Summary
Denna vidhäftningsflödesanalys ger en enkel, hög modell av T-cell-epitelceller interaktioner inverkan. En sprutpump används för att generera skjuvspänning, och konfokal mikroskopi fångar bilder för kvantifiering. Målet med dessa studier är att på ett effektivt sätt kvantifiera T-cell adhesion med hjälp av flödesförhållanden.
Abstract
Totalt sett är T-cell-adhesion en kritisk komponent i funktion, vilket bidrar till de distinkta processer av cellrekrytering till inflammationsställen och interaktion med antigenpresenterande celler (APC) i bildandet av immunologiska synapser. Dessa två sammanhang av T-cell adhesion skiljer sig genom att T-cell-APC interaktioner kan anses statisk, medan T-cell-blodkärls interaktioner utmanas av skjuvspänningen som genereras av cirkulation själv. T-cell-APC-interaktioner klassificeras som statisk eftersom de två cellulära partners är statiska i förhållande till varandra. Vanligtvis sker denna växelverkan inom lymfkörtlarna. Som en T-cell samverkar med blodkärlsväggen, cellerna gripa och måste motstå den genererade skjuvspänningen. 1,2 Dessa skillnader understryker behovet av att bättre förstå statisk vidhäftning och vidhäftning under flödesförhållanden som två skilda regulatoriska processer. Regleringen av T-cell adhesion kan de flesta kortfattat beskrivas som controlling affinitetstillstånd grin molekyler som uttrycks på cellytan, och därmed reglera interaktionen av integriner med adhesionsmolekylen-ligander som uttrycks på ytan av det samverkande cellen. Vår nuvarande förståelse av regleringen av integrin affinitetstillstånd kommer från ofta förenklad i modell vitro-system. Analysen av vidhäftning med användning av flödesförhållanden som beskrivs här gör det möjligt för visualisering och noggrann kvantifiering av T-cell-epitelial cell-interaktioner i realtid efter ett stimulus. En adhesion under analys flöde kan tillämpas på studier av vidhäftning signalerings inom T-celler efter behandling med hämmande eller stimulerande ämnen. Dessutom kan denna analys utvidgas bortom T-cell-signalering till varje vidhäftande leukocytpopulation och varje grin-adhesionsmolekyl paret.
Introduction
T-lymfocyter vidhäftning förmedlar ett antal distinkta processer i ett friskt immunsystem, tre spela kritiska roller i T-cell trafficking och antigenpresentation. Huruvida under immunövervakning eller ett aktivt immunsvar dessa två breda roller för vidhäftning är kritiska. 4 De fysiologiska signaleringshändelser av T-cell-endoteliala cellinteraktioner är distinkta från T-cell-antigenpresenterande cell (APC) interaktioner, och därför kräver olika metoder för studie för att bäst förstå signaleringskaskader inblandade. Företaget vidhäftning av en T-cell till en blodkärlsvägg under lymfocyter extravasering kräver snabb och dynamisk grin aktivering. Den snäva växelverkan mellan ett aktivt tillstånd grin och adhesionsmolekyler längs endotelet leder till vidhäftning resistent mot flödet av blod, vilket gör att T-celler att krypa längs ytan på jakt efter ett område tillåtande till cellpassage. 5 för genomsökning av en T-cell bi -directionally alonga blodkärlsväggen är beroende av polariserade adhesion, med en distinkt adhesiv främre änden av den T-cellen. 6 Viktigast starka adhesion och migration kräver motstånd mot skjuvkraft som alstras genom att cirkulera blodflödet.
