים של עניין. טכניקה זו דורשת להשיג בקלות, זמינים מסחרי תאי מייקרו-זרימה בשילוב עם משאבת מזרק, מאוד לפשט את הציוד הדרוש מודל זרימת דם ואת לחץ גזירה לעומת דגמים אחרים. 9 עוד יתרון חשוב של assay זה הוא כי איתות ספציפיתמפלי מדינת ההפעלה וכתוצאה מכך של integrins הבודד ניתן ללמוד בצורה נקיה באמצעות השימוש בתאי CHO מהונדסים לבטא מולקולות דבקות אדם של עניין. בנוסף, שילוב של נתונים כמותיים עם הדמית תא חי הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. בסך הכל, בעוד מספר מבחנים של הידבקות תא סטטי T תוארו כי יפה מודל T אינטראקציות תא-APC, מודלים אלה אינם מספיקים לכידת התהליך הדינמי של הידבקות תא-אפיתל T. מסיבה זו, בעת בחירת assay הידבקות הגירוי הנדון יש לקחת בחשבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ציפוי תאי CHO-ICAM
הערה: המטרה של שלב זה היא צלחת תאי CHO-ICAM בתאי התזרים לצמיחת לילה עם המטרה של יצירה בשכבה ומחוברת.
- שמור על תאים CHO-ICAM ב 10 ס"מ תרבות מנות מטופלים רקמות-תרבות ב 10 מ"ל התקשורת RPMI בתוספת סרום שור העובר 10% (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (מדיה תרבות שלמה CHO-ICAM) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- כדי לאסוף תאים, להוסיף 1 מ"ל 0.5% טריפסין-EDTA דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה עם רעד עדין. לנטרל את טריפסין עם 4 מ"ל של התקשורת.
- ספירת התאים CHO-ICAM באמצעות hemacytometer ולחשב 0.75 x 10 5 תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה: 2.25 x 10 5 תאים יהיו צורך זרע 3 תאים.
- צנטריפוגה 0.75 x 10 5 CHO-ICAM תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר ו resuspend התא גלולה ב 30 μl לכל תא של CHO-ICAM תקשורת תרבות שלמה.
הערה: בניסוי זה 90 μl יהיה צורך זרע 3 תאים. - לאט לאט מוסיף את התאים לתוך מאגר אחד של החדר לזרום. אפשר התאים להסתפק 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2.
- הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות מלאה לכל רוחב שני מאגרים של כל תא. תוספות חלופיות בין שתיים כדי למנוע תנועה של התאים כמערכה equilibrates.
- דגירת תאי הלילה בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2.
2. הכנת תאי T
הערה: assay ניתן לעשות זאת עם תאי T האנושי ראשוניים או שורת תאי T. פרוטוקול על בידוד תא T מדם תואר בעבר. 10 אם תאי T אנושיים ראשוני באמצעות שימוש בתאי מבודדים טרי עבור התוצאות הטובות ביותר. אם באמצעות קו תא T, לעקוב אחר פרוטוקול התרבות שצוין על ידי המקור של התאים. כדי לזהות את התאים על microsco ניאוןpe תאי T מסומנים עם אסתר succinimidyl carboxy והעמסה (CFSE).
- ספירת תאי T באמצעות hemacytometer ולחשב 2 x 10 6 תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה, 6 x 10 6 תאים יהיו צורך 3 תאים.
- צנטריפוגה 2 x 10 6 T תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר resuspend התאים 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל גלוקוז 1% או 2% FBS.
- להוסיף CFSE ב 1: 1,000 דילול (מלאה שבוצע 5 מ"מ). מכסים מפני אור דגירה במשך 8 דקות ב RT
- ספין ב XG 500 במשך 5 דקות, RT.
- גלולה תא גלולה עם 240 μl לכל מצב (ראה סעיף 4 "הערה") של סרום חסר RPMI התקשורת. בניסוי זה, resuspend התא גלולה ב 720 μl של מישור RPMI. מחלק את התאים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ריקים שכותרתה עבור כל תא, 240 μl לכל צינור. שמור את התאים בתוך גוש חום 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. הגדרת הדואר קלט / פלט hosing ו מזרק משאבה
- מומלץ לחמם את חדר הדמיה מיקרוסקופ חי ל -37 מעלות צלזיוס.
