Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Published: June 6, 2016 doi: 10.3791/54204
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2,3
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 3Translational Research Institute, Mater Medical Research - University of Queensland

Summary

Здесь мы опишем методы для рассечения плода и материнских тканей от термина плаценты человека, с последующим выделением и расширением мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) из этих тканей.

Introduction

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) появляются в качестве перспективного кандидата для использования в клеточной терапии 1. Большинство приложений , по всей видимости целевой MSC-опосредованного восстановления тканей или иммунной регуляции 2. Во многих из этих применений, аллогенной MSC может быть столь же эффективным , как аутологичных МСК 3. Использование аллогенных MSC имеет экономическое преимущество быть совместимы с крупномасштабного производства нескольких доз клеток из одного источника ткани 4 для лечения многих пациентов.

Исторически сложилось так , доклинические и клинические исследования использовали ЦКМ , полученных из костного мозга 4. Костный мозг, как правило, собирают из гребня подвздошной кости донора добровольцев. Этот процесс является инвазивным, и лишь небольшой объем мозга (~ 20 мл) собирают через один прокол. Создание клинически значимых числа MSC требует обширной в расширении пробирке. Cell активность уменьшается с числом пассажей 4), которые могут быть собраны в асептических условиях в течение кесарева сечения без риска для донора. MSC полученный из плаценты имеют долгосрочный пролиферации 5 и иммуномодулирующее способность 6, более из костного мозга MSC. В предыдущем исследовании мы показали , что один термин плацента содержал достаточное количество MSC для производства до 7000 клинических доз 4. Эти характеристики делают плацента идеальным источником ткани для изготовления аллогенной MSC.

Плацента является fetomaternal орган , состоящий из как матери и плода ткани 7, и , таким образом , MSC плода или материнского происхождения может быть, теоретически, изолированы. Следующие ссылки предоставляют дехвостатые информация о развитии и патологии, а также микроскопического и макроскопического исследование плаценты человека и придатков 8,9. Плацента собственно состоит в основном из эмбриональных кровеносных сосудов и секреторных и поддерживающих клеток , называемых трофобласты, составляя хорионический ворсинки , охватываемые хориона frondosum (пластины) 8. Разветвленные плацентарные ворсинки купаются в материнской крови, доставленных из матки спиральных артерий, что позволяет питательных веществ, гормонов и газообмен между плодом и матерью. Плацента прикреплена к эндометрии через материнские децидуальными стромальных клеток и фетальных extravillious трофобласта перемежаются во внеклеточном матриксе 8. Ворсинок сходятся на эмбриональной хорионического пластины , где они образуют пуповину 8.

Итоги первого международного семинара по плацентарных стволовых клеток, полученных (2008) была оценка необходимости стандартизировать изоляцию и characterizatioп клеток из человеческого термина плаценты 10. Из-за анатомии плаценты, рассечение различных тканей, выделение MSC и ожидаемых результатов культуры может быть подавляющим для новичков в этой области. В этом протоколе, урожай плацентарных тканей хориона, а затем MSC изоляции и расширения тщательно детализированы. MSC характеристику с помощью проточной цитометрии и в пробирке дифференциации считаются рутинную 5,11-13, и , таким образом , лишь кратко подробно описаны здесь.

Как было отмечено в недавнем систематическом обзоре литературы 14, MSC , полученного из плацентарных ворсин хориона , как правило , предполагается плода. Несмотря на то, только 18% исследований изучили происхождение MSC, полученного, и из них только половина исследований сообщили плода MSC, а другая половина населения сообщили матери или смешанные MSC. Каждый из трех компонентов ткани, описанных здесь (хорионический ворсинки, хориона и децидуальной пластинчатые базального) являются Composed в основном из плода мембраны / ворсинок, а также небольшая часть маточных происхождения материнских клеток, которые остаются прикрепленными к поставляемому плаценты. Мы предоставляем данные , показывающие , что изоляция MSC от материнской стороны плаценты, а не плода стороны плаценты, как мы уже ранее сообщали 5,11, является более подходящим исходным материалом , если материнский MSC желательны. Этот протокол также описывает использование XY FISH для проверки плода или материнской вклад в клеточных культурах. Несмотря на то , что это стандартный протокол от производителя, этот анализ часто пренебрегают и его значение недооценивается 14.

Protocol

Исследовательские комитеты человека по этике в Mater служб здравоохранения, Royal Brisbane и женской больницы, Технологический университет Квинсленда и Университета Квинсленда одобрил исследование и сбор образцов плаценты человека, используемых в исследовании. Все протоколы выполнены с национальными руководящими принципами исследований. Пациенты при условии, что письменное информированное согласие на использование тканей для исследовательских целей.

Третий триместр плацента были получены от здоровых матерей следующих обычных кесарева сечения (КС) родов на срок от вышеупомянутых больниц в Брисбене, Австралия. Мужской дискордантные беременностей для срочных образцов были использованы в этом исследовании, чтобы отличить фетальной от материнских клеток. Фетальный пол был определен с помощью ультразвука до рождения и / или визуальный осмотр новорожденному при рождении медицинским персоналом. X и Y - хромосома флуоресценции в гибридизация (FISH) в была использована для дальнейшей проверки и пол плода или материнского происхождения ткани , спасенный оторигинальные плацента.

1. Перед жатвы, подготовить следующие

Примечание: При составлении ферментные решения, специфические требования и концентрации, предусмотренные заводом-изготовителем для каждого продукта должны быть соблюдены. Ферменты часто предоставляется в виде сырой смеси белков, поэтому подобные ферменты из различных компаний, вероятно, имеют различные виды деятельности / концентрации. По этой причине рекомендации изготовителя должны быть признаны и приготовления раствора, возможно, придется изменить соответствующим образом.

