Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

के लिए फीमर विंडो चैंबर मॉडल Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54205
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1,2,3
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Techna Institute, University Health Network
* These authors contributed equally

Introduction

अस्थि मज्जा एक महत्वपूर्ण hematopoiesis और प्रतिरक्षा विनियमन में शामिल अंग है। यह hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) युक्त एक hematopoietic घटक के होते हैं, और गैर hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं है कि mesenchymal कोशिकाओं 1 को जन्म दे युक्त एक stromal घटक है। Hematopoietic गतिविधि के दो-तिहाई माइलॉयड कोशिकाओं 2 की पीढ़ी के लिए समर्पित है। विशेष रूप से, न्यूट्रोफिल की एक बड़ी संख्या है, अस्थि मज्जा में उत्पादित कर रहे हैं के साथ 1-2 एक्स 10 11 कोशिकाओं को एक सामान्य वयस्क मानव 2 में प्रति दिन उत्पन्न। न्यूट्रोफिल सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं और ज्यादातर अस्थि मज्जा में आरक्षित हैं जब तक तनाव परिधीय न्यूट्रोफिल 1,3 के पूरक के लिए उनकी लामबंदी से चलाता है। उनके विरोधी माइक्रोबियल प्रभाव के अलावा, हाल के अध्ययनों बदलने के विकास पर निर्भर करता है कैंसर जीव विज्ञान में न्यूट्रोफिल की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव है, दोनों के समर्थक और विरोधी tumorigenic phenotypes होनेकारक बीटा (TGF-β) ट्यूमर microenvironment 4,5 में संकेत। इसके अलावा, अध्ययन प्रदर्शन किया है कि न्यूट्रोफिल कि प्राथमिक ट्यूमर में जमा है, टी कोशिकाओं 6.7 की साइटोटोक्सिक समारोह दबा द्वारा समर्थक tumorigenic और मेटास्टेटिक प्रभाव डालती है, जबकि संचलन में न्यूट्रोफिल एक साइटोटोक्सिक, विरोधी मेटास्टेटिक प्रभाव 8 डालती है। जैसे, अस्थि मज्जा में hematopoietic कोशिकाओं, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, की जांच के प्रतिरक्षा और ट्यूमर नियमन में उनकी भूमिका elucidating के लिए महत्वपूर्ण है।

ऊतकविकृतिविज्ञानी और एक पूरा परिधीय रक्त गणना नियमित रूप से अस्थि मज्जा 9 में सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इन तरीकों ही अलग सेल आबादी या ऊतक microstructures के स्थिर जानकारी प्रदान करते हैं। Vivo इमेजिंग में अनुदैर्ध्य सेल करने वाली सी के रूप में रूप में अच्छी तरह कई सेलुलर, नाड़ी और stromal घटकों की गतिशीलता का आकलन करने के लिए मानक तरीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकताएक अनुदैर्ध्य ढंग से पक्ष बातचीत। Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM), सूक्ष्म संकल्प 10 पर जानवरों के रहने की इमेजिंग के रूप में परिभाषित करते हैं, वही नमूने में समय के साथ गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक जानवर की संख्या को कम करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। IVM अक्सर महीने के लिए सप्ताह की अवधि खत्म हो इमेजिंग के लिए ब्याज की अंग पहुँचने के लिए एक लंबे समय से प्रत्यारोपित खिड़की कक्ष (WC) के साथ संयुक्त है। कपाल और पृष्ठीय skinfold WC मॉडल वापस 1990 के दशक में वापस डेटिंग उपयोग की सबसे लंबे समय तक का इतिहास है। हाल ही में, अन्य अंग विशेष तरह के स्तन वसा पैड और विभिन्न पेट अंगों के उन लोगों के रूप में WC मॉडल 11 विकसित किया गया है।

