Summary
Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.
Abstract
Insgesamt ist T Zelladhäsion eine kritische Komponente der Funktion, einen Beitrag zu den unterschiedliche Prozesse der zellulären Rekrutierung von Entzündungsherden und die Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Bildung von immunologischen Synapsen. Diese beiden Kontexte T Zelladhäsion unterscheiden, daß T-Zell-APC-Interaktionen statisch betrachtet werden können, während T-Zell-Wechselwirkungen Blutgefß durch die Scherbeanspruchung durch Zirkulation selbst erzeugt werden, in Frage gestellt. T-Zellen-APC-Wechselwirkungen werden als statisch klassifiziert, dass in den beiden Zellpartnern sind statisch relativ zueinander. Normalerweise tritt diese Wechselwirkung innerhalb der Lymphknoten. Als eine T - Zelle mit der Blutgefäßwand in Wechselwirkung tritt, verhaften die Zellen und muss die erzeugte Scherbeanspruchung zu widerstehen. 1,2 markieren Diese Unterschiede die Notwendigkeit einer besseren statischen Haftung und Haftung unter Strömungsbedingungen als zwei unterschiedliche regulatorische Prozesse zu verstehen. Die Regulation der T-Zell-Adhäsion am meisten werden kann kurz und bündig als con beschriebenTrolling die Affinitätszustand von Molekülen exprimiert auf der Zelloberfläche Integrin, und somit die Wechselwirkung von Integrinen mit den adhesion molecule-Liganden auf der Oberfläche der Zelle exprimiert Interaktion reguliert wird. Unsere aktuellen Verständnis der Regulation von Integrin Affinität Staaten kommt von häufig vereinfachend in vitro Modellsystemen. Der Test der Adhäsion Strömungsbedingungen unter Verwendung von hier ermöglicht folgenden Stimulus für die Visualisierung und genaue Quantifizierung von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit beschrieben. Eine Haftung unter Strömungs Assay kann auf Studien der Haftung angewendet werden Signalgebung innerhalb von T-Zellen nach der Behandlung mit inhibitorisch oder stimulatorisch Substanzen. Darüber hinaus kann dieser Test über T-Zell-Signalgebung auf jede Klebe Leukozytenpopulation und jedes Integrin-Adhäsionsmolekül Paar erweitert werden.
Introduction
T - Lymphozyten - Adhäsion vermittelt eine Anzahl verschiedener Prozesse in einem gesunden Immunsystem, 3 entscheidende Rolle bei der T - Zell - Handel und Antigenpräsentation spielen. Ob bei der Immunüberwachung oder eine aktive Immunantwort diese beiden Rollen breiten für die Haftung sind kritisch. 4 Die physiologischen Signalereignisse von T - Zell-Endothel-Interaktionen unterscheiden sich von T - Zell-Antigen - präsentierenden Zellen (APC) Wechselwirkungen und erfordern daher unterschiedliche Methoden Studie am besten verstehen, die signal~~POS=TRUNC beteiligt. Die feste Haftung einer T-Zelle zu einer Blutgefäßwand während der Lymphozyten-Extravasation erfordert eine schnelle und dynamische Integrin-Aktivierung. Die enge Wechselwirkung zwischen einem aktiven Zustand Integrin und Adhäsionsmoleküle entlang des Endothels führt zu beständige Haftung auf den Fluss von Blut, T - Zellen , so dass auf der Suche nach einer Fläche permissive Zellpassage entlang der Oberfläche zu kriechen. 5 Das Crawling einer T - Zelle bi -directionally Alonga Blutgefßwand ist angewiesen auf polarisierter Adhäsion, mit einem ausgeprägten Klebe vorderen Ende der T - Zelle. 6 Am wichtigsten ist, feste Adhäsion und Transmigration erfordern Widerstand gegenüber der Scherkraft , die durch den Blutfluss zirkuliert.
