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Immunology and Infection

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

doi: 10.3791/54203 Published: June 29, 2016

Summary

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Abstract

Nel complesso, l'adesione cellulare T è un componente critico della funzione, contribuire ai processi distinti di assunzione cellulare per siti di infiammazione e di interazione con cellule presentanti l'antigene (APC) nella formazione di sinapsi immunologica. Questi due contesti di adesione delle cellule T si differenziano che T interazioni cellula-APC può essere considerato statico, mentre le interazioni dei vasi cellule T del sangue sono sfidati dal shear stress generato da circolazione stessa. interazioni cellule T-APC sono classificati come statico dal fatto che i due partner cellulari sono relative statico a vicenda. Solitamente, questa interazione avviene nei linfonodi. Come una cellula T interagisce con la parete dei vasi sanguigni, le cellule arrestano e devono resistere alla sollecitazione di taglio generate. 1,2 Queste differenze evidenziano la necessità di comprendere meglio l'adesione statica e aderenza in condizioni di flusso come due processi normativi distinti. Il regolamento di adesione delle cellule T possono essere più succintamente descritta come contraina stato affinità delle integrine molecole espresse sulla superficie cellulare, e regolando così l'interazione delle integrine con leganti molecola di adesione espresse sulla superficie della cellula interagenti. La nostra attuale comprensione del regolamento di integrine stati affinità viene dal spesso semplicistico nei sistemi modello in vitro. Il saggio di adesione con condizioni di flusso qui descritte permette la visualizzazione e la quantificazione precisa delle cellule epiteliali interazioni delle cellule T in tempo reale dopo uno stimolo. Un'adesione sotto test flusso può essere applicata a studi di aderenza segnalazione all'interno delle cellule T dopo il trattamento con sostanze inibenti o stimolatori. Inoltre, questo test può essere espansa al di là di segnalazione delle cellule T a qualsiasi popolazione adesiva leucociti e qualsiasi coppia molecola di integrina-adesione.

Introduction

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T adesione dei linfociti media una serie di processi distinti in un sistema immunitario sano, 3 giocare un ruolo critico nel traffico delle cellule T e presentazione dell'antigene. Sia durante la sorveglianza immunitaria o una risposta immunitaria attiva queste due grandi ruoli per l'adesione sono fondamentali. 4 Gli eventi di segnalazione fisiologiche di cellule endoteliali interazioni delle cellule T sono distinti da cellule T che presentano l'antigene delle cellule (APC) interazioni, e quindi richiedono metodi distinti di studio per comprendere meglio le cascate di segnalazione coinvolte. La ferma adesione di una cellula T a una parete del vaso sanguigno durante linfociti stravaso richiede l'attivazione rapida e dinamica integrina. La stretta interazione tra uno stato attivo integrine e di adesione molecole lungo l'endotelio conduce alla resistenza al flusso di sangue adesione, consentendo alle cellule T per strisciare lungo la superficie alla ricerca di un'area permissivo per il passaggio delle cellule. 5 La scansione di un bi cellule T -directionally alonga parete dei vasi sanguigni è legato alla adesione polarizzato, con una distinta adesiva estremità anteriore della cellula T. 6 Soprattutto, ferma adesione e la trasmigrazione richiedono resistenza alla forza di taglio generata dal flusso di sangue circolante.

Durante la progettazione di esperimenti per studiare l'adesione dei linfociti, occorre prestare attenzione allo stimolo specifico di interesse. Mentre integrina attivazione è un componente comune e critica di tutte le forme di adesione cellulare T, le cascate di attivazione sono suscettibili di essere unico valle dei singoli recettori e corecettori. Allo stesso modo, le coppie integrina e molecola di adesione funzionano in microambienti specializzate e su sottopopolazioni specifiche. In questo modo, queste coppie possono essere regolati in modo diverso. Il modello qui presentato è l'ideale per lo studio delle cascate di segnalazione che portano alla integrina attivazione che si svolgono in condizioni di stress di taglio. 7 Queste interazioni non può essere adeguatamente compreso in un Pellicole staticail sistema a causa dell'impatto hanno dimostrato queste forze di avere direttamente sul comportamento delle cellule T. 8 Anche qui presentata con le cellule T e le cellule CHO (ovaio di criceto cinese) ingegnerizzate per esprimere (cellule CHO-ICAM) umana ICAM-1, il sistema può essere facilmente modificato per studiare diverse popolazioni dei leucociti o molecole di adesione.