Vid utformningen av experiment för att studera lymfocytadhesion bör uppmärksamhet ägnas åt den specifika stimulansen av intresse. Medan integrinaktivering är en vanlig och viktig del av alla former av T-cell adhesion, kaskader av aktivering kommer sannolikt att vara unik nedströms individuella receptorer och co-receptorer. Likaså integrin och adhesionsmolekyl par fungerar i specialiserade mikromiljöer och på specifika subpopulationer. På detta sätt kan dessa par regleras helt annorlunda. Den modell som presenteras här är idealisk för att studera signaleringskaskader som leder till integrinaktivering sker under skjuvspänning förhållanden. 7 Dessa interaktioner kan inte förstås tillräckligt i en statisk adhesipå systemet på grund av effekterna dessa krafter har visat sig ha direkt på T-cellbeteende. 8 Även presenteras här med T-celler och CHO (Chinese Hamster Ovary) celler manipulerade att uttrycka human ICAM-1 (CHO-ICAM-celler) Systemet kan lätt modifieras för att studera olika leukocytpopulationer eller adhesionsmolekyler.
Denna analys tillhandahåller en metod för att kvantifiera T-cellvidhäftningsförmåga och integrin-aktivering med hjälp av skjuvspänning, vilket ger en modell för fast vidhäftning skede av leukocyter extravasering. Genom användning av CHO-ICAM-celler kan undersökas affiniteten hos LFA-1 för sin ligand i levande celler i realtid som svar på olika stimuli av intresse. Denna teknik kräver lätt erhållas, kommersiellt tillgängliga mikroflödeskammare i kombination med en sprutpump, kraftigt förenkla den utrustning som krävs för att modellera blodflödet och skjuvning stress jämfört med andra modeller. 9 En annan stor fördel med denna analys är att specifika signaleringskaskader och den resulterande aktiveringstillstånd enskilda integriner kan rent studeras genom användning av konstruerade CHO-celler som uttrycker humana adhesionsmolekyler av intresse. Dessutom är kombinationen av kvantitativa data med levande cell imaging en betydande fördel med denna metod. Sammantaget medan ett antal analyser av statisk T-cell adhesion har beskrivits som fint modell T-cell-APC-interaktioner, dessa modeller är otillräckliga i att fånga den dynamiska processen för T-cell-epitelial vidhäftning. Av denna anledning, när man väljer ett vidhäftningsanalysen stimulans i fråga måste övervägas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating CHO-ICAM-celler
Obs: Målet med detta steg är att plätera de CHO-ICAM-celler i flödeskamrarna för tillväxt över natten med målsättningen att generera ett sammanflytande monoskikt.
- Upprätthålla CHO-ICAM-celler i 10 cm vävnadsodlingsbehandlade odlingsskålar i 10 ml RPMI-medium som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplett odlingsmedium) vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Att samla upp celler, tillsätt 1 ml 0,5% trypsin-EDTA och inkubera vid rumstemperatur under 1 min med försiktig skakning. Neutralisera trypsinet med 4 ml av media.
- Räkna CHO-ICAM-celler med hjälp av en hemacytometer och beräkna 0,75 x 10 5 celler per kammare. Obs: I detta experiment: 2,25 x 10 5 celler kommer att behövas för att ympa 3 kammare.
- Centrifug 0,75 x 10 5 CHO-ICAM celler per kammare under 5 min vid 500 xg, rumstemperatur och resuspendera cellpelleten i 30 ^ per kammare CHO-ICAM Fullständigt odlingsmedia.
Obs: I detta experiment kommer att behövas 90 pl till utsäde 3 kammare. - Tillsätt långsamt cellerna till en reservoar av flödeskammaren. Tillåta cellerna att sedimentera under 5 min i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Tillsätt 200 pl av kompletta odlingsmedia över de två reservoarerna i varje kammare. Alternativa tillägg mellan de två för att undvika rörelse av cellerna som systemet jämvikt.
- Inkubera cellerna över natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
2. Framställning av T-cellerna
Notera: Denna analys kan göras med primära humana T-celler eller en T-cellinje. Ett protokoll på T-cell isolering från blod har beskrivits tidigare. 10 Om du använder primära humana T-celler använder nyisolerade celler för bästa resultat. Vid användning av en T-cellinje, följ kultur protokoll som specificeras av källan av cellerna. För att detektera de celler på en fluorescerande microscope T-cellerna märks med karboxi fluorescein-succinimidylester (CFSE).