विवो में अस्थि मज्जा इमेजिंग के लिए विशिष्ट दृष्टिकोण चूहों के calvaria, जहां पतला अस्थि शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप कम से कम 12-14 के साथ एकल कक्षों के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए सक्षम बनाता है की मुख्य रूप से शामिल जोखिम है। हालांकि, calvarial अस्थि मज्जा ख सकता हैई, ऐसे लंबी हड्डी के रूप में अन्य हड्डियों, उस से अलग रूप में calvaria में HSPCs और hypoxic कोशिकाओं का एक कम संख्या है, जो HSPCs 15 के रखरखाव और विकास के लिए कम इंगित करता है के द्वारा प्रदर्शन किया। इसलिए, लंबी हड्डी में सेलुलर घटकों का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीकों जांच की गई है। ये ऊरु अस्थि मज्जा 16 वर्ष की प्रत्यक्ष निवेश और पृष्ठीय skinfold WC 17 में विभाजन फीमर के अस्थानिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। हालांकि, पूर्व में एक टर्मिनल प्रक्रिया है कि अब समय अवधि खत्म, सेलुलर संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन की ट्रैकिंग की अनुमति नहीं देता है, और बाद होने की संभावना पृष्ठीय skinfold WC के अंदर एक अस्थानिक साइट के लिए फीमर के प्रत्यारोपण के कारण सामान्य अस्थि मज्जा समारोह आ रही है। एक अन्य विधि समय के साथ ऊरु अस्थि मज्जा का ओर्थोटोपिक सीरियल इमेजिंग सक्षम बनाता है कि ऊरु हड्डी में एक शौचालय का इस्तेमाल होता है। एक पिछली रिपोर्ट ऊरु अस्थि मज्जा में microcirculation के दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन किया एक का उपयोग करचूहों 18 में WC फीमर। इसके अतिरिक्त, लेखकों फीमर में ट्यूमर कोशिकाओं के दृश्य का प्रदर्शन किया, निगरानी अस्थि मज्जा मेटास्टेसिस में इसकी उपयोगिता का संकेत है। हालांकि, इस WC डिजाइन अपने बड़े आकार (1.2 सेमी व्यास) और अपेक्षाकृत छोटे इमेजिंग क्षेत्र (4 मिमी व्यास), जो बड़े चूहों (26-34 जी, उम्र के 3-6 महीने) के लिए ही उपयुक्त था द्वारा सीमित था जिससे नियमित प्रयोग के लिए अव्यावहारिक दृष्टिकोण।

इसलिए, और एक छोटे समग्र आकार के साथ एक नया WC बड़ा आंतरिक इमेजिंग क्षेत्र इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए डिजाइन किया गया था। इस अध्ययन का लक्ष्य विभिन्न प्रकार के सेल इमेजिंग ऊरु अस्थि मज्जा में एक विधि के लिए प्रदान किया गया। फीमर WC मॉडल घर में विकसित किया गया था और 3 डी संवहनी नेटवर्क के भीतर कल्पना और न्यूट्रोफिल ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस मॉडल का उपयोग करना, अस्थि मज्जा का IVM 40 दिनों में क्रमानुसार किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण hematopoiesis की प्रक्रियाओं elucidating, प्रतिरक्षा विनियमन एक के लिए क्षेत्र की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकताएन डी ट्यूमर के विकास।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सभी जानवर काम प्रोटोकॉल # 2615 विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के तहत बाहर किया गया था।