Questa analisi fornisce un metodo per quantificare l'adesività delle cellule T e l'attivazione delle integrine con sforzo di taglio, fornendo un modello per lo stadio ferma adesione dei leucociti stravaso. Attraverso l'uso di cellule CHO-ICAM l'affinità di LFA-1 per il suo ligando in cellule vive può essere esaminata in tempo reale in risposta a vari stimoli di interesse. Questa tecnica richiede facilmente ottenuta, disponibili in commercio camere di micro-flusso in combinazione con una pompa a siringa, semplificando notevolmente l'attrezzatura necessaria per modellare il flusso sanguigno e sollecitazione di taglio rispetto ad altri modelli. 9 Un altro importante vantaggio di questo saggio è che la segnalazione specificacascate e lo stato di attivazione risultante singoli integrine possono essere pulito studiate attraverso l'uso di cellule CHO ingegnerizzate esprimono molecole di adesione umani di interesse. Inoltre, la combinazione di dati quantitativi con cellule vive è un significativo vantaggio di questo metodo. Nel complesso, mentre sono stati descritti una serie di saggi di adesione cellulare T statica che ben modellare le interazioni delle cellule T-APC, questi modelli non sono sufficienti a catturare il processo dinamico di adesione delle cellule epiteliali-T. Per questo motivo, quando si sceglie un saggio di adesione deve essere considerato lo stimolo in questione.

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Protocol

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1. placcatura le cellule CHO-ICAM

Nota: Lo scopo di questa fase è quello piastra cellule CHO-ICAM nelle camere di flusso per la crescita notte con l'obiettivo di generare un monostrato confluente.

  1. Mantenere le cellule CHO-ICAM a 10 cm di tessuto-coltura trattata piatti della cultura in 10 ml di mezzi RPMI con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (CHO-ICAM completa terreni di coltura) a 37 ° C con 5% CO 2.
  2. Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto agitando delicatamente. Neutralizzare la tripsina con 4 ml di media.
  3. Contare le cellule CHO-ICAM utilizzando un emocitometro e calcolare 0.75 x 10 5 cellule per camera. Nota: In questo esperimento: saranno necessari 2,25 x 10 5 cellule per seminare 3 camere.
  4. Centrifuga 0,75 x 10 5 cellule CHO-ICAM per camera per 5 minuti a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 30 ml per camera di CHO-ICAM Terreni di coltura completo.
    Nota: In questo esperimento saranno necessari 90 ml di sementi 3 camere.
  5. Aggiungere lentamente le cellule in un serbatoio della camera di flusso. Permettono alle cellule di stabilirsi per 5 minuti nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2.
  6. Aggiungere 200 ml di terreni di coltura completo tra i due serbatoi di ciascuna camera. aggiunte alternare tra i due per evitare il movimento delle cellule, come il sistema equilibra.
  7. Incubare le cellule durante la notte all'interno di un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2.

2. Preparazione delle cellule T

Nota: Questo test può essere fatto con le cellule umane T primarie o una linea cellulare T. Un protocollo su isolamento delle cellule T da sangue è stato descritto in precedenza. 10 Se si utilizzano cellule T umane primarie utilizzano cellule appena isolate per i migliori risultati. Se si utilizza una linea cellulare T, seguire il protocollo coltura specificato dalla fonte delle cellule. Al fine di individuare le cellule su un microsco fluorescentepe le cellule T sono etichettati con carbossi estere succinimidyl fluoresceina (CFSE).

