Summary
Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.
Abstract
Overall, T-cel adhesie is een kritische component van functie bijdraagt aan de verschillende processen van cellulaire rekrutering op plaatsen van ontsteking en interactie met antigeen presenterende cellen (APC) bij de vorming van immunologische synapsen. Deze twee contexten van T cel adhesie verschil is dat T-cel-interacties APC kan statisch worden beschouwd, terwijl T-cel-interacties bloedvat worden geconfronteerd met de schuifspanning die door circulatie zelf. T-cel-interacties APC worden geclassificeerd als statisch, dat de twee mobiele partners statisch ten opzichte van elkaar. Meestal deze interactie plaatsvindt binnen de lymfeklieren. Als een T-cel interageert met de wand van het bloedvat, de cellen te arresteren en moet de gegenereerde shear stress te weerstaan. 1,2 Deze verschillen onderstrepen de noodzaak om beter te begrijpen statische hechting en hechting onder stroom voorwaarden als twee afzonderlijke wettelijke processen. De regulering van T-cel-adhesie kunnen de meeste bondig worden omschreven als controlling de affiniteitstoestand integrine moleculen tot expressie gebracht op het celoppervlak, en daardoor de interactie van integrinen met het adhesiemolecuul liganden op het oppervlak van de interagerende cellen reguleren. Onze huidige kennis van de regulatie van integrine affiniteit staten komt uit vaak simplistisch in vitro modelsystemen. De bepaling van adhesie middels stroming hier beschreven omstandigheden maakt de visualisatie en kwantificatie van T-cel-epitheliale cel interacties in real time volgen van een stimulus. Een hechting onder stroom test kan worden toegepast op studies van hechting signalering in T-cellen na behandeling met remmende of stimulerende stoffen. Bovendien kan deze test worden uitgebreid buiten T-cel signalering naar elke lijm leukocyten bevolking en eventuele integrine-adhesie molecuul pair.
Introduction
T lymfocyt adhesie medieert een aantal verschillende werkwijzen in een gezond immuunsysteem, 3 cruciale rol spelen in T celtransport en antigeenpresentatie. Of tijdens immune surveillance of een actieve immuunreactie beide brede rollen voor hechting kritisch. 4 Fysiologische signalering gebeurtenissen van T-cel-endotheelcelinteracties verschillen van T-cel-antigeen-presenterende cel (APC) interacties en vereisen daarom verschillende methodes studie om het best begrijpen de signalering cascades betrokken. De firma hechting van een T-cel naar een wand van het bloedvat tijdens lymfocyten extravasatie vereist een snelle en dynamische integrine activering. De nauwe interactie tussen een actieve toestand integrine en adhesiemoleculen aan het endotheel leidt tot hechting bestand tegen de bloedstroom, waardoor T-cellen te kruipen langs het oppervlak, op zoek naar een gebied permissief celpassage. 5 het doorzoeken van een T-cel bi -directionally alonga bloedvatwand is aangewezen op gepolariseerd hechting en is uitdrukkelijk kleefstof vooreinde van de T-cel. 6 Belangrijker, stevige adhesie en transmigratie bestand moeten zijn tegen de afschuifkracht opgewekt door circulerende bloedstroom.
Bij het ontwerpen van experimenten om lymfocyt adhesie studeren, moet aandacht worden besteed aan de specifieke stimulus van belang. Terwijl integrine activering een gemeenschappelijke en essentieel onderdeel van alle vormen van T-cel adhesie, de stromen van activering waarschijnlijk unieke stroomafwaarts van individuele receptoren en co-receptoren zijn. Evenzo, en integrine adhesiemoleculen paren functioneren in gespecialiseerde micro-omgevingen en specifieke subpopulaties. Zo kunnen deze paren heel verschillend geregeld. De hier gepresenteerde model is ideaal voor de studie van signalering cascades leidt aan integrine activering plaatsvindt onder schuifspanning omstandigheden. 7 Deze interacties kunnen niet adequaat worden opgevat in een statische lijm,betreffende systeem door het effect van deze krachten bleek direct bij hebben op T-cel gedrag. 8 Hoewel hier voorgesteld met T-cellen en CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen om humaan ICAM-1 (CHO-ICAM-cellen) tot expressie kan het systeem eenvoudig worden aangepast verschillende leukocyt populaties of adhesiemoleculen te bestuderen.
