Introduction
Kemik iliği, hematopoiez ve bağışıklık düzenlenmesinde rol oynayan önemli bir organdır. Bu hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) ihtiva eden bir hematopoietik bileşen oluşur ve mezenkimal hücreler 1 doğuran olmayan hematopoietik projenitor hücrelerini ihtiva eden stromal bileşeni. Hematopoetik faaliyet üçte ikisi miyeloid hücrelerin 2 nesil adamıştır. 1-2 x 10 hücre 11, normal, yetişkin bir insan 2 günde üretilen özellikle nötrofillerden çok sayıda, kemik iliği üretilir. Nötrofiller mikrobik enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır ve stres periferik nötrofil 1,3 tamamlamak için onların seferberlik tetikler kadar çoğunlukla kemik iliğinde saklıdır. anti-mikrobik etkilere ek olarak, son çalışmalar dönüştürücü büyüme bağlı pro- ve anti-tümör oluşturucu fenotiplerinin her ikisi de olan, Kanser biyolojisinde nötrofil önemli bir rol oynadığını düşündürürtümör mikro 4,5'ten sinyalizasyonu faktör beta (TGF-β). Ayrıca, çalışmaların dolaşımdaki nötrofil bir sitotoksik anti-metastatik etkisi 8 gösterirler ve birincil tümörlerin biriken nötrofiller, T-hücreleri 6,7 sitotoksik fonksiyonunu bastırmak Pro-tümörijenik ve metastatik etkisi olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, kemik iliği hematopoetik hücreler ve özellikle nötrofiller, araştırılması bağışıklık ve tümör düzenleme rollerini açıklık için çok önemlidir.
Histopatoloji ve tam bir periferal kan sayımı rutin kemik iliği 9 hücresel ve yapısal değişiklikler değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler sadece farklı hücre popülasyonlarının veya doku mikro statik bilgi sağlar. In vivo görüntüleme uzunlamasına hücreden C gibi bir çok hücresel, vaskular ve stromal bileşenleri dinamiklerini değerlendirmek için standart yöntem ile kombinasyon halinde kullanılabiliruzunlamasına bir şekilde ell etkileşimleri. Mikroskopik çözünürlükte 10 hayvanların yaşama görüntüleme gibi tanımlanmıştır intravital mikroskobu (IVM), aynı numunede, zaman içinde dinamik hücresel işlemleri değerlendirilmesi gereken deney hayvan sayısını azaltmak için özellikle yararlıdır. IVM genellikle haftalar ve aylar arasında bir süre boyunca görüntüleme için ilgi organ ulaşmak için kronik transplant pencere bölmesi (WC) ile birleştirilir. Kraniyal ve dorsal-deri kıvrımı wc modeller 1990'lı yılların ortalarına kadar uzanan kullanım uzun bir geçmişi var. Daha yakın zamanlarda, örneğin meme yağ pedi ve çeşitli karın organlarının gibi diğer organa özgü tuvalet modelleri 11 geliştirilmiştir.
In vivo kemik iliği görüntüleme için tipik yaklaşım inceltilmiş kemik minimal cerrahi müdahale 12-14 ile tek hücre doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan farelerin calvaria, ağırlıklı olarak dahil pozlama vardır. Ancak, kalvarial kemik iliği b olabilire HSPCs 15 bakım ve gelişme indirgenmiş gösterir calvaria'da HSPCs ve hipoksik hücrelerde daha düşük bir sayıda, gösterildiği gibi, bu tür uzun kemik gibi diğer kemik, bu farklı. Bu nedenle, uzun kemik hücresel bileşenleri değerlendirmek için alternatif yaklaşımlar araştırılmıştır. Bu femur kemik iliği 16 doğrudan maruz kalma ve dorsal deri kıvrım WC 17 bölünmüş femur ektopik nakli sayılabilir. Ancak, eski uzun süreler boyunca, hücresel yapısal ve fonksiyonel değişiklikler izleme izin vermez bir terminal işlemdir ve ikincisi olasılıkla nedeniyle dorsal deri altı WC içinde ektopik siteye femur nakli normal kemik iliği fonksiyonunu bozar. zamanla femoral kemik iliği ortotopik seri sokulmuşlardır Başka bir yöntem, femur kemiği içindeki bir WC kullanılmasıdır. Bir önceki rapor kullanarak femoral kemik iliğinde mikrosirkülasyonun uzun vadeli görüntüleme gösterdiFarelerde 18 WC femur. Buna ek olarak, yazarlar izleme kemik iliği metastazında yararını gösteren femur tümör hücrelerinin görselleştirme gösterdi. Bununla birlikte, bu tuvalet bir tasarım büyük bir fareler (26-34 g, yaş 3-6 aylık) için uygun olduğu büyük boyutu (1.2 cm çaplı) ve nispeten küçük bir görüntüleme alanı (4 mm çapında) ile sınırlı ve böylece verme rutin kullanım için pratik yaklaşım.
Bu nedenle, bir daha küçük bir genel boyutu ile yeni WC ve geniş iç görüntüleme alanı Bu çalışmanın amacı için dizayn edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, femoral kemik iliğinden çeşitli hücre tipleri görüntülenmesi için bir yöntem sağlamaktır. Femur WC modeli in-house geliştirilen ve 3D damar ağı içinde nötrofillerin görselleştirmek ve izlemek için kullanılmıştır. Bu modeli kullanarak, kemik iliği IVM 40 gün içinde seri yapılabilir. Bu yaklaşım, bağışıklık düzenlemesi, bir hematopoez işlemleri ortaya çıkması için çeşitli alanlarda uygulanabilirnd tümör gelişimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan çalışmaları Üniversitesi Sağlık Ağı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol # 2615 altında gerçekleştirilmiştir.
Mouse 1. Cerrahi Hazırlık
- Cerrahiden önce, tüm cerrahi aletler ve otoklav ile pencere odası (WC) sterilize edin. 2 gün önce cerrahi amoksisilin 50 mg / kg vücut ağırlığı ile içme suyu katkı. periton boşluğu içine 4 saat önce cerrahi buprenorfin 0.1 mg / kg vücut ağırlığı ile fare enjekte edilir.
- 80 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg ksilazin (Not içeren 350-400 ul tuzlu su çözeltisi intraperitoneal enjeksiyonu ile atimik çıplak fare anestezisi: Bu Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve biz yan etkileri ile herhangi bir deneyim olmadı ). Ayak refleks için test ederek uygun anestezi onaylayın. İşlem sırasında solunum desen, mukoza renk ve ayak refleks için gözlem devam edin.
- Cerrahi pr gerçekleştirinBir biyogüvenlik kabini altında ocedures ameliyat sırasında steril koşulları sağlamak için. Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için bir cerrahi örtü ile kaplı bir elektrikli ısıtma yastığı fare yerleştirin. stereomicroscope altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin.
- Ameliyat sırasında gözleri nemli tutmak için göz merhemi sürün. cerrahi işlem sırasında gerekirse tekrarlayın. arka arkaya% 7.5 povidon-iyot,% 70 izopropil alkol ve% 10 povidon-iyot ile silerek fare çalışma alanını sterilize ve iki kez bu işlemi tekrarlayın.
- lateralden femur yaklaşan bir bıçak (# 15) ile neşter kullanılarak 10 mm boyuna cilt kesi olun. kas işlevsellik sağlamak için forseps ve hemostat kullanarak künt diseksiyon ile fleksör ve ekstansör kaslar arasındaki femur Açığa.
- Kemik altında U-şekilli bir bar yerleştirin ve WC (Şekil 1) yükleyin. iki somunu kullanarak pencere çubuğu Güvenli ve için somun sıkınceps. kemik ve diş çimento ile wc arasındaki boşluğu doldurmak.
- Kemik iliği boşluğuna optik erişmek için bir mikro-matkapla 6 x 2 mm 2 bölgede kortikal kemik eziyet.
Not: Bu işlemi yaparken dikkatli mikroskop altında kortikal kemiğin incelmesine kontrol edin. kemik sağlam bir, neredeyse şeffaf periost tabakası bırakın. - pencere üzerine 8 mm coverglass yerleştirin ve yerinde tutmak için bir çırpıda halkası ile coverglass sabitleyin.
- ameliyatı takiben fonksiyonlarını korumak için forseps kullanarak geri orijinal konumlarına fleksör ve ekstansör kas yeniden ayarlayın. 5-0 sütür ve bir iğne tutucu kullanarak dermis sütür.
- bilinçli ve özgürce hareket edebilmek kadar, kurtarma için fare izleyin. kurtarıldı zaman yeni bir kafes içine hayvan koyun.
- İyileştikten sonra, aynı gün ya da sonraki günlerde hayvan görüntü alımı gerçekleştirmek (bölüm 2). fiziksel erişiminiz monitörgünlük fare cal durum.
Not: ağırlık, hızlı ya da sığ nefes, arka bacak şişmesi, kendini yaralama, selülit ve şiddetli dermatit hunching, bacak üzerinde taşıyan gibi fiziksel koşulları, izleyin. - 3 gün buprenorfin / kg vücut ağırlığı 0.1 mg intraperitonal enjeksiyonu ve ameliyat sonrası ağrı ve enflamasyon tedavisinde cerrahi sonrası 5 gün meloksikam 1 mg / kg vücut ağırlığıdır. 5 gün boyunca amoksisilin-desteklenmiş su sağlamaya devam.
- Deneysel uç noktada, CO ikincil yöntemle (örneğin, servikal dislokasyon) izledi 2 narkoz hayvan euthanize.
Kombine Çok foton ve konfokal mikroskopi kullanılarak 2. Görüntü Alma
- Önceki görüntüleme, 80 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg ksilazin içeren bir 350-400 ul tuzlu su çözeltisinin intraperitonal enjeksiyon ile fare anestezi. kullanılabilir Alternatif olarak, solunabilir anestezi kullanın.göz merhemi sürün.
- Etiketleme damar için intravasküler boyaların karışımı (0.65 2 MDa Floresein (FITC) -dextran mg) ve nötrofiller (Allophycocyanine (APC 4 ug)-Anti-Ly6G antikoru) enjekte edilir.
- maviden kırmızıya eksitasyon dalga boylarını sağlayan 705-980 nm iki foton uyarılması için kadar çoklu foton lazer, hem de tek foton lazer ile donatılmış bir dikine Birleştirilen çoklu foton ve konfokal mikroskop kullanarak.
- Mikroskop (Şekil 1B) üzerine ısmarlama görüntüleme sahne. timsah klipler ile WC iki ucu sıkma ile sahnede fare sabitleyin.
WC tutmak için iki timsah klipleri ve bir ısıtma elemanı görüntüleme sırasında fare fizyolojik sıcaklığı (37 ° C) muhafaza etmek: aşamanın kritik bileşenleri şunlardır: Not. - iki foton lazer ve konfokal sistemi açın ve "Başlat Sistemi" tıklayarak görüntü elde etme yazılımı başlatmak. 4 sekmeleri ile bir pencere (bulunToplama, İşleme ve Bakım) açılacaktır.
- görüntüleme kanalları ayarlayın. Toplama sekmesi altındaki "Akıllı Setup" tıkla ve görüntüleme için kullanılacak boyalar seç: FITC (488 nm uyarma, 493-588 nm emisyon) ve APC (633 nm uyarma ve 638-743 nm emisyon). "En iyi Sinyali" seçin ve "Uygula" butonuna tıklayınız.
- elle ikinci harmonik üretimi (SHG) görüntü elde etme kanalı ekleyin. Toplama sekmesinde "Lazer" penceresi altında iki foton lazer açın. Kanallar penceresinin altında, bir parça eklemek için "+" işaretini tıklayın.
- SHG parça ayarlayın. yukarı ve aşağı okları kullanarak Kanallar pencerenin altında 840 nm dalga boyunu değiştirmek ve kaydırma çubuğunu kullanarak "Işık Yolu" penceresi altında 415-425 nm olarak tespit aralığı seçin.
- Bulun sekmesi altında "Okülerler Online'da" üzerine tıklayın. FITC ilgi bölgeyi görmek ve t çevirerek odağı manuel olarak ayarlamak için filtre ayarı altında FITC tıklayınO mikroskop tarafındaki düğmeyi odaklanır. ilgi bölgesi bulunduğu zaman, bulun sekmesi altında "Okülerler Çevrimdışı" tıklayın.
- Toplama sekmesine tıklayın. Kanallar pencerenin altında FITC parçayı seçin ve 5X amacı ile FITC-dekstran görüntü önizleme "Canlı" linkine tıklayın. Gerekirse odağı ayarlayın ve önizleme durdurmak için Acquisition sekmesi altındaki "Durdur" butonuna tıklayınız.
- El ile lensler üzerinde bir tekerleği hareket ettirerek 20X su amacına açın. 20X objektif kullanılarak FITC dekstran tekrar görüntüyü izlemek ve optimum sinyal ve kontrast elde etmek Kanallar pencerenin altında Usta Kazanç ve iğne deliği ayarlayın. Kanallar pencerenin altında APC ve SHG parçaları seçerek diğer kanallar için tekrarlayın.
- görüntüleme parametrelerini seçin. kendi penceresini açmak için "Acquisition Mode" a tıklayın. yüksek kalitede görüntüler elde etmek için çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel olacak şekilde ayarlayın ve 4X ortalama.
- 2B anlık kazanır. Kanallar kazanmak altındaki tüm kanalları seçinDow ve Satın Alma sekmesi altında "Yapış" üzerine tıklayın. Görüntünün kalitesini kontrol edin ve gerekirse görüntüleme parametrelerini değiştirmek.
- 2B time-lapse görüntü kazanır.
- Zaman Serisi penceresini açmak için Acquisition sekmesinde "Zaman Serileri" işaretleyin. zaman aralığı olmadan sürekli 40 fotoğraf çekmek için taramaların toplam sayısı için aralıklarla altında 0 ve 40 yazın.
Not: 40 tarama 7.5 saniye / çerçeve bir tarama hızı ile 600 mm x 600 mm görüntü boyutu ile yaklaşık olarak 5 dakika kadar zaman serisi oluşturur. aralığı ve mikroskop, görüntü alma ayarları ve kamera kare hızına bağlı olarak taramalarının sayısını ayarlayın. Sabit aralık süresi (> 0 sn) farklı zaman noktalarında elde edilen zaman atlamalı görüntüleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Daha uzun zaman atlamalı görüntüleme süresi deneysel koşullarda nötrofillerin (veya ilgi diğer hücrelere) beklenen ortalama hızına bağlı olarak gerekli olabilir.
- Zaman Serisi penceresini açmak için Acquisition sekmesinde "Zaman Serileri" işaretleyin. zaman aralığı olmadan sürekli 40 fotoğraf çekmek için taramaların toplam sayısı için aralıklarla altında 0 ve 40 yazın.
- 3D görüntü elde edin.
- Z-Stack penceresini açmak için Acquisition sekmesinde "Z-Stack" işaretleyin. FITC dekstran için "Canlı" önizleme modu başlatın. Numunenin üst odaklanın ve "Önce Set" i tıklayın ve örnek diğer ucunda odaklanmak ve tıklayın Z-yığın penceresinde "Son Set".
- Z-yığın pencerenin altında 10 mikron olmak aralığını ayarlayın. Önceki aşamadan seçilmiş olan ilk ve son optik dilim bağlı olarak, bu 90-180 um toplam optik kalınlığı, 10-20 dilim oluşturur.
Not: z yığın aralığı optik dilim kalınlığını belirler iğne deliği, büyüklüğüne bağlıdır. Optik dilim kalınlığından daha az olduğu aralığını ayarlayın. - görüntüleri toplamaya başlamak için Acquisition sekmesi altında "Başlat Experiment" tıklayın.
- 3D time-lapse görüntü kazanır.
- Zaman Serisi açmak için Acquisition sekmesinde "Zaman Serileri" ve "Z-yığını" kapalı kontrolve Z-yığın pencereler.
- adımlarda 2.14 ve 2.15 açıklandığı gibi Zaman Serisi kurmak ve Z-yığını elde etme parametreleri. görüntüleri toplamaya başlamak için Acquisition sekmesi altında "Başlat Experiment" tıklayın.
- kararlı ve bilinçsiz olduğundan emin olmak için görüntüleme sırasında fare izleyin. Fare görüntüleme sırasında dengesiz ve / veya bilinçli ise, sahneden fareyi kaldırmak intraperitoneal anestezik solüsyonun ek 100-150 ul enjekte ve görüntüleme devam edin.
Not: istikrarsızlık belirtileri hızlı nefes alma ve elde edilen görüntülerde eserler değişen olarak görülebilir fare hareketini içerir. - Görüntü alındıktan sonra, sahneden fareyi alıp kafesine geri. sıcak tutmak ve bilinçli kadar fareyi izlemek için bir ısıtma lambası kullanın.
3. Görüntü Analizi ve miktarının belirlenmesi
- 3D ve zaman serisi verilerini analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. yazılımını açın ve"Arena" görünümü denir açık ekran sürükleyerek görüntüleri eklemek. açmak için bir resim dosyası üzerine çift tıklayın; görüntü "Aşmak" görünümü altında açılacak.
- 2D / 3D görüntü oluşturun.
- Sağ üst köşede bulunan "Diğer" çubuğundan, "Ekran Ayarı" penceresini açmak için "Edit / Show Ekran Ayarı" i tıklayın. Her kanal için eşik ayarlayarak floresan ekran optimize etmek ve görüntü kaydetmek için bir anlık görüntü alabilir.
- zaman atlamalı görüntüleri kullanarak nesne parçalarını oluşturur.
- Görüntüyü aç "Aşmak" görünümü altında analiz edilecek. "Aşmak" simgesinin altında bulunan turuncu noktalar bir görüntü ile simgesine tıklayın. Bu yeni bir "Spotlar" penceresi açılacaktır.
- "(Zaman İçinde) Parça Spots" kapalı kontrol ve sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. "Kaynak Channel" altında izlemek için nesneleri içeren kanalı seçin ve tahmini nesne Diamet ayarlamakbir sayı yazarak "Tahmini XY Çap" altında er. Bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın.
Not: nötrofil izleme için, nötrofiller için APC floresan içeren kanalı seçin ve nötrofillerin bilinen boyutuna göre 12 um nesne çapı ayarlayın. - penceresinde, bulmak ve aşağı oku tıklatarak "Kalite" filtre seçin. yazılım tarafından belirlenen noktalar gözlemleyin ve eklemek veya lekeler dışlamak için elle ayarlayabilirsiniz.Özellik. Eşik tanımlandıktan sonra, "İzleme" adıma geçmek için mavi oka tıklayın.
- Algoritma altında bulmak ve aşağı oku tıklatarak "Autoregressive Motion Algoritma" seçeneğini seçin. "Max Gap Boyutu" için "Max Mesafe" için 10 mikron ve 3 tip Parametreler altında buldular. izlemeye başlamak için "algılanan tüm nesnelerle boşlukları doldurun" kapalı kontrol edin ve bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın.
Not: "Özbağlanımlı hareket algoritması" f kullanılırveya önceki hareket tahmin yere göre parça üretir, çünkü hareket yönlendirdik nesneler. "En çok Mesafe" ve "Max Boşluk Boyutu" izlenen yanı sıra time-lapse görüntü toplam süresi olan beklenen boyut ve nesnenin hızına bağlı olarak ayarlanabilir. - Filtre Türü altında, "Parça Süresi" filtre seçin. izleme bitirmek ve oluşturulan parçaları kontrol etmek için yeşil oku tıklayın. el parça sıralamak gerekirse önceki adıma geri dönün.
- öteleme sürüklenme için doğru oluşturulan time-lapse görüntü sürüklenir, eğer.
- Bir kalem bir görüntü ile simgesine tıklayın. Bu "Edit Tracks" penceresi açılır bir düzenleme sekmesi. time-lapse görüntü incelemek ve tüm görüntüler için hareket edilmemesi gereken bir referans nokta bulmak.
- Ekranın sol üst köşesinde, "Pointer" pencere bulmak ve kapalı kontrol cu etkinleştirmek için "Seç"bir nokta seçilmesi için rsor. Referans yerinde tıklayın.
- "Edit Parçalar" penceresinde "Doğru Drift" tıklayın. "Translational Drift" işaretleyin. Yazılım otomatik görüntü düzeltilmiş dizi üretecektir.
- Time-lapse görüntüleri nesne parçaları tarafından tanımlanan hücresel hareketini ölçmek.
- "Edit Parçalar" penceresinde altında, "Tracks" işaretini ve bir hücrenin hareketini temsil eden bir parça seçin. Seçilen parça zaman serisi görüntüde sarı vurgulanır.
- "İstatistik" penceresi (istatistik sekmesi) açmak için bir grafik bir görüntü ile simgesine tıklayın.
- "Seçimi" altında, parça hızı seçilen parça için ortalama oluşturmak için aşağı oka tıklayarak "Pist Hız Mean" seçeneğini seçin. Farklı parçaları seçin ve parça hız ilgi tüm hücreler için ortalama ölçmek için adımları tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mürin femur kemik iliği başarıyla bireysel nötrofil ve damar ağları görselleştirme etkinleştirmek için WC kullanarak erişebilirsiniz. 1 WC alet gösterir ve iç optik erişim elde etmek için femur kemik ve kortikal kemik incelmesi maruziyetini içeren cerrahi işlem açıklanır Şekil kemik. cerrahi farelerde iyi tolere edilir; onlar sıkıntı yok raporu ile, örneğin 5 gün ameliyat sonrası için WC arka bacak şişmesi, sigara ağırlık uzuv taşıyan, kendini yaralama, selülit ve dermatit gibi hasar gibi olumsuz fiziksel reaksiyonlar, değerlendirildi. Özellikle, pencere bir müdahalenin şu hücresel ve yapısal değişikliklerin uzun vadeli bir değerlendirme sağlayabilir kadar 40 gün boyunca IVM için optik açık kalır.
Kemik iliği içinde damar örneğin FITC dekstran gibi damar içi boyalar ile görselleştirilebilir(Şekil 2). kontrast madde enjekte bağımlı olduğu için, elde edilen görüntü, yeterli kan akışı fonksiyonel damar temsil eder. Damar ek olarak, nötrofiller, anti-Ly6G antikoru kullanılarak in vivo boyanmış olabilir. Şekil 3A ve 3B, nötrofil intravasküler ve damar dışı alana hem de görülen farklı zaman noktalarında, gözlenen kemik iliği aynı alanı temsil eder. Bu alanlar vasküler simge ile karakterize edilmiştir. Rodamin 6G in vivo nötrofilleri leke önleyici Ly6G alternatif olarak kullanılabilir; Bununla birlikte, spesifik olmayan bir şekilde ekstravasküler boşlukta vaskülatür ve leke monosit üzerinden difüze olur. Bu nedenle, bir anti-Ly6G Nötrofiller belirli görüntüleme sağladığı için. Şekil 3C, esas olarak kolajen liflerinin oluşan kortikal kemiğin görüntüleme temsil tercih edilir. elde görüntüleme için maksimum derinliğiBu deneyde, 180 um (Şekil 3C) 'dir.
Time-lapse floresan görüntüleme in vivo izleme ve hücresel hareketin miktarının kolaylaştırır. Şekil 4A kemik iliği vasküler niş nötrofillerin izleme gösterir. Her tarama arasında hiçbir ek zaman aralığı ile görüntüleme hücrelerinin doğru izleme için izin verir; Ancak, bazı kullanıcı girişi ayrıca yazılım tarafından oluşturulan parça doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Noktalar İzleme (yani, ilgi hücreleri) gibi ortalama parça hız (Şekil 4B) gibi çeşitli parametrelerin ölçümü sağlar. dahil ölçülebilir, ancak bunlarla sınırlı olmayan diğer parametreleri, nokta boyutu, şekli ve yoğunluğu uzunluğunu değiştirmek izler. Bu testte, hücresel hareketler ve etkileşimleri karakterize etmek çeşitli parametrelerin ölçümü sağlar.
Şekil 1: Femur pencere odası (WC), görüntüleme aşaması ve cerrahi işlem yerine femur düzeltmek için hizmet veren bir U-şekilli bar (A) Ismarlama titanyum femur WC.. Tuvalet bir çırpıda halka ile güvence altına 8 mm çapında cam kapak, tutar. (B) Ismarlama görüntüleme aşaması. Bir ısıtma elemanı görüntüleme sırasında fare fizyolojik sıcaklığı korumak için sahne altına yerleştirilir. İki timsah klipleri WC tutmak için kullanılır. (C - H) femur WC yüklemek için cerrahi prosedür. (C) femur fleksör ve ekstansör kaslar arasındaki maruz kalmaktadır. Kaslar prosedür sırasında kaldırılmaz. (D) U-şekilli çubuk femur altına yerleştirilir ve (E) wc yüklü ve iki somunu kullanarak sabitlenir. (F) diş çimentosu kemik arasında uygulanırWC boşluğu doldurmak için. (G) dermiş dikildi ve (H) cam kapak tutma halkası ile yerine sabitlenir. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: in vivo olarak kemik iliğinde damar ağının 3D flüoresan görüntüleme kemik iliğindeki vaskülatürün Örnek görüntüsü femur WC ile görüntülenmiştir.. Damar (yeşil) 2 MDa FITC-dekstran kuyruk damarı enjeksiyonu ile görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: in vivo vasküler ağ, nötrofiller ve kemik matrisinin 3 boyutlu görüntüleme 10 gün femur WC ameliyat sonrası kemik iliği (a) 3 gün ve (B) 'de damar görüntüleri ve nötrofiller.. APC etiketli Ly6G antikorunun kuyruk damar enjeksiyonu ile boyanan nötrofiller, intravasküler ve ekstravasküler mekanlarda hem de görülür. oklar zamanla aynı konumunu izlemek için yeteneği gösteren, iki gün görülen damar yapısına işaret etmektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (C) kemik matrisi damar (yeşil) ve nötrofillerin (kırmızı) e ek olarak, SHG (beyaz) kullanılarak görüntülenebilir. Görüntü 40 gün WC ameliyat sonrası elde edildi. Ölçek çubuğu = 70 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: in vivo kemik iliğinin damar ağı içinde nötrofil hareketleri izleme damar ağı içinde nötrofil (A) Parça yolları.. Parçalar yazılımın Autoregressive yerleşik Hareket algoritması kullanılarak otomatik olarak oluşturulur. Her beyaz nokta bir parçacığın bir merkez noktası (nötrofiller) izleniyor temsil eder. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (B) nötrofillerin hareketinde farkı gösteren, intravasküler ve ekstravasküler nötrofiller için ölçülen parça hızı ortalama (ortalama = Hata bar + SD, * p = 0.0176, iki kuyruklu t-testi). Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu figür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gerçek zamanlı, kemik iliğinde dinamik hücresel süreçlerin seri görüntüleme aksi takdirde bu tür histoloji ve toplam kan sayımları gibi geleneksel teknikler kullanılarak elde etmek zordur bilgiler sağlar. Burada anlatılan femur WC modeli zamanla kemik iliğinde hücresel ve yapısal değişiklikleri araştırmak için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. femur WC modeli daha önce rapor edilmiş olmasına rağmen, bizim yeni tasarım, yetişkin farelerde kullanım için daha uygun olan bir görünüm ve de daha küçük yapı wc boyutunun daha büyük bir görüntüleme alanını içerir. Femur WC modeli bağışıklık bileşimi ve / veya transgenik raportör fareler de dahil olmak üzere fare suşlarının çeşitli kullanılabilir.
Genel süresini ve görüntüleme kalitesini belirleyen ameliyat sırasında kritik adımlar vardır. femur açığa zaman fleksör ve ekstansör arasındaki kasların sadece bir künt diseksiyon yapılır; Bu kasların kaldırma fare ve mus azaltılmış hareketlilik neden olabilirT önlenebilir. Bundan başka, kortikal kemik öğütme dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Femoral damar ağı yapısal bütünlüğünü korurken, yaklaşık 50 um taşlama optik görüntüleme için yeterlidir. kemik etrafında diş çimento Uygulama, cerrahi maruz alanı mühürleme sıvı birikimi önleyerek ve enfeksiyon riskini azaltırken bir ay boyunca açık optik görüntüleme penceresi korumak için çok önemlidir. Diş çimento ayrıca femoral kemik etrafında dönmesini wc önlenmesi, yerinde wc düzeltmek için hareket eder. Son olarak, coverglass tutmak için kullanılan ek bir halka su sızdırmazlık sağlayan, su daldırma objektif ile kullanım için uygundur. Segman yapıştırıcılar ilave böylece için ulaşılabilir penetrasyon derinliğini azaltarak, görüntüleme düzlemine hafif bir açıyla coverglass kemik ve coverglass arasındaki boşluğu artırmak veya yerleştirebilir çünkü wc coverglass takmak için yapıştırıcılar üzerinde tavsiye edilir görüntüleme. ayrıcacoverglass temizlenmesi veya değiştirilmesi gereken zaman, Segman yararlıdır.
Ameliyat ek olarak, kemik iliği, başarılı bir optik görüntüleme elde etmek için birkaç önemli adım vardır. femur WC içinde görüntü, WC objektif lens uygun daldırma görüntüleme aşamasına yatay yerleştirilir. Bu lens ile ilgili olarak WC açısının ayarlanması için izin verdiği ölçüye görüntüleme aşaması, bu amaç için uygundur. Ayrıca, WC, U-şekilli çubuğun, özellikle büyüklüğü, tasarımı uygun bir penetrasyon derinliğine ulaşmak mümkün coverglass yakın olarak yatay konumda kemik tutar. görüntüleme sırasında, nefes eserler floresan görüntüleri yatay çizgiler olarak görülebilir. Görüntüleme aşamasına WC sağlanmasına ek olarak, görüntüleme aşamasına göre ısıtıcı öğenin sıcaklığı yeterince fazla nefes en aza indirmek için hayvan ısınmaya ayarlanabilir. gazlı bez ince bir tabakaFare ve daha görüntüleme sırasında solunum eserler azaltmak için ısıtıldı evre arasında yerleştirilebilir. Biyolojik görüntüleme hedefe bağlı olarak, bu tür kare oranı, görüntüleme hacmi ve görüntüleme süresi gibi satın alma parametreleri deneysel soruları yanıtlamak için yeterli görüntüleri toplamak için ayarlanabilir. Örneğin, nötrofil göç ve tarama hızı her yerde enflamatuvar durumlarda 19-21 altında nötrofiller için 5-10 mm / dak arasında değişen bazal koşullarda ikamet nötrofiller için 2.8 mm / dk, çeşitli deneysel koşullar altında farklı olabilir. Böylece, in vivo nötrofil takibi için uygun görüntüleme hızı ve süresi de deneysel koşullara bağlı olarak değişiklik olacaktır. Buna ek olarak, bir yüksek kare hızı ile hızlı bir görüntüleme kamerası (30 kare / sn) gerektirecek damar sistemi içindeki hücrelerin izleme, sonuçlarından da görüleceği. Bununla birlikte, hedef hücreler ekstravasküler boşlukta bulunan, ya da eğer hücreden hücreye interactio halindeilgi n daha yavaş, görüntü kalitesi üzerinde öncelik verilmelidir görüntüleme hızını ortaya çıkması bekleniyor.
Hücre fonksiyonu ile ilgili in vivo hücre boyama enjekte antikorların etkisi de göz önüne alınmalıdır. Çalışmamızda, biz genellikle tedavülden nötrofillerin tüketmek ve çeşitli hastalık modellerinde rollerini incelemek için yüksek dozlarda (150-250 mikrogram) kullanılan anti-Ly6G antikoru (1A8 klonu), kullandık. Yipp ve Kubes florokrom etiketli anti-Ly6G antikoru düşük intravasküler enjeksiyon dozları (1-40 ug) 22 ° C'de lökosit bozmayan gösterdi. Ancak, daha yeni bir çalışma fluorochromes, molekül kütlesi ve kimyasal yapısında büyük farklılıklar olması, farklı şekilde anti-Ly6G 23 fonksiyonunu etkileyebilir düşündürmektedir. Çalışma etkili bir şekilde düşük bir konsantrasyonda (30 ug) in vivo olarak nötrofiller tüketir, anti-Ly6G FITC işaretli ancak PE değildir ve antikorları APC etiketli olduğunu göstermiştir.Çalışmamızda, biz APC-işaretli anti-Ly6G 4 ug kullanılarak nötrofil tükenmesi mesai dikkat etmedi. Bununla birlikte, in vivo koşullarında florokrom etiketli anti-Ly6G antikorun işlevinin daha fazla karakterizasyon intravital görüntüleme kullanımını doğrulamak için gereklidir. Bu, aynı zamanda, hücresel etkileşimlerini değiştirmek fonksiyonel yeteneği olan diğer antikorlar için de geçerlidir. Antikorlar ile in vivo olarak, hücre boyama alternatif olarak, transjenik muhabir fareler 24 ve / veya işaretlenmiş flüoresan hücre olarak 25 nötrofiller ya da in vivo ilgi diğer hücre popülasyonu görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
Bu protokol açıklanan femur WC modeli ameliyat sonrası 40 gün boyunca görüntüleme sağlar. Bu WC modeli kullanılarak uzun vadeli görüntüleme için zorluklardan bazıları gecikmeli kemik iyileşme sürecini ve temiz bir cam pencere bakım içerir. Özellikle, biz hangi dahil olmak olur, WC implantasyonu aşağıdaki bariz kemik iyileşmesi belirtileri gözlemlemek vermediperiost e kalınlaşma; Bu kemik iyileşme süreci tipik olarak 1 ½-3 ay 26,27 sonra gerçekleşir verilen beklenmedik bir durum değildir. temiz ve optik bakımdan saydam pencere bakımı diş çimentosu uygulanması ve doku ile sıkı bir su sızdırmazlık sağlayan ek halka ve coverglass kullanımı ile elde edilebilir. coverglass bazen toz ve enkaz kaldırmak için dışarıdan pamuk ipuçları ile temizlenebilir. Tuvalet hemen önce yayınlanmış bir model 18 üstün hale diyafiz bölgesi (yaklaşık 8.4-8.6 mm, 28), tüm uzunluğu kapsayan geniş bir görüntüleme alanı vardır. Ancak, uzak bölgelere erişim ve daha derin ilik boşluğu sınırlıdır. Özel olarak, gövde üzerinde, uzak uçlarında yer alan trabeküler zengin metafiz, HPSCs 29 açısından zengin olduğu bilinmektedir. Bu alanlar histolojik girip, veya bir terminal bir yöntem olarak IVM ile hazırlanabilir. Alternatif olarak, mikro-comp gibi farklı görüntüleme yöntemleriusulünde tomografi vivo 30 görüntü kemik iliğinin uzak bölge kullanılabilmektedir. Bu tür yöntemler kemik iliği içinde anatomi ve çeşitli hücresel ve yapısal değişiklikler ve etkileşimleri değerlendirmek için entegre bir yaklaşım sağlayarak, IVM tamamlayıcı niteliktedir.
Burada açıklanan protokol hücresel çözünürlük farelerde femoral kemik iliğinden uzun süreli uzay-zaman değerlendirmesi için yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Sunulan yöntemler aynı zamanda kemik iliği yapısal ve işlevsel bilgiler elde ederken, tek bir hücrede veya biyolojik ilgili zaman ölçekleri üzerinde hücresel nüfus hareketlerini izlemek için in vivo seri görüntüleme sağlar. Buna ek olarak, kantitatif resim analizi bundan başka, hücre hareketleri takip olarak hücresel ve işlevsel değişiklikler, karakterize etmek için gerçekleştirilebilir. Özellikle transgenik muhabiri fareler 31 farelerde çeşitli suşları, bu femur WC modelinin uygulanması,ayrıca bu tür hematopoez katılanların gibi birden ayrı ayrı etiketli hücre popülasyonlarının soruşturma sağlayabilir. Bu nedenle, açıklanan protokol preklinik hematopoez, lösemi, HPSC transplantasyon, immün regülasyon, kemik iliği mikro (örn hipoksik niş) 'de incelemelerde de dahil olmak üzere yaşayan fare kemik iliği içinde çeşitli biyolojik süreçleri içeren çalışmalar ve geniş bir yelpazede yaygın olarak uygulanmaktadır tümör ilerlemesi ve metastaz bağışıklık hücrelerinin katkısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Yazarlar mikroskobu ile yardım için Üniversite Sağlık Ağı Advanced Optik Mikroskop Tesisi (www.aomf.ca) teşekkür etmek istiyorum, ve WC ve görüntüleme sahne üretimi için Prenses Margaret Kanser Merkezi Makine Shop Bay Jason Ellis olacaktır. Biz de el yazması düzenleme için Dr. Iris Kulbatski teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