  1. Подготовка или приобрести от 1,5 до 2 л общего стерильными Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) для этого протокола.
  2. Приготовьте коллагеназы I маточного раствора путем взвешивания коллагеназы типа I и растворить 1 мг / мл в HBSS и водоворот осторожно, чтобы обеспечить полное растворение. Определить объем HBSS (содержащих кальций и магний), необходимые для приведения раствора коллагеназы до 100 единиц (U) / мкл (1,000x маточный раствор), а затем фильтруют с использованием 0,2 &# 181; м шприц фильтр. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо.
  3. Подготовка диспаза маточного раствора путем растворения нестерильный диспазу при 10 мг / мл в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) без кальция или магния. Далее разбавить ДЗФР без кальция или магния до конечной концентрации 2,4 ед / мл. Фильтр стерилизовать через шприцевой фильтр 0,2 мкм. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо.
  4. Готовят дизоксирибонуклеаза (ДНКазы) -I маточного раствора путем растворения ДНКазы I в дозе 10 мг / мл в 0,15 М NaCl. Фильтр Копание шприцевой фильтр 0,2 мкм. Алиготе объем 1 мл в 1,5 мл пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока это необходимо.
  5. Подготовка рабочего раствора переваривания путем объединения 100 ед / мл коллагеназы типа I, В.5 мкг / мл ДНКазы I и 2,4 Ед / мл диспаза в свободной от сыворотки DMEM. Свежеиспеченный разморозить и разбавьте запасов фермента непосредственно перед использованием. Примерно, в соотношении 1: 1 пищеварения раствораобъем до нужного объема ткани требуется (например , 10 мл ткани, измеренная в 50 мл трубки, требуется 10 мл раствора пищеварения).
  6. Готовят раствор 4% параформальдегида (PFA) в PBS и доведения рН до 7,4 15. Хранить в 25 мл аликвот при -20 ° С в течение длительного времени или при 4 ° С в течение 1 недели.
  7. Приготовьте MSC из культуральной среды DMEM-низкого уровня глюкозы (DMEM-LG), дополненной 1x антибактериальной и противогрибковой раствора и 10% нетепловыделяющих инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. MSC-класса FBS можно приобрести у многих поставщиков FBS.
  8. Автоклав стерилизовать рассечение оборудование заранее в соответствии с ведомственным руководящим принципам. К ним относятся ножницы, пинцеты, скальпели и большой металлический поднос рассечение. Сбор дополнительной стерильной культуре ткани из пластмассы и расходные материалы (например , лезвия скальпеля, 50 мл и 15 мл пробирки, 25 мл, 10 мл и 5 мл пипетки, а 75 или 175 см 2 клеточной культуры баллонах).
  9. Использование стандартной первичной культуры клеток лабораторное оборудование: класс II Biosafety шкаф подходит для изоляции первичных клеток, клеточных культур инкубатор при 5% CO 2 и 37 ° С, коромысло в 37 ° С инкубатор и центрифугу, вместимостью 50 мл пробирки.
  10. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты: лабораторный пальто, 2 пары перчаток (во все времена), защитные очки и близко носком обуви в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  11. Подготовить соответствующие дезактивирующих растворов для образцов крови человека в соответствии с ведомственным руководящим принципам и жидких биологических отходов контейнеров заранее.