- הכן את hosing קלט:
- מלאו בקבוק זכוכית 500 מ"ל עם מים ולעשות 2 חורים לתוך המכסה. לייבל חורים "" ו- "Out". זה ישמש באמבט מי חימום עבור תקשורת הקלט.
- הפעל את הקלט hosing דרך החורה שבמכסה לאמבטית המים. ודא שהצד של hosing המתחבר המזרק מגיע דרך "ב" חור והצד שיחבר למאגר קלט מגיע דרך החור "החוצה".
- שטוף את קלט hosing עם 60 מ"ל של מים כדי להסיר כל האוויר מהמערכת.
- ראש קלט hosing עם התקשורת RPMI חסר בסרום חימם עד 37 מעלות צלזיוס. ממלאי מזרק 60 מ"ל ולדחוף באמצעות התקשורת עד hosing הוא דרוך לחלוטין וחסר כל בועות אוויר.
הערה: בהתאם length של צינורות השתמש הנפח נדרש ממשלה ישתנה.- חשב את נפח של התקשורת הדרושים הניסוי על ידי הכפלת קצב הזרימה (כאן 0.3 mL / min) במספר דקות (5 דק ') במספר תאי בניסוי (כאן 3); בניסוי זה, השתמש 4.5 מיליליטר תקשורת. הערה: אנו ממליצים ליצור 5 מ"ל נפח נוסף (כאן בסך 9.5 מ"ל) שנותרו המזרק לאחר תחול.
- מניח את התקנת הקלט כולו לתוך מתחם הדמית חיה של מיקרוסקופ כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס. הפעל את hosing ומזרק מתוך המתחם ולטעון את המזרק לתוך משאבת מזרק.
- הכן את hosing פלט:
- עושים חור במכסה של בקבוק 250 מ"ל להשתמש כפסולת פלט.
- הפעל את צינורות פלט דרך החור לתוך הבקבוק. רופף לאבטח את המכסה, לא לסגור את כל הדרך.
- מניח את ההתקנה פלט לתוך מתחם הדמית החיה של המילcroscope.
- חשב את קצב הזרימה (mL / min) דרושים כדי ליצור את לחץ הגזירה הרצוי (dyn / cm 2). שאר מתח משתנה בתאים וסקולרית שונים, ולכן לקחת בחשבון את המודל בכללותו כולל סוגי תאים להיחקר וטיפולים כאשר מחליטים על רמת מאמץ הגזירה.
הערה: בניסויים אלה נערכים 0.4 dyn / 2 סנטימטרים לחקות באופן הדוק הגדרת וריד קטנה.- קח את ממדי תא בחשבון בעת חישוב מאמץ הגזירה. השתמש בנוסחה הבאה (שסיפק היצרן 11) לתאי הזרימה משמש כאן (ראו טבלה של חומרים): T = η * 176.1 * ø איפה T = גזירה מתח, η = צמיגות דינמיות, מ = והספיקה. ההערה: הצמיגות הדינמית של RPMI תקשורת ב 37 ° C היא 0.007.
טוען 4. של צ'יימברס זרימת הגירוי של התאים
הערה: על מנת ליזום הדבקה,יש לגרות תאי T. בניסוי הבא התאים יהיה גם להישאר unstimulated או מגורה עם אצטט myristate phorbol 12 או SDF-1α (PMA; בקרה חיובית) 13. עבור הצגה נאותה הכמוקין לתא T, תאים CHO-ICAM הם preincubated עם-1α SDF (ואחריו שוטף סדרתי), המאפשר הצגה על פני התא. PMA היא אסתר phorbol כי היא מבנית דומה גליצרול שליח diacyl השני (DAG); כאן הוא משמש כביקורת חיובית. תאי T מטופלות ישירות עם PMA לפני הטעינה לתוך תא הזרימה.
- מניחים את השקף תא הזרימה על המיקרוסקופ ולהגדיר את מישור המוקד על monolayer CHO-ICAM באמצעות המטרה 20X.
- שמור את התאים T CFSE מוכתם לכל התנאים האחרים בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס. להכין את התאים CHO-ICAM או T כדלקמן ערב assay עבור ובלבד:
- עבור תנאי unstimulated (תא 1), לשמור ch צינור / זרימה אחדענבר לא מטופל, לשרת בקרה שלילית כמו לגירוי.