  1. Contare le cellule T utilizzando un emocitometro e calcolare 2 x 10 6 cellule per camera. Nota: In questo esperimento, saranno necessari 6 x 10 6 cellule per 3 camere.
  2. Centrifugare 2 x 10 6 cellule per T camera per 5 min a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di glucosio o 2% FBS.
  3. Aggiungere CFSE a 1: 1.000 diluizione (magazzino fatta a 5 mm). Coprire dalla luce e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente
  4. Spin a 500 xg per 5 minuti, RT.
  5. Risospendere il pellet cellulare con 240 pl per condizione (vedere il paragrafo 4 "Note") di RPMI mezzi privi di siero. In questo esperimento, risospendere il pellet cellulare in 720 ml di pianura RPMI. Dividere le celle vuote in provette da 1,5 ml etichettate per ciascuna camera, 240 ml per provetta. Mantenere le cellule in un blocco C di calore 37 ° fino al momento dell'uso.

3. Impostazione °e Input / Output condutture e pompa a siringa

  1. Riscaldare il microscopio dal vivo camera di imaging a 37 ° C.
  2. Preparare il tubazioni di ingresso:
    1. Riempire una bottiglia di vetro da 500 ml con acqua e fare 2 fori nel coperchio. Etichettare i fori "in" e "out". Questo fungerà da un bagno di acqua di riscaldamento per i mezzi di ingresso.
    2. Eseguire l'ingresso getti attraverso i fori del coperchio e nel bagno d'acqua. Assicurarsi che il lato della tubazioni che collega alla siringa passa attraverso il "in" foro e la parte che si collega al serbatoio di ingresso passa attraverso il "out" buco.
    3. Lavare l'ingresso getti con 60 ml di acqua per rimuovere l'aria dal sistema.
    4. Primo l'ingresso getti con i media RPMI privo di siero riscaldato a 37 ° C. Riempire una siringa da 60 ml e spingere attraverso i media fino a quando il tubazioni è completamente innescato e privo di eventuali bolle d'aria.
      Nota: A seconda del length di tubo utilizzato il volume richiesto per primo varierà.
      1. Calcolare il volume del supporto necessari per l'esperimento moltiplicando la velocità del flusso (qui 0,3 ml / min) per il numero di minuti (5 min) per il numero di camere nell'esperimento (qui 3); in questo esperimento, utilizzare 4,5 ml media. Nota: Si consiglia con 5 ml di volume extra (qui per un totale di 9,5 ml) rimanendo nella siringa dopo aver riempito.
    5. Posizionare l'intera impostazione di ingresso nel recinto di immagini dal vivo del microscopio per mantenere 37 ° C. Eseguire il tubazioni e la siringa fuori del recinto e caricare la siringa nella pompa a siringa.
  3. Preparare il tubazioni di uscita:
    1. Effettuare un foro nel coperchio di una bottiglia da 250 ml da utilizzare come rifiuti uscita.
    2. Eseguire il tubo di uscita attraverso il foro e nella bottiglia. Liberamente fissare il coperchio, non chiudere tutta la strada.
    3. Posizionare la messa a punto di uscita nel recinto di immagini dal vivo del microscope.
  4. Calcolare la portata (ml / min) necessario per generare la tensione di taglio desiderata (dyn / cm 2). Lo sforzo di taglio varia nei diversi compartimenti vascolari, quindi prendere in considerazione il modello globale che comprende tipi di cellule da studiare e trattamenti momento di decidere su un livello di stress di taglio.
    Nota: Questi esperimenti sono condotti a 0,4 dine / cm 2 per imitare da vicino un piccolo ambiente vena.
    1. Prendere le dimensioni della camera in considerazione nel calcolo sforzo di taglio. Utilizzare la seguente formula (fornita dal produttore 11) per le camere a flusso usati qui (vedi Tabella dei Materiali): T = η * 176,1 * ø dove lo stress T = taglio, η = viscosità dinamica, ø = portata. Nota: La viscosità dinamica dei media RPMI a 37 ° C è 0.007.

4. Caricamento delle Camere di flusso e stimolazione delle cellule

Nota: Al fine di avviare l'adesione,Le cellule T devono essere stimolati. Nel seguente esperimento le cellule o rimanere non stimolata o vengono stimolati con SDF-1α 12 o acetato forbolo miristato (PMA; controllo positivo) 13. Per una corretta presentazione delle chemochine a cellule T, cellule CHO-ICAM sono preincubate con SDF-1α (seguito da lavaggi di serie), che consente per la presentazione sulla superficie cellulare. PMA è un estere del forbolo che è strutturalmente simile al secondo messaggero diacil glicerolo (DAG); qui viene utilizzato come controllo positivo. Le cellule T sono direttamente trattati con PMA prima del caricamento nella camera di flusso.