2. Выделение плацентарный MSC

  1. Получение плаценте
    1. Платье в необходимых средств индивидуальной защиты. Настройка биологической безопасности с необходимыми материалами, растворов и контейнеров для отходов, чтобы выполнить процедуру до ферментативного расщепления (раздел 2.5.6).
    2. Получить плаценту с информированного согласия и этического утверждения. Собрать плаценту через кесарево секции в асептических хирургических условиях, а также упаковка в стерильный пакет или ведро для транспортировки в лабораторию.
    3. Во время транспортировки и перед вскрытием, хранить плаценту при комнатной температуре или температуре 4 ° С.
      Примечание: Ткань можно хранить в течение до 6 часов без снижения производительности для культивирования клеток.
      1. Ограничение времени между сбором плацента и обработки ткани, где это возможно. Эта рекомендация основана на практических вопросах. В некоторых случаях, мы затянули процесс выделения клеток до 6 часов после рождения. В этих случаях плацента содержались при комнатной температуре или при температуре 4 ° С (в лаборатории или в центре сбора). Не было обнаружено различий обнаруживаемые, приведенной выше общей вариации донора, в MSC, полученного из последов, когда они хранились при 4 ° С или при комнатной температуре.
    4. Поместите контейнер с плацентой в кабинете биологической безопасности. Откройте контейнер и передать через плаценту в стерильный лоток.
    5. Открыть из фетальные мембраны (амниотической или амнион-хорионический laeve) 8. Стать сориентирована частями плаценты. Фетальный сторона имеет вставку пуповины, которая в общем случае, центрально вставляется в плаценте. Материнской линии (облицованы децидуальной базального), которое противоположно фетальной стороны, имеет очевидные семядоли (или долей).
    6. Чтобы начать препарирование, сориентировать плаценту с пуповиной вверх в стерильный лоток.
      Примечание: Этот протокол предназначен для получения достаточное количество клеток семени в одну колбу Т175 от каждого из трех типов тканей. Каждый Digest начинается с приблизительно 10 г ткани. Это аналогично Отправной количество колб как MSC культур, инициированных из аспирата 20 мл костного мозга. Если все большее число клеток желательно, то большее количество тканей может быть собран и протокол можно масштабировать линейно. Размеры ткани, подлежащей заготовленные являются лишь ориентировочными, что является практичным с плацентарной ткани. Есть несколько defininг особенности в плацентарных ворсинок, которые могут быть использованы в качестве опорной точки. Указанные размеры служат в качестве оценки и пуповина используется в качестве ориентира на поверхности плода.
  2. Рассечение (D) тканей децидуальной
    1. Флип плаценту над тем, материнская поверхность (децидуальной базального) вверх. Убедитесь, что сторона плода с пупочной точки вставки шнура лицевой стороной вниз.
    2. Вырезать куски толщиной 0,5 см с материнской стороны плаценты (содержащий децидуальная базального ткани).
    3. Поместите тканевые части в чашку Петри, содержащую HBSS во время вскрытия, чтобы держать куски ткани увлажненной.
    4. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить трубки до отметки 10 мл в 50 мл пробирку (это примерно 10 г ткани).
  3. Рассечение плиты хорионического (CP) Ткань
    1. Механически удалить амниотической мембраны из плода поверхности плаценты (не амниотической), оставляя чоrionic frondosum (хорионический пластины) нетронутыми.
    2. Вырезать куски ~ шириной 1 см на 0,5 см глубиной от хорионического пластины. Урожай хорионический пластины из области, ближайшей к пуповине, подальше от края плаценты.
    3. Поместите кусочки ткани в чашку Петри, содержащую HBSS во время диссекции, чтобы держать их увлажненной.
    4. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить 50 мл пробирку до 10 мл отметки (~ 10 г ткани).
  4. Рассечение ворсин хориона (CV) Ткань
    1. Рассеките CV ткани ~~~HEAD=iobj 1 см 2 х 0,5-1 см в глубину от плацентарной ткани , где уже была удалена CP. Опять же, урожай резюме из региона ближе всего к пуповине, от края плаценты. Постарайтесь оставаться на расстоянии не менее 1 см от материнской стороны плаценты (содержащей децидуальной базального ткани); цель состоит в том, чтобы собрать ткань от внутренней части плацентарной ткани ворсинки.
    2. Поместите кусочки ткани в чашку Петри, содержащую HBSS в течение Диссефикция, чтобы держать их увлажненной.
    3. Перенести достаточную ткань, чтобы заполнить 50 мл пробирку до 10 мл отметки (~ 10 г ткани).
  5. Мясорубки и ферментативные Расщепление D, CP и CV плацентарные Тканей
    1. Поскольку существует ~ 10 г D, CP или CV ткани в трех различных 50-мл пробирки, заполнить каждую пробирку с примерно 40 мл HBSS и повторно инвертировать трубку для того, чтобы вымыть ткани (повторить в течение ~ 10 сек).
    2. Слейте супернатант и повторить этот шаг мыть 2-3 раза до тех пор, пока раствор не станет в значительной степени свободна от крови. С помощью 10 мл пипетки или длинный пинцет, чтобы гарантировать, кусочки ткани не теряется из трубки (ы), когда декантированием супернатанта.
    3. Возвращение кусочки ткани на 10 см чашку Петри с минимальной передачей жидкости. Чоп / фарша ткань на мелкие кусочки примерно 1-5 мм 3 с ножницами или лезвием бритвы.
    4. Передача рубленые ткани обратно в соответствующей маркировкой (D, CP или CV) 50 мл пробирки.
    5. Добавить свеже ДГОред дайджест СМИ по меньшей мере , соотношении 1: 1 с тканью (например , 10 мл ткани плюс 10 мл переваривать средств массовой информации). Заменить колпачок на каждой трубе и инвертировать трубок несколько раз перемешать.
    6. Инкубируйте ткани в пробирки с переваривать СМИ в течение 1-2 часов при температуре 37 ° С. Увлажненной атмосфере 5% CO 2 не являются необходимыми для этого шага.
      Примечание: Быстрое встряхивание требуется для того, чтобы эффективно диссоциируют клеток из ткани и максимальный выход MSC. Ограниченный выход будет очевидно, очень немногие клеток, прикрепленных к колбе культуры на 48 ч и времени первого прохождения более чем через 1-2 недели. Время инкубации и метод встряхивания зависит от 37 ° С инкубатор доступны в лаборатории, так и может потребовать оптимизации.
      1. Для инкубатора с быстрым и управляемым механизмом встряхивания, место ткани и переваривать среду в 50 мл пробирку или стерильного коническую колбу, место в инкубаторе и установить встряхивая скорость до 250 оборотов в минуту. Это приведет к полному дайджестаткань в течение 1 ч.
      2. В качестве альтернативы для инкубатора с мягким покачиванием или нет раскачивания механизма, вручную трясти трубку быстро и энергично вручную в течение 10 с каждые 30 мин в течение от 1,5 до 2 часов. Период инкубации фермента является подходящее время, чтобы отказаться от отходов, очистки шкафа биобезопасности ненужных предметов, изменить лабораторный халат, если загрязнен и подготовиться к следующей части процедуры.
  6. Коллекция мононуклеаров и Покрытие в колбах
    Примечание: Из предыдущего шага, три 50 мл пробирки (D, CP или CV) с перевариванием Куски ткани. Когда ткань раствор дайджеста развивается мутный внешний вид и белые кровеносные сосуды очевидны в ткани, пищеварение завершена.
    1. Добавить 30 мл среды, содержащей MSC FBS в каждую пробирку, чтобы инактивировать ферменты, содержащиеся в растворе пищеварения.
    2. Для того, чтобы отделить мононуклеарных клеток из большого непереваренной мусора, пульс центрифугировать 50 мл трубки. В кратком изложении, позволяютцентрифуга достичь 340 х г в течение 5 сек, а затем остановится. Это заставит крупного мусора, чтобы осадить в нижней части трубки, оставляя мононуклеарных клеток в жидкой суспензии.
      Примечание: одноядерные клетки будут оставаться в жидкой фазе, если трубка находится только на короткое время (импульсный) центрифугируют. Если центрифугирование удлиняется, мононуклеарные клетки будут также осадить на дне пробирки с кусочками ткани, что приводит к нежелательной потере клеток.
    3. Собирают супернатант, содержащий мононуклеарные клетки, и передать это в новый 50 мл пробирку с пипеткой.
    4. Добавьте 30 мл среды или HBSS к оставшемуся мусора плацентарной ткани и энергично встряхивают. Это приведет оставшиеся отдельные одноядерные клетки в суспензии и дать второй урожай мнимого MSC из ткани.
    5. Пульс центрифугу трубку во второй раз, и снова передать супернатант в новую 50 мл трубки. Повторите этот шаг в третий раз, чтобы максимально увеличить эффективность сборамононуклеарных клеток из каждого источника ткани.
    6. Объединяют супернатанты от каждого из отдельных типов тканей в две 50 мл пробирки. Это даст 6 трубок (всего 2 трубы каждого D, CP и CV). Центрифуга каждая трубка в течение 5 мин при 340 х г. Этот этап будет осадить мононуклеарных клеток в нижней части труб.
    7. Тщательно сцедить или пипеткой надосадочную в отходы. Нет необходимости, чтобы попытаться устранить каждую каплю надосадочной жидкости.
      Примечание: Клеточный осадок будет хрупкой из-за большого количества красных кровяных телец. Будьте осторожны, чтобы случайно не выбросить осадок, если вы сцеживания непосредственно из 50 мл трубки.
    8. После удаления большей части супернатанта, осторожно вылить трубку несколько раз пальцем, чтобы смещать осадок клеток. Объединяют гранул, так что есть одна труба для каждого D, CP или CV ткани и ресуспендируют каждый в 35 мл MSC средств массовой информации.
    9. Дополнительно: Фильтр мононуклеарную фракцию через сетчатый клеточный фильтр 100 мкм положим ир в 50 мл пробирку, чтобы удалить сгустки клеток или волокнистого материала.
      Примечание: Уход требуется, поскольку фильтры могут легко засорить и переполнять. Кроме того, воздушные пузырьки могут препятствовать фильтры сливать. Если это происходит, медленно поднимите фильтр из трубы, чтобы позволить воздуху проходить под фильтром, промыть фильтр через с среды для культивирования клеток или обмен на новый фильтр. За исключением этапе фильтрации не появляется, чтобы изменить выход или качество последующих культур MSC.
      1. Необязательно, эритроцит (RBC) лизис или центрифугирования в градиенте плотности могут быть выполнены на этой стадии 15. Тем не менее, наш опыт показывает, что РБК не мешают с приложением MSC или пролиферации, и поэтому РБК лизиса не является необходимым. Мононуклеары можно было бы рассчитывать на данном этапе , если удаление эритроцитов было проведено 15. Несмотря на то, что подавляющее большинство клеток на этой стадии не будет ЦКМ, но быть эмбриональных происхождения трофобласта, эндотелиальные клетки и гемопоэтические клетки, а также мавнешнее происхождение кроветворные клетки и децидуальной клетки стромы.
    10. Передачи клеточной суспензии для каждого из D, CP или CV ткани в одну колбу T175 и культуры в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
  7. Сообщение Изоляция-элементный расширения
    1. По прошествии 48 часов после первоначального выделения, удалите среду из каждой из колб (D, CP и CV) и заменить 35 мл свежей MSC сред. Отработанный среда и отдельные клетки могут быть отброшены, а мнимый ЦКМ , как предполагается, быть присоединены к культуре ткани колбы 16. Возвращение колб в инкубатор еще в течение 24 ч.
    2. После дополнительных 24 ч культуры, моют колб дважды с ДЗФР (25 мл), чтобы удалить твердые частицы и эритроциты. Вихревой жидкости вокруг дна колбы, чтобы сместить RBCs. С помощью пипетки, чтобы удалить жидкость и твердые частицы. Добавить 35 мл MSC средств массовой информации в колбах и вернуть колб в инкубатор.
    3. Заменить носитель два раза в неделю, а вcubate культуры до клеточных монослоев 80- 90% сплошности. Это начальное расширение занимает 4-14 дней, в зависимости от качества ткани, количество исходного материала и эффективности и времени инкубации с раствором дайджеста.

