Summary
이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.
Abstract
전반적으로, T 세포 유착, 면역 시냅스 형성 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용 및 염증 부위로 세포 모집 고유 프로세스에 기여 함수의 중요한 구성 요소이다. T 세포의 혈관 작용은 순환 자체에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 도전하는 동안 T 세포 유착이 두 상황은 휴대 APC 상호 정적으로 간주 될 수있는 T 다르다. T 세포 APC 상호 작용은 두 개의 휴대 파트너가 서로 정적 상대적 점에서 정적으로 분류하고 있습니다. 일반적으로, 이러한 상호 작용이 임파절 내에서 발생한다. T 세포가 혈관의 벽과 상호 작용으로 세포를 구속하고 생성 된 전단 응력에 저항해야한다. -1,2- 이러한 차이는 더 두 가지 규정하는 처리와 유동 조건에서 고정 부착 및 접착 성 증진의 필요성을 강조. T 세포 접착의 조절이 가장 간결 단점이라고 할 수있다세포 표면에 발현 분자 인테그린과 상호 작용하여 세포의 표면에 발현되는 접착 분자 인테그린 리간드의 상호 작용을 조절하는 친 화성 상태 조업. 인테그린 선호도 상태의 규제의 우리의 현재 이해는 체외 모델 시스템에서 종종 단순한에서 온다. 접착 여기서 설명 유동 조건을 사용하여 분석하고 시각화 자극 다음 실시간 T 세포 상피 세포 상호 작용의 정확한 정량을 허용한다. 유동 검정 하에서 접착 저해 또는 자극 물질로 처리 다음 T 세포 내 시그널링 밀착성 시험에 적용될 수있다. 또한,이 분석은 접착제 백혈구 집단 및 인테그린 접착 분자 쌍 T 세포 신호 전달을 넘어 확장 될 수있다.
Introduction
T 림프구 접착 성 T 세포 트래 피킹 및 항원 제시에 중요한 역할을 수행하는 3 건강한 면역 시스템의 고유 프로세스들을 중재한다. 면역 감시 또는 접착이 두 가지 역할이 중요한 활성 면역 반응 동안의 여부. 4 T 세포 - 내피 세포 상호 작용의 생리 학적 신호 이벤트 (APC) 상호 셀 제시 T 세포 항원을 구별하고, 따라서의 구분 방법을 필요 연구는 가장 관련된 신호 폭포를 이해합니다. 림프구 넘쳐 중에 혈관 벽에 대한 T 세포의 밀착성 신속한 동적 인테그린 활성화를 필요로한다. 내피 따라 액티브 상태 인테그린 접착 분자 간의 긴밀한 상호 작용은 T 세포가 세포 통로 허용 영역 검색에 표면을 따라 기어 있도록 혈류에 강한 접착력을 이끈다. 5 T 세포의 Bi 크롤링 -directionally 아론GA 혈관벽은 T 세포의 구별 접착제 선단부와 편광 접착시에 의존한다.도 6은 가장 중요한 것은, 밀착성 및 윤회 혈류 순환에 의해 발생되는 전단력에 대한 저항을 요구한다.
림프구 접착력을 연구하는 실험을 설계 할 때,주의가 관심있는 특정 자극에 지불해야한다. 인테그린 활성화하는 T 세포 유착 모든 형태의 일반적이고 중요한 요소이지만, 활성화 캐스케이드의 개별 수용체 공동 수용체의 하류 고유 할 가능성이있다. 마찬가지로, 인테그린 및 접착 분자 쌍은 전문 미세 환경에서 특정 소집단에 작동합니다. 이와 같이, 이러한 쌍은 매우 다르게 조절 될 수있다. 여기에 제시된 모델은 전단 응력 조건에서 발생하는 활성화를 인테그린에 이르는 폭포 신호의 연구에 이상적입니다. (7) 이러한 상호 작용이 적절히 정적 adhesi에서 이해 될 수 없다시스템에 의한 충격이 힘은 8 비록. T 세포의 행동을 직접 갖고 도시 한 인간 ICAM-1 (CHO-ICAM 세포)를 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포 및 CHO (중국 햄스터 난소) 세포 시스템을 수 여기서 제시 쉽게 백혈구 집단 또는 다른 부착 분자 연구를 수정할.