  1. Posizionare il vetrino camera di flusso sul microscopio e impostare il piano focale sul monostrato CHO-ICAM con l'obiettivo 20X.
  2. Mantenere le cellule T CFSE-colorate per tutte le altre condizioni del blocco C di calore 37 °. Preparare le cellule CHO-ICAM o T come segue immediatamente prima del test per la condizione:
    1. Per la condizione non stimolato (camera 1), tenere un tubo / ch flussoambra non trattata, per servire come controllo negativo per la stimolazione.
    2. Per la stimolazione PMA (camera 2), di stimolare un tubo di cellule T con PMA (10 ng / ml) per servire come controllo positivo; il trattamento subito prima di caricare in camera di flusso.
    3. Per la stimolazione SDF-1α, (camera 3), stimolano la terza camera di flusso con SDF-1α (100 ng / ml) rimuovendo 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio superiore (serbatoio output) e quindi aggiungendo 70 ml di SDF -1α (100 ng / ml) nella (serbatoio ingresso) inferiore serbatoio. Incubare per 5 min.
  3. Rimuovere e gettare 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio di uscita di una camera.
  4. Aggiungere 70 ml di sospensione pre-trattati (a seconda dei casi) delle cellule T nel serbatoio di ingresso 3 volte. Attendere 5 min per permettere alle cellule di muoversi dalla ingresso della camera ( "In"), e per raggiungere l'uscita prossimale ( "Out") della camera.
  5. Durante questo tempo, immagine 5campi per le cellule T CFSE-macchiati. Scegliere campi che sono dispersi in tutto il centro della camera (Figura 1). Utilizzare le seguenti condizioni di eccitazione / emissione: eccitazione lunghezza d'onda del laser: 488 nm; filtro di raccolta di emissione: 500 - 540 nm. Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule pre-flow.
  6. Collegare il tubo di ingresso e uscita contemporaneamente ai serbatoi camera di flusso.
    Nota: fissaggio della tubazione contemporaneamente è critico in modo da non introdurre bolle d'aria nella camera e mantenere equilibrio globale entro la camera.
  7. Inizia flusso a 0,3 ml / min (0,4 dine / cm 2), mentre la visualizzazione delle cellule T CFSE-macchiati. Come flusso comincia, soprattutto con la prima camera, vi è spesso un ritardo tra l'avvio del flusso e osservando rotolamento delle cellule T, quindi iniziare a cronometrare 5 min all'inizio del movimento delle cellule T.
  8. Termina flusso dopo 5 min, e di immagine 5 campi nel canale CFSE. Scegli campi dispersi casualmente throughout centro della camera di flusso (Figura 1). Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule post-flow.

5. determinazione della percentuale di cellule aderenti

Nota: Determinazione del numero delle cellule nelle immagini acquisite avviene oggettivamente con software automatizzato. Per i nostri studi abbiamo utilizzato il software Volocity (versione 6.2.1), ma altri software come ImageJ (versione 1.48V) sono applicabili anche.

  1. Determinare il numero di cellule per campo pre-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il "numero di celle media pre-flow." 7
  2. Determinare il numero di cellule per campo post-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il "numero di celle media post-flow." 7
  3. Calcolare la percentuale di cellule aderenti utilizzando la seguente formula: Percentuale di cellule aderenti = (post-flow conteggio medio delle celle) / (numero di cellule media pre-flow) x 100%.

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Representative Results

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Risultati rappresentativi sono mostrati dal saggio di adesione flusso utilizzando Jurkat e cellule T CD3 umani primari, come indicato, stimolate con SDF-1α. I controlli negativi in ​​tutti gli esperimenti riportati sono cellule non stimolate. Una adesione soglia basale percentuale di cellule non stimolate è compresa tra 5 - 10%; Adesione bassa in particolare al di sopra di questo intervallo indica un esperimento problematico e suggerisce la popolazione inizio di cellule T sono stati in maniera non specifica pre-attivato in fase di preparazione. Piegare aumento del numero di cellule aderenti post-flusso in ciascuna condizione oltre che di cellule non stimolate può essere calcolato in aggiunta al calcolo di aderenza per cento. Dati che rappresentano questi due metodi di calcolo sono inclusi qui.