Deze analyse verschaft een werkwijze om T-cel hechting en integrine activering kwantificeren volgens afschuifspanning, die een model voor de stevige adhesie fase van extravasatie van leukocyten. Door het gebruik van CHO-cellen ICAM de affiniteit van LFA-1 voor zijn ligand in levende cellen in real time kan worden onderzocht in reactie op verschillende stimuli plaats. Deze techniek vereist gemakkelijk te verkrijgen, in de handel verkrijgbare micro-stromingskamers in combinatie met een spuitpomp, veel eenvoudiger de nodige bloedstroom en schuifspanning modelleren apparatuur in vergelijking met andere modellen. 9 Een ander groot voordeel van deze test is dat specifieke signaleringcascades en de resulterende activatie status van afzonderlijke integrinen kan netjes worden bestudeerd door het gebruik van gemanipuleerde CHO-cellen die humane adhesiemoleculen plaats. Bovendien is de combinatie van kwantitatieve gegevens beeldvorming van levende cellen is een belangrijk voordeel van deze methode. Overall, terwijl een aantal assays statische T celadhesie beschreven die mooi model T-cel-interacties APC, deze modellen zijn onvoldoende vastleggen van het dynamische proces van T-cel-epitheliale adhesie. Daarom, bij het kiezen van een adhesietest de stimulus opnieuw dienen te worden beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating de CHO-cellen ICAM
Opmerking: Het doel van deze stap is de CHO-cellen overnacht ICAM plaat in de stromingskamers groei met als doel het genereren van een confluente monolaag.
- Onderhouden CHO-ICAM-cellen in 10 cm weefselkweek behandelde kweekschalen in 10 ml RPMI medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (CHO-ICAM compleet kweekmedium) bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Om cellen te verzamelen, voeg 1 ml 0,5% trypsine-EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min onder zacht schudden. Neutraliseer de trypsine met 4 ml medium.
- Tel de CHO-ICAM-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 0,75 x 10 5 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment: 2,25 x 10 5 cellen nodig is om 3 kamers zaad.
- Centrifugeer 0,75 x 10 5 CHO-cellen ICAM per kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de celpellet in 30 gl per kamer van CHO-ICAM Volledige cultuur media.
Let op: In dit experiment wordt 90 ul nodig zijn om 3 kamers zaad. - Voeg langzaam de cellen in een reservoir van de stroom kamer. Laat de cellen te regelen voor 5 min in 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Voeg 200 ul van complete cultuur media over de twee reservoirs van elke kamer. Alternate toevoegingen tussen de twee bewegingen van de cellen te voorkomen als het systeem in evenwicht.
- Incubeer de cellen overnacht in een 37 ° C incubator met 5% CO2.
2. Bereiding van de T-cellen
Opmerking: Deze test kan worden uitgevoerd met primaire humane T-cellen of T-cellijn. Een protocol op T-cel-isolatie van bloed is eerder beschreven. 10 Bij gebruik van primaire menselijke T-cellen te gebruiken vers geïsoleerde cellen voor het beste resultaat. Bij gebruik van een T-cellijn, volgt de cultuurprotocol door de bron van de cellen. Om de cellen op een fluorescerende Micr detecterenpe de T-cellen gelabeld met carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE).
- Tel de T-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 2 x 10 6 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment wordt 6 x 10 6 cellen nodig voor 3 kamers.
- Centrifugeer 2 x 10 6 cellen per T kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de cellen in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% glucose en 2% FBS.
- Voeg CFSE bij 1: 1000 verdunning (voorraad gemaakt tot 5 mm). Bedek tegen licht en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur
- Spin bij 500 xg gedurende 5 min, RT.