3. Субкультура ЧВОФ

  1. Когда культуры 80-90% сплошности, мыть два раза с 20 мл 1x HBSS или ДЗФР и выбросьте стирок. Добавить трипсин-заменителя в каждую колбу (т.е. используют 5 мл для T175 колбы).
  2. Инкубацию колб в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы освободить MSC от поверхности тканевой культуры. Нажмите по бокам колбы каждые ~ 2 мин для облегчения отделения.
  3. Когда клетки отделяют от поверхности и в суспензии отдельных клеток, промыть клетки из колбы MSC медиа и сбора клеток в пробирках. ЦКМ СМИ будет разбавлять и деактивировать трипсин-заменитель (использование ~ 15 мл MSC среды на T175 колбу).
  4. Перенести содержимое каждой тканевой культуральной колбы до 50мл трубки.
  5. Центрифуга трубки при 340 мкг в течение 5 мин для осаждения клеток.
  6. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют клеточный осадок в 1 мл MSC сред.
  7. Развести 10 мкл клеточной суспензии в 10 мкл трипанового синего. Граф клеток с использованием гемоцитометра и рассчитать общее количество ячеек 15.
  8. Передача клеток в новые колбы при 1,150 клеток / см 2 в свежей MSC средах и инкубировать в инкубаторе тканевых культур. При такой плотности высева, семена 200000 MSC в каждую новую T175 колбу в 35 мл MSC СМИ. Кормите клетки дважды в неделю до 80-90% сплошности. Семенной последующие проходы в 1,150 клеток / см 2 или 200 000 MSC в каждую колбу Т175.
  9. Когда проход 1 (Р1) или P2 клетки сливающийся, криоконсервируют большинство клеток для будущего использования, и переустановку только одну T175 колбу для дальнейшего распространения и определения характеристик. Продвинутые клетки могут быть использованы в P3 или P4 для мезодермальный дифференцировки клеток и анализов характеристик через флвл цитометрии.
    Примечание: В ранних пассажах, может быть очень мало скудно отделенные колоний, но локальная плотность клеток в каждой колонии может быть очень высокой. Это не идеальное решение, так как локальная плотная упаковка клеток приведет к контактного торможения, задерживая роста и снижения производительности культуры. Мы рекомендуем, когда наблюдаются плотные колонии, клетки должны быть собраны и пересевали в новую колбу. Этот процесс перераспределения обеспечивает клетки с комнатой для быстрого размножения, и общая производительность культуры будет улучшена.
  10. Для криоконсервируют MSC, сбор ~ 1 × 10 6 клеток в 1 мл 90% FCS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и замораживают с использованием стандартных протоколов.
    Примечание: В разделе результаты репрезентативного, есть описания MSC характеристик с использованием проточной цитометрии, мезодермального дифференциации и анализа FISH XY, чтобы определить пол трех разных (D, CP и CV) расширенных клеточных популяций. В нашем исследовании, плацента были от младенцев мужского пола; Таким образом, всефетальные клетки можно выделить, как мужского (Y-хромосомы) и все материнские клетки можно выделить, как самки (Х-хромосома только).