- עבור גירוי PMA (תא 2), לעורר צינור אחד של תאי T עם PMA (10 ng / ml) לשרת בקרה חיובית כמו; לטפל מייד לפני הטעינה לתוך תא זרימה.
- עבור גירוי SDF-1α, (תא 3), לעורר את תא הזרימה השלישי עם-1α SDF (100 ng / ml) על ידי הסרת 70 μl בכל פעם 3 פעמים מהמאגר העליון (מאגר פלט) ולאחר מכן להוסיף 70 μl של SDF -1α (100 ng / ml) לתוך (מאגר קלט) מהמאגר התחתון. דגירה במשך 5 דקות.
- סר וזורק 70 μl בכל פעם 3 פעמים ממאגר הפלט של תא אחד.
- להוסיף 70 μl של שטופל מראש (לפי עניין) השעית תא T אל תוך מאגר הקלט 3 פעמים. מתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים לנוע המכניסה של החדר ( "ב"), וכדי להגיע לשקע הפרוקסימלית ( "מתוך") של החדר.
- במהלך תקופה זו, תמונה 5שדות עבור תאי T מוכתמות CFSE. בחר שדות פזורים במרכז החדר (איור 1). השתמש תנאי עירור / פליטה הבאה: אורך גל ליזר עירור: 488 ננומטר; פליטה לסנן אוסף: 500 - 540 ננומטר. תמונות אלה תשמשנה ספירת התאים מראש הזרימה.
- צרף צינורות הקלט ופלט זמנית למאגרי תא זרימה.
הערה: חיבור הצינורות במקביל הוא קריטי כדי לא להכניס בועות אוויר לתוך התא ושמירת שיווי משקל הכולל בתוך החדר. - בגין הזרימה ב 0.3 מ"ל / דקה (0.4 dyn / 2 ס"מ) בעוד לדמיין את תאי ה- T-מוכתמים CFSE. כזרימה מתחילה, במיוחד עם התא הראשון, על פי רוב קיים פער בין ייזום זרימה וההתבוננות מתגלגל תא T, ולכן מתחיל דקות עיתוי 5 עם תחילת התנועה של תאי T.
- סיים זרימה לאחר 5 דק ', ותמונת 5 שדות בערוץ CFSE. בחר שדות התפזרו באופן אקראי throughout במרכז תא הזרימה (איור 1). תמונות אלה תשמשנה ספירת התאי שלאחר הזרימה.
5. קביעת אחוז התאים חסידים
הערה: קביעת מספר תאי התמונות שנרכשו נעשית באופן אובייקטיבי עם תוכנות אוטומטיות. עבור מחקרים שלנו השתמשנו בתוכנה Volocity (גרסה 6.2.1), אבל תוכנות אחרות כגון ImageJ (1.48V Version) חלים גם.
- קבע את מספר תאים לכל זרימת מראש שדה לכל מצב. הממוצע של 5 שדות הוא "ספירת תאי הממוצע מראש הזרימה." 7
- קבע את מספר תאים לכל זרימת פוסט שדה לכל מצב. הממוצע של 5 השדות הוא "ספירת תאים הממוצעת שלאחר הזרימה." 7
- חישוב אחוזי התאים חסידים באמצעות הנוסחא הבאה: אחוז התאים החסידים = (ספירת תאים ממוצעת שלאחר זרימה) / (ספירת תאי ממוצע מראש זרימה) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות נציג מוצגים מתוך assay הידבקות זרימה באמצעות Jurkat ואנושי העיקרי תאים CD3 + T, כפי שצוין, מגורה עם-1α SDF. הפקדים השליליים בכל הניסויים המוצגים הם תאי unstimulated. הידבקות אחוזי הבזליים סף של תאי unstimulated היא בין 5 - 10%; הידבקות בסיס בעיקר מעל לטווח זה מצביע על ניסוי בעייתי ומציעה אוכלוסיית תחילת תאי T מולאה מראש מופעל nonspecifically בהכנה. מקפלי גידול במספר תאים חסידים זרימת פוסט בכל מצב בהשוואה לתאי unstimulated ניתן לחשב בנוסף לחישוב של הידבקות אחוזים. נתונים הייצג שיטות החישוב שני אלה נכללים כאן.