La Figura 2A mostra immagini rappresentative dei campi all'interno della camera di flusso per ogni condizione pre e post-flusso. Prima dell'esperimento, Jurkat (mostran in figura 2A) o cellule T CD3 + umani primari sono purificati, contati, ed etichettati con CFSE. Per ciascuna condizione sperimentale sono stati etichettati 2 x 10 6 cellule. Le cellule T stimolate sono stati caricati in camere di flusso contenenti cellule CHO-ICAM in presenza o assenza di SDF-1α. Le cellule T sono stati autorizzati a muoversi e si accumulano nella camera per 5 minuti, e durante questo tempo immagini sono state acquisite per determinare i conteggi pre-flow. Un numero paragonabile di cellule pre-flusso tra i diversi stimoli è indispensabile per assicurare condizioni sperimentali uniformi. Dopo 5 minuti di sforzo di taglio continuo generato dal flusso, le immagini sono state catturate di nuovo per determinare i conteggi post-flow. E 'chiaro da queste immagini rappresentative che SDF-1α aumenta il numero di cellule T capaci di aderire alle cellule CHO-ICAM sotto sollecitazione di taglio.

La figura 2B mostra la variazione volte in adesione delle cellule T come calcolato in base al numero di cellule Jurkat T pre e post-flusso sia non stimolate o in presenza di SDF-1α. Per ogni condizione la conta media delle cellule di 5 campi pre-flow e 5 campi di post-flusso sono stati determinati, e un confronto di stimolazione SDF-1α per non stimolato viene utilizzato per calcolare il cambiamento volte adesione delle cellule T. Come mostrato qui, SDF-1α induce un quasi aumento di 2 volte in aderenza rispetto ai non stimolato.

Figura 2C mostra un metodo alternativo di calcolo dei dati. Qui l'adesione percentuale di cellule primarie umane + T CD3 in presenza o assenza di SDF-1α è determinata determinando prima conte medie pre e post-flow cellule T, dividendo la media post-flusso per la media pre-flow e moltiplicando per 100. Attraverso questo calcolo dell'intera popolazione pre-flow rappresenta il 100% di adesione. Come mostrato qui, il 15% delle cellule T non stimolate aderire sotto taglio stress rispetto al 50% di cellule T stimolate con SDF-1α.

Figura 1
Figura 1. È importante analizzare solo le aree esposte al flusso omogeneo. Rappresentazione schematica delle camere di flusso utilizzati con indicazione di dove campi devono essere esposte. Come da informazioni fornite dai produttori camera, la portata prestabilita viene raggiunta solo attraverso il centro delle camere, indicato da arancione in questo schema. Più vicino ai confini della camera il tasso diminuisce di flusso e non dovrebbero essere inclusi nel imaging o analisi sperimentale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. <strong> SDF-1α induce l'adesione delle cellule T di ICAM-1 sotto sforzo di taglio. A. cellule Jurkat T sono stati etichettati con CFSE ad una concentrazione di 5 micron. Successivamente, le cellule sono state caricate nelle camere di flusso che sono stati pretrattati con SDF-1α (100 ng / ml) o non stimolato e configurare sul microscopio confocale e possono circolare e si accumulano nella camera per 5 min. In alternativa, le cellule Jurkat T sono state pretrattate con PMA (10 ng / ml) prima dell'aggiunta alle camere di flusso. In tutto i 5 min immagini pre-flusso sono stati catturati. Il flusso è stato poi avviato a 0.4 dyn / cm 2 per creare shear stress per 5 min. Al termine, le immagini post-flusso sono stati catturati. Immagini rappresentative di cellule Jurkat T sono mostrati, barra della scala 50 micron. B. cambiamento Fold in adesione delle cellule Jurkat T è stato calcolato prima determinazione delle conte medie pre e post-flusso di cellule per ogni condizione e dividendo il numero medio di post-flow per la media co pre-flowunt singolarmente per ogni condizione. Questo quoziente adesione per ciascuna condizione di stimolazione, qui SDF-1α o PMA, viene diviso per il quoziente adesione non stimolato per determinare la variazione piega in aderenza. Barre rappresentano media di 3 esperimenti ± SEM. C. adesione per cento delle cellule T CD3 + umani primaria è stato calcolato in primo luogo la determinazione dei conteggi delle cellule media pre e post-flow per ogni condizione. Per ciascuna condizione, il conteggio medio post-flusso viene diviso per il numero medio di pre-flusso e moltiplicato per 100. L'adesione percentuale risultante è basato sul conteggio delle cellule pre-flusso essendo 100% adesione. Barre rappresentano media di 5 esperimenti ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. TCellule primo accumulano poi scorrono sul monostrato CHO-ICAM. Le cellule Jurkat T sono state marcate con CFSE ad una concentrazione di 5 mM. Successivamente, le cellule sono state caricate nelle camere di flusso che sono stati pretrattati con SDF-1α (100 ng / ml) e configurare sul microscopio confocale e possono circolare e si accumulano nella camera per 5 min. Nel corso di questi 5 min immagini sono state acquisite come una serie time-lapse; fotogrammi fissi (A). Il flusso è stato poi avviato a 0.4 dyn / cm 2 per creare shear stress per 5 min. Nel corso di questi 5 min immagini sono state acquisite come una serie time-lapse; fotogrammi fissi (B). La direzione del flusso in queste immagini è dal basso verso l'alto, e il piano focale è fissato al monostrato CHO-ICAM. Le cellule T possono essere classificati in 3 gruppi: (1) le cellule T di laminazione lungo il monostrato alla portata vengono visualizzati come brevi linee orizzontali in movimento dal basso verso l'alto attraverso il campo in quanto si stanno muovendo rapidamente mentre viene ripreso. (2) T cellule crawling lungo il monostrato. Queste cellule sono saldamente rispettati basato sulla resistenza al flusso, e sono strisciando probabilmente alla ricerca di una zona permissivo passaggio cellulare, che non osservata in questo modello. (3) cellule T che fermamente aderiscono al monostrato, sono resistenti a scorrere, ma sono immobile. Queste cellule non sono attivamente scorrimento orizzontale o verticale lungo il monostrato. Un'analisi più sofisticata può essere fatto, in base agli obiettivi dello studio, attraverso l'uso di uno script ImageJ progettato per sezionare queste popolazioni cellulari di ulteriore quantificazione e caratterizzazione. Scala bar 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. cellule CHO-ICAM devono formare un monostrato confluente. Immagine rappresentativa di un confluenti CHO-ICAM monolayer all'interno di una camera di flusso. Barra della scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Per analizzare correttamente l'adesione delle cellule T, lo stimolante da includere nello studio deve essere considerato nella scelta di un metodo in vitro. Mentre ci sono diversi metodi per studiare i segnali che portano a LFA-1 attivazione e ICAM-1 vincolante tutti i metodi non sono intercambiabili. Un test di adesione statica 10 è più adatto per studiare le interazioni delle cellule T-APC; In alternativa, il metodo descritto qui sforzo di taglio è ideale per modellare cellule epiteliali interazioni delle cellule T. In vivo, come le chemochine sono presentati insieme l'endotelio, a rotazione le cellule T devono rispondere saldamente aderente e resistere alla sollecitazione di taglio del sangue fluire 14,15. Per questo motivo, lo studio di segnalazione chemochine è più adatto ad essere studiato in un metodo che incorpora shear stress. Il vantaggio principale di questa adesione utilizzando condizioni di flusso è la sua semplicità nel modellare le interazioni tra cellule T e integrine. Questo test combina abbastanza unica funzione e meccanicisticastudi di modellazione di un ambiente per lo studio di una coppia di molecole uno integrina-adesione. Un'altra forza di questo metodo è la sua adattabilità; questo metodo può essere usato per quantificare l'adesione di qualsiasi leucocitaria a qualsiasi molecola di adesione. Questo metodo può essere utilizzato per lo screening l'effetto dei farmaci multipli o manipolazioni genetiche attesi per alterare il reclutamento delle cellule T e di stravaso attraverso l'attivazione integrina alterato.