- Räkna T-cellerna med användning av en hemacytometer och beräkna 2 x 10 6 celler per kammare. Obs: I detta experiment kommer 6 x 10 6 celler behövas för 3 kammare.
- Centrifugera 2 x 10 6 T celler per kammare under 5 minuter vid 500 xg, rumstemperatur och suspendera cellerna i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% glukos eller 2% FBS.
- Lägg CFSE vid 1: 1000 utspädning (lager görs till 5 mM). Täcka från ljus och inkubera i 8 min vid RT
- Snurra vid 500 xg under 5 min, RT.
- Resuspendera cellpelleten med 240 pl per tillstånd (se avsnitt 4 "not") RPMI media som saknar serum. I detta experiment, resuspendera cellpelleten i 720 pl vanligt RPMI. Dela upp cellerna i tomma 1,5 ml rör märkta för varje kammare, 240 ul per rör. Hålla celler i ett 37 ° C värmeblock fram till användning.
3. Ställa in the Input / Output spolning och sprutpump
- Värm mikroskopet levande avbildning kammaren till 37 ° C.
- Förbered ingångs spolning:
- Fyll en 500 ml glasflaska med vatten och gör 2 hål i locket. Märk hålen "i" och "ut." Detta kommer att fungera som en värme vattenbad under material som matas in.
- Kör ingångs spolning genom hålen i locket och in i vattenbad. Säkerställa att den sida av spolning som ansluter till sprutan kommer genom "i" hål och den sida som kommer att ansluta till ingångs reservoaren kommer genom "ut" hålet.
- Spola ingångs spolning med 60 ml vatten för att avlägsna all luft ur systemet.
- Prime ingångs spolning med RPMI-medium som saknar serum värms till 37 ° C. Fyll en 60 ml spruta och driva igenom media tills spolning är helt grundad och saknar eventuella luftbubblor.
Obs! Beroende på length av slangar som används den volym som krävs för att prima kommer att variera.- Beräkna volymen av media som krävs för experimentet genom att multiplicera hastigheten av flöde (här 0,3 ml / min) med antalet minuter (5 min) av antalet kamrar i experimentet (här tre); i detta experiment, använda 4,5 ml medium. Obs: Vi rekommenderar att 5 ml extra volym (här totalt 9,5 ml) kvar i sprutan efter priming.
- Placera hela ingångs inställning till levande avbildning hölje mikroskop för att bibehålla 37 ° C. Kör spolning och spruta ut ur höljet och ladda sprutan i sprutpumpen.
- Förbered utgång slang:
- Göra ett hål i locket på en 250 ml flaska att använda som utgångs avfall.
- Köra den utgående slangen genom hålet och in i flaskan. Löst säkra locket inte stänga hela vägen.
- Placera den utgående inställningar i levande avbildning hölje av mimikroskop.
- Beräkna flödet (ml / min) som krävs för att generera den önskade skjuvpåkänning (dyn / cm 2). Skjuvspänning varierar i olika vaskulära fack, därför ta hänsyn till den övergripande modell inklusive celltyper som skall studeras och behandlingar när beslut fattas om en skjuvspänning nivå.
Obs: Dessa experiment genomförs vid 0,4 dyn / cm 2 till nära efterlikna en liten ven inställning.- Ta kammardimensioner beaktas vid beräkningen av skjuvspänning. Använd följande formel (tillhandahålls av tillverkaren 11) för flödeskammare som används här (se tabell of Materials): T = η * 176,1 * ø där T = skjuvspänning, η = dynamisk viskositet, ø = flödeshastighet. Obs: Den dynamiska viskositeten för RPMI-medium vid 37 ° C är 0,007.