- Resuspendeer celpellet met 240 ul per staat (zie hoofdstuk 4 "Note") RPMI media ontbreekt serum. In dit experiment, resuspendeer de celpellet in 720 ui RPMI vlakte. Verdeel de cellen in lege 1,5 ml buisjes gelabeld voor elke kamer, 240 ul per buis. Houd cellen in een 37 ° C verwarmen blok tot gebruik.
3. Het opzetten van the Input / Output Hosing en -spuitpomp
- Verwarm de microscoop live-imaging kamer tot 37 ° C.
- Bereid de ingang schoonspuiten:
- Vul een 500 ml glazen fles met water en maak 2 gaten in het deksel. Label de gaten "in" en "out." Deze zal fungeren als een verwarmen van water bad voor de input media.
- De ingangsstroomkabels schoonspuiten door de gaten in het deksel en in het waterbad. Zorg ervoor dat de zijde van het schoonspuiten die aansluit op de spuit komt door de "in" gat en de kant die zal aansluiten op de ingang reservoir komt door de "out" gat.
- Spoel de input schoonspuiten met 60 ml water om alle lucht uit het systeem te verwijderen.
- Prime de ingang afspuiten met RPMI medium zonder serum verwarmd tot 37 ° C. Vul een 60 ml spuit en duwen door de media tot het schoonspuiten is volledig gegronde en het ontbreekt aan eventuele luchtbellen.
Opmerking: Afhankelijk van de length slang gebruikt het volume dat nodig is om prime zal variëren.- Bereken de hoeveelheid media die nodig zijn voor het experiment van de stroomsnelheid (hier 0,3 ml / min) te vermenigvuldigen met het aantal minuten (5 min) van het aantal kamers in het experiment (hier 3); in dit experiment gebruikt 4,5 ml media. Let op: Wij raden met 5 ml extra volume (hier in totaal 9,5 ml) die nog in de spuit na priming.
- Plaats het gehele ingangsinstelling in de levende beeldvorming behuizing van de microscoop 37 ° C te houden. Voer het schoonspuiten en spuit uit de behuizing en plaats de injectiespuit in de injectiepomp.
- Bereid de uitgang schoonspuiten:
- Een gat in het deksel van de fles 250 ml te gebruiken als output afval.
- Voer het uitgangsbuizen door het gat en in de fles. Losjes zet de deksel niet helemaal sluiten.
- Leg de output setup in de live-imaging omheining van het microscope.
- Bereken het debiet (ml / min) moet de gewenste schuifspanning (dyn / cm 2) genereren. Schuifspanning varieert in verschillende vasculaire compartimenten, neem dan ook rekening gehouden met de algemene model met inbegrip van celtypen te onderzoeken en behandelingen bij de besluitvorming over een shear stress-niveau.
Let op: Deze experimenten worden uitgevoerd bij 0,4 dyn / cm2 om nauw samen te bootsen een kleine ader setting.- Neem de kamer afmetingen rekening gehouden bij de berekening van shear stress. Gebruik de volgende formule (verstrekt door de fabrikant 11) voor de stroom kamers hier gebruikt (zie tabel of Materials): T = η * 176,1 * ø waarbij T = shear stress, η = dynamische viscositeit, ø = debiet. Opmerking: De dynamische viscositeit van RPMI medium bij 37 ° C is 0,007.
4. Laden van de Flow Chambers en stimulatie van de cellen
Let op: Om hechting te leiden,T-cellen worden gestimuleerd. In het volgende experiment wordt de ongestimuleerde cellen ofwel blijven of worden gestimuleerd met SDF-1α 12 of forbolmyristaatacetaat (PMA; positieve controle) 13. Voor een juiste weergave van chemokine T-cel, zijn CHO-ICAM-cellen gepreïncubeerd met SDF-1α (serieel gevolgd door wassen), waardoor de presentatie op het celoppervlak. PMA is een forbolester die structureel vergelijkbaar met de tweede boodschapper diacylglycerol (DAG); hier wordt gebruikt als een positieve controle. T-cellen worden direct behandeld met PMA vóór het laden in de stromingskamer.
- Plaats de stroom kamer dia op de microscoop en zet de focal plane op de CHO-ICAM monolaag met behulp van de 20X objectief.
- Houd CFSE-gekleurde T-cellen voor alle andere voorwaarden in de 37 ° C verwarmen blok. Bereid de CHO-ICAM of T-cellen vóór de test voor deze voorwaarde als volgt:
- Voor de niet gestimuleerde toestand (kamer 1), houdt één buis / stroom chamber onbehandeld, als negatieve controle voor stimulatie dienen.
- PMA stimulatie (kamer 2) stimuleren een buis van T-cellen met PMA (10 ng / ml) als positieve controle te dienen; behandel onmiddellijk vóór het laden in de stroom kamer.
- Voor SDF-1α stimulatie, (kamer 3) stimuleren de derde stromingskamer met SDF-1α (100 ng / ml) door 70 gl per keer 3 keer uit het bovenste reservoir (output reservoir) en vervolgens toevoegen van 70 gl SDF -1α (100 ng / ml) in het onderste reservoir (input reservoir). Incubeer gedurende 5 min.
- Verwijder en gooi 70 ul op een moment 3 keer van de uitgang reservoir van één kamer.
- Voeg 70 ul van voorbehandeld (indien van toepassing) T celsuspensie in de ingang reservoir 3 maal. Wacht 5 minuten om de cellen om van de inlaat van de kamer ( "In"), en de proximale uitlaat ( "Out") van de kamer bereiken.
- Gedurende deze tijd, afbeelding 5velden CFSE-gekleurde T-cellen. Kies velden die gedurende het midden van de kamer (figuur 1) worden gedispergeerd. Gebruik de volgende excitatie / emissie voorwaarden: excitatie laser golflengte: 488 nm; emissie collectie filter: 500 - 540 nm. Deze beelden zullen dienen als de pre-flow-cel-tellingen.
- Bevestig de input en output buizen tegelijkertijd de stromingskamer reservoirs.
Opmerking: Bevestigen van de buis gelijktijdig is cruciaal om geen luchtbellen te introduceren in de kamer en bewaard bleef evenwicht binnen de kamer. - Begin stroom bij 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), terwijl het visualiseren van de CFSE-gekleurde T-cellen. Als er stroming, vooral met de eerste kamer, er vaak verloren gaat tussen de stroom en observeren T cel rollen dus beginnen timing 5 min bij aanvang van T-cel beweging.
- Beëindigen flow na 5 min, en het beeld 5 velden in de CFSE kanaal. Kies velden willekeurig verspreid throughout het centrum van de stromingskamer (figuur 1). Deze beelden zullen dienen als de post-stroom cel telt.
5. Het bepalen van de Percentage van de hechtende cellen
Noot: Bepaling van het aantal cellen in de verkregen beelden objectief gebeurt met geautomatiseerde software. Voor onze studies gebruikten we de software Volocity (versie 6.2.1), maar ook andere software zoals ImageJ (Version 1.48V) zijn eveneens toepasbaar.
- Bepaal het aantal cellen per veld pre-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het "pre-stromingsgemiddelde celtelling." 7
- Bepaal het aantal cellen per veld post-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het "post-stromingsgemiddelde celtelling." 7
- Bereken het percentage hechtende cellen met de volgende formule: percentage hechtende cellen = (na stromingsgemiddelde celtelling) / (pre-stromingsgemiddelde celtelling) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden weergegeven van de stroom adhesietest behulp Jurkat en primaire humane CD3 + T-cellen, zoals aangegeven, gestimuleerd met SDF-1α. De negatieve controles in elke getoonde experimenten ongestimuleerde cellen. Een drempel basale procent adhesie van ongestimuleerde cellen tussen 5 - 10%; base hechting met name boven deze range duidt op een problematische experiment en stelt het begin populatie van T-cellen werden niet-specifiek pre-geactiveerde in voorbereiding. Voudige toename van het aantal hechtende cellen na doorstroming per conditie dan die van niet-gestimuleerde cellen kan naast de berekening van het percentage hechting berekend. Gegevens die deze twee berekeningsmethoden is hier opgenomen.