Come con qualsiasi metodo in vitro, ci sono alcune limitazioni di questo test. Questo modello utilizza ingegnerizzato cellule CHO, piuttosto che le cellule endoteliali primarie stimolati come gli altri modelli hanno usato. 16 Anche se questo ci dà la capacità di comprendere gli eventi di segnalazione che influenzano lo stato di attivazione di un unico integrina, questo può anche essere considerato un punto debole del modello. Poiché non vi sono selectine espressi dalle cellule CHO, l'analisi viene effettuata in due fasi. Durante la prima fase (fase di accumulo), le cellule T sono iniettati nel riserv ingressoOIR su un lato della camera e viaggiare verso l'altro lato dalla pressione minima e forze capillari. Il comportamento delle cellule T durante questi 5 min può essere osservato nella Figura 3A. Dopo 5 min, e durante la seconda fase (fase di flusso) la portata viene aumentata e le cellule inizierà a rotolare e aderire. È importante notare che non tutte le cellule T iniettate nel movimento serbatoio di ingresso attraverso la camera durante la fase di accumulazione, e queste cellule rotolano lungo il monostrato come flusso aumenta (Figura 3B). In questo modo, la fase di laminazione di stravaso è artificialmente migliorata, ma non eliminato, in questo modello.

Poiché il numero massimo di cellule aderenti è espressione del numero di celle di input che entrano nella camera c'è il potenziale per numero di greggio variabilità tra esperimenti. Mentre le immagini preflusso non rappresentano pienamente la popolazione di cellule T fino al 100%, perché non tengono account il serbatoio di ingresso, è un controllo importante includere nei calcoli soprattutto quando due diversi tipi di cellule contate singolarmente devono essere comparati. Inoltre, non è consigliabile che i linfociti esplosione primaria essere utilizzati in una singola analisi adesione variabile. Vale a dire, pre-stimolazione delle cellule T attraverso recettori di cellule T (TCR) e / o co-recettori per confondere l'effetto del trattamento degli interessi sull'adesione. Queste variabili devono essere considerati in fase di progettazione sperimentale. Allo stesso modo, gli studi funzionali con PBMC precedentemente congelato spesso producono risultati confondenti, e per questo motivo le linee di cellule o appena isolate PBMC primarie funzionano meglio con questo test. Conoscere il livello normale base di aderenza non stimolato per la PBMC inclusi nello studio è fondamentale per identificare una popolazione di cellule che è stato aspecifico pre-attivato porta a risultati confondenti.

Per replicare questo saggio con precisione, è essenziale che alcune steps nel protocollo, compresi i tempi di assestamento e di incubazione di flusso, essere precisi e uniformi fra tutte le condizioni. In questa stessa luce, cellule CHO-ICAM devono essere confluenti uniformemente in tutte le camere di flusso (Figura 4) e la conta delle cellule T deve essere preciso. 17 Anche piccole differenze di questi fattori possono influenzare l'accuratezza della conta delle cellule alla fine. Una futura applicazione di questo test è lo sviluppo di una serie di linee cellulari che esprimono individualmente selectine e molecole di adesione per ampliare l'impatto di questo metodo per altre cascate di segnalazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T cell samples (cell line or primary) ATCC TIB-152 Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells ATCC CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi 80606
500 ml glass bottle Fisher FB800500
250 ml glass bottle Fisher FB800250
Silicone tubing 0.8 mm ibidi 10841
Confocal microscope with incubator chamber Ziess 700 Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
60 ml syringe BD 309653
CFSE eBioscience 65-0850
SDF-1α R&D 350-NS-010/CF
RPMI Lonza 12-702F/12
PBS  Lonza 17-516F
Microcentrifuge Eppendorf  5424
D-Glucose Sigma Aldrich G8270 
PMA Sigma Aldrich 16561-29-8
Volocity software Perkin Elmer Version 6.2.1
ImageJ software NIH Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes Falcon 353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H
Penicillin/Streptomycin Fisher BP295950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20, (5), 525-532 (2008).
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Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni
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Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).More

Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).

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