4. Laddning av Flow Chambers och Stimulering av cellerna
Obs: För att initiera adhesion,T-celler måste stimuleras. I följande experiment cellerna kommer antingen förbli ostimulerade eller stimuleras med SDF-1α 12 eller forbolmyristatacetat (PMA; positiv kontroll) 13. För korrekt presentation av kemokin till T-cell, är CHO-ICAM-celler förinkuberades med SDF-1α (följt av serie tvättar), vilket möjliggör presentation på cellytan. PMA är en forbolester som strukturellt liknar den andra budbäraren diacylglycerol (DAG); här det används som en positiv kontroll. T-celler direkt behandlas med PMA före laddning i flödet kammaren.
- Placera flödet kammaren glida på mikroskop och ställa fokalplanet på CHO-ICAM monolager med hjälp av 20X mål.
- Håll CFSE-färgade T-celler för alla andra förhållanden i 37 ° C värmeblock. Framställa de CHO-ICAM eller T-celler som följer omedelbart före analysen för att detta villkor:
- För ostimulerade tillstånd (kammaren 1), hålla ett rör / flöde chbärnsten obehandlade, för att tjäna som negativ kontroll för stimulering.
- För PMA-stimulering (kammare 2), stimulera ett rör av T-celler med PMA (10 ng / ml) för att tjäna som positiv kontroll; behandla omedelbart före lastning i flödeskammaren.
- För SDF-1α stimulering, (kammare 3), stimulera den tredje flödeskammare med SDF-1α (100 ng / ml) genom att ta bort 70 | il vid en tidpunkt 3 gånger från den övre reservoaren (output reservoar) och därefter tillsats av 70 | il av SDF -1α (100 ng / ml) i den nedre reservoaren (input reservoar). Inkubera i 5 min.
- Ta bort och kasta 70 pl vid en tidpunkt 3 gånger från utgångs reservoar av en kammare.
- Lägg 70 pl förbehandlade (i förekommande fall) T cellsuspensionen i inmatningsbehållaren 3 gånger. Vänta 5 min för att tillåta cellerna att röra sig från inloppet av kammaren ( "I"), och för att nå den proximala utloppet ( "Out") av kammaren.
- Under denna tid, bild 5fält för CFSE-färgade T-celler. Välj fält som är spridda över hela centrum av kammaren (Figur 1). Använd följande excitation / emissionsvillkor: excitation laser våglängd: 488 nm; emissionsuppsamlingsfilter: 500-540 nm. Dessa bilder kommer att fungera som pre-flöde kroppar.
- Fäst ingångs- och utgångsslangen samtidigt flödet kammaren reservoarer.
Obs: Montera slangen samtidigt är kritisk för att inte införa luftbubblor i kammaren och att upprätthålla den allmänna jämvikten i kammaren. - Börja flöde på 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2) medan visualisera CFSE-färgade T-celler. Som flödet börjar, särskilt med den första kammaren, finns det ofta en fördröjning mellan att initiera flöde och observera T-cells rullande, därför börja timing 5 minuter i början av T-cellrörelse.
- Avsluta flödet efter 5 min, och bild 5 fält i CFSE-kanalen. Välj fält slumpmässigt spridda throughout centrum av flödet kammaren (Figur 1). Dessa bilder kommer att fungera som efterflödeskroppar.
5. Fastställande av Andel vidhäftande celler
Obs: Fastställande av antalet celler i de förvärvade bilderna görs objektivt med automatiserad programvara. För våra studier har vi använt programvaran Volocity (version 6.2.1), men andra program som ImageJ (version 1.48V) är också tillämpliga.