איור 2 א מראה תמונות נציג של שדות בתוך תא הזרימה לכל טרום מצב ומזרימת פוסט. לפני הניסוי, Jurkat (צגn באיור 2 א) או אדם מן המעלה הראשונה תאי CD3 + T הם מטוהרים, נספר, ומסומן עם CFSE. עבור כל תנאי הניסוי 2 x 10 6 תאים תויגו. T תאים unstimulated הועמסו תאי זרימה המכיל תאים CHO-ICAM בנוכחות או העדר-1α SDF. תאי T הורשו לנוע ולצבור בתא למשך 5 דקות, ובמשך כל הזמן הזה תמונות נתפסו לקבוע את הספירה מראש זרימה. מספר דומה של תאים טרום זרימה בין הגירויים שונים מהותי להבטיח תנאי ניסוי אחידים. בעקבות 5 דקות של מאמץ גזירה מתמשך שנוצר על ידי זרימה, תמונות נתפסו שוב כדי לקבוע ספירה שלאחר זרימה. זה בא לידי ביטוי באמצעות דימויי הנציגים האלה SDF-1α מגדיל את מספר תאי ה- T מסוגל לדבוק תאי CHO-ICAM תחת מאמץ גזירה.
איור 2B מראה את השינוי של פי הידבקות תא T כמו קאלculated מבוסס על מספר תאים Jurkat T או לפני ואחרי זרימת unstimulated או בנוכחות-1α SDF. עבור כל מצב ספירת התאים הממוצעת של 5 שדות מראש זרימה 5 שדות שלאחר הזרימה נקבעה, וכן השוואה של גירוי SDF-1α כדי unstimulated משמשות לחישוב שינוי של פי הידבקות תא T. כפי שניתן לראות כאן, SDF-1α גורם עלייה של פי 2 ליד הידבקות לעומת unstimulated.
איור 2C מדגים שיטה חלופית של חישוב נתונים. כאן הידבקות אחוז התאים ראשוניים אדם CD3 + T בנוכחות או עדר-1α SDF נקבעה תחילה על ידי קביעת ספירת תאי T לפני ואחרי זרימה הממוצעת, אז חלוקת ממוצע הזרימה נמה ליד הממוצע מראש הזרימה ומכפיל אותו 100. דרך חישוב זו האוכלוסייה טרום הזרימה כולו מייצג 100 הידבקויות%. כפי שניתן לראות כאן, 15% של תאי T unstimulated לדבוק תחת stre גזירהss לעומת 50% של תאי T מגורים עם-1α SDF.
איור 1. חשוב לנתח האזורים היחידים חשופים תזרים הומוגנית. ייצוג סכמטי של תאי הזרימה משמש עם אינדיקציה איפה צריך להיות צילמו שדות. על פי מידע הנמסר על ידי היצרני הקאמרי, את קצב הזרימה שנקבע מראש מושגת רק דרך המרכז לתאי, שמסומן על ידי תפוז סכמטית זו. קרוב יותר לגבולות חדר ירידות קצב הזרימה ולא צריך להיכלל הדמיה או ניתוח הניסיון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. <strong>-1α SDF גורם הידבקות התא T כדי ICAM-1 תחת מאמץ הגזירה. תאי א Jurkat T תויגו עם CFSE בריכוז של 5 מיקרומטר. לאחר מכן, התאים הועמסו תאי זרימה טופלו קודם-1α SDF (100 ng / ml) או unstimulated ולהקים על המיקרוסקופ confocal ואיפשר לעבור ולצבור בתא למשך 5 דקות. לחלופין, תאי Jurkat T טופלו קודם PMA (10 ng / ml) לפני תוספת לתאי הזרימה. במשך 5 התמונות האלה מראש זרימת דקות נתפסו. תזרים יזמה אז 0.4 dyn / 2 ס"מ כדי ליצור מתח גזירה למשך 5 דקות. בסיום, תמונות זרימה פוסט נתפסו. נציג תמונות של תאי Jurkat T נראות לעין, סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. ב שינוי מקפל פנימה הידבקות של תאי Jurkat T חושב על ידי קביעת הראשונה ספירת התאים טרום ופוסט זרימה הממוצעת עבור כל תנאי ו חלוקת מונה הודעות זרימת הממוצע על ידי שיתוף מראש הזרימה הממוצעunt בנפרד עבור כל תנאי. מנת הידבקות זו עבור כל תנאי גירוי, כאן SDF-1α או PMA, מחולק מכן על ידי מנת הידבקות unstimulated כדי לקבוע את השינוי של פי הידבקות. ברים מייצגים ממוצעים של 3 ניסויים ± SEM. ג אחוז ההידבקות של תאים + T CD3 אדם מן המעלה הראשונה חושב על ידי קביעת מראש הממוצע ראשון וספירת תאים שלאחר זרימה עבור כל תנאי. עבור כל תנאי, הספירה שלאחר הזרימה הממוצעת מחולקת הספירה מראש הזרימה הממוצעת ומוכפלת 100. הידבקות האחוז וכתוצאה מכך מבוססת על ספירת התאים מראש הזרימה להיות 100 הידבקויות%. ברים מייצגים ממוצע של 5 ניסויים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Tהתאים הראשונים לצבור ואז לזרום על monolayer CHO-ICAM. תאים Jurkat T תויגו עם CFSE בריכוז של 5 מיקרומטר. לאחר מכן, התאים הועמסו תאי זרימה טופלו קודם-1α SDF (100 ng / ml) ולהקים על המיקרוסקופ confocal ואיפשר לעבור ולצבור בתא למשך 5 דקות. במשך 5 אלה התמונות דקות נתפסו כסדרה זמן לשגות; סטילס (א). תזרים יזמה אז 0.4 dyn / 2 ס"מ כדי ליצור מתח גזירה למשך 5 דקות. במשך 5 אלה התמונות דקות נתפסו כסדרה זמן לשגות; סטילס (B). כיוון הזרימה בתמונות אלה הוא מלמטה למעלה, ואת מטוס המוקד מוגדר בשכבת CHO-ICAM. תאי T ניתן לסווגם ל 3 קבוצות: (1) תאי T מתגלגלים לאורך בשכבה בקצב הזרימה הם דמיינו כמו קצרים, קווים אופקיים נעו מלמטה למעלה על פני השדה מאז הם נעים במהירות בעת היותו צלמו. (2) crawlin תאי Tg יחד בשכבה. תאים אלה הם דבקו התבססו על ההתנגדות לזרימה, והם זוחל סבירים בחיפוש אחר שטח מתירנית למעבר הסלולר, אשר לא נצפה במודל זה. (3) תאי T כי לדבוק בתוקף בשכבה, עמידים לזרום, אבל הם נייחים. תאים אלה אינם מתגלגלים באופן פעיל או זחילה לאורך בשכבה. ניתוח מתוחכם יותר יכול להיעשות, על בסיס מטרות המחקר, באמצעות סקריפט ImageJ שנועד לנתח אוכלוסיות תאים אלה כימות או אפיון נוספים. סולם bars 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תאי CHO-ICAM חייבים יוצרי monolayer ומחובר. תמונה מייצגת של monolay CHO-ICAM ומחוברתאה בתוך תא זרימה. סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי כראוי לנתח הידבקות תא T, את החומר מהגוף להיכלל במחקר יש לקחת בחשבון בעת בחירת שיטה במבחנה. אמנם יש מספר מבחנים ללמוד אותות שמובילים הפעלת LFA-1 ו- ICAM-1 מחייב כל השיטות אינן ניתנות להחלפה. Assay הידבקות סטטית 10 הוא המתאים ביותר כדי לחקור אינטראקציות T תא-APC; לחלופין, שיטת מאמץ הגזירה המפורטת כאן היא אידיאלית מודל אינטראקציות תא T-אפיתל תא. בשנת vivo, כמו כמוקינים מוצגים לאורך האנדותל, מתגלגלים תאי T חייב להגיב על ידי עמיד בתוקף ולהתנגד מאמץ הגזירה של דם לזרום 14,15. מסיבה זו, המחקר של איתות chemokine הוא מתאים ביותר כדי להיחקר בתוך assay משלב מאמץ גזירה. היתרון העיקרי של הידבקות זו באמצעות תנאי זרימה הוא בפשטותו בדוגמנות יחסי הגומלין בין תאי T ו integrins. assay זה די ייחודי המשלב פונקציה ומכניסטייםמחקרים על ידי הדוגמנות סביבה לחקר זוג מולקולה אחת integrin-הידבקות. עוד כוח של שיטה זו הוא ההסתגלות שלה; שיטה זו יכולה לשמש כדי לכמת הדבקה של כל לויקוציטים לכל מולקולת הידבקות. שיטה זו יכולה לשמש כדי להקרין את ההשפעה של תרופות מרובות או מניפולציות גנטיות צפויות לשנות גיוס תאי T ו extravasation באמצעות הפעלת integrin שינתה.