Representative Results

Процедура плацентарный изоляции ЦКМ приводится на рисунке 1. Три области плацентарной анатомии , из которого были выделены ЦКМ выделены на рисунке 2. Это материнский децидуальной, а также в значительной степени фетальных тканей хорионический пластины и хорионического ворсинок. Многие учебники, статьи и ресурсы в Интернете подробно Развитие и функциональная роль различных плацентарных тканей (см ссылку 8).

Морфология культур через 48 часов после выделения и удаления мусора ткани.
После 48 часов культивирования МСК будет присоединили к культуре ткани пластика, в то время как эритроциты и большинство других клеточных обломков не будет установлен. В это время, среда должна быть заменена на 35 мл свежей культуральной среды. До этого обмена среды, трудно делать точные наблюдения из-забольшое количество эритроцитах, которые затрудняют визуальную оценку. Появление культурального супернатанта может существенно варьировать между плацентарных доноров. Это изменение можно увидеть визуально в примере 1 и 2 (рис 3А). Эти два MSC обособления, которые оказались очень разные, были выполнены одновременно с двух разных плаценте. Тем не менее, как только моют, обе культуры оказались схожими (см промытого пример 3, рис 3 , а ).

Под микроскопом после 48 часов обмена медиа, только несколько клеток будут прикреплены к колбе (фиг.3В), и клетки будут появляться значительно отличается от более широко расширенных ПКЦ. Некоторые обломки и Эритроциты будут видны в виде плавающих или прикрепленных комков, и они не будут мешать росту MSCs. Более длинные фибробластические клетки, прилипшие к нижней части колбы, вероятно, будут смесь клеток в том числе MSC, кроветворной,трофобласта или эндотелиальные клетки. Опять же, эти клетки не-MSC не ставят под угрозу ЦКМ культуры, так как эти клетки не выживают более 1-2 пассажей в условиях культивирования MSC. Несмотря на некоторые изменения в первоначальном виде культур, последующие результаты расширения в целом согласуются.

Морфология MSC культур с течением времени.
В этом представительном примере, через семь дней после изоляции, небольшие фибробластические MSC колонии были видны, хотя и не ЦКМ-клетки также можно рассматривать как круглые или слабо прикрепленные клетки (фиг.4А). Прикрепленные клетки то , что первоначально было названо "блок колониеобразующих -fibroblast "(CFU-F) 17 и позже назвал MSC 18. Тринадцать дней после изоляции, фибробластические MSC колонии были большими (4В). Как правило, монослой будет 80-90% сплошности в этой точке, и клетки должны быть пасса ВГО. Из прохода 2 года, плацентарный MSC монослой будет развивать характерную водоворота морфологию при слиянии (рис 4в). Если клетки пассируют при низкой плотности, не будет больше не наблюдается образование КОЕ-Ф. При низкой плотности, плацентарного происхождения ЦКМ имеют меньший, квадратным внешний вид , чем взрослый из костного мозга MSC 1. В то время как плацентарного происхождения MSC и из костного мозга МСК обладают аналогичными скорость пролиферации, плацентарные клетки , полученные из менее склонны к быстрому старению 5.

Характеристика плацентарной MSC в пробирке.
Каждая расширена популяция клеток должна быть охарактеризована , чтобы гарантировать , что оно соответствует стандартным критериям MSC 16, в том числе (1) пластиковом присоединение (2) наличие поверхностных маркеров мезенхимальных и отсутствие гемопоэтических поверхностных маркеров, и (3) способность претерпевать мезодермальными дифференциация.

"ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> плацентарной MSCs пластичны приверженцем.
Как показано на фиг.4, в культуре MSCs пластичны прилипший и имеют фибробластов морфологию; это подтверждает , что клетки отвечают первым критериям , которые определяют MSC 16.

Плацентарные дисплей MSC мезенхимальных поверхностные маркеры.
Второй определяющий ЦКМ характеристикой является наличие поверхностных маркеров мезенхимальных и отсутствие гемопоэтических маркеров 16 поверхности. Так как нет ни одного маркера способен окончательно идентифицировать ПКЦ, панели маркеров, как правило, используются в сочетании с методом проточной цитометрии анализа для идентификации клеток, которые являются мезенхимальные, но не гемопоэтические. В представительном наборе данных , представленной здесь (рис 5А), мы оценили экспрессию клеток мезенхимальных маркеров CD73, CD105, CD90, CD146 и CD44, гемопоэтические маркеры CD45 и CD34, и HLA-DR, как вэйл в качестве маркера эндотелиальной CD31. Все антител , используемых в этом плацентарной процесса определения параметров MSC перечислены в таблице материалов / оборудования. Окрашивание проводили согласно инструкции производителя, с помощью методов анализа , описанных здесь 19.

Клетки были положительными для мезенхимальных маркеров CD73, CD105, CD44 и отрицательные для маркеров клеточной поверхности CD45, CD34, HLA-DR и CD31, как и ожидалось 5,20. Примерно, 37% и 57% клеток в нашем представительном наборе данных были положительными для CD90 и CD146 21, соответственно. Оба CD90 и CD146 обычно используются маркеры MSC 21. MSC профили маркера клеточной поверхности может быть различной в зависимости от источника MSC ткани, состава среды, или пассажа 22. В наш многолетний опыт, мы не наблюдали длительное загрязнение плацентарной происхождения MSC с не-мезенхимальных клеток после 1-2 рassages 5,11.