Wenn Experimente entwerfen Lymphozytenadhäsion zu studieren, sollten ihr Augenmerk auf den spezifischen Reiz von Zinsen gezahlt werden. Während Integrin-Aktivierung eine übliche und wichtige Komponente für alle Formen der T-Zell-Adhäsion, sind die Kaskaden von der Aktivierung wahrscheinlich einzigartig nachgeordnet einzelnen Rezeptoren und Co-Rezeptoren zu sein. Ebenso funktionieren Integrin und Adhäsionsmolekül-Paare in spezialisierten Mikroumgebungen und auf spezifische Subpopulationen. Auf diese Weise können diese Paare ganz anders geregelt werden. Das Modell präsentiert hier ist ideal für die Untersuchung von Signalkaskaden , die zu Integrin - Aktivierung unter Scherspannungsbedingungen nehmen. 7 Diese Wechselwirkungen können nicht adäquat in einem statischen ADHESI verstanden werdenauf System , um die Auswirkungen durch diese Kräfte direkt auf T - Zellen - Verhalten gezeigt haben , wurden. 8 Obwohl hier mit T - Zellen und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen entwickelt , um menschliche ICAM-1 (CHO-ICAM - Zellen) exprimieren das System präsentiert werden , können leicht modifiziert werden, um verschiedene Leukozytenpopulationen oder Adhäsionsmoleküle zu untersuchen.
Dieser Test stellt ein Verfahren T-Zell-Klebrigkeit und Integrin-Aktivierung unter Verwendung von Scherspannung zu quantifizieren, ein Modell für die feste Haftung Stadium der Leukozytenextravasation bereitstellt. Durch die Verwendung von CHO-Zellen ICAM die Affinität von LFA-1 für seinen Liganden in lebenden Zellen können in Echtzeit in Reaktion auf verschiedene Stimuli von Interesse untersucht werden. Diese Technik erfordert einfach erhalten, im Handel erhältliche Mikroströmungskammern in Kombination mit einer Spritzenpumpe, stark die Ausrüstung vereinfacht notwendigen Durchblutung und Scherspannung im Vergleich zu anderen Modellen. 9 Ein weiterer großer Vorteil dieses Assays zu modellieren ist , dass spezifische SignalKaskaden und der resultierende Aktivierungszustand einzelner Integrine sauber durch die Verwendung von gentechnisch veränderten CHO-Zellen können menschlichen Adhäsionsmoleküle von Interesse exprimieren, untersucht. Darüber hinaus ist die Kombination von quantitativen Daten mit lebenden Zellen ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Insgesamt während eine Reihe von Tests der statischen T Zelladhäsion beschrieben wurden, die gut T-Zell-APC-Interaktionen zu modellieren, sind diese Modelle nicht ausreichend in den dynamischen Prozess der T-Zell-epitheliale Adhäsion zu erfassen. Aus diesem Grund wird, wenn ein Adhäsionstest der Reiz in Frage entscheiden müssen berücksichtigt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Auflage die CHO-Zellen ICAM
Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die CHO-ICAM-Zellen in den Strömungskammern für das Wachstum über Nacht mit dem Ziel der Erzeugung einer konfluenten Monoschicht zu plattieren.
- Pflegen CHO-ICAM-Zellen in 10 cm Gewebekultur behandelten Kulturschalen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (CHO-ICAM kompletten Kulturmedium) bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Um Zellen zu sammeln, 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min unter leichtem Schütteln. Neutralisieren des Trypsins mit 4 ml Medium.
- Zählen Sie die CHO-ICAM - Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 0,75 x 10 5 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment: 2.25 x 10 5 Zellen werden auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein.
- Zentrifuge 0,75 x 10 5 CHO-ICAM - Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren des Zellpellets in 30 & mgr; l pro Kammer von CHOICAM komplette Kulturmedien.
Anmerkung: In diesem Experiment 90 & mgr; l wird auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein. - Fügen Sie langsam die Zellen in ein Reservoir der Strömungskammer. Lassen Sie die Zellen für 5 min in 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 zu begleichen.
- In 200 ul kompletten Kulturmedien über die beiden Stauseen jeder Kammer. Abwechselnden Zugaben zwischen den beiden Bewegung der Zellen zu vermeiden, da das System äquilibriert.