כמו בכל שיטה חוץ גופית, ישנן מספר מגבלות של assay זה. מודל זה משתמש מהונדס תאי CHO ולא בתאי האנדותל עיקריים מגורים כמו השתמשו במודלים אחרים. 16 אמנם זה נותן לנו את היכולת להבין את אירועי איתות המשפיעים על מצב ההפעלה של integrin יחיד, זה יכול להיות גם נחשב חולשה של המודל. כאשר אין selectins הביע ידי תאי CHO, assay נעשה בשני שלבים. במהלך השלב הראשון (שלב ההצטברות), תאי T מוזרקים לתוך הקלט ReservOIR בצד אחד של החדר ואת הנסיעה לצד השני על ידי לחץ מינימאלי וכוחות נימים. ההתנהגות של תאי T ברחבי דקות 5 אלה ניתן לראות באיור 3 א. לאחר 5 דקות, ובמהלך השלב השני (שלב הזרימה) את קצב הזרימה הוא גדל והתאים יתחילו להתגלגל לדבוק. חשוב לציין כי לא כל תאי T מוזרקים לתוך מהלך מאגר הקלט לאורך ההדר בשלב ההצטברות, והתאים האלה מתגלגלים בשכבה כזרימה הוא גדלה (איור 3 ב). בדרך זו, בשלב המתגלגל של extravasation מוגבר באופן מלאכותי, אבל לא בוטל, במודל זה.
מאז המספר המרבי של תאים חסידים הוא ביטוי של מספר תאי קלט שנכנס לתוך התא יש פוטנציאל השתנות מספר גלם בין ניסויים. בעוד תמונות preflow אינן מייצגות באופן מלא את אוכלוסיית תא 100% לכל היותר T כי הם אינם מביאים account מאגר הקלט, זה הוא פקד חשוב לכלול בחישובים במיוחד כאשר שני סוגי תאים שונים נספרים בנפרד הם ישוו. בנוסף, לא מומלץ כי לימפוציטים פיצוץ ראשוני לשמש לניתוח הידבקות משתנה אחד. כלומר, מראש גירוי של תאי T באמצעות קולטנים T-cell (TCR) ו / או-קולטנים שיתוף עלול לבלבל את השפעת הטיפול של הריבית על הידבקות. משתנים אלו יש לשקול במהלך תכנון הניסוי. כמו כן, מחקרים פונקציונלי עם PBMCs קפוא בעבר לעתים קרובות להניב תוצאות בלבול, ועל שורות תאים מסיבה זו או PBMCs העיקרי מבודדים טרי פועלים בצורה הטובה ביותר עם assay זה. הבנת רמת הבסיס הנורמלית של הידבקות unstimulated עבור PBMC שנכלל במחקר הוא קריטית בזיהוי אוכלוסיית תא כי כבר מראש מופעל nonspecifically מה שהוביל לתוצאות מבלבלות.
כדי לשכפל assay זה עם דיוק, זה הכרחי כי כמה צעדהים בפרוטוקול, לרבות מועדי השיקוע ותזרים דגירה, לייתר דיוק ואחידות בין כל התנאים. באותו אור, תאי CHO-ICAM חייבים להיות ומחוברות באופן אחיד לאורך כל תאי הזרימה (איור 4) ואת ספירת תאי T חייב גם להיות מדויק. 17 הבדלים קטנים אפילו גורמים אלה עשויים להשפיע על דיוק של ספירת תאים בסופו של הדבר. יישום עתידי של assay זה הוא הפיתוח של סדרה של שורות תאים בנפרד להביע selectins ומולקולות דבקות כדי להרחיב את ההשפעה של שיטה זו מפלי איתות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