- Bestämma antalet celler per fält före flöde för varje tillstånd. Genomsnittet av de 5 fält är "pre-flöde genomsnittlig cellräkning." 7
- Bestämma antalet celler per fält efter flöde för varje tillstånd. Genomsnittet av de 5 fält är "post-flöde genomsnittlig cellräkning." 7
- Beräkna den procentuella andelen av adherenta celler genom att använda följande formel: Procent vidhäftande celler = (post-flöde genomsnittlig cellräkning) / (pre-flöde medelcellantal) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat visas från vidhäftningsflödesanalys med användning av Jurkat och primära humana CD3 + T-celler, såsom anges, stimulerades med SDF-1α. De negativa kontrollerna i alla experiment som visas är ostimulerade celler. En tröskel basal procent adhesion av ostimulerade celler är mellan 5-10%; bas adhesion särskilt över detta område indikerar en problematisk experiment och föreslår start populationen av T-celler ospecifikt föraktiverad under utarbetande. Faldig ökning av antalet vidhäftande celler efter flöde i varje tillstånd jämfört med den för ostimulerade celler kan beräknas utöver beräkningen av procent adhesion. Data som representerar de två beräkningsmetoder ingår här.
Figur 2A visar representativa bilder av områden som omfattas av flödeskammaren för varje tillstånd före och efter flöde. Före experimentet, Jurkat (shown i figur 2A) eller primära humana CD3 + T-celler renas, räknades och märkt med CFSE. För varje experimentell tillstånd 2 x 10 6 celler märktes. Ostimulerade T-celler laddades i flödeskamrarna innehållande CHO-ICAM-celler i närvaro eller frånvaro av SDF-1α. T-cellerna tilläts att röra sig och ackumuleras i kammaren under 5 min, och under denna tid bilder fångades för att bestämma de pre-flödes räknas. Ett jämförbart antal celler pre-flöde mellan de olika stimuli är nödvändig för att tillförsäkra enhetliga experimentella betingelser. Efter fem minuter av kontinuerlig skjuvspänning som genereras av flöde, var bilderna igen fångas för att bestämma efterflödes räknas. Det är uppenbart genom dessa representativa bilder som SDF-1α ökar antalet T-celler med förmåga att vidhäfta till de CHO-ICAM celler under skjuvspänning.
Figur 2B visar faldig förändring i T-cell vidhäftning calnas baserat på antalet Jurkat T-celler före och efter flödes antingen ostimulerade eller i närvaro av SDF-1α. För varje tillstånd den genomsnittliga celltal av 5 fält före flöde och 5 fält efter flöde bestämdes, och en jämförelse av SDF-1α stimulering till ostimulerade används för att beräkna faldig förändring i T-cell adhesion. Som visas här, SDF-1α inducerar en nära 2-faldig ökning av adhesion jämfört med ostimulerade.
Figur 2C visar en alternativ metod för databeräkning. Här den procentuella vidhäftningen av primära humana CD3 + T-celler i närvaro eller frånvaro av SDF-1α bestäms genom att först bestämma de genomsnittliga före och efter flödes T cellräkningar, sedan dividera den genomsnittliga post-flöde med genomsnittligt pre-flöde och multiplicera med 100. genom denna beräkning hela pre-flöde befolkning utgör 100% vidhäftning. Som visas här, 15% av ostimulerade T-celler vidhäfta under skjuvning stress i jämförelse med 50% av T-celler som stimulerats med SDF-1α.
Figur 1. Det är viktigt att analysera endast områden som är utsatta för homogent flöde. Schematisk bild av flödeskammare som används med uppgift om var fält ska avbildas. Enligt uppgifter från kammar tillverkare, är flödeshastigheten förinställda endast uppnås genom centrum av kamrarna, som indikeras av orange i denna schematiska. Närmare gränser kammarens flödeshastigheten minskar och bör inte ingå i experimentell avbildning eller analys. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. <strong> SDF-1α inducerar T-cellvidhäftning till ICAM-1 under skjuvspänning. A. Jurkat T-celler märktes med CFSE vid en koncentration av 5 ^ M. Därefter cellerna laddas in i flödeskamrarna som förbehandlats med SDF-1α (100 ng / ml) eller ostimulerad och som inrättats på konfokalmikroskop och tillåts att röra sig och ackumuleras i kammaren under 5 min. Alternativt var Jurkat T-celler förbehandlades med PMA (10 ng / ml) före tillsats till de flödeskamrarna. I alla de 5 min före flödes bilder fångades. Flöde initierades sedan vid 0,4 dyn / cm 2 för att skapa skjuvspänning under 5 min. Vid fullbordades efter-flödesbilder tas. Representativa bilder av Jurkat T-celler visas, skala bar 50 ^ m. B. faldig förändring av adhesion av Jurkat T-celler beräknades genom att först bestämma de genomsnittliga före och efter flödescellräkningar för varje tillstånd och dividera den genomsnittliga räkningen post-flöde av de genomsnittliga koldioxid pre-flödeunt individuellt för varje tillstånd. Denna vidhäftning kvoten för varje stimuleringstillstånd, här SDF-1α eller PMA, divideras sedan med den ostimulerade vidhäftning kvoten för att bestämma den faldig förändring av vidhäftning. Staplarna representerar medelvärdet av 3 experiment ± SEM. C. Procent vidhäftning av primära humana CD3 + T-celler beräknades genom att först bestämma de genomsnittliga före och efter flödescellräkningar för varje tillstånd. För varje tillstånd, är den genomsnittliga räkningen efterflöde dividerat med medelantal pre-flöde och multiplicerat med 100. Den erhållna procent adhesion baseras på räknevärdet pre-flödescellen är 100% vidhäftning. Staplar representerar genomsnitt 5 experiment ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. TCellerna först ackumuleras sedan strömma över CHO-ICAM monolager. Jurkat T-celler märktes med CFSE vid en koncentration av 5 ^ M. Därefter tillsattes cellerna laddas in i flödeskamrarna som förbehandlades med SDF-1α (100 ng / ml) och som inrättats på konfokalmikroskop och tillåts att röra sig och ackumuleras i kammaren under 5 min. Under dessa 5 min bilder fångades som en time-lapse-serien; stillbilder (A). Flöde initierades sedan vid 0,4 dyn / cm 2 för att skapa skjuvspänning under 5 min. Under dessa 5 min bilder fångades som en time-lapse-serien; stillbilder (B). Flödesriktningen i dessa bilder är från botten till toppen, och fokalplanet är satt till den CHO-ICAM monoskiktet. T-celler kan delas in i 3 grupper: (1) T-celler som rullar längs monoskikt vid en flödeshastighet visualiseras som korta, horisontella linjer som rör sig från botten till toppen över fältet eftersom de rör sig snabbt samtidigt som avbildas. (2) T-celler crawling längs monoskiktet. Dessa celler är fast vidhäftad baserat på flödesmotståndet, och kryper sannolikt på jakt efter ett område tillåtande cellulär passage, som inte observerats i denna modell. (3) T-celler som är fast vidhäftar till monolagret, är resistenta att flyta, men är orörliga. Dessa celler är inte aktivt rullar eller kryper längs monoskiktet. En mer sofistikerad analys kan göras, baserat på målen för studien, med hjälp av en ImageJ skript för att dissekera dessa cellpopulationer för ytterligare kvantifiering eller karakterisering. Skalstrecken 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. CHO-ICAM-celler måste bilda en sammanhängande monolager. Representativ bild av en sammanflytande CHO-ICAM monolayer inom en flödeskammare. Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att kunna analysera T-cell adhesion, till stimulerande ingå i studien måste beaktas när man väljer en in vitro-metod. Medan det finns flera analyser för att studera signaler som leder till LFA-1-aktivering och ICAM-1-bindning alla metoder är inte utbytbara. En statisk vidhäftningsanalys 10 är bäst lämpad för att studera T-cell-APC interaktioner; alternativt, är skjuvspänningen metoden beskriven här idealiskt för att modellera T-cell-epitelceller interaktioner. In vivo, som kemokiner presenteras tillsammans endotelet, rullande T-celler måste svara med fast vidhäftning och motstå skjuvspänning av blodflödet 14,15. Av denna anledning, är studiet av kemokin signalerings bäst lämpad för att studeras i en analys som inkorporerar skjuvspänning. Den primära fördelen med denna vidhäftning med användning flödesförhållanden är dess enkelhet i att modellera interaktionerna mellan T-celler och integriner. Denna analys kombinerar ganska unikt funktion och mekanistiskastudier av modellering en miljö för studiet av en integrin-adhesionsmolekyl par. En annan styrka med denna metod är dess anpassningsförmåga; denna metod kan användas för att kvantifiera vidhäftningen av alla leukocyter till någon adhesionsmolekyl. Denna metod kan användas för att screena effekten av flera läkemedel eller genetiska manipulationer som förväntas förändra T-cell rekrytering och extravasation genom förändrad grin-aktivering.