- Inkubieren der Zellen über Nacht in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2.
2. Herstellung der T-Zellen
Anmerkung: Dieser Test kann mit primären humanen T-Zellen oder T-Zelllinie durchgeführt werden. Ein Protokoll auf T - Zell - Isolierung aus Blut zuvor beschrieben worden ist . 10 Bei der Verwendung von primären humanen T - Zellen frisch isolierten Zellen für beste Ergebnisse. Wenn eine T-Zelllinie verwenden, befolgen Sie die Kultur-Protokoll durch die Quelle der Zellen angegeben. Um die Zellen auf einem Fluoreszenz microsco nachzuweisenpe die T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) markiert sind.
- Zählen Sie die T - Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 2 x 10 6 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment wurden 6 x 10 6 Zellen werden für 3 Kammern erforderlich sein.
- Zentrifuge 2 x 10 6 T - Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren der Zellen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) , enthaltend 1% Glucose oder 2% FBS.
- In CFSE bei 1: 1000 Verdünnung (Lager aus bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei RT
- Spin bei 500 × g für 5 min, RT.
- Resuspendieren Zellpellet mit 240 & mgr; l pro Zustand (siehe Kapitel 4 "Hinweis") von RPMI Medium ohne Serum. In diesem Experiment Zellpellet in 720 ul RPMI Ebene. Teilen Sie die Zellen in leere 1,5-ml-Röhrchen für jede Kammer beschriftet, 240 & mgr; l pro Röhrchen. Halten Sie Zellen in einem 37 ° C Wärmeblock bis zur Verwendung.
3. Definieren von the Input / Output Verschlauchung und Spritzenpumpe
- Wärmen Sie das Mikroskop Live-Imaging-Kammer auf 37 ° C.
- Bereiten Sie die Eingabe Verschlauchung:
- Füllen Sie eine 500 ml Glasflasche mit Wasser und machen zwei Löcher in den Deckel. Beschriften Sie die Löcher "in" und "out". Dies wird für die Eingabemedien als Heizwasser Bad handeln.
- Führen Sie die Eingabe durch die Löcher in dem Deckel und in das Wasserbad abspritzen. Stellen Sie sicher , dass die Seite des Schlauches, der an der Spritze verbindet kommt durch die "in" Loch und der Seite , die mit dem Eingangsbehälter verbinden die "out" Loch kommt durch.
- Spülen Sie die Eingabe mit 60 ml Wasser abspritzen alle Luft aus dem System zu entfernen.
- Prime die Eingangs hosing mit RPMI - Medium Serum fehlt erwärmt auf 37 ° C. Füllen Sie eine 60-ml-Spritze und drücken durch die Medien, bis der Schlauch vollständig grundiert und ohne alle Luftblasen.
Hinweis: Je nach length Schlauch verwendet, um das Volumen zu grundieren erforderlich variieren.- Berechnen des Volumens der Medien für das Experiment erforderlich, indem die Strömungsgeschwindigkeit multipliziert wird (hier 0,3 ml / min) durch die Anzahl der Minuten (5 min) durch die Anzahl der Kammern in dem Experiment (hier 3); in diesem Experiment verwendet werden 4,5 ml Medium. Hinweis: Wir empfehlen 5 ml zusätzliches Volumen (hier in Höhe von insgesamt 9,5 ml) in der Spritze verbleibenden nach dem Grundieren.
- Platzieren Sie die gesamte Eingabe - Setup in die Live - Bildgebung Gehäuse des Mikroskops 37 ° C zu halten. Führen Sie den Schlauch und Spritze aus dem Gehäuse heraus und laden Sie die Spritze in die Spritzenpumpe.
- Bereiten Sie die Ausgabe Verschlauchung:
- Machen Sie ein Loch in den Deckel einer 250 - ml - Flasche als Ausgangs Abfall zu verwenden.
- Führen Sie den Ausgangsschlauch durch das Loch und in die Flasche. Angelehnt an die Deckel zu sichern, nicht den ganzen Weg zu schließen.
- Legen Sie die Ausgabeeinstellung in die Live - Imaging - Gehäuse des mikop.
- Berechnen der Fließgeschwindigkeit (ml / min) erforderlich , um die gewünschte Scherbeanspruchung (dyn / cm 2) zu erzeugen. Schubspannung variiert in den verschiedenen Gefäßfächer, daher berücksichtigen, die Gesamtmodell einschließlich Zelltypen untersucht und Behandlungen werden, wenn sie auf einer Schubspannung Ebene zu entscheiden.
Hinweis: Diese Experimente durchgeführt werden , bei 0,4 dyn / cm 2 bis eng eine kleine Vene Einstellung zu imitieren.- Nehmen Sie die Kammer Dimensionen berücksichtigen, wenn sie Scherspannung zu berechnen. Verwenden Sie die folgende Formel ( zur Verfügung gestellt vom Hersteller 11) für die Strömungskammern verwendet hier (Siehe Tabelle der Materialien): T = η * 176,1 * ø wobei T = Schubspannung, η = dynamische Viskosität, ø = Durchfluss. Hinweis: Die dynamische Viskosität von RPMI-Medium bei 37 ° C 0,007 ist.
4. Laden der Strömungskammern und Stimulation der Zellen
Hinweis: Um die Haftung zu initiieren,T-Zellen müssen stimuliert werden. In dem folgenden Experiment werden die Zellen bleiben entweder unstimuliert oder werden mit SDF-1α 12 oder Phorbolmyristatacetat (PMA; positive Kontrolle) stimuliert 13. Für die korrekte Darstellung von Chemokin auf T-Zellen, CHO-ICAM-Zellen werden mit SDF-1α (gefolgt von seriellen Wäschen), so dass für die Präsentation auf der Zelloberfläche vorinkubiert. PMA ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich dem zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist; hier wird es als positive Kontrolle verwendet. T-Zellen werden direkt mit PMA behandelt, bevor es in die Strömungskammer zu laden.
- Platzieren Sie die Flusskammer gleiten auf dem Mikroskop und stellen Sie die Fokusebene auf der CHO-ICAM einschichtigen die 20x-Objektiv verwendet wird.
- Halten Sie CFSE-gefärbten T-Zellen für alle anderen Bedingungen in der 37 ° C Heizblock. Herstellung der CHO-ICAM oder T-Zellen, wie dem Assay für den Zustand unmittelbar vor folgt:
- Für die nicht-stimulierten Zustand (Kammer 1) halten ein Rohr / Fluss chBernstein unbehandelt, als negative Kontrolle für die Stimulation dienen.
- Für PMA-Stimulation (Kammer 2), stimulieren eine Röhre von T-Zellen mit PMA (10 ng / ml) als Positivkontrolle zu dienen; sofort behandeln, bevor sie in Flusskammer geladen werden.
- Für SDF-1α Stimulation (Kammer 3), stimulieren die dritte Strömungskammer mit SDF-1α (100 ng / ml) von 70 & mgr; l zu einem Zeitpunkt 3 Mal von dem oberen Reservoir (Ausgangsbehälter) Entfernen und Hinzufügen dann 70 ul SDF -1α (100 ng / ml) in den unteren Behälter (Eingangsbehälter). Inkubieren für 5 min.
- Entfernen und entsorgen 70 & mgr; l zu einer Zeit , 3 - mal aus dem Ausgabebehälter von einer Kammer.
- Hinzufügen , 70 & mgr; l vorbehandelte (gegebenenfalls) T - Zellsuspension in den Eingangsbehälter 3 mal. Warten 5 min die Zellen zu ermöglichen, von dem Einlass der Kammer ( "In") zu bewegen, und dem proximalen Auslass ( "Out") der Kammer zu erreichen.
- Während dieser Zeit Bild 5Felder für CFSE-gefärbten T-Zellen. Wählen Felder, die während der Mitte der Kammer verteilt sind (Abbildung 1). Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionsbedingungen: Anregung Laser-Wellenlänge: 488 nm; Emissionssammelfilter: 500 - 540 nm. Diese Bilder werden als die Pre-Flow-Zellzählungen dienen.
- Bringen Sie die Eingangs- und Ausgangsleitungen gleichzeitig an die Strömungskammer Stauseen.
Hinweis: Anbringen der Schläuche gleichzeitig kritisch ist, so dass keine Luftblasen in die Kammer und die Aufrechterhaltung Gesamtgleichgewicht innerhalb der Kammer einzuführen. - Beginnen Fluss bei 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2) , während die CFSE-gefärbten T - Zellen sichtbar zu machen . Als Fluss beginnt, insbesondere mit der ersten Kammer, gibt es oft eine Verzögerung zwischen Strömungs Initiierung und T-Zell-Roll Beobachtung daher Zeitpunkt 5 min zu Beginn der T-Zell-Bewegung zu beginnen.
- Terminate Fluss nach 5 min und Bild 5 Felder in der CFSE-Kanal. Wählen Sie Felder zufällig verteilten throughout der Mitte der Strömungskammer (Abbildung 1). Diese Bilder werden als die Post-Flow-Zellzählungen dienen.
5. Bestimmung des Prozentsatzes von adhärenten Zellen
Anmerkung: Die Bestimmung der Anzahl der Zellen in den erfassten Bildern wird objektiv mit automatisierter Software. Für unsere Untersuchungen verwendeten wir die Software Volocity (Version 6.2.1), aber auch andere Software wie ImageJ (Version 1.48V) sind ebenfalls anwendbar.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Pre-Flow für jede Bedingung. Der Mittelwert der 5 Feldern ist die "pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl." 7
- Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Nachströmzeit für jede Bedingung. Der Durchschnitt der fünf Felder ist die "post-flow durchschnittliche Zellzahl." 7
- Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen mit der folgenden Formel: Anteil der anhaftenden Zellen = (post-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) / (pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repräsentative Ergebnisse sind aus der Strömungs Adhäsionsassay gezeigt unter Verwendung von Jurkat und primären humanen CD3 + T - Zellen, wie angegeben, stimuliert mit SDF-1α. Die negativen Kontrollen in allen gezeigten Experimente sind nicht stimulierten Zellen. Ein Schwellenwert basal Prozent Anhaftung von nicht-stimulierten Zellen von 5 - 10%; Basis Haftung zeigt insbesondere eine problematische Experiment über diesem Bereich und schlägt vor, die Start Population von T-Zellen wurden in Vorbereitung unspezifisch voraktiviert. Fache Erhöhung der Anzahl der anhaftenden Zellen post-Strömung in jedem Zustand gegenüber der nicht stimulierten Zellen können zusätzlich zur Berechnung der prozentualen Haftung berechnet werden. Daten, die diese beiden Berechnungsmethoden sind hier eingeschlossen.
2A zeigt repräsentative Bilder von Feldern innerhalb der Strömungskammer für jede Bedingung vor und nach dem Durchfluss. Vor dem Experiment, Jurkat (Shown in 2A) oder primären humanen CD3 + T - Zellen werden gereinigt, gezählt und mit CFSE markierte. Für jede Versuchsbedingung 2 x 10 6 Zellen wurden markiert. Unstimulierten T-Zellen wurden in die Strömungskammern enthaltenden CHO-ICAM-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-1α geladen. Die T-Zellen wurden in der Kammer Bilder bewegen und reichern sich für 5 Minuten, und während dieser Zeit wurden gefangen genommen, die Pre-Flow zählt zu bestimmen. Eine vergleichbare Anzahl von Zellen prä-Strömung zwischen den verschiedenen Stimulationen ist wichtig, einheitliche Versuchsbedingungen zu gewährleisten. Nach 5 min kontinuierlicher Schubspannung durch die Strömung erzeugt wurden Bilder wieder gefangen Nachströmzeit zählt zu bestimmen. Es ist offensichtlich, durch diese repräsentativen Bilder, die SDF-1α die Anzahl der T-Zellen können erhöht den CHO-ICAM-Zellen unter Schubspannung zu halten.
2B zeigt die Falte Änderung der T - Zell - Adhäsion als calnete basierend auf der Anzahl von Jurkat-T-Zellen vor und nach der Strömung entweder unstimuliert oder in Gegenwart von SDF-1α. Für jeden Zustand die durchschnittliche Zellzahl von 5 Feldern pre-flow und 5 Felder post-Strömungs bestimmt wurden, und ein Vergleich von SDF-1α Stimulation zu unstimulierten verwendet fache Änderung in T-Zell-Adhäsion zu berechnen. Wie hier gezeigt, induziert SDF-1α eine nahezu 2-fache Erhöhung der Haftung im Vergleich zu nicht stimulierten.
2C veranschaulicht ein alternatives Verfahren zur Datenberechnung. Hier die prozentuale Adhäsion von primären humanen CD3 + T - Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-1α, indem zuerst die Bestimmung der durchschnittlichen prä- und post-Strömungs T - Zellzahl bestimmt wird , dann Dividieren der post-Strömungsdurchschnitt durch die vorgeStrömungs durchschnittliche und die gesamte pre-Strömungs Bevölkerung durch diese Berechnung mit 100 multipliziert repräsentiert 100% Adhäsion. Wie hier gezeigt, haften 15% der nicht-stimulierten T-Zellen unter Scher stress im Vergleich zu 50% von T mit SDF-1α-stimulierten Zellen.
Abbildung 1. Es ist wichtig , nur Bereiche homogene Strömung. Schematische Darstellung der Strömungskammern mit Angabe der verwendeten ausgesetzt zu analysieren , wo die Felder sollten abgebildet werden. Gemäß Angaben der Kammer Herstellern zur Verfügung gestellt, wird die eingestellte Strömungsgeschwindigkeit nur durch das Zentrum der Kammern erreicht, von Orange in dieser schematischen angezeigt. Näher an den Grenzen der Kammer die Strömungsgeschwindigkeit abnimmt und sollte nicht in der experimentellen Bildgebung oder Analyse einbezogen werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. <strong> SDF-1α induziert T - Zelladhäsion an ICAM-1 unter Scherbelastung. A. Jurkat T - Zellen mit CFSE in einer Konzentration von 5 uM markiert wurden. Als nächstes wurden die Zellen in die Strömungskammern geladen, die mit SDF-1α (100 ng / ml) oder nicht-stimulierten und Einrichtung unter dem konfokalen Mikroskop und erlaubt sich zu bewegen und reichern sich in der Kammer für 5 min vorbehandelt wurden. Alternativ wurden Jurkat-T-Zellen mit PMA (10 ng / ml) vor der Zugabe zu den Strömungskammern vorbehandelt. Während dieser 5 min vor dem Strömungsbilder wurden gefangen genommen. Flow wurde dann bei 0,4 eingeleitet dyn / cm 2 Scherspannung für 5 min zu erzeugen. Nach der Fertigstellung wurden Nachströmzeit Bilder aufgenommen. Repräsentative Bilder von Jurkat - T - Zellen gezeigt, die Maßstabsleiste 50 um. B. Falten Änderung der Haftung von Jurkat - T - Zellen wurde berechnet , indem zunächst für jede Bedingung die durchschnittlichen Pre- und Post-Flow - Zellzahl zu bestimmen und die durchschnittliche Nachströmzeit Zahl dividiert durch die mittlere vorgeStrömungs count individuell für jede Bedingung. Diese Haftung Quotienten für jeden Stimulationsbedingung, hier SDF-1α oder PMA, wird dann durch den nicht-stimulierten Adhäsion Quotienten dividiert, um den fold change in Adhäsion zu bestimmen. Balken stellen Durchschnitt von 3 Experimenten ± SEM. C. Percent Adhäsion von primären humanen CD3 + T - Zellen , indem zunächst die mittlere prä- und post-Durchflußzelle Zählwerte für jede Bedingung berechnet. basiert auf der vorge Durchflußzelle 100% Adhäsion Zählung wobei jeder Bedingung wird der durchschnittliche postStrömungs Zählung durch die durchschnittliche pre-Strömungszahl und multipliziert mit 100. Die sich ergebende Prozent Haftung geteilt. Die Balken stellen durchschnittlich 5 Experimenten ± SEM. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. TZellen akkumulieren ersten fließen dann über die CHO-ICAM - Monoschicht. Jurkat T - Zellen in einer Konzentration von 5 uM mit CFSE markiert wurden. Als nächstes wurden die Zellen in die Strömungskammern geladen, die mit SDF-1α (100 ng / ml) und Einrichtung unter dem konfokalen Mikroskop und erlaubt sich zu bewegen und reichern sich in der Kammer für 5 min vorbehandelt wurden. Während dieser 5 min Bilder wurden als Zeitraffer-Serie erfasst; Standbilder (A). Flow wurde dann bei 0,4 eingeleitet dyn / cm 2 Scherspannung für 5 min zu erzeugen. Während dieser 5 min Bilder wurden als Zeitraffer-Serie erfasst; Standbilder (B). Die Strömungsrichtung in diesen Bildern ist von unten nach oben, und die Brennebene an der CHO-ICAM-Monoschicht eingestellt. T-Zellen können in drei Gruppen eingeteilt werden: (1) T-Zellen entlang der Monoschicht mit einer Fließgeschwindigkeit visualisiert als kurze, horizontale Linien Bewegen von unten rollen über das Feld nach oben, da sie sich schnell bewegen, während das abgebildet wird. (2) krabbeln T-Zelleng entlang der Monoschicht. Diese Zellen sind fest auf der Basis der Widerstand eingehalten zu fließen und kriechen wahrscheinlich auf der Suche nach einer Fläche permissive Zelldurchgang, der nicht in diesem Modell beobachtet. (3) T-Zellen, die fest mit der Monoschicht anhaften, sind resistent zu fließen, aber sind unbeweglich. Diese Zellen sind nicht aktiv Walzen oder entlang der Monoschicht kriecht. Eine anspruchsvollere Analyse kann durchgeführt werden, basierend auf den Zielen der Studie durch die Verwendung eines ImageJ Skript entwickelt, um diese Zellpopulationen zur weiteren Quantifizierung oder Charakterisierung zu sezieren. Maßstabsbalken 50 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. CHO-ICAM - Zellen müssen eine konfluente Monoschicht bilden. Repräsentative Bild einer konfluenten CHO-ICAM monolayer innerhalb einer Strömungskammer. Maßstabsbalken 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um das Stimulans richtig T - Zell - Adhäsion zu analysieren, um in die Studie aufgenommen werden müssen berücksichtigt werden , wenn ein in vitro - Verfahren wählen. Zwar gibt es mehrere Assays sind Signale zu untersuchen, die zu LFA-1-Aktivierung und ICAM-1-Bindung Alle Methoden sind nicht austauschbar. Eine statische Adhäsionstest 10 ist am besten geeignet , T - Zell-APC - Wechselwirkungen zu untersuchen; alternativ detailliert die Schubspannung Methode hier ist ideal T - Zell-epithelialen Zell - Interaktionen zu modellieren. In vivo als Chemokine entlang des Endothels präsentiert werden, T - Zellen ins Rollen , indem fest haftender und Widerstand gegen die Scherspannung von Blut 14,15 fließen reagieren muss. Aus diesem Grund ist die Untersuchung der Chemokinsignalisierung am besten geeignet in einem Assay untersucht werden, die Scherspannung enthält. Der primäre Vorteil dieser Haftströmungsbedingungen unter Verwendung ist seine Einfachheit in der Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und Integrine modellieren. Dieser Test ziemlich einzigartig kombiniert Funktion und mechanistischeStudien, die von einer Umgebung für die Untersuchung eines Integrin-Adhäsionsmolekül Paar modellieren. Eine weitere Stärke dieser Methode ist ihre Anpassungsfähigkeit; Dieses Verfahren kann verwendet werden, die Haftung jeder Leukozyt einem Adhäsionsmolekül zu quantifizieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Wirkung von mehreren Medikamenten oder genetische Manipulationen zu screenen zu erwarten T-Zell-Rekrutierung und Extravasation durch veränderte Integrin-Aktivierung verändern.
Wie bei jedem in vitro Verfahren gibt es einige Einschränkungen dieses Assays. Dieses Modell CHO - Zellen entwickelt , verwendet und nicht stimulierten primären Endothelzellen als andere Modelle verwendet haben. 16 Während dies gibt uns die Möglichkeit , die Signalereignisse beeinflussen den Aktivierungszustand eines einzelnen Integrin zu verstehen, kann dies auch eine Schwäche des Modells berücksichtigt werden. Da es keine Selektine ausgedrückt durch die CHO-Zellen sind, ist der Test in zwei Schritten. Während der ersten Stufe (die Akkumulationsphase) werden die T-Zellen in den Eingangs reserv injiziertenoir an einer Seite der Kammer und Reise auf die andere Seite durch minimalen Druck und Kapillarkräfte. Das Verhalten der T - Zellen während dieser 5 min in 3A beobachtet werden. Nach 5 min, und während der zweiten Stufe (die Strömungsphase) wird die Strömungsgeschwindigkeit erhöht und die Zellen werden zu rollen und haften beginnen. Es ist wichtig , dass nicht alle T - Zellen in den Eingangsbehälter bewegen sich über der Kammer während der Akkumulationsphase zu injizierenden beachten, und diese Zellen entlang der einschichtigen rollen kann als Strömungs erhöht wird (3B). Auf diese Weise wird die Walzstufe von Extravasation künstlich verstärkt, aber nicht beseitigt, in diesem Modell.
Da die maximale Anzahl der anhaftenden Zellen ein Ausdruck der Anzahl der Eingangszellen ist, die in die Kammer eintreten gibt es das Potenzial für rohe Anzahl Variabilität zwischen Experimenten. Während die Vorströmungswirkung Bilder repräsentieren nicht vollständig die 100% maximale T-Zellpopulation, weil sie in accoun nicht nehment der Eingangsbehälter, ist es eine wichtige Kontrolle in den Berechnungen enthalten insbesondere, wenn zwei verschiedene Zelltypen einzeln gezählt sind, verglichen werden. Zusätzlich wird es nicht empfohlen, dass die primäre Druckwelle Lymphozyten in einer einzigen Variablen Adhäsion Analyse verwendet werden. Das heißt, Vorstimulation der T-Zellen durch T-Zell-Rezeptoren (TCR) und / oder Co-Rezeptoren kann die Wirkung der Behandlung von Interesse auf Adhäsion vermengen. Diese Variablen sollten während der Versuchsplanung berücksichtigt werden. Ebenso funktionelle Studien mit zuvor eingefroren PBMCs ergeben oft verwirrende Ergebnisse, und aus diesem Grund Zelllinien oder frisch isolierten primären PBMCs funktionieren am besten mit diesem Test. die normale Grundniveau von nicht-stimulierten Haftung Verständnis für die PBMC in die Studie eingeschlossen ist entscheidend, um eine Zellpopulation zu identifizieren, die unspezifisch voraktiviert was zu verwirrenden Ergebnissen wurde.
Zur Nachbildung dieses Assays mit einer Genauigkeit, ist es wichtig, dass einige Schritts in dem Protokoll, einschließlich der Absetz- und Fluss Inkubationszeiten, unter allen Bedingungen präzise und einheitlich sein. In dieser gleichen Licht müssen CHO-ICAM - Zellen gleichmäßig in allen Strömungskammern (4) und die T - Zellzahlen auch konfluent werden muß präzise sein. 17. Selbst kleine Unterschiede in diesen Faktoren kann die Genauigkeit der Zellzahl am Ende auswirken. Eine zukünftige Anwendung dieses Assays ist die Entwicklung einer Reihe von Zelllinien einzeln Selektine und Adhäsionsmoleküle exprimieren, die Auswirkungen dieses Verfahrens auf andere Signalkaskaden zu erweitern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