Плацентарная дисплей MSC мезенхимальных дифференцировки потенциал
По определению, MSC должен обладать в пробирке мезодермального дифференцировки способность 5,13. Мезодерма дифференциацию потенциал обычно оценивается либо через три- или раз в две линии преемственности дифференцировки анализов. Би-линии преемственности анализы в целом оценивают остеогенной и Adipogenic потенциала дифференциации, в то время как три-линии преемственности анализы дополнительно оценить хондрогенный способность дифференцировки. В репрезентативных результатов , представленных здесь, мы покажем , что Расширенной популяции MSC образуют как отложения кальция, что указывает на остеогенной дифференцировки, и липидных вакуолей, свидетельствует о адипогенеза (рис 5б).

Для характеристики популяций MSC сообщенные здесь, мы засевали клетки в 24 лунки с культурой в 6 х 10 4 клеток в 1 мл индукционной среде. Среда компоненты перечислены в таблице материалов / оборудования. В то время как средние индукционные препараты широко распространены в литературе, есть значительные различия в опубликованных составах. По этой причине мы кратко перечислить наши индукционные среда формулировки и подходы окрашивания здесь. Остеогенная индукционная среда содержала DMEM-HG, 10% FBS, 1x антибиотик противогрибкового раствора, 10 мМ β-глицерин фосфат, 100 нМ дексаметазон и 50 мкМ L-аскорбиновая кислота, 2-фосфат. Адипогенных индукционная среда содержала DMEM-HG, 10% FBS, 1x антибиотик противогрибкового раствора, 10 мкг / мл инсулина, 100 нМ дексаметазона, 200 мкМ индометацин и 500 мкМ 3-изобутил-1-метил-ксантин. Здесь, культуры поддерживали в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе и культивировали в течение 14 дней. Индукционная среду заменяли два раза в неделю в течение периода культивирования. После 14 дней индукции, культуры были охарактеризованы либо кости, как матрица (остеогенеза) или липидных вакуолей (липогенез) в соответствии с нашим предIOUs издание 5. Остеогенная анализа осаждения матрицы кальция достигалось первый аспирационных от среды, фиксируя культур 4% параформальдегидом в течение 20 мин, промывание монослой с ДЗФР, а затем окрашиванием ализарин Красный S согласно инструкции производителя. Адипогенных индукции оценивали с помощью аспирационного от среды, фиксируя культур 4% параформальдегидом в течение 20 мин, промывание монослой, и окрашивание с раствором масляным красным O согласно инструкции производителя. Витражи отложения кальция и масла вакуоли затем визуализировали с помощью светового микроскопа, и изображения сохраняются для дальнейшего использования.

В предыдущих публикациях мы охарактеризовали дифференциацию потенциал плацентарного происхождения MSC более широко 4,5. Плацентарного происхождения MSC остеогенез подобен из костного мозга MSC, в то время как липогенез , как правило , менее эффективны в плацентарной производных MSC 5 </ SUP>. Мы не регулярно проводят хондрогенный дифференцировку по нескольким причинам, хотя это уже сообщалось ранее нами для плацентарной-MSC 5. Во - первых, в то время как мощность мезодермальный дифференциация является определяющей характеристикой MSC, то, скорее всего , имеет второстепенное значение 23-25, особенно там , где терапевтический эффект, вероятно, будет получена из паракриновых выделениями MSC 26. Во- вторых, хотя Доминиси и др. Предложили минимальные критерии для клинического производства взрослого человека из костного мозга MSC 16, более поздние исследования показывают MSC из разных нишах имеют различные врожденные свойства и возможности дифференциации 5,13,27-32. На самом деле, Parolini и др. Предложили , что плацента происхождения MSC должен дифференцироваться в "один или более мезодермальных" родословных , а не всех трех линий 10. Наконец, многие исследования MSC исключают хондрогенный дифференциации, как это происходит через аналогичныйвнутриклеточный сигнальный путь , как остеогенеза (TGF - beta семьи путь) 33-35.

Плацентарного МСК материнской по своему происхождению, используя этот метод культуры, несмотря на анатомическое местоположение исходного материала.
Во многих публикациях , предполагают , что клетки , выделенные из эмбриональной выход хорион плода MSC на культуре 14. Однако, как мы уже сообщали ранее 5, все культуры , полученные из фетальной хориона, используя этот протокол, быстро обогащаться на материнский MSC , как бы интуитивно ожидать для материнских децидуальных культур MSC. В этих репрезентативных результатов мы использовали плацентарной ткани от младенцев мужского пола так, чтобы можно было легко очертить плода и матери вклад клеток в расширенных клеточных популяций. Для этих исследований мы использовали FISH набор XY , перечисленных в таблице материалов / оборудования, и следовали инструкциям изготовителя.

(рисунок 6) , При пропускании 2, популяции клеток, полученные из материнских тканей были ~ 100% материнские клетки (XX) и фетальные клетки (XY) не были обнаружены. Это говорит о том, что физическое рассечение материнской ткани привело к обогащению материнских клеток в последующих культурах. Тем не менее, важно учитывать результаты культуры от плода хорионического ворсинок хориона и культур пластинчатых происхождения. При прохождении 0 оба плода хорионический ворсинок и хориона пластины культуры были получены ~ 85% XY или фетального происхождения, что указывает на целенаправленный рассечение обогащенные для клеток плода (рисунок 6). При прохождении 0, обе культуры содержали ~ 15% материнской клетки загрязнения (XX). Удивительно, но при прохождении 2, оба плода культуры были заполнены ~ 100% материнских клеток (XX) и клеток плода (XY)больше не были обнаружены. XY анализ FISH показывает, что материнские клетки (XX) хромосомы быстро и последовательно поглощениям культуры происходит от плода хориона тканей. Это критическое наблюдение культура , которая часто упускается из виду 5. Детали этого анализа включен в данном протоколе, поскольку он демонстрирует очень важное наблюдение, что материнские клетки быстро заселить все культуры при DMEM, дополненной 10% FBS используется без дополнительных факторов, предназначенных для поддержки плодные происхождения населения.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Резюме плацентарной процедуры выделения MSC (этап 1) ориентируют себя с плацентой анатомии. (Этап 2) вручную рассекать 10 г ткани либо из децидуальной, хорионического ворсинок или хорионический пластины с помощью ножниц. (Шаг 3) Фарш тон рассеченные части децидуальной, хорионического ворсинок хориона или тканей пластины на мелкие кусочки с ножницами или скальпелем.
(Этап 4) Освободить клетки из тонких кусочков через 1-2 ч в пищеварении диспаза и коллагеназы I.
(Шаг 5) Отдельные клетки из фиброзной ткани импульсным центрифугированием и / или промывкой их через клеточный фильтр. Сбор и ресуспендирования клеток в культуральной среде и помещают в колбы с культурой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