Som med alla in vitro-metod, finns det vissa begränsningar av denna analys. Denna modell använder konstruerad CHO-celler snarare än stimulerade primära endotelceller som andra modeller har använt. 16 Även om detta ger oss möjlighet att förstå de signaleringshändelser som påverkar aktiveringstillståndet för en enda integrin, kan detta också vara en svaghet i modellen. Som det finns inga selektiner uttrycks av CHO-celler, utförs analysen görs i två steg. Under det första steget (ansamling fas), är T-cellerna injicerades i inmatnings reservoir vid en sida av kammaren och att resa till andra sidan av minimalt tryck och kapillärkrafter. Beteendet av T-cellerna under dessa 5 minuter kan observeras i Figur 3A. Efter 5 min, och under det andra steget (flödesfasen) flödeshastigheten ökas och cellerna kommer att börja att rulla och vidhäfta. Det är viktigt att notera att inte alla T-celler injicerade i inmatningsbehållaren rör sig över kammaren under ackumuleringen fasen, och dessa celler gör rulla längs monolagret som flödet ökas (figur 3B). På detta sätt är den valsningssteget av extravasation på konstgjord väg förbättras, men inte elimineras, i denna modell.
Eftersom det maximala antalet vidhäftande celler är ett uttryck för antalet ingångsceller som kommer in i kammaren finns det potential för rå antal variationsrikedomen bland experiment. Medan de förflödestiderna bilderna inte är helt representativ för 100% maximal T-cellpopulationen eftersom de inte tar hänsyn redovist ingångsreservoaren, är det en viktig kontroll för att ta med i beräkningarna speciellt när två olika celltyper räknas individuellt skall jämföras. Dessutom är det inte rekommenderat att det primära spräng lymfocyter användas i en enda variabel vidhäftningsanalys. Det vill säga, för-stimulering av T-cellerna genom T-cellreceptorer (TCR) och / eller co-receptorer kan förväxla effekten av behandling av ränta på vidhäftning. Dessa variabler bör övervägas vid experimentell design. Likaså funktionella studier med tidigare frysta PBMC ger ofta confounding resultat, och av denna anledning cellinjer eller nyligen isolerade primära PBMC fungerar bäst med denna analys. Förstå den normala basnivån av ostimulerad vidhäftning för PBMC som ingår i studien är kritisk i att identifiera en cellpopulation som har icke-specifikt föraktiverad leder till confounding resultat.
Att replikera denna analys med noggrannhet, är det viktigt att en del stegsi protokollet, inklusive sedimentering och flödes inkubationstider, vara exakt och enhetlig bland alla förhållanden. I samma ljus, måste CHO-ICAM-celler likformigt sammanflytande i alla flödeskammare (Figur 4) och cellräkning T måste också vara exakt. 17 Även små skillnader i dessa faktorer kan påverka noggrannheten hos cellräkningar i slutet. En framtida tillämpning av denna analys är att utveckla en serie av cellinjer individuellt uttrycker selektiner och adhesionsmolekyler att utvidga effekten av denna metod för att andra signaleringskaskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