Figuur 2A toont representatieve beelden van velden binnen de stroom kamer voor elke conditie pre- en post-flow. Voorafgaand aan het experiment, Jurkat (toonn in figuur 2A) of primaire humane CD3 + T-cellen gezuiverd, geteld en gemerkt met CFSE. Voor elke experimentele conditie werden 2 x 10 6 cellen gelabeld. Niet gestimuleerde T-cellen werden in stroomkamers die CHO-ICAM-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van SDF-1α. De T-cellen werden toegestaan te bewegen en accumuleren in de kamer gedurende 5 minuten, en gedurende deze tijd beelden zijn opgeslagen op de pre-flow tellingen te bepalen. Een vergelijkbaar aantal cellen pre-stroming tussen de verschillende prikkels essentieel uniforme experimentele omstandigheden te verzekeren. Na 5 min van continue shear stress opgewekt door stroming, werden beelden weer gevangen genomen om post-stroom tellingen te bepalen. Het getuige deze representatieve beelden die SDF-1α verhoogt het aantal T-cellen kunnen hechten aan de CHO-ICAM cellen onder schuifspanning.
Figuur 2B toont de voudige verandering in T-celadhesie als calkend gebaseerd op het aantal Jurkat T-cellen voor en na de stroom te gestimuleerde of in aanwezigheid van SDF-1α. Voor elke omstandigheid het gemiddelde celtellingen van 5 velden pre-flow en 5 velden na stroom werden bepaald, en een vergelijking van SDF-1α stimulatie ongestimuleerde wordt gebruikt voudige verandering in T-celadhesie berekenen. Zoals hier getoond, SDF-1α induceert een bijna 2-voudige toename in vergelijking met ongestimuleerde hechting.
Figuur 2C toont een alternatieve berekeningsmethode data. Hier het percentage hechting van primaire humane CD3 + T-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van SDF-1α wordt bepaald door eerst het gemiddelde voor en na doorstroming T celtellingen, vervolgens te delen de post-stromingsgemiddelde door de pre-stromingsgemiddelde en vermenigvuldigen met 100. door deze berekening de volledige pre-flow bevolking vertegenwoordigt 100% hechting. Zoals hier getoond, 15% van de gestimuleerde T-cellen hechten onder afschuiving stress vergeleken met 50% van T-cellen gestimuleerd met SDF-1α.
Figuur 1. Het is belangrijk om alleen gebieden met een homogene stroom te analyseren. Schematische weergave van de stroomkamers gebruikt indicatie waar velden moeten worden afgebeeld. Per informatie die door de kamer fabrikanten, is de vooraf ingestelde stroomsnelheid alleen bereikt door het centrum van de kamers, aangegeven met oranje in dit schema. Dichter bij de grenzen van de kamer de stroomsnelheid afneemt en moet niet worden opgenomen in de experimentele imaging of analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. <strong> SDF-1α induceert T cel adhesie aan ICAM-1 onder schuifspanning. A. Jurkat T-cellen werden gelabeld met CFSE in een concentratie van 5 uM. Vervolgens werden de cellen geladen in de stroomkamers die werden voorbehandeld met SDF-1α (100 ng / ml) of ongestimuleerde en opstelling op de confocale microscoop en men laat bewegen en accumuleren in de kamer gedurende 5 minuten. Alternatief werden Jurkat T-cellen voorbehandeld met PMA (10 ng / ml) voorafgaand aan toevoeging aan de stroomkamers. Gedurende die 5 min pre-flow beelden werden gevangen genomen. Stroom werd vervolgens gestart met 0,4 dyn / cm2 schuifspanning creëren 5 min. Na voltooiing, werden post-stroom opnamen. Representatieve beelden van Jurkat T-cellen worden getoond, schaalbalk 50 micrometer. B. voudige verandering in hechting van Jurkat T-cellen werd berekend door eerst het gemiddelde voor en na de stroomcel telt voor elke voorwaarde en verdelen van de gemiddelde post-stroom count het gemiddelde pre-flow count afzonderlijk voor elke conditie. Deze hechting quotiënt voor elk stimulatiekanaal conditie, hier SDF-1α of PMA, wordt vervolgens gedeeld door de gestimuleerde hechting quotiënt de veelvoudverandering hechting te bepalen. Staven stellen gemiddelde van 3 experimenten ± SEM. C. Het percentage hechting van primaire humane CD3 + T-cellen werd berekend door eerst het gemiddelde voor en na de stroomcel telt voor elke conditie. Voor elke voorwaarde, wordt het gemiddelde na stroom count gedeeld door het gemiddelde pre-flow tellen en vermenigvuldigd met 100. Het verkregen percentage hechting is gebaseerd op de pre-flow celtelling zijnde 100% hechting. Bars vertegenwoordigen gemiddeld 5 experimenten ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. TCellen eerst ophopen stroomt dan via CHO-ICAM monolaag. Jurkat T-cellen werden gelabeld met CFSE in een concentratie van 5 uM. Vervolgens werden de cellen geladen in de stroomkamers die werden voorbehandeld met SDF-1α (100 ng / ml) en ingesteld op de confocale microscoop en men laat bewegen en accumuleren in de kamer gedurende 5 minuten. Gedurende deze 5 min beelden werden gevangen genomen als een time-lapse-serie; stilstaande beelden (A). Stroom werd vervolgens gestart met 0,4 dyn / cm2 schuifspanning creëren 5 min. Gedurende deze 5 min beelden werden gevangen genomen als een time-lapse-serie; stilstaande beelden (B). De doorstroomrichting van deze beelden wordt van beneden naar boven, en het brandpuntsvlak is ingesteld op de CHO-ICAM monolaag. T-cellen kunnen worden onderverdeeld in 3 groepen: (1) T-cellen rollen langs de monolaag met een debiet worden gevisualiseerd als korte, horizontale lijnen die zich van onder naar boven over het gebied aangezien zij snel bewegen terwijl ze afgebeeld. (2) T-cellen CrawlinG langs de monolaag. Deze cellen zijn stevig gehecht op basis van de stromingsweerstand en kruipen waarschijnlijk op zoek naar een gebied tolerante cellulaire passage, die niet wordt waargenomen in dit model. (3) T-cellen die stevig tegen de monolaag, resistent te stromen, maar beweeglijk. Deze cellen zijn niet actief walsen of kruipen langs de monolaag. Een meer verfijnde analyse kan worden uitgevoerd op basis van de doelstellingen van de studie, door middel van een script ImageJ beoogd deze celpopulaties voor verdere karakterisering en kwantificering ontleden. Schaal bars 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. CHO-ICAM cellen moeten een confluente monolaag te vormen. Representatief beeld van een confluente CHO-ICAM monolayer binnen een stromingskamer. Schaal bar 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om goed te analyseren T celadhesie, de stimulans voor opname in de studie moet worden overwogen bij het kiezen van een in vitro werkwijze. Hoewel er verschillende assays om signalen leidt tot LFA-1 activering en ICAM-1 bindende bestuderen alle methoden zijn niet uitwisselbaar. Een statische hechting assay 10 is het meest geschikt voor T-cel-APC interacties te bestuderen; Als alternatief kan de shear stress methode die hier beschreven is ideaal om T-cel-epitheliale cel interacties te modelleren. In vivo, zoals chemokines worden gepresenteerd samen het endotheel, glooiende T-cellen moeten reageren door stevig vast te houden en het weerstaan van de shear stress van de bloedstroom 14,15. Daarom is de studie van chemokine signalering meest geschikt worden onderzocht in een test die schuifspanning opgenomen. Het belangrijkste voordeel van deze adhesie middels stromingsomstandigheden is de eenvoud in het modelleren van de interacties tussen T-cellen en integrinen. Deze test combineert zeer unieke functie en mechanistischestudies door het modelleren van een omgeving voor de studie van een integrine-adhesiemolecuul paar. Een ander sterk punt van deze methode is zijn aanpassingsvermogen; Deze methode kan worden toegepast om de hechting van elke leukocyt kwantificeren één adhesiemolecuul. Deze methode kan worden gebruikt om het effect van verschillende geneesmiddelen of genetische manipulaties wordt naar T cel recrutering en extravasatie veranderen met veranderde integrine activering screenen.
Zoals bij elke in vitro werkwijze, zijn er enkele beperkingen van deze test. Dit model maakt gebruik van gemanipuleerde CHO-cellen en niet gestimuleerde primaire endotheelcellen andere modellen gebruikt. 16 Hoewel dit geeft ons de mogelijkheid om de signalering gebeurtenissen beïnvloeden van de activeringsstatus van een integrine begrijpen, kan dit ook worden beschouwd als een zwakte van het model. Aangezien er geen selectinen door CHO-cellen tot expressie gebracht, wordt de test uitgevoerd in twee stappen. Tijdens de eerste stap (de accumulatie fase), worden de T-cellen geïnjecteerd in de ingang reservoir aan één zijde van de kamer en naar de andere zijde van minimale druk en capillaire krachten. Het gedrag van de T-cellen gedurende deze 5 min worden waargenomen in figuur 3A. Na 5 min, en in de tweede stap (de fase stroming) het debiet wordt verhoogd en de cellen begint te rollen en hechten. Het is belangrijk op te merken dat niet alle T-cellen tijdens de accumulatie fase naar de ingang reservoir bewegen over de kamer geïnjecteerd en deze cellen rollen langs de monolaag als stroom wordt verhoogd (Figuur 3B). Op deze wijze wordt de walsstap extravasatie kunstmatig verbeterd, maar niet geëlimineerd, in dit model.
Aangezien het maximum aantal hechtende cellen is een uitdrukking van het aantal van de input cellen die in te voeren in de kamer is er de mogelijkheid voor ruwe aantal variatie tussen experimenten. Terwijl de preflow beelden niet volledig vertegenwoordigen de maximale 100% T-celpopulatie omdat ze geen rekening account de ingang reservoir is een belangrijke controle bij berekeningen bevatten, vooral wanneer twee verschillende celtypen afzonderlijk geteld moeten worden vergeleken. Bovendien wordt afgeraden blast primaire lymfocyten worden gebruikt in een enkele variabele hechting analyse. Dat wil zeggen, pre-stimulatie van T-cellen door T-celreceptoren (TCR) en / of co-receptoren kan het effect van de behandeling plaats op adhesie verwarren. Deze variabelen moeten tijdens de experimentele opzet worden overwogen. Evenzo functionele studies met eerder ingevroren PBMC leiden steeds verwarrende resultaten, en daarom cellijnen of primaire vers geïsoleerde PBMCs werkt het beste als deze assay. Inzicht in de normale basisniveau van ongestimuleerde PBMC lijmen voor de in de studie opgenomen is essentieel in het identificeren van een celpopulatie die is aspecifiek vooraf geactiveerde leidt tot verwarrende resultaten.
Om deze test nauwkeurig repliceren, is het essentieel dat een bepaald onderdeels in het protocol, zoals het bezinken en stroming incubatietijden, zijn nauwkeurige en uniforme onder alle omstandigheden. Bij deze bedekt MOET CHO-ICAM-cellen uniform worden confluent ganse stroomkamers (figuur 4) en de T-cel tellingen moet nauwkeurig zijn. 17 Zelfs kleine verschillen in deze factoren invloed kunnen nauwkeurig celtellingen in het einde. Een toekomstige toepassing van deze test is de ontwikkeling van een reeks cellijnen afzonderlijk tot expressie selectinen en adhesiemoleculen het effect van deze methode om andere signaaltransductiecascades breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