будут выбраны мезенхимальные стромальные клетки (МСК), основываясь на их склонности к пластической адгезии и способности к выживанию в и пролиферируют в культуральной среде. И, наконец, в разделе результатов, расширенный ЦКМ может быть охарактеризован и сохранены для использования в будущих экспериментах.


Рисунок 2:. Анатомия термина плаценты человека и тканей , выделенных в этой процедуре Первая ткань для жатвы является материнской децидуальной. Децидуальной является ткань, которая остается в виде тонкого слоя на поверхности плаценты после того, как он пролил от стенки матки (децидуальной идентифицируется зелеными маркерами). Вторая ткань, которая будет собран из внутренней части плаценты плода хорионический ворсинки (синие маркеры). Третья ткань для жатвы является фетальный хорионический пластины (красные маркеры) (адаптировано из ссылки 36). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Морфология культур через 48 часов после выделения и повторногоперемещение обломков ткани. (A) Появление супернатанта культуры может существенно варьировать между донорами плаценты , прежде чем смывая мусор. Пример культур 1 и 2 демонстрируют этот вариант. Эти два обособления были выполнены одновременно, но с двух разных плаценте. После того, как Промытые культуры будет ясно из эритроцитах и ​​обломков ткани, как показано в примере 3. Дальнейшие результаты расширения в целом согласуются. (В) После 48 часов обмена медиа, только несколько клеток будут прикреплены к колбе. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рис . 4: Морфология MSC культур с течением времени (А) через семь дней после изоляции, маленький еibroblastic MSC колонии видно хотя и не-MSC клетки будут также присутствовать в виде круглой или неплотно присоединенных клеток. (B) через 13 дней после изоляции, фибробластические MSC колонии являются большими и часто монослой MSC является сливающийся и готов к прохождению. (C) Из прохода 2 года, монослой MSC будет развиваться характерный водоворота морфологию при слиянии. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
На рис . 5: ЦКМ характеристика с помощью проточной цитометрии и мезодермального дифференцировки (А) плацентарный хорионический ворсинки полученный ЦКМ отображения классический профиль MSC - маркер с помощью проточной цитометрии, хотя для этих маркеров клеточной поверхности, ExpresSion одинакова для всех видов человеческой MSC. Каждая гистограмма показывает интенсивность сигнала (ось х) в зависимости от нормированной числа клеток на оси у (% от максимального). В этом представительном наборе данных клетки были позитивными для CD73, CD105 и CD44, так и отрицательные для гемопоэтических маркеров CD45 и CD34 и HLA-DR. (В) , плацентарный ЦКМ в целом претерпевают надежную остеогенной дифференцировки, тем не менее (С) липогенный дифференцировка может быть менее эффективным , чем с из костного мозга MSC. Изображения в заголовках B и C были взяты при 40 - кратном увеличении. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: плацентарный МСК материнский по своему происхождению , используя этот метод культуры, несмотря на анатомическое местоположение исходного материала.Графики показывают, количественное определение фетального (мужчина, XY) и материнской (женской, XX) клеточного состава плацентарных MSC культур, выделенных из децидуальной, хорионического ворсинок хориона и тканей пластины на каждом втором проходе. Материнские клетки (XX) быстро и воспроизводимо взять на себя культур, полученных из эмбриональных тканей хориона. Фетальный = мужчина = XY хромосомы, обнаруженные в отдельной ячейке, материнской = женский = XX хромосомы обнаружены в отдельной ячейке. Данные, представленные здесь, была из N = 3 независимых плацентами доноров от младенцев мужского пола, но не менее 100 клеток, окрашенных для XY FISH и подсчитанных для каждой точки данных. Бары представляют собой средние значения , а столбики ошибок отражают одно стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Плацента является физически большой fetomaternal орган, из которого плода или матери MSC может быть выделен 22. Здесь мы представили подробный обзор плацентарной анатомии и инструкции о том, как конкретно рассекают децидуальной (материнской), хорионический ворсинки (плода) и хорионический пластины (плода) ткани (этап 2.2-2.4). В дальнейшем, мы изложили надежный протокол, позволяющий MSC изоляцию от каждого из этих трех тканей (этап 2,5-2,6). Расширение плацентарной MSC является эффективным и культуры выглядеть подобно из костного мозга MSC культур (3 и 4). Остеогенная дифференциация надежен (Фиг.5В), в то время как липогенный дифференциация , как правило , менее эффективны (5С) 5.

Многие новички в этой области будет предположить, что культуры, полученные из плода хорионического ворсинок хориона или тканей пластины будет обогащаться для плода MSC. Тем не менее, в наших руках FeОбогащение тал клетка только переходный , когда стандартное расширение MSC среде , такой как DMEM-LG + 10% FBS используется 5. Здесь мы предлагаем репрезентативные результаты с использованием плацентарной ткани, полученные из мужского пола ребенка. При использовании плацента ткани из мужского ребенка, фетальные клетки легко идентифицируемым как имеющие XY хромосомами, в то время как материнские клетки могут быть идентифицированы как имеющие XX хромосомы. На рисунке 6 показаны результаты XY FISH для представительной культуры. В то время как эмбриональный ЦКМ (XY) обогащены (до 80%) в исходных культур, полученных из фетальной ворсин хориона или хориона ткани пластины, эти же самые культуры быстро обогнали (~ 100%) материнским (XX) MSC в течение первых двух проходах , В стандартной среде, состоящей из DMEM-LG + 10% FBS, немногие MSC материнской происхождения, которые загрязняют эмбриональные ткани вытеснять фетальные клеток, полученных в культуре.

