Summary
这种流动粘附实验提供了T细胞的上皮细胞间的相互作用一个简单的，高冲击的模型。的注射器泵用于产生剪切应力，和共聚焦显微镜捕捉图像进行定量。这些研究的目标是使用流动条件，有效地量化的T细胞粘附。
Abstract
总体而言，T细胞的粘附是功能的关键组成部分，有助于细胞招募的不同的过程，以炎症和与免疫突触的形成抗原呈递细胞（APC）的相互作用的位点。这两个T细胞粘附的背景下在T细胞相互作用的APC可以认为是静态的不同，而T细胞的血管相互作用由循环本身产生的剪切应力的挑战。 T细胞的APC的相互作用被归类为在静态的两个蜂窝伙伴是相对于彼此静止。一般，这种相互作用淋巴结内发生。作为T细胞与血管壁相互作用，细胞逮捕和必须抵制产生的剪切应力。1,2这些差异突出了需要更好地了解流动条件下的静态强度和附着力为两个不同的监管程序。 T细胞粘附的调节可以最简洁地描述为CON曳整合在细胞表面上表达的分子，并从而调节与相互作用细胞的表面上表达的粘附分子的配体整合素相互作用的亲和力状态。我们目前的整合亲和力国家调控的认识来自于体外模型系统常常简单化。使用此处描述的流动条件附着力的测定允许可视化和实时以下一个刺激的T细胞的上皮细胞的相互作用准确定量。流测定下的粘合可以应用于在用抑制或刺激物质治疗的T细胞内信令粘附研究。另外，该测定可超出T细胞信号被扩展到任何粘合剂白细胞种群和任何整合素的粘附分子对。
Introduction
T淋巴细胞的粘附介导许多不同的过程中健康的免疫系统，3中的T细胞贩卖和抗原呈递发挥重要作用。是否免疫监视或主动免疫应答用于粘附这两大作用是至关重要的过程。4的T细胞-内皮细胞相互作用的生理信号事件是从T细胞的抗原呈递细胞（APC）的相互作用不同，因此需要的不同的方法研究以更好地了解所涉及的信号通路。 T细胞向淋巴细胞外渗期间的血管壁的牢固粘附，需要快速和动态的整合激活。沿内皮激活状态整合和粘附分子之间的紧密相互作用导致密合性的血液流动性，从 而使T细胞沿着搜索容许到孔通道区域的表面爬行。5 T细胞双向的抓取-directionally ALONガ血管壁是在偏振粘附依赖，与T细胞的不同粘合剂前端6最重要的，牢固粘附和轮回需要由循环血液流动产生的剪切力的阻力。
当设计实验来研究细胞粘连，应注意感兴趣的特定的刺激。而整合激活是各种形式的T细胞粘附的常见和重要组成部分，活化的级联很可能是唯一的个人受体和共同受体的下游。同样，整合和黏附分子对在专门的微环境和特定亚群的功能。以这种方式，这些对可以相当不同的管制。这里提出的模型是理想的信号级联，导致整活化发生的剪切应力条件下的研究。7这些相互作用不能充分在静态adhesi理解系统由于冲击这些力已显示直接对T细胞的行为。8虽然与T细胞和CHO（中国仓鼠卵巢）细胞工程化以表达人ICAM-1（CHO-ICAM细胞）的系统可以在这里提出很容易被修改，以研究不同白细胞群或粘附分子。
此法提供了使用剪切应力，为白细胞外渗的牢固粘附阶段的模型来量化T细胞的粘附性和整合激活的方法。通过使用CHO-ICAM细胞LFA-1为它的活细胞中配体的亲合性可以实时响应于感兴趣的各种刺激进行检查。需要容易地获得该技术中，在组合市售微流腔室用注射器泵，极大地简化必要的血液流动和剪切应力建模设备相比其他模型9该测定的另一主要优点在于，特定的信令级联和单个整合的所得活化状态可以通过使用表达所关注的人的粘附分子工程改造的CHO细胞的被干净了研究。此外，量化数据的与活细胞成像的组合是此方法的一个显著优势。总体而言，虽然许多静态的T细胞粘附试验中已经描述了很好地建模T细胞的APC的相互作用，这些模型中捕获的T细胞上皮粘附的动态过程不充分。由于这个原因，选择一个粘附试验时有问题的刺激必须加以考虑。
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Protocol
1.电镀CHO-ICAM细胞
注意：该步骤的目的是与产生一个汇合单层的目标镀CHO-ICAM细胞在流动室生长过夜。
- 保持于10cm组织培养处理过的培养皿的CHO-ICAM细胞中，在37℃在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（CHO-ICAM完全培养基），用5％10毫升RPMI培养基的 CO 2。
- 以收集细胞，加入1ml的0.5％胰蛋白酶-EDTA，并在室温下孵育1分钟，轻轻摇动。中和胰蛋白酶用4ml的介质。
- 算使用血细胞计数器的CHO-ICAM细胞，并计算每室0.75×10 5个细胞。注意：在这个实验：将需要2.25×10 5个细胞播种3的腔室。
- 离心机0.75×10 5个每室的CHO-ICAM细胞5分钟，在500 xg离心，室温，并重新悬浮在每CHO的室30微升细胞沉淀-ICAM完整的培养基。
注：在这个实验中，将需要90微升种子3室。 - 慢慢加入细胞进入流室的一个储存器。使细胞在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2沉降5分钟。
- 加入200μl完全培养基穿过每个腔室的两个储存器。两者之间交替加法，以避免细胞的运动作为系统达到平衡。
- 孵育细胞过夜37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的内部。
2. T细胞的制备
注意：此测定法可以与初级人T细胞或T细胞系进行。从血T细胞分离的协议已如前所述。10如果使用原代人T细胞用新鲜分离细胞，以取得最佳效果。如果使用T细胞系，按照由单元的源所指定的培养协议。为了检测在荧光microsco细胞PE的T细胞标记有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。
- 算使用血细胞计数器的T细胞，并计算每腔室2×10 6个细胞。注意：在这个实验中，6×10 6个细胞将需要3的腔室。
- 离心机2×10 6个 T细胞每室，用于在500 xg离心，室温下5分钟，重悬在1ml磷酸盐缓冲盐水含有1％葡萄糖或2％FBS的细胞（PBS）中。
- 1添加CFSE：1000稀释液（股票5毫米制造）。从灯盖和在室温下孵育8分钟
- 旋转，在500×g离心5分钟，室温。
- 每240条件微升悬浮细胞沉淀（见第4节“说明”）RPMI媒体缺乏血清。在该实验中，重悬细胞沉淀在720微升纯的RPMI。分裂细胞转化为标示每室，每管240微升空1.5毫升管。保存在37℃加热块电池备用。
3.设置日Ë 输入/输出软管和注射泵
- 暖显微镜实时成像室至37℃。
- 准备输入软管：
- 填的500毫升玻璃瓶与水和使2个孔到盖子。标签上的孔“中”和“out”。这将作为一个加热水浴输入媒体。
- 运行输入通过在盖和进入水浴中的孔冲水。确保连接到注射器的软管的一侧来通过“中的”孔和将连接到输入储存器的一侧来通过“去”的孔。
- 刷新输入用60ml水冲水以从体系中除去任何空气。
- 素输入用RPMI培养基缺少血清冲水加热到37℃。填充60毫升注射器，并通过媒体推，直到软管完全底漆，缺乏任何气泡。
注：根据lengt油管h的使用要求总理将改变音量。- 由分钟（5分钟）通过的室的数目的数目在实验（这里3）流量（这里0.3ml /分钟）的速率乘以计算的实验所需的介质的体积;在这个实验中，使用4.5毫升介质。注意：我们建议有5毫升额外的体积（这里共9.5ml）中剩余的注射器吸了。
- 将整个输入设置到显微镜的实时成像外壳保持37℃。运行软管和注射器滑出机壳和注射器加载到注射器泵。
- 准备输出软管：
- 使在250毫升瓶作为输出废物用的盖的孔。
- 运行通过孔并进入瓶的输出管道。松散的固定盖板，不关闭所有的方式。
- 放置输出设置成英里的实时成像外壳croscope。
- 计算的流量（毫升/分钟）必要以产生期望的剪切应力（达因/厘米2）。剪应力在不同血管隔室而变化，因此，考虑到包括待研究的细胞类型并在剪应力水平决定何时治疗的总体模型。
注意：这些实验是在0.4达因/厘米2进行密切模仿小静脉设置。- 计算剪切应力时拿腔尺寸考虑在内。使用下面的公式为此处使用的流动室（由生产商11提供）（参见材料表）T =η* 176.1 *直径：其中T =剪切应力η=动态粘度，直径=流速。注意：RPMI培养基在37℃下的动力粘度为0.007。
4.装载细胞的流动室和刺激
注意：为了启动粘附，T细胞需要被刺激。在以下实验中，细胞将或者保持未刺激或SDF-1α12或佛波醇肉豆蔻乙酸酯（PMA;阳性对照）被刺激13。对T细胞的趋化因子的适当呈现，CHO-ICAM细胞预温育与SDF-1α（后跟串行洗涤），允许在细胞表面上呈现。 PMA是一个佛波酯在结构上类似于第二信使二酰基甘油（DAG）;此处它被用作阳性对照。 T细胞被直接用PMA装载到流动室前处理。
- 放置在显微镜流室的幻灯片，并设置使用20X客观的CHO-ICAM单层焦平面。
- 保持CFSE染色T细胞在37℃加热块的所有其他条件。制备的CHO-ICAM或T细胞如下之前立即测定该条件：
- 对于未刺激条件（室1），保持一管/流量通道琥珀未经处理的，以服务为刺激作为阴性对照。
- 对于PMA刺激（室2），刺激T细胞用PMA（10毫微克/毫升），作为阳性对照一管;立即装入流室之前对待。
- 为SDF-1α刺激，（室3），通过每次从上部储存器（ 输出水库）除去70微升3次，然后加入70微升的SDF的刺激与SDF-1α（100毫微克/毫升）的第三流动腔室-1α（100毫微克/毫升）到下部容器（ 输入容器）。孵育5分钟。
- 从一个腔室的输出贮存器中删除，并在一个时间丢弃70微升3倍。
- 加70微升预处理（如适用）的T细胞悬液到输入储存器3次。等待5分钟，使细胞从室（“以”）的入口移动，并且到达腔室的近端出口（“输出”）。
- 在此期间，图像5对于CFSE染色T细胞领域。选择分散在整个腔室（ 图1）的中心领域。使用下面的激发/发射条件：激发激光波长：488纳米;排放收集过滤器：500 - 540纳米。这些图像将作为预流动细胞计数。
- 同时附加的输入和输出管连接到流动室水库。
注意：同时附加管路是至关重要的，以便不引入气泡进入室和保持室中整体平衡。 - 以0.3毫升/分钟（0.4达因/厘米2）开始流动，同时可视化的CFSE染色的T细胞。如流程开始，特别是与第一腔室，经常会有引发流动和观察T细胞轧制之间的滞后，因此，在T细胞的运动的发生开始定时5分钟。
- 终止流动5分钟后，并在CFSE通道图像5字段。选择随机分散的救援人员到场领域ughout流动室的中心（ 图1）。这些图像将作为流动后细胞计数。
5.确定粘附细胞的百分比
注意：在所获取的图像中的细胞的数目的测定用自动软件客观完成。对于我们的研究，我们使用的软件Volocity（版本6.2.1），但是其他的软件如ImageJ的（版本1.48V）也是适用的。
- 确定每个场的预流对于每个条件的细胞的数量。 5场的平均是“流预平均细胞数。”7
- 确定每场的后流的每个条件的细胞的数量。 5场的平均是“流后平均细胞数。”7
- 计算使用下面的公式贴壁细胞的百分比： 贴壁细胞=（流量后平均细胞数）/（流预平均细胞数）的百分比×100％。
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Representative Results
代表性的结果从使用Jurkat和初级人CD3 + T细胞的流动粘附实验中所示，所指示的，与SDF-1α刺激。在所有所示实验的阴性对照是未刺激细胞。未刺激细胞的基础门槛百分之附着力5之间 - 10％;基附着力特别是高于此范围表示一个有问题的实验，并建议T细胞的起始群体中非特异地在制备预活化。折叠在贴壁细胞中超过未刺激细胞的每个条件流动后可以除了百分之粘附的计算来计算的数目的增加。代表这两种计算方法的数据包括在这里。
图2A示出了流动室每个条件前和流动后内的字段的代表性图像。在实验前，Jurkat细胞（显示n的图2A）或原代人CD3 + T细胞是纯化的，计数，并用CFSE标记。每个实验条件2×10 6个细胞进行标记。未刺激的T细胞被装入含在SDF-1α的存在或不存在的CHO-ICAM细胞流腔室。 T细胞被允许移动和积聚在腔室5分钟，在这段时间内的图像被捕获，以确定流预计数。不同刺激之间可比较数量的细胞预流动是必不可少的，以确保均匀的实验条件。继5分钟由流动产生持续的剪切应力，图像捕获再次确定流后计数。正是通过SDF-1α增加能够粘附到CHO-ICAM细胞剪切应力下的T细胞的数量的这些代表图像明显。
图2B示出在T细胞粘附作为校准的倍数变化基于Jurkat T细胞的前，后的流或未受刺激或SDF-1α的存在数量culated。对于每一个状态5字段预流，并且平均细胞数5字段流后进行测定，和SDF-1α刺激的未刺激的比较来计算在T细胞粘附的倍数变化。如这里所示，SDF-1α诱导粘附的近2倍的增加相比未刺激。
图2C展示了数据计算的另一种方法。这里主要人CD3 + T细胞中SDF-1α的存在或不存在的百分比粘附是通过首先确定的平均前和流动后T细胞计数，然后除以流预平均流量后平均测定并通过100通过该计算整个流预填充乘以代表100％粘附性。如这里所示，未刺激的T细胞的15％在剪切下STRE附着分类与用SDF-1α刺激的T细胞的50％。
图1只分析暴露于同质流动面积是重要的。与何处字段应该被成像指示所使用的流动室的示意图。按照由厂家室提供的资料，预先设定的流量只能通过腔的中心，在这个示意图被橘表示实现。接近室的边界流速降低，不应该被包括在实验成像或分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. <强> SDF-1α 诱导的T细胞粘附至ICAM-1的剪切应力下。A. Jurkat T细胞分别以5μM的浓度用CFSE标记。接着，将细胞加载到预处理用SDF-1α（100毫微克/毫升）或无刺激，并设置在共聚焦显微镜并使其移动，积聚在腔室5分钟的流动腔室。可替代地，Jurkat T细胞用PMA（10毫微克/毫升）加入到流动室前进行预处理。纵观这5分钟预流动的图像被抓获。然后流程在0.4达因/厘米2发起的5分钟创建剪切应力。建成后，流后的图像被抓获。 Jurkat T细胞的代表性图像示，比例尺为50μm。B.在Jurkat T细胞的粘附折变化是通过首先确定平均前和流后的细胞计数为每个条件和除以平均流量后计数计算由平均流量预共单独为每个条件UNT。这对于每个刺激条件，这里的SDF-1α或PMA粘附商数，然后由未刺激的粘附商数分割，以确定在粘附的倍数变化。棒代表3个实验±初级人CD3 + T细胞的SEM。C.百分比粘附平均通过首先确定每个状态的平均值前和流后的细胞计数来计算。对于每个条件，平均流量后计数由平均流量预计再乘以100所得到的百分比粘附是基于预流动细胞计数为100％的粘合。酒吧代表的5个实验±SEM平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.ŧ细胞首先积累然后流过的CHO-ICAM单层。Jurkat T细胞分别以5μM的浓度用CFSE标记。接着，将细胞加载到预处理用SDF-1α（100毫微克/毫升），并设置在共聚焦显微镜并使其移动，积聚在腔室5分钟的流动腔室。在这些5分钟图像捕获为时间推移系列;静帧（A）。然后流程在0.4达因/厘米2发起的5分钟创建剪切应力。在这些5分钟图像捕获为时间推移系列;静帧（B）。在这些图像流的方向是从底部到顶部，并焦平面被设定在CHO-ICAM单层。 T细胞可以分为三组：（1）沿着在流速单层轧制T细胞被可视化为短，水平线从底部移动穿过场到顶部，因为它们被迅速移动，而被成像。 （2）T细胞crawlin沿着单层克这些细胞是基于流动阻力牢固地附着，并且抓取可能在搜索区域容许蜂窝通道，其未在此模型中观察到的。 （三）坚定不移地坚持单层T细胞，是抗流动，但动弹不得。这些细胞不积极滚动或沿所述单层爬行。一个更复杂的分析可以做到的基础上，研究目标，通过使用而设计的解剖进行进一步定量或鉴定这些细胞群的ImageJ的脚本。比例尺50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. CHO-ICAM细胞必须形成一个融合单层，一个融合的CHO-ICAM monolay的形象代表流室中呃。比例尺10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
为了适当地分析T细胞的粘附，将包括在该研究中的兴奋剂选择的体外方法时必须加以考虑。虽然有多种测定法来研究信号导致LFA-1的活化和ICAM-1的结合的方法都不能互换。静态粘附实验10是最适合于研究T细胞APC相互作用;另外，这里详细的剪切应力的方法是理想的模型T细胞上皮细胞间的相互作用在体内 ，趋化因子沿内皮提出，滚动T细胞必须牢牢坚持和抗血液的剪切应力流14,15回应。出于这个原因，趋化因子信号传导的研究是最适合于并入剪切应力的测定法进行研究。使用流动条件此密合性的主要优点是其在模拟T细胞和整联之间的相互作用的简单性。此法很独特地结合功能和机理通过模拟一个整合素粘附分子对的学习环境的研究。这种方法的另一个优势是它的适应性;此法可用于量化的任何粘附分子的任何白细胞的粘附。此方法可用于筛选的预期通过改变整联活化以改变T细胞招募和外渗多种药物或基因操作的效果。
如同任何的体外方法，有该测定的一些限制。该模型采用工程改造的CHO细胞，而不是刺激原代内皮细胞作为其他模型已经使用16虽然这给我们了解影响单一整合的激活状态的信号事件的能力，这也可以被认为是该模型的一个弱点。因为没有由CHO细胞中表达选择素，该测定在两个步骤完成。在第一个步骤（积累阶段），则T细胞被注入输入RESERVOIR在由最小的压力和毛细管力室和旅行到另一侧的一侧。可以在图3A中可以观察到的T细胞在这些5分钟的行为。 5分钟后，并在第二个步骤（流动相）的流速增加，细胞将开始滚动和附着。要注意的是不期间积累阶段注入在整个腔室中的输入储存器移动所有的T细胞，这些细胞就沿单层滚作为流量增加（图3B）是重要的。以这种方式，外渗的轧制阶段被人为提高，但并没有消除，在这种模式。
自贴壁细胞的最大数目是，进入到腔室输入细胞数的表达存在用于实验间原数变异性的潜力。而预流图像不完全代表100％的最大的T细胞群体，因为它们没有考虑到有分t时输入容器，它是在计算中包括特别是当单独计数两种不同的细胞类型是要比较的重要控制。此外，它不建议主鼓风淋巴细胞在单个变量粘附分析中使用。这就是说，通过T细胞受体（TCR）和/或共受体的T细胞，预刺激可能混淆的粘附感兴趣的治疗的效果。这些变量应该实验设计时加以考虑。同样地，与先前冷冻的PBMC功能性研究经常产生混淆的结果，并且因为这个原因的细胞系或新鲜分离的主要的PBMC最适用于该测定。理解未刺激粘附的正常基础水平为PBMC纳入研究是在确定的细胞群已被非特异性预先激活导致混淆的结果是至关重要的。
复制该测定精度，重要的是，一些步骤S IN的协议，包括沉降和流孵育时间，是在所有情况中精确和均匀的。在此相同的光，CHO-ICAM细胞必须被均匀地遍及所有的流动室（ 图4）和T细胞计数汇合还必须精确17在这些因素即使是很小的差异，可能在端影响细胞计数的精确度。该测定的一个未来的应用是一系列的细胞系单独表达选择素和粘附分子以扩大该方法的其它信号级联冲击的发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
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