이 분석은, 백혈구의 혈관 외 유출의 밀착성 스테이지에 대한 모델을 제공하고, 전단 응력을 이용하여 T 세포의 접착 성 및 인테그린 활성화를 정량하는 방법을 제공한다. CHO-ICAM 세포를 이용하여 살아있는 세포에서의 리간드 LFA-1의 친화 관심 다양한 자극에 응답하여 실시간으로 검사 할 수있다. 이러한 기술은 용이하게 크게 다른 모델에 비해 혈류 및 전단 응력을 모델링하는 데 필요한 장비를 단순화 주사기 펌프를 조합하여 시판 미세 유동 챔버를 얻을 필요. (9) 상기 분석의 다른 주요 장점은 특정 시그널링 있다는캐스케이드 개별 인테그린의 결과 활성화 상태는 깨끗하게 관심 인간 부착 분자를 발현하는 CHO 세포 공학을 사용하여 조사 할 수있다. 또한, 생균 이미징 정량적 데이터의 조합이 방법의 중요한 장점이다. 정적 T 세포 부착 분석법 다수 좋게 T 세포 APC 상호 작용을 모델링하는 설명되었지만 전반적으로,이 모델은 T 세포의 상피 부착 동적 프로세스 포착이 불충분하다. 접착 시험을 선택할 때이 때문에, 당해 자극을 고려해야한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 도금 CHO-ICAM 세포
주 :이 단계의 목적은 합류 단층을 생성하는 것을 목표로 밤새 성장 유동 챔버의 CHO-ICAM 세포 플레이트이다.
- 5 %, 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (CHO-ICAM 완전 배지)로 보충 된 10 ml의 RPMI 배지에서 10cm 조직 배양 처리 된 배양 접시에서 CHO-ICAM 세포 유지 CO 2.
- 세포를 수집하기 위해, 1 ml의 0.5 % 트립신 EDTA를 추가하고 온화한 진탕 1 분 동안 실온에서 배양한다. 미디어의 4 ml의 트립신을 중화.
- hemacytometer를 사용하여 CHO-ICAM 세포를 계산하고 챔버 당 0.75 × 10 5 세포를 계산합니다. 참고 :이 실험에서 : 2.25 × 10 5 세포 3 실 시드 필요합니다.
- 원심 0.75 × 105 CHO-ICAM의 500 XG, 실온에서 5 분 동안 실 당 세포 및 CHO의 챔버 당 30 μL의 세포 펠렛을 재현 탁-ICAM 전체 문화 미디어.
참고 :이 실험에서는 90 μl의 3 챔버 시드 필요합니다. - 천천히 유량 용기의 한 저수지로 세포를 추가합니다. 세포가 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 5 분 동안 정착하도록 허용합니다.
- 각 실의 두 저수지에 걸쳐 완전한 배양 배지 200 μl를 추가합니다. 시스템이 평형화 같이 둘 사이의 추가는 다른 세포의 이동을 방지한다.
- 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기 내에서 하룻밤 세포를 품어.
T 세포의 제조 2
주 :이 분석은 일차 인간 T 세포 또는 T 세포 라인으로 수행 될 수있다. 혈액 T 세포의 분리에 대한 프로토콜은 이전에 설명되었다.하여 10 일차 인간 T 세포가 최상의 결과를 새롭게 분리 된 세포를 사용하는 경우. T 세포 라인을 사용하는 경우, 셀의 소스에 의해 지정된 배양 프로토콜을 따른다. 형광 microsco에 세포를 검출하기 위해T 세포가 카복시 플루오 레세 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 표시되어 퍼가기.
- hemacytometer를 이용하여 T 세포를 세어 챔버 당 2 × 106 개 세포를 계산한다. 주 :이 실험에서는 6 × 106 세포를 3 챔버에 대해 필요하다.
- 원심 분리 (2)는 T × 106 500 × g으로 실온에서 5 분 동안 세포 챔버 당 1 % 글루코스 또는 2 % FBS를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖의 세포 (PBS)에 재현 탁.
- 1 CFSE 추가 : 1000 희석 (주 5 mm로했다). 빛 덮고 실온에서 8 분 동안 품어
- 5 분, RT 500 XG에 스핀.
- 조건 당 240 μL에 재현 탁 세포 펠렛을 RPMI 미디어 부족 혈청 (4 절 "주의"를 참조하십시오). 이 실험에서는, 일반 RPMI 720 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 각 챔버, 튜브 당 240 ㎕의 표지 빈 1.5 ml의 튜브에 세포를 나눈다. 사용할 때까지 37 ° C 열 블록의 세포를 유지합니다.
3 일 설정전자 입력 / 출력 뿌리고과 주사기 펌프
- 37 ° C에 현미경 라이브 영상 실을 따뜻하게.
- 입력 뿌리고을 준비합니다 :
- 물 500㎖의 유리 병을 채우고 뚜껑으로이 구멍을 만든다. 그리고 "의"구멍 레이블을 "알아." 이 입력 매체 가열 수조로서 작용한다.
- 뚜껑과 수조 내로 관통 뿌리기 입력을 실행. "출력"구멍을 통해 제공되는 주사기에 연결 뿌리고의 측면 구멍 "에서", 입력 저수지에 연결 측면을 통해 오는 있는지 확인합니다.
- 시스템에서 모든 공기를 제거하기 위해 물 60 ㎖로 뿌리기 입력을 플래시합니다.
- 프라임 RPMI 미디어 혈청 부족으로 뿌리기 입력은 37 ° C로 예열. 60 ML의 주사기를 입력하고 뿌리고 완전히 끝났다과 공기 방울을 결여 될 때까지 미디어를 통해 밀어 넣습니다.
참고 : lengt 기반으로 주사기 Z- 추적 injection.Size에 따라튜브의 시간은 달라질 수 소수에 필요한 볼륨을 사용했다.- (여기서 3) 실험 챔버의 수에 의해 분 (5 분)의 개수에 의해 흐름 (여기에서는 0.3 ㎖ / 분)의 속도를 곱함으로써 실험에 필요한 매체의 부피를 계산하게하고; 이 실험에서, 4.5 ml의 용지를 사용합니다. 참고 : 우리는 프라이밍 후 주사기에 남아있는 (여기에 9.5 ㎖의 총) 5 ml의 여분의 체적을 갖는 것이 좋습니다.
- 37 ° C를 유지하기 위해 현미경의 라이브 영상 인클로저에 전체 입력 설정을 놓습니다. 뿌리고을 실행하고 인클로저 밖으로 주사기와 주사기 펌프에 주사기를로드합니다.
- 출력 뿌리고을 준비합니다 :
- 출력 폐기물로 사용하는 250 ml의 병의 뚜껑에 구멍을 만듭니다.
- 구멍을 통해 병에 출력 튜브를 실행합니다. 느슨하게 뚜껑을 고정하는 모든 방법을 폐쇄하지.
- 마일의 라이브 영상 인클로저로 출력 설정을 배치croscope.
- 원하는 전단 응력 (DYN / cm 2)을 생성하기 위해 상기 유량 (ml / 분)에 필요한 계산. 전단 응력 따라서 계정으로 세포 연구 할 유형과 치료 전단 스트레스 수준 결정을 포함하여 전체 모델을, 다른 혈관 구획에 따라 다릅니다.
참고 :이 실험은 밀접하게 작은 정맥 설정을 모방하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 수행된다.- 전단 응력을 계산할 때 고려 챔버의 크기를 가져 가라. 여기에 사용 된 흐름 챔버 용 (제조업 (11)에 의해 제공) 다음 공식을 사용 (재료의 표 참조) : T = η * 176.1 *의 ø는 T = 전단 응력, η = 동적 점도, ø는 = 유량 곳. 참고 : 37 ° C에서 RPMI 미디어의 동적 점도는 0.007이다.
셀 흐름 챔버와 자극 4.로드
주 : 접착을 개시하기 위해,T 세포를 자극한다. 다음 실험에서 세포를 자극되지 남아 있거나 SDF-1α (12) 또는 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA, 양성 대조군)으로 자극 13. T 세포에 대한 케모카인의 적절한 프리젠 테이션을 위해, CHO-ICAM 세포는 세포 표면에 프레 수 (연속 세척 하였다) SDF-1α와 함께 예비 인큐베이션한다. PMA는 제 톡 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사한 포르 볼 에스테르; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. T 세포는 바로 전에 유동 챔버 내로 로딩하기 PMA로 처리된다.
- 현미경의 흐름 챔버 슬라이드를 놓고 20 배 목표를 사용하여 CHO-ICAM 단층에 초점면을 설정합니다.
- 37 ° C 열 블록에있는 다른 모든 조건 CFSE - 스테인드 T 세포를 유지합니다. 그 조건에 대한 분석 직전에 다음과 같이 CHO-ICAM 또는 T 세포를 준비합니다
- 비자극 조건 (챔버 (1))의 경우, 하나의 튜브 / 유동 채널을 유지치료 황색, 자극에 대한 부정적인 제어를 제공합니다.
- PMA 자극 (챔버 (2))의 경우, 양성 대조군으로서 역할하는 PMA (10 NG / ㎖)와 T 세포를 자극 한 튜브; 유량 용기에 넣기 전에 즉시 처리합니다.
- SDF-1α 자극 (챔버 (3))의 경우, 상부 리저버 (출력 저장조)에서 한 번에 3 회 70 μL를 제거하고 SDF의 70 μl를 첨가하여 SDF-1α (100 NG / ㎖)와 제 3 유동 챔버를 자극 -1α (100 NG / ㎖) 하부 통 (입력 저수지)로. 5 분 동안 품어.
- 하나의 챔버의 출력 저장소로부터 3 회 제거하고 시간에 70 μl를 버린다.
- 입력 저수지로 3 회를 전처리 (해당되는 경우) T 세포 현탁액의 70 μl를 추가합니다. 세포가 챔버 ( "에서")의 입구에서 이동할 수 있도록하기 위해 5 분을 기다린 챔버의 근위 출구 ( "아웃")에 도달 할 수 있습니다.
- 이 시간 동안, 화상 (5)CFSE - 스테인드 T 세포에 대한 필드. 챔버 (그림 1)의 중심에 걸쳐 분산되어있는 필드를 선택합니다. 여기 레이저 파장 : 다음 여기 / 방출 488 nm의 조건으로 사용하는 단계; 발광 컬렉션 필터 : 500-540 나노. 이러한 이미지는 미리 유동 세포 수의 역할을한다.
- 유량 용기 저수지에 동시에 입력 및 출력 튜브를 연결합니다.
주 : 챔버 내에 기포를 도입하여 챔버 내의 전체적인 균형을 유지하지 않도록 동시에 튜브를 부착하는 것은 매우 중요하다. - CFSE - 스테인드 T 세포를 시각화하는 동안 0.3 ml / 분 (0.4 DYN / cm 2)에서 흐름을 시작합니다. 흐름은, 특히 제 1 챔버와, 시작으로, 따라서 T 세포 이동의 개시 타이밍에서 5 분 시작 종종 유동을 시작 및 T 세포를 관찰 압연의 차이도있다.
- 5 분 후, 흐름을 종료하고 CFSE 채널에서 이미지 필드 5. 무작위로 죽 분산 필드를 선택유동 챔버의 중심 ughout (도 1). 이러한 이미지는 이후 흐름 세포 수의 역할을 할 것이다.
5. 접착 세포의 비율을 결정
주 : 획득 된 영상에서 세포 수의 측정은 자동 소프트웨어 객관적으로 이루어진다. 우리의 연구에 우리는 ImageJ에 (버전 1.48V)와 같은 소프트웨어 Volocity (버전 6.2.1)하지만 다른 소프트웨어를 사용하여도 적용 할 수있다.
- 각 조건에 대한 필드 사전 흐름 당 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 "프리 플로우 평균 세포 수"입니다. (7)
- 각 조건에 대한 필드 이후의 흐름에 따라 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 "포스트 흐름 평균 세포 수"입니다. (7)
- 다음 수식을 사용하여 부착 된 세포의 비율을 계산 / (프리 플로우 평균 세포 수) = 부착 세포 (포스트 플로우 평균 세포 수)의 비율 × 100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
나타낸 바와 같이, 대표적인 결과 SDF-1α 자극, 주르 케트 일차 인간 CD3 + T 세포를 사용하여 유동 부착 분석법에서 도시된다. 모든 도시 실험에서 음성 대조군은 무 자극 세포이다. 자극되지 않은 셀의 문턱 기저 %의 밀착성 5 사이 - 10 %; 특히이 범위에서 상기 기재의 밀착성이 문제가 실험을 나타내고 T 세포의 시작 인구 비특이적 제제에 미리 활성화 하였다 나왔다. 자극되지 않은 세포의 위에 각 조건에서의 포스트 플로우 %의 밀착성의 계산에 더하여 계산 될 수 접착 세포 수의 증가를 접어. 이 두 가지 계산 방법을 나타내는 데이터는 여기에 포함된다.
도 2a는 각 조건의 전후의 유동 흐름 챔버 내의 필드를 나타내는 이미지를 나타낸다. 실험에 앞서, 주르 케트 (쇼n은 그림 2A) 또는 기본 인간의 CD3 + T 세포에서 계산, 정제 및 CFSE으로 표시됩니다. 각 실험 조건의 경우 2 × 10 6 세포를 표시했다. 자극되지 않은 T 세포 SDF-1α의 존재 또는 부재 CHO-ICAM 세포를 포함하는 유동 챔버로 적재 하였다. T 세포를 5 분 동안 상기 챔버로 이동하여 축적하도록 허용하고,이 시간 동안 화상이 프리 플로우 수를 결정하기 위해 캡쳐 하였다. 다른 자극 사이 셀 비교할 수 프리 흐름 균일 실험 조건을 보장하는 것이 필수적이다. 흐름에 의해 생성 된 연속 전단 응력의 5 분 후, 이미지는 다시 포스트 플로우 수를 결정하기 위해 캡쳐 하였다. 또한 SDF-1α는 전단 응력 하에서 ICAM-CHO 세포에 부착 할 T 세포의 수를 증가 이러한 대표적인 이미지를 알 수있다.
도 2b는 CAL 같은 T 세포 유착의 배 변화를 나타낸다주르 케트 T 세포의 숫자 비자극 또는 SDF-1α의 존재 하에서 하나 전후 흐름에 기초 culated. 모든 조건에 대해 평균 셀 5 필드 프리 플로우의 수와 포스트 플로우를 측정 하였다 5 필드 및 자극되지 SDF-1α에 대한 자극의 비교는 T 세포 접착 배 변화를 계산하기 위해 사용된다. 여기에 도시 된 바와 같이, SDF-1α는 비자극에 비해 밀착성이 거의 2 배의 증가를 유도한다.
도 2c는 데이터를 계산하는 다른 방법을 보여준다. 여기 SDF-1α의 존재 또는 부재 차 인간 CD3 + T 세포의 백분율 밀착성 먼저 프리 플로우 평균 포스트 플로우 평균 나누어 평균 전후 유동 T 세포 수를 측정함으로써 결정된다 이러한 계산을 통해 (100)에 의해 전체 사전 - 유동 인구 곱하여 100 % 접착 성을 나타낸다. 여기에 도시 된 바와 같이, 자극되지 않은 T 세포의 15 %는 전단 하에서 부착 헤어 구조 강화SDF-1α 자극 T 세포의 50 %에 비해 SS.
도 1은 균일 한 흐름에 노출 된 전용 영역을 분석하는 것이 중요하다. 필드가 이미징 될 위치의 표시에 사용되는 유동 챔버의 개략도. 챔버 제조 업체에 의해 제공되는 정보에 따라, 미리 설정된 유량 만이 회로도에서 오렌지로 나타낸 챔버의 중앙을 통해 달성된다. 챔버의 국경에 가까운 유량 감소 및 실험 영상 또는 분석에 포함 할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. <강한> SDF-1α는 전단 응력 하에서 ICAM-1 T 세포 유착을 유도한다. A. 된 Jurkat T 세포를 5 μM의 농도에서 CFSE로 표지 하였다. 이어서, 세포는 SDF-1α (100 NG / ㎖) 또는 자극되지 전처리 및 공 초점 레이저 주사 현미경을 설정하고 5 분 동안 상기 챔버로 이동 축적시켰다 유동 챔버로 적재 하였다. 대안 적으로, 주르 케트 T 세포를 PMA (10 NG / ㎖) 전에 유동 챔버에 추가로 전처리 하였다. 그 5 분 예비 유동 이미지에 걸쳐 포착 하였다. 흐름은 5 분 동안 전단 응력을 생성하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 개시되었다. 완료되면, 이후 유동 이미지 캡쳐 하였다. 주르 케트 T 세포의 대표적인 이미지를 스케일 바, 도시 50㎛의. B. 된 Jurkat T 세포 접착 배 변화는 먼저 각 조건에 대해 평균 전후 유동 세포 수를 결정하고, 평균 포스트 플로우 개수로 나누어 계산 하였다 평균 사전 흐름 공동으로개별적으로 각 조건에 대한 UNT. 각각의 자극 여기 상태, SDF-1α 또는 PMA에 대한이 부착 지수는 다음 접착의 배의 변화를 결정하기 위해 자극되지 접착 몫으로 나누어진다. 바는 먼저 각각의 조건에 대해 평균 전후 유동 세포 수를 측정하여 계산 하였다 차 인간 CD3 + T 세포의 SEM. C. 백분율 접착 ± 3 실험의 평균을 나타낸다. 각 조건에 대한 평균 후 유동 카운트 결과 퍼센트의 밀착성이 프리 플로우 셀 수가 100 %의 밀착성을 기반 (100)에 의해 평균 프리 플로우 수에 의해 나누어 곱해진다. 바는 SEM ± 5 실험의 평균을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. T세포는 먼저 축적 CHO-ICAM 단일 층에 걸쳐 흐른다. 된 Jurkat T 세포는 5 μM의 농도로 CFSE로 표지 하였다. 이어서, 세포는 SDF-1α (100 NG / ㎖)으로 전처리하여 공 초점 레이저 주사 현미경을 설정하고 5 분 동안 상기 챔버로 이동 축적시켰다 유동 챔버로 적재 하였다. 이 5 분의 이미지를 통해 시간 경과 시리즈로 촬영되었다; 여전히 (A) 프레임. 흐름은 5 분 동안 전단 응력을 생성하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 개시되었다. 이 5 분의 이미지를 통해 시간 경과 시리즈로 촬영되었다; 정지 (B) 프레임들을 포함 할 수도있다. 이러한 이미지에서의 흐름 방향 아래에서 위로하고, 초점 평면은 CHO-ICAM 단층 설정된다. (1) 유량의 단층을 따라 롤링 T 세포를 시각화 짧게, 가로줄 묘화하면서 이들이 빠르게 이동하기 때문에 필드를 통해 아래에서 위로 움직이는 : T 세포는 3 그룹으로 분류 할 수있다. (2) T 세포 득실단층을 따라 g. 이 세포는 단단히 흐름 저항에 따라 부착하고,이 모델에서 관찰되지 않는 세포 통로 허용 면적의 검색 가능성이 크롤링됩니다. (3)에 단단히 부착 단층 T 세포의 흐름에 저항하지만, 고정되어있다. 이 세포들은 적극적으로 압연 또는 단층을 따라 크롤링되지 않습니다. 더 복잡한 분석은 상기 정량 또는 특성화 이러한 세포 집단을 해부 설계된 ImageJ에 스크립트의 사용을 통해, 본 연구의 목적에 기초하여 수행 될 수있다. 규모는 50 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. CHO-ICAM 세포 합류 단층을 형성해야합니다. 합류 CHO-ICAM의 monolay의 대표 이미지흐름 챔버 내 어. 스케일 바 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
올바르게 T 세포 유착을 분석하기 위하여, 자극은 시험관 내 방법을 선택할 때 고려되어야 연구에 포함된다. LFA-1의 활성화 및 바인딩 ICAM-1에 이르는 신호를 연구하는 여러 가지 분석이 있지만 모든 방법이 서로 호환되지 않습니다. 정적 접착 분석 (10)는 최적의 T 세포 APC의 상호 작용을 연구하는 데 적합하다; 대안으로, 여기에 설명 된 전단 응력 방법은 T 세포 상피 세포의 상호 작용을 모델링하기에 이상적이다. 생체 내, 케모카인 단단히 부착 및 혈액의 전단 응력은 14, 15, 흐름 저항에 의해 응답해야 T 세포 롤링, 내피 함께 제공됩니다있다. 이런 이유로, 케모카인 시그널링의 연구는 전단 응력을 통합 한 분석에서 연구 될 것이 가장 적합하다. 유동 조건을 사용하여이 접착의 주요 장점은 T 세포와 인테그린과의 상호 작용을 모델링 단순하다. 이 분석은 매우 독특한 기능과 기계적 결합하나 인테그린 접착 분자 쌍의 연구 환경을 모델링하여 연구. 이 방법의 또 다른 강점은 적응성이다 이 방법은 임의의 접착 분자에 임의의 백혈구의 부착을 정량화 할 수있다. 이 방법은 변형 인테그린 활성화를 통해 T 세포의 모집 및 혈관 외 유출을 변경할 것으로 예상 다중 약물 또는 유전자 조작의 효과를 스크리닝하기 위해 사용될 수있다.
어떤 시험 관내 방법과 마찬가지로,이 분석의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 다른 모델이 사용될 것처럼이 모델은 CHO 세포보다 자극 차 내피 세포 공학 용도. 16이 우리에게 단일 인테그린의 활성 상태에 영향을 미치는 신호 이벤트를 이해할 수있는 능력을 제공하지만, 이것은 또한 모델의 약점으로 간주 될 수있다. CHO 세포에 의해 발현에는 셀렉틴이 없을 때, 상기 분석은 두 단계로 수행된다. 첫 번째 단계 (축적 단계) 동안, T 세포는 입력 RESERV에 주입최소 압력 및 모세관 힘에 의해 다른 쪽의 이동 챔버의 일측에 OIR. 이 5 분에 걸쳐 T 세포의 동작은도 3a에서 볼 수있다. 5 분 후, 두 번째 단계 (흐름 상) 중에 유량이 증가하고, 세포를 감아 부착 시작할 것이다. 이 흐름은 (도 3B)이 증가함에 따라 퇴적 단계 동안 챔버에 걸쳐 입력 저류 이동 주입 모든 T 세포, 이들 세포가 단층 굴러하지 것이 중요하다. 이와 같이, 혈관 외 유출의 압연 단계는 인공적으로 향상되지만,이 모델에서 제거되지.
부착 세포의 최대 수는 상기 챔버에 입력 입력 셀 개수의 표현이므로 실험 중에서 원료 수가 변동에 대한 가능성이있다. 그들은 accoun 고려하지 않기 때문에 이미지 preflow 완전히 100 % 최대 T 세포군을 나타내지 않지만입력 저장조 T, 개별적으로 카운트 서로 다른 세포 유형이 비교 될 때, 특히 계산에 포함하는 중요한 제어이다. 또한, 1 차 폭발 림프구가 하나의 변수 접착 분석에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 즉, T 세포 수용체 (TCR) 및 / 또는 코 - 수용체를 통하여 T 세포의 사전 자극 접착에 관심있는 치료 효과를 혼동 할 수있다라고하는 것이다. 이러한 변수는 실험 설계시 고려되어야한다. 마찬가지로, 이전에 냉동 PBMC를 가진 기능 연구는 종종 혼동 결과를 산출하고,이 때문에 세포주 또는 갓 격리 기본 PBMC를 위해이 분석에 최선을 작동합니다. PBMC를 대상으로 자극되지 대한 밀착성의 정상 기준 레벨 이해 비특이적 혼동 결과에 이르는 예비 - 활성화 된 세포 집단을 확인하는데 중요하다.
정확성이 분석을 복제하기 위해서는 필수적이다 일부 공정정착 및 흐름 배양 시간을 포함하여 프로토콜에서의 모든 조건 사이에 정확하고 균일합니다. 이 같은 관점에서, CHO-ICAM 세포를 균일하게 또한 정확해야하는 모든 흐름 챔버 (그림 4)와 T의 세포 수를 통해 컨 플루 언트해야합니다. 이러한 요소 17도 작은 차이가 결국 세포 수의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 분석의 후속 애플리케이션은 각각 다른 시그널링 캐스케이드이 방법의 효과를 확대 할 셀렉틴 및 부착 분자를 발현하는 세포주의 일련의 개발이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