Важным шагом изложенные в этом протоколе является оценка плацентарный анатомии и откуда плодаи материнской ткани наиболее эффективно может быть собран. Как указано в разделе результаты репрезентативного, рассечение тканей плода делает позволяют кратковременное обогащение для плода, полученных MSC. Улучшения в разработке расширения среды, с помощью конкретных экзогенного фактора роста добавок среды должны позволить селективное расширение популяций MSC эмбриональных происхождения и производства продукта клеток, который обогащен для плода, а не материнской клетки (наша группа в настоящее время разрабатывает такие средние составы). Производство популяций MSC плода может иметь ряд преимуществ, что и фетальные ЦКМ подразумеваются , чтобы иметь больший ангиогенез и иммуносупрессивные свойства , чем эквивалентные популяции материнских MSC 37.

В каждом из описанных протоколов изоляции, мы использовали примерно 10 г ткани. Целый плацента, как правило, 500-750 г, а в предыдущей работе мы показали, что с помощью автоматизированной ткани перевариваются и биореактора Proc расширения клетоксах, она должна быть возможность производить более 7000 клинических доз клеток из одной плаценты 4. Эти цифры подчеркивают потенциальную пригодность плацентарного происхождения MSC в аллогенных MSC терапии, и значение этого метода независимо от MSC происхождения (плода или матери). С терапевтической точки зрения, это наиболее важно, что пользователи имеют полное представление о продукте клеток и способность надежно производить этот сотовый продукт. Мы надеемся, что наше видео поможет исследователям понять, плацента анатомии, изолировать MSC из плаценты, и предвидеть вероятное плода или материнской клеточный состав их культур.

Acknowledgments

RP был поддержан Национальным исследовательским советом здравоохранения и медицинской (NHMRC) последипломной подготовки стипендий. VS был поддержан Университетом Квинсленда Международной Аспирант стипендии. МОБ была поддержана NHMRC и внутреннее колесо Австралии.

Мы благодарим клинический и медицинский персонал для оказания помощи в согласии пациента и сбора образцов. Мы благодарим профессора Nickolas Фиск, профессор Керри Аткинсон и д-р Рохана Лурье для проницательных дискуссий в акушерстве, плодово-плацентарного развития и плацента анатомии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Gibco/Invitrogen 14185-052 Long name: Hanks Balanced Salt Solution
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
trypsin-substitute Gibco/Invitrogen 12563-029 Long name: TrypLE Select
DMEM-LG Gibco/Invitrogen 11885-092 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
PBS (Mg+Ca+ free) Gibco/Invitrogen 14190-250 Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
paraformaldehyde powder or 4% solution any 
Collagenase I Invitrogen 17100-017  2,500 U/ml
Dnase I Sigma D5025 10 mg/ml in  0.15 M NaCl
Dispase Invitrogen 17105-041  10 mg/ml in water (20,000 U/ml).
Material Company Catalog Number Comments
Disposables:
50 ml centrifuge tubes Falcon or any brand
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) Nunc
Cell strainers (100 μm) Becton Dickinson 352340
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes any brand
Material Company Catalog Number Comments
Equipment:
 Centrifuge  
 tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2
Biological safety cabinet
 Sterile scissors and tweezers
Tube racks 
Pipette-boy or equivalent
Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl.
rocking or shaking incubator (37 °C)
personal protective equipment
cleaning solutions (suitable for blood)
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood
Reagents for MSC characterization
Antibody (Clone ID) Manufacturer Catalogue No. Isotype
CD73 (AD2) Miltenyi Biotec 130-095-183 Mouse IgG1
CD105 (43A4E1) Miltenyi Biotec 130-094-941 Mouse IgG1
CD90/Thy-1 (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-403 Mouse IgG1
CD45 (5B1) Miltenyi Biotec 130-080-202 Mouse IgG2a
CD34 (AC136) Miltenyi Biotec 130-090-954 Mouse IgG2a
HLA-DR (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-298 Mouse IgG2a
CD31 (PECAM-1) BD Pharmingen 555446 Mouse IgG1
CD146 (541-10B2) Miltenyi Biotec 130-092-849 Mouse IgG1
CD44 (DB105) Miltenyi Biotec 130-095-180 Mouse IgG1
Isotype Controls (Clone ID) Manufacturer Catalogue No.
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-214
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-212
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-213
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-091-837
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-098-849
MACS Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Osteogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol Phophate Sigma 50020
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
Alizarin Red S Sigma A5533-25G For calcium matrix staining
Adipogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
insulin Sigma I2643
Dexamethasone Sigma D4902
Indomethacin Sigma I7378
3-isobutyl-1-methyl xanthine Sigma I5879
Oil Red O solution Sigma O1391-250ML For lipid vacuole staining
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells
XY chomosome FISH kit Vysis (Abbott Molecular) 07J20-050 Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
  2. Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
  3. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).
  4. Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
  5. Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
  6. Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
  7. Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
  8. Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
  9. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
  10. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
  11. Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
  12. Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
  13. Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
  14. Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
  15. Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  17. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
  18. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).
  19. Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
  20. Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
  21. Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
  22. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  23. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
  24. Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
  25. Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
  26. Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
  27. Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
  28. Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
  29. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
  30. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  31. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
  32. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
  33. James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
  34. Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
  35. Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
  36. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
  37. Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).

Tags

Биология развития выпуск 112 плацента человек срок третий триместр материнская мезенхимальные стволовые клетки стромальные клетки
Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S.,… More

Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue. J. Vis. Exp. (112), e54204, doi:10.3791/54204 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter