Summary
Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.
Abstract
Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. 1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.
Introduction
T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, 3 desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. 4 Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sanguíneo durante o extravasamento de linfócitos requer activação rápida e dinâmica integrina. A interacção estreita entre uma integrina e adesão activas moléculas de estado ao longo do endotélio leva a aderência resistente ao fluxo de sangue, permitindo que as células T para rastrear ao longo da superfície em busca de uma área permissiva para a passagem de células. 5 O rastreamento de um bi células T -directionally Alonda parede do vaso sanguíneo GA é dependentes de adesão polarizada, com uma extremidade dianteira adesiva distinta da célula T. 6 Mais importante ainda, a adesão e transmigração firme requerem resistência à força de corte gerada pela circulação de fluxo sanguíneo.
Ao projetar experimentos para estudar a adesão de linfócitos, deve ser dada atenção ao estímulo específico de interesse. Enquanto a activação de integrina é um componente comum e crítica de todas as formas de adesão das células T, as cascatas de activação são susceptíveis de ser único a jusante dos receptores individuais e co-receptores. Do mesmo modo, pares de integrina e molécula de adesão funcionam em microambientes especializados e em subpopulações específicas. Desta forma, estes pares podem ser regulados de forma bastante diferente. O modelo aqui apresentado é ideal para o estudo da cascata de sinalização que levam à integrina ativação ocorrendo em condições de tensão de cisalhamento. 7 Essas interações não podem ser adequadamente compreendidas em um ADHESI estáticano sistema devido ao impacto ter sido mostrado que estas forças têm directamente no comportamento das células T. 8 Embora apresentado aqui com as células T e as células CHO (Ovário de Hamster Chinês) manipuladas para expressar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1, o sistema pode facilmente ser modificado para estudar diferentes populações de leucócitos ou moléculas de adesão.
Este ensaio proporciona um método para quantificar a aderência de células T e a activação da integrina utilizando tensão de corte, fornecendo um modelo para a fase de adesão firme dos leucócitos extravasamento. Através da utilização de células CHO-ICAM a afinidade de LFA-1 para o seu ligando em células vivas pode ser examinada em tempo real, em resposta a vários estímulos de interesse. Esta técnica requer facilmente obtida, câmaras de micro-fluxo disponíveis comercialmente em combinação com uma bomba de seringa, o que simplifica grandemente o equipamento necessário para modelar o fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento, em comparação com outros modelos. 9 Uma outra vantagem principal deste ensaio é que a sinalização específicacascatas e do estado de activação das integrinas resultante individuais podem ser estudados de forma limpa através da utilização de células CHO modificadas que expressam moléculas de adesão humanos de interesse. Além disso, a combinação dos dados quantitativos com imagem de células vivas é uma vantagem significativa do presente método. Em geral, embora um certo número de ensaios de adesão de células T estática ter sido descrito que bem modelar as interacções célula T-APC, estes modelos são insuficientes na captura do processo dinâmico de adesão celular epitelial-T. Por este motivo, quando a escolha de um ensaio de adesão do estímulo em questão deve ser considerado.
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Protocol
1. plaqueamento das células CHO-ICAM
Nota: O objectivo deste passo é a chapear as células CHO-ICAM nas câmaras de fluxo para o crescimento durante a noite com o objectivo de gerar uma monocamada confluente.
- Manter as células CHO-ICAM em 10 cm de cultura de tecidos tratados pratos de cultura de 10 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM meio de cultura completo) a 37 ° C com 5% CO 2.
- Para recolher as células, adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 1 min com agitação suave. Neutraliza-se a tripsina com 4 ml de meio.
- Contar as células CHO-ICAM usando um hemocitômetro e calcular 0,75 x 10 5 células por câmara. Nota: Neste experimento: 2,25 x 10 5 células serão necessários para semear 3 câmaras.
- Centrifugar 0,75 x 10 5 células CHO-ICAM por câmara durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender o sedimento celular em 30 ul por câmara de CHO-ICAM Meios de cultura completos.
Nota: Neste experimento serão necessários 90 l para semear 3 câmaras. - Lentamente adicionar as células para um reservatório da câmara de fluxo. Permitir que as células que se contentar com 5 min na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Adicionar 200 ul de meios de cultura completos entre os dois reservatórios de cada câmara. adições alternar entre os dois para evitar o movimento das células como o sistema equilibra.
- Incubar as células durante a noite dentro de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
2. Preparação das células T
Nota: Este ensaio pode ser feito com células T humanas primárias ou de uma linha de células T. Um protocolo de isolamento de células T do sangue foi descrita anteriormente. Se 10 utilizando células T humanas primárias utilização de células isoladas de fresco para obter os melhores resultados. Se utilizar uma linha de células T, seguir o protocolo de cultura especificado pela fonte de células. A fim de detectar as células em uma microsco fluorescentepe as células T são marcadas com éster de succinimidilo de fluoresceína carboxi (CFSE).
- Contar as células T utilizando um hemacitómetro e calcular 2 X 10 6 células por câmara. Nota: Neste experimento, serão necessários 6 x 10 6 células por 3 câmaras.
- Centrífuga 2 x 10 6 células T por câmara, durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender as células em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) contendo 1% de glucose ou 2% de FBS.
- Adicionar CFSE a 1: 1000 de diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra da luz e incubar durante 8 min a RT
- Girar a 500 xg durante 5 min, temperatura ambiente.
- pellet celular Ressuspender com 240 ul por condição (ver secção 4 "Nota") de soro falta mídia RPMI. Nesta experiência, ressuspender o sedimento celular em 720 ul de meio RPMI simples. Dividir as células vazias em tubos de 1,5 ml rotulados para cada câmara, 240 ul por tubo. Manter as células em um bloco de calor C 37 ° até utilização.
3. Criação de the Input / Output Hosing e bomba de seringa
- Aquece-se a câmara de imagem ao vivo microscópio para 37 ° C.
- Preparar a mangueira de entrada:
- Encha uma garrafa de vidro de 500 ml com água e fazer 2 furos na tampa. Rotular os buracos "in" e "out". Isto irá actuar como um banho de água de aquecimento para os meios de entrada.
- Executar a mangueira de entrada através dos orifícios na tampa e para dentro do banho de água. Certifique-se de que o lado da mangueira que liga à seringa vem através da "em" buraco eo lado que vai ligar para o reservatório de entrada vem através do "fora" buraco.
- Lave a mangueira de entrada com 60 ml de água para remover o ar do sistema.
- Primeiro a entrada de mangueira com meio RPMI sem soro aquecido a 37 ° C. Encha uma seringa de 60 ml e empurre através da mídia até que a mangueira é completamente preparado e falta quaisquer bolhas de ar.
Nota: Dependendo do length de tubo utilizado o volume necessário para preparar irão variar.- Calcular o volume dos meios de comunicação necessários para a experiência multiplicando a taxa de fluxo (aqui 0,3 ml / min) ao número de minutos (5 min), com o número de câmaras na experiência (aqui três); neste experimento, use 4,5 ml de mídia. Nota: Recomendamos que tem 5 ml volume extra (neste caso, totalizando 9,5 ml) que permanece na seringa após priming.
- Coloque toda a configuração de entrada para o recinto de imagens ao vivo do microscópio para manter 37 ° C. Execute o mangueiras e seringa para fora do gabinete e carregar a seringa na bomba de seringa.
- Preparar a mangueira de saída:
- Fazer um furo na tampa de um frasco de 250 ml para usar como resíduos de saída.
- Executar o tubo de saída através do orifício e para dentro da garrafa. Vagamente fixar a tampa, não fechar todo o caminho.
- Coloque a configuração de saída para dentro do gabinete imagens ao vivo da microscope.
- Calcula-se a taxa de fluxo (mL / min) necessária para gerar a tensão de cisalhamento desejada (dyn / cm 2). A tensão de cisalhamento varia em diferentes compartimentos vasculares, portanto, ter em conta o modelo global, incluindo tipos de células a serem estudados e tratamentos Ao decidir sobre um nível de tensão de cisalhamento.
Nota: Estas experiências são realizadas em 0,4 dyn / cm 2 para perto imitar um cenário veia pequena.- Tome as dimensões da câmara em conta no cálculo tensão de cisalhamento. Use a seguinte fórmula (fornecido pelo fabricante 11) para as câmaras de fluxo usados aqui (Ver Tabela de Materiais): T = η * 176,1 * o onde o stress T = cisalhamento, η = viscosidade dinâmica, o = taxa de fluxo. Nota: A viscosidade dinâmica do meio RPMI a 37 ° C é 0,007.
4. Carregando do Fluxo de Chambers e estimulação das células
Nota: Para iniciar a adesão,As células T deve ser estimulada. Na experiência seguinte as células ou permanecerá não estimuladas ou estimuladas com a SDF-1α 12 ou acetato de miristato de forbol (PMA; controlo positivo) 13. Para apresentação adequada de quimiocina para células T, as células CHO-ICAM são pré-incubados com SDF-1α (seguido por lavagens em série), permitindo a apresentação na superfície celular. PMA é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro glicerol diacil (DAG); aqui é usado como um controlo positivo. As células T são tratados directamente com PMA antes de carregar para dentro da câmara de fluxo.
- Colocar a lâmina câmara de fluxo no microscópio e definir o plano focal sobre a monocamada de células CHO-ICAM usando a objectiva de 20x.
- Manter as células T CFSE manchada por todas as outras condições no bloco de calor C 37 °. Preparar as células CHO-ICAM ou T como se segue imediatamente anterior ao ensaio para esta condição:
- Para a condição de não estimulada (câmara 1), mantenha um ch / tubo de fluxoâmbar não tratado, para servir como controlo negativo para a estimulação.
- Para a estimulação de PMA (câmara 2), estimular um tubo de células T com PMA (10 ng / ml) para servir como controlo positivo; tratar imediatamente antes do carregamento na câmara de fluxo.
- Para a estimulação SDF-1α, (a câmara 3), estimular a câmara de fluxo terceiro com SDF-1α (100 ng / ml), removendo 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório superior (reservatório de saída) e, em seguida, adicionar 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) para dentro do reservatório inferior de (reservatório de entrada). Incubar durante 5 min.
- Remover e descartar 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório de uma câmara de saída.
- Adicionar 70 ul de suspensão de células pré-tratadas (conforme o caso) T para dentro do reservatório de entrada 3 vezes. Esperar 5 min para permitir que as células se mover a partir da entrada da câmara ( "In"), e para alcançar a saída proximal ( "out") da câmara.
- Durante esse tempo, a imagem 5campos para células T CFSE manchada. Escolha campos que estão dispersas por todo o centro da câmara (Figura 1). Use as seguintes condições de excitação / emissão: excitação laser de comprimento de onda: 488 nm; emissão de filtro de recolha: 500 - 540 nm. Estas imagens servirá como as contagens de células pré-fluxo.
- Conecte a tubulação de entrada e saída simultaneamente para os reservatórios de câmara de fluxo.
Nota: Colocar o tubo em simultâneo é essencial de modo a não introduzir bolhas de ar para dentro da câmara de equilíbrio e manutenção geral no interior da câmara. - Inicie o fluxo a 0,3 ml / min (0,4 dines / cm2), visualizando as células T-coradas com CFSE. Como o fluxo começa, especialmente com a primeira câmara, existe muitas vezes um atraso entre o início do fluxo e observação de rolamento de células T, por conseguinte, começar a cronometragem 5 min, no início do movimento de células T.
- Terminar fluxo após 5 min, e de imagem 5 campos no canal CFSE. Escolha campos dispersos aleatoriamente throughout o centro da câmara de fluxo (Figura 1). Estas imagens servirá como as contagens de células pós-fluxo.
5. determinação da percentagem de células aderentes
Nota: a determinação do número de células nas imagens adquiridas é feito objectivamente com software automatizado. Para os nossos estudos, utilizamos o Volocity software (versão 6.2.1), mas outros softwares como o ImageJ (versão 1.48V) também são aplicáveis.
- Determinar o número de células por campo pré-fluxo para cada condição. A média dos 5 domínios é a "contagem média de células pré-fluxo." 7
- Determinar o número de células por campo de pós-fluxo para cada condição. A média dos 5 campos é a "contagem de células média de pós-fluxo." 7
- Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (contagem média de células pós-fluxo) (contagem de células pré-fluxo médio) / x 100%.
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Representative Results
Os resultados representativos são apresentados a partir do ensaio de adesão de Jurkat e de fluxo utilizando células T CD3 + humanos primária, tal como indicado, estimuladas com SDF-1α. Os controlos negativos em todas as experiências mostradas são células não estimuladas. Um limiar basal percentagem de adesão das células não estimuladas é entre 5 - 10%; adesão de base notadamente acima dessa faixa indica uma experiência problemática e sugere a população início de células T foram de maneira inespecífica pré-ativado em preparação. Fold aumento no número de células aderentes de pós-fluxo em cada condição de que mais de células não estimuladas podem ser calculados, para além do cálculo da percentagem de adesão. Os dados que representam estes dois métodos de cálculo é incluído aqui.
A figura 2A mostra imagens representativas de áreas no interior da câmara de fluxo para cada condição pré- e pós-escoamento. Antes do experimento, Jurkat (showN na figura 2A) ou células T CD3 + humanos primários são purificados, contadas, e marcadas com CFSE. Para cada condição experimental 2 X 10 6 células foram marcadas. As células T não estimuladas foram carregadas em câmaras de fluxo contendo células CHO-ICAM na presença ou ausência de SDF-1α. As células T foram deixados a mover-se e acumulam-se na câmara durante 5 minutos, e durante este tempo imagens foram capturadas para determinar as contagens de pré-fluxo. Um número comparável de células pré-fluxo entre os diferentes estímulos é essencial para assegurar condições experimentais uniformes. Seguindo 5 min de tensão de cisalhamento contínua gerada pelo fluxo, as imagens foram novamente capturado para determinar a contagem de pós-fluxo. É evidente através destas imagens representativas que o SDF-1α aumentam o número de células T capazes de aderir às células CHO-ICAM sob tensão de corte.
A Figura 2B mostra a variação vezes na adesão das células T como calculada com base no número de células T de Jurkat, pré e pós-escoamento, quer não estimuladas ou na presença de SDF-1α. Para cada condição, as contagens médias de células de 5 campos pré-fluxo e 5 campos foram determinados pós-escoamento, e uma comparação de estimulação SDF-1α para não estimulada é usado para calcular a mudança vezes na adesão das células T. Como mostrado aqui, SDF-1α induz um aumento de 2 vezes perto na adesão em comparação com não-estimuladas.
A Figura 2C mostra um método alternativo para o cálculo dos dados. Aqui, a percentagem de adesão das células primárias humanas CD3 + T na presença ou ausência de SDF-1α é determinada determinando em primeiro lugar as contagens de células T pré e pós de fluxo médio, em seguida, dividindo-se a média de pós-fluxo pela média pré-fluxo e multiplicando por 100. através deste cálculo toda a população pré-fluxo representa 100% de adesão. Como mostrado aqui, 15% de células T não estimuladas aderir sob cisalhamento streSS, em comparação com 50% de células T estimuladas com SDF-1α.
Figura 1. É importante analisar apenas áreas expostas ao fluxo homogêneo. Representação esquemática das câmaras de fluxo usados com indicação de onde os campos devem ser trabalhada. De acordo com as informações fornecidas pelos fabricantes de câmaras, a taxa de fluxo pré-conjunto só pode ser conseguida através do centro das câmaras, indicado por laranja neste esquema. Mais perto das fronteiras da câmara diminui a taxa de fluxo e não deve ser incluída na imagem latente experimental ou análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. <forte> SDF-1α induz a adesão de células T a ICAM-1 sob tensão de corte. A. Células T Jurkat foram marcadas com CFSE a uma concentração de 5 uM. Em seguida, as células foram carregadas nas câmaras de fluxo que foram pré-tratados com SDF-1α (100 ng / ml) ou não estimuladas e criados no microscópio confocal e podem mover e acumulam-se na câmara durante 5 min. Alternativamente, as células T de Jurkat foram pré-tratadas com PMA (10 ng / ml) antes da adição às câmaras de fluxo. Ao longo dessas imagens pré-flow 5 min foram capturados. O fluxo foi então iniciada a 0,4 dines / cm2 para criar a tensão de corte durante 5 min. Após a conclusão, as imagens pós-fluxo foram capturados. Imagens representativas de células T de Jurkat são mostrados, barra de escala 50? M. B. Dobra mudança na adesão de células Jurkat T foi calculada determinando em primeiro lugar as contagens de células pré e pós-fluxo médio para cada condição e dividindo-se a contagem média de fluxo pós- pelo co média pré-fluxount individualmente para cada condição. Este quociente de adesão para cada condição de estimulação, aqui SDF-1α ou PMA, é então dividido pelo quociente aderência não estimulada para determinar a mudança vezes na adesão. As barras representam média de 3 experiências ± SEM. C. adesão por cento das células T CD3 + humanos primária foi calculada pela primeira determinação das contagens de células pré-médio e pós-fluxo para cada condição. Para cada condição, a contagem média de pós-fluxo é dividido pela média da contagem pré-fluxo e multiplicado por 100. A percentagem de adesão resultante baseia-se na contagem de células pré-fluxo ser de 100% de adesão. As barras representam média de 5 experiências ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. TCélulas primeiro acumular então o fluxo através da monocamada de células CHO-ICAM. As células T de Jurkat foram marcadas com CFSE a uma concentração de 5 uM. Em seguida, as células foram carregadas nas câmaras de fluxo que foram pré-tratados com SDF-1α (100 ng / ml) e criados no microscópio confocal e podem mover e acumulam-se na câmara durante 5 min. Ao longo destes 5 min imagens foram capturadas como uma série de lapso de tempo; ainda quadros (A). O fluxo foi então iniciada a 0,4 dines / cm2 para criar a tensão de corte durante 5 min. Ao longo destes 5 min imagens foram capturadas como uma série de lapso de tempo; ainda quadros (B). A direcção do fluxo no destas imagens é de baixo para cima, e o plano focal está definido na monocamada de células CHO-ICAM. As células T podem ser classificadas em 3 grupos: (1) células T que rolam ao longo da monocamada com o caudal são visualizadas como curtas, linhas horizontais que se deslocam de baixo para cima através do campo, uma vez que se movem rapidamente enquanto está a ser trabalhada. (2) células T crawling ao longo da monocamada. Estas células são firmemente aderido com base na resistência ao fluxo, e são provavelmente o rastreamento em busca de uma área permissiva para a passagem celular, que não é observada neste modelo. (3) células T que aderem firmemente à monocamada, são resistente ao fluxo, mas são imóveis. Essas células não estão rolando ativamente ou rastejando ao longo da monocamada. Uma análise mais sofisticada pode ser feito, com base nos objectivos do estudo, através do uso de um script ImageJ concebido para dissecar estas populações de células para posterior quantificação ou caracterização. Escala de barras 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Células CHO-ICAM deve formar uma monocamada confluente. Imagem representativa de um confluente CHO-ICAM monolayer dentro de uma câmara de fluxo. Barra de escala de 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático 10 é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacções das células de células T-epitelial. In vivo, como quimiocinas são apresentados ao longo do endotélio, células T de rolamento devem responder, aderindo e resistir à tensão de corte do fluxo de sangue firmemente 14,15. Por este motivo, o estudo da sinalização da quimiocina é o mais adequado para ser estudado num ensaio que incorpora tensão de cisalhamento. A principal vantagem desta adesão usando condições de fluxo é a sua simplicidade na modelagem das interações entre células T e integrinas. Este ensaio combina bastante exclusivamente função e mecanicistaestudos de modelagem de um ambiente para o estudo de uma integrina-adesão par molécula. Outro ponto forte deste método é a sua adaptabilidade; este método pode ser utilizado para quantificar a aderência de leucócitos a qualquer qualquer molécula de adesão. Este método pode ser utilizado para pesquisar o efeito de múltiplas drogas ou manipulações genéticas possam alterar o recrutamento de células T e extravasamento através da activação de integrina alterada.
Como acontece com qualquer processo in vitro, há algumas limitações deste ensaio. Este modelo utiliza engenharia células CHO em vez de células endoteliais primárias estimuladas como outros modelos usaram. 16 Enquanto isso nos dá a capacidade de compreender os eventos de sinalização que influenciam o estado de ativação de uma única integrina, isso também pode ser considerado uma fraqueza do modelo. Como não há selectinas expressas pelas células CHO, o ensaio é realizado em dois passos. Durante a primeira fase (a fase de acumulação), as células T são injectados na entrada Reservoir a um lado da câmara e viajar para o outro lado a pressão mínima e forças capilares. O comportamento das células T ao longo de 5 min estas podem ser observadas na Figura 3A. Depois de 5 min, e durante a segunda fase (a fase de fluxo) a taxa de fluxo é aumentada e as células começam a rolar e aderir. É importante observar que nem todas as células T injectadas no movimento de entrada do reservatório através da câmara durante a fase de acumulação, e estas células não rolar ao longo da monocamada de fluxo é aumentada (Figura 3B). Desta forma, a fase de laminagem do extravasamento é artificialmente aumentada, mas não eliminada, neste modelo.
Uma vez que o número máximo de células aderentes é uma expressão do número de células de entrada, que entra para dentro da câmara há o potencial de variabilidade entre experiências número bruto. Enquanto as imagens de pré-fluxo não representa totalmente a população de células T máximo de 100%, porque eles não levam em account o reservatório de entrada, que é um controlo importante para incluir nos cálculos, especialmente quando dois tipos diferentes de células contados individualmente estão a ser comparadas. Além disso, não é recomendado que os linfócitos de sopro primário ser usado em uma única análise de aderência variável. Ou seja, pré-estimulação das células T através de receptores de células T (TCR) e / ou co-receptores podem confundir o efeito do tratamento de interesse na adesão. Essas variáveis devem ser consideradas durante o projeto experimental. Da mesma forma, estudos funcionais com PBMC previamente congelados muitas vezes produzir resultados de confusão e, por essa razão linhas celulares ou recentemente isolados PBMC primárias funcionam melhor com este ensaio. A compreensão do nível de base normal da adesão não estimulado por PBMC incluídos no estudo é crítica na identificação de uma população de células que foi pré-activada de forma não específica conduz a resultados de confusão.
Para replicar este ensaio com precisão, é essencial que alguns etapas no protocolo, incluindo os tempos de sedimentação e de incubação de fluxo, ser preciso e uniforme entre todas as condições. Nesta mesma luz, as células CHO-ICAM deve ser uniformemente confluentes em todas as câmaras de fluxo (Figura 4) e as contagens de células T deve também ser mais preciso. 17 Mesmo pequenas diferenças na estes factores podem influenciar a precisão de contagem de células no final. Uma aplicação futura deste ensaio é o desenvolvimento de uma série de linhas de células que expressam individualmente as selectinas e as moléculas de adesão para expandir o impacto deste método com outras cascatas de sinalização.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