1. माउस की शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले, सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और खिड़की कक्ष (WC) autoclaving द्वारा बाँझ। amoxicillin के 50 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन 2 दिन पहले सर्जरी के साथ पीने के पानी के पूरक है। buprenorphine की 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन intraperitoneally 4 घंटा सर्जरी से पहले के साथ माउस इंजेक्षन।
  2. असंवेदनता 80 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 13 मिलीग्राम / किलो xylazine (नोट से युक्त 350-400 μl खारा समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा athymic नग्न माउस: इस संस्थागत पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और हम प्रतिकूल प्रभाव के साथ किसी भी अनुभव नहीं किया है )। पैर पलटा के लिए परीक्षण द्वारा उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। सांस पैटर्न, श्लेष्मा झिल्ली का रंग और प्रक्रिया के दौरान पैर पलटा के लिए अवलोकन के लिए आगे बढ़ें।
  3. शल्य जनसंपर्क प्रदर्शन करनाएक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत ocedures सर्जरी के दौरान बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए। एक इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड सर्जरी के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक सर्जिकल कपड़ा के साथ कवर पर माउस रखें। stereomicroscope के तहत सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
  4. आँख मरहम लागू सर्जरी के दौरान आंखें नम रखने के लिए। यदि शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक दोहराएँ। लगातार 7.5% povidone आयोडीन, 70% isopropyl शराब और 10% povidone आयोडीन के साथ पोंछते द्वारा माउस के परिचालन क्षेत्र जीवाणुरहित, और इस प्रक्रिया में दो बार दोहराएँ।
  5. एक 10 मिमी अनुदैर्ध्य त्वचा एक ब्लेड (# 15) के साथ छुरी का उपयोग कर चीरा, पार्श्व की ओर से फीमर आ। संदंश और hemostats का उपयोग कर मांसपेशियों की कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए कुंद विच्छेदन से flexor और extensor मांसपेशियों के बीच फीमर बेनकाब।
  6. हड्डी के तहत यू के आकार बार डालें, और WC (चित्रा 1) स्थापित करें। दो पागल का उपयोग कर खिड़की के साथ बार, सुरक्षित, और के लिए के साथ नट कसCeps। हड्डी और दंत सीमेंट के साथ WC के बीच अंतरिक्ष भरें।
  7. एक माइक्रो-ड्रिल के साथ एक 6 एक्स 2 मिमी 2 क्षेत्र में cortical हड्डी नीचे पीसने मज्जा गुहा के लिए ऑप्टिकल का उपयोग हासिल करने के लिए।
    नोट: ध्यान से खुर्दबीन के नीचे cortical हड्डी के thinning का निरीक्षण किया, जबकि इस प्रक्रिया का प्रदर्शन। हड्डी के एक अक्षुण्ण, लगभग पारदर्शी periosteal परत छोड़ दें।
  8. खिड़की पर 8 मिमी coverglass प्लेस, और एक तस्वीर की अंगूठी के साथ coverglass सुरक्षित जगह में रखने के लिए।
  9. संदंश का उपयोग सर्जरी के बाद उनके कार्य को बनाए रखने के द्वारा flexors और extensors वापस उनके मूल स्थानों के मांसलता मरम्मत करना। 5-0 सिवनी और एक सुई धारक का उपयोग डर्मिस सिवनी।
  10. वसूली के लिए माउस मॉनिटर, जब तक वह होश में है और आसानी से ले जाने में सक्षम है। जब बरामद एक नया पिंजरे में पशु रखो।
  11. वसूली के बाद, उसी दिन या बाद के दिनों पर जानवर पर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन (धारा 2 देखें)। श्री बुश मॉनिटरदैनिक माउस के सीएएल हालत।
    नोट: इस तरह के वजन अंग पर असर, hunching, तेजी से या उथले श्वास, हिंद अंग में सूजन, आत्म विकृति, cellulitis और गंभीर जिल्द की सूजन के रूप में भौतिक स्थिति, निगरानी।
  12. 3 दिनों के लिए 0.1 मिलीग्राम buprenorphine के / किग्रा शरीर के वजन के intraperitoneal इंजेक्शन दे दो, और 1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर meloxicam के 5 दिनों के लिए शल्य चिकित्सा के बाद दर्द और सूजन के इलाज के लिए सर्जरी के बाद वजन। 5 दिनों के लिए amoxicillin पूरक पानी उपलब्ध कराने के लिए आगे बढ़ें।
  13. प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर, 2 narcosis एक माध्यमिक विधि (जैसे, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था) के बाद सीओ द्वारा पशु euthanize।

2. छवि अधिग्रहण संयुक्त बहु फोटॉन और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

  1. इमेजिंग के लिए पहले, एक 350-400 μl खारा 80 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 13 मिलीग्राम / किलो xylazine युक्त समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize। वैकल्पिक रूप से, inhalable संवेदनाहारी, का उपयोग करें जब उपलब्ध है।आँख मरहम लागू करें।
  2. लेबलिंग वाहिका के लिए intravascular रंगों के मिश्रण (2 एमडीए fluorescein (FITC) -dextran की 0.65 मिलीग्राम) और न्यूट्रोफिल (Allophycocyanine (एपीसी के 4 माइक्रोग्राम) विरोधी Ly6G एंटीबॉडी) इंजेक्षन।
  3. एक ईमानदार संयुक्त बहु फोटॉन और confocal खुर्दबीन एक बहु फोटॉन लेजर दो photon उत्तेजना के लिए 705-980 एनएम से लेकर, साथ ही एक फोटान पराबैंगनीकिरण है कि नीले रंग से लाल करने के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य प्रदान करता है के साथ सुसज्जित का प्रयोग करें।
  4. माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) पर एक कस्टम बनाया इमेजिंग मंच तैयार है। मगरमच्छ क्लिप के साथ WC के दोनों सिरों clamping द्वारा मंच पर माउस सुरक्षित।
    नोट: मंच के महत्वपूर्ण घटक हैं: दो मगरमच्छ क्लिप WC धारण करने के लिए, और एक हीटिंग तत्व इमेजिंग के दौरान माउस के शारीरिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखने के लिए।
  5. दो photon लेजर और confocal प्रणाली पर बारी, और "प्रारंभ सिस्टम" पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लांच। 4 टैब के साथ एक खिड़की (जानें,अधिग्रहण, प्रसंस्करण, और बनाए रखने) खुल जाएगा।
  6. इमेजिंग चैनलों को निर्धारित करें। अधिग्रहण टैब के अंतर्गत "स्मार्ट सेटअप" क्लिक करें और रंजक कि इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा चुनें: FITC (488 एनएम उत्तेजना, 493-588 एनएम उत्सर्जन) और एपीसी (633 एनएम उत्तेजना और 638-743 एनएम उत्सर्जन)। "सबसे अच्छा संकेत" चुनें और "लागू करें" पर क्लिक करें।
  7. दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) छवि अधिग्रहण चैनल मैन्युअल रूप से जोड़ें। अधिग्रहण टैब में "लेजर" खिड़की के नीचे दो photon लेजर चालू करें। चैनल खिड़की के नीचे, एक ट्रैक जोड़ने के लिए "+" पर हस्ताक्षर पर क्लिक करें।
  8. एसएचजी ट्रैक सेट करें। चैनल खिड़की के नीचे 840 एनएम के तरंग दैर्ध्य बदले ऊपर और नीचे तीर का उपयोग कर, और पता लगाने रेंज चुन "प्रकाश पथ" स्लाइडर पट्टी का उपयोग कर खिड़की के नीचे 415-425 एनएम होने के लिए।
  9. पता लगाएँ टैब के अंतर्गत पर "oculars ऑनलाइन" पर क्लिक करें। FITC ब्याज के क्षेत्र को देखने और फोकस टी मोड़ से मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए फिल्टर सेटिंग के तहत FITC क्लिक करेंवह माइक्रोस्कोप की तरफ घुंडी ध्यान केंद्रित। जब ब्याज के क्षेत्र में स्थित है, का पता लगाने टैब के तहत "oculars ऑफलाइन" पर क्लिक करें।
  10. अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। चैनल खिड़की के नीचे FITC ट्रैक का चयन करें और 5X उद्देश्य के साथ FITC-dextran की छवि पूर्वावलोकन करने के लिए "लाइव" पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो तो फोकस समायोजित करें, और क्लिक करें "बंद करो" अधिग्रहण टैब के तहत पूर्वावलोकन रोकने के लिए।
  11. मैन्युअल लेंस के ऊपर एक पहिया ले जाकर 20X पानी उद्देश्य की बारी है। FITC-dextran 20x उद्देश्य का उपयोग करने के लिए फिर से छवि देखें, और चैनल खिड़की के नीचे मास्टर लाभ और पिनहोल समायोजित इष्टतम संकेत है और इसके विपरीत प्राप्त करने के लिए। चैनल खिड़की के नीचे एपीसी और एसएचजी पटरियों का चयन करके अन्य चैनलों के लिए दोहराएँ।
  12. इमेजिंग पैरामीटर चुनें। अपनी खिड़की खोलने के लिए "अधिग्रहण मोड" पर क्लिक करें। सेट फ्रेम का आकार 1024 x 1024 पिक्सल है, और 4X की औसत उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए।
  13. एक 2 डी स्नैपशॉट मोल। सभी चैनलों का चयन करें के तहत चैनल जीतडॉव और अधिग्रहण टैब के अंतर्गत "तस्वीर" पर क्लिक करें। छवि की गुणवत्ता की जाँच करें और इमेजिंग मानकों को बदलने के लिए यदि आवश्यक हो।
  14. 2 डी छवि समय चूक मोल।
    1. समय श्रृंखला विंडो खोलने के लिए अधिग्रहण टैब में "समय श्रृंखला" बंद की जाँच करें। अंतराल के तहत 0, और 40 में टाइप स्कैन की कुल संख्या समय के अंतराल के बिना 40 छवियों लगातार लेने के लिए।
      नोट: 40 स्कैन 7.5 सेकंड / फ्रेम के स्कैन की गति और 600 माइक्रोन x 600 माइक्रोन की छवि आकार के साथ लगभग 5 मिनट लंबे समय श्रृंखला उत्पन्न करता है। अंतराल और माइक्रोस्कोप, छवि अधिग्रहण सेटिंग्स और कैमरे के फ्रेम दर के आधार पर स्कैन की संख्या को समायोजित करें। एक निश्चित अंतराल समय (> 0 सेकंड) समय चूक छवियों अलग अलग समय बिंदुओं पर हासिल की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक लंबे समय चूक इमेजिंग अवधि प्रयोगात्मक हालत में न्यूट्रोफिल (या हित के अन्य कोशिकाओं) की उम्मीद की औसत वेग पर निर्भर करता है की आवश्यकता हो सकती है।
  15. 3 डी छवि मोल।
    1. Z ढेर विंडो खोलने के लिए अधिग्रहण टैब में "Z ढेर" बंद की जाँच करें। FITC-dextran के लिए "लाइव" पूर्वावलोकन मोड शुरू करो। नमूने के शीर्ष पर ध्यान दें और क्लिक करें "पहला सेट", और नमूना के दूसरे छोर पर ध्यान केंद्रित करने और क्लिक करें "अंतिम सेट" Z ढेर विंडो में।
    2. अंतराल सेट Z ढेर खिड़की के तहत 10 माइक्रोन होना करने के लिए। पिछले चरण में चयन पहली और आखिरी ऑप्टिकल टुकड़ा पर निर्भर करता है, यह 10-20 स्लाइस उत्पन्न होगा, 90-180 माइक्रोन के समग्र ऑप्टिकल मोटाई के साथ।
      नोट: जेड ढेर अंतराल पिनहोल, जो ऑप्टिकल टुकड़ा की मोटाई निर्धारित करता है के आकार पर निर्भर है। अंतराल सेट ऑप्टिकल टुकड़ा की मोटाई से भी कम हो।
    3. अधिग्रहण टैब के अंतर्गत "प्रारंभ प्रयोग" पर क्लिक करें छवियों का संग्रह शुरू करने के लिए।
  16. 3 डी छवि समय चूक मोल।
    1. समय श्रृंखला खोलने के लिए अधिग्रहण टैब में "टाइम सीरीज" और "Z ढेर" बंद की जाँच करेंऔर जेड ढेर खिड़कियां।
    2. समय श्रृंखला की स्थापना की और जेड ढेर अधिग्रहण पैरामीटर कदम 2.14 और 2.15 में वर्णित है। अधिग्रहण टैब के अंतर्गत "प्रारंभ प्रयोग" पर क्लिक करें छवियों का संग्रह शुरू करने के लिए।
  17. इमेजिंग के दौरान माउस मॉनिटर यह स्थिर और बेहोश है सुनिश्चित करने के लिए। अगर माउस अस्थिर और / या इमेजिंग के दौरान होश में है, मंच से माउस को हटाने intraperitoneally संवेदनाहारी समाधान के अतिरिक्त 100-150 μl इंजेक्षन, और इमेजिंग जारी है।
    नोट: अस्थिरता के लक्षण तेजी से सांस लेने और माउस, जो अधिग्रहीत छवियों में कलाकृतियों स्थानांतरण के रूप में देखा जा सकता है की गति शामिल हैं।
  18. छवि अधिग्रहण के बाद, मंच से माउस ले और इसे पिंजरे में लौटने। यह गर्म रखने के लिए, और माउस पर नजर रखने के लिए जब तक वह होश में है एक हीटिंग दीपक का प्रयोग करें।

3. छवि विश्लेषण और मात्रा का ठहराव

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें 3 डी और समय श्रृंखला डेटा का विश्लेषण करने के लिए। सॉफ्टवेयर खोलें औरउन्हें जो "अखाड़ा" दृश्य कहा जाता है खुले स्क्रीन, में खींचकर छवियों को जोड़ने। इसे खोलने के लिए एक छवि फ़ाइल पर डबल क्लिक करें; छवि "पार" देखने के तहत खोला जाएगा।
  2. एक 2D / 3D छवि बनाएं।
    1. शीर्ष दाएं कोने पर "अधिक" पट्टी से, को खोलने के लिए "प्रदर्शन समायोजन" खिड़की क्लिक करें "संपादन / दिखाएँ प्रदर्शन समायोजन"। प्रत्येक चैनल के लिए थ्रेसहोल्ड समायोजन करके प्रतिदीप्ति प्रदर्शन का अनुकूलन, और छवि को बचाने के लिए एक स्नैपशॉट ले।
  3. समय चूक छवियों का उपयोग कर वस्तु पटरियों उत्पन्न करता है।
    1. छवि खोलें "पार" देखने के तहत विश्लेषण किया जाना है। नारंगी डॉट्स की एक छवि है, "पार" आइकन के नीचे पाया के साथ आइकन पर क्लिक करें। यह एक नया 'स्पॉट' विंडो खुलेगा।
    2. "ट्रैक स्पॉट (समय के साथ)" बंद की जाँच करें और अगले कदम के लिए जाने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें। "स्रोत चैनल" के तहत ट्रैक करने के लिए वस्तुओं से युक्त चैनल का चयन करें, और अनुमानित वस्तु diamet सेट"अनुमानित XY व्यास" में एक नंबर लिखकर तहत इंजी। नीले तीर पर क्लिक करें अगले कदम के लिए जाने के लिए।
      नोट: न्यूट्रोफिल ट्रैकिंग के लिए, न्यूट्रोफिल के लिए एपीसी प्रतिदीप्ति युक्त चैनल का चयन और 12 माइक्रोन के लिए वस्तु व्यास न्यूट्रोफिल के ज्ञात आकार के आधार पर निर्धारित किया है।
    3. विंडो में, खोजने के लिए और नीचे तीर पर क्लिक करके "गुणवत्ता" फिल्टर का चयन करें। स्पॉट सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित निरीक्षण करें और शामिल है या धब्बे बाहर करने के लिए मैन्युअल रूप से सीमा समायोजित करें। एक बार जब सीमा परिभाषित किया गया है, "ट्रैकिंग" चरण में जाने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
    4. एल्गोरिथ्म के तहत, खोजने के लिए और "autoregressive मोशन एल्गोरिथ्म" का चयन नीचे तीर पर क्लिक करके। "अधिकतम अंतराल के आकार" के लिए "अधिकतम दूरी" 10 माइक्रोन और 3 में टाइप पैरामीटर्स के नीचे पाया। बंद की जाँच करें "सभी का पता चला वस्तुओं के साथ अंतराल को भरने" ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, और अगले चरण पर जाने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
      नोट: "autoregressive गति एल्गोरिथ्म" प्रयोग किया जाता है चया वस्तुओं है कि, आंदोलन का निर्देशन किया है, क्योंकि यह पिछले गति से भविष्यवाणी स्थान पर आधारित पटरियों उत्पन्न करता है। "अधिकतम दूरी 'और' मैक्स अंतराल के आकार" उम्मीद आयाम और वस्तु के वेग के आधार पर पता लगाया जा रहा है, साथ ही समय चूक छवि के समग्र अवधि समायोजित किया जा सकता है।
    5. के तहत फ़िल्टर प्रकार, "ट्रैक अवधि" फिल्टर का चयन करें। ट्रैकिंग खत्म, और पटरियों है कि उत्पन्न किया गया जांच करने के लिए हरी तीर पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो तो मैन्युअल पटरियों सुलझाने के लिए पिछले चरण के लिए वापस जाओ।
  4. तो उत्पन्न छवि समय चूक drifts, ट्रांसलेशनल बहाव के लिए सही है।
    1. एक पेंसिल की एक छवि के साथ आइकन पर क्लिक करें। यह एक संपादन टैब "ट्रैक संपादित करें" खिड़की खुलती है। समय चूक छवि की जांच करने और एक संदर्भ जगह है कि सभी छवियों के लिए आगे बढ़ नहीं किया जाना चाहिए पाते हैं।
    2. स्क्रीन के ऊपरी बाएँ कोने में, "सूचक" खिड़की और जाँच बंद "का चयन करें" घन सक्रिय करने के लिएएक जगह का चयन करने के लिए rsor। संदर्भ मौके पर क्लिक करें।
    3. "ट्रैक संपादित करें" विंडो में "सही बहाव" पर क्लिक करें। "ट्रांसलेशनल बहाव" बंद की जाँच करें। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से छवियों के सुधारा श्रृंखला उत्पन्न होगा।
  5. सेलुलर आंदोलन समय चूक छवियों में वस्तु पटरियों से परिभाषित उपाय।
    1. "ट्रैक संपादित करें" खिड़की के नीचे, "पटरियों" बंद की जाँच करें और एक ट्रैक है कि एक सेल के आंदोलन का प्रतिनिधित्व करता है का चयन करें। चयनित ट्रैक समय श्रृंखला छवि में पीले रंग में प्रकाश डाला जाएगा।
    2. एक ग्राफ की एक छवि के साथ आइकन पर क्लिक करें "सांख्यिकी" खिड़की (सांख्यिकी टैब) खोलने के लिए।
    3. के तहत "चयन", उत्पन्न करने के लिए ट्रैक स्पीड चयनित ट्रैक के लिए क्या मतलब नीचे तीर पर क्लिक करके "ट्रैक स्पीड मतलब है" का चयन करें। अलग पटरियों का चयन और मापने के लिए ट्रैक स्पीड ब्याज की सभी कोशिकाओं के लिए क्या मतलब चरणों को दोहराएँ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murine ऊरु अस्थि मज्जा को सफलतापूर्वक अलग-अलग न्यूट्रोफिल और संवहनी नेटवर्क के दृश्य सक्षम करने के लिए WC का उपयोग कर पहुँचा है। चित्रा 1 WC साधन पता चलता है और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया है, जो ऊरु हड्डी और cortical हड्डी के पतले होने का जोखिम शामिल अंदर ऑप्टिकल पहुँच प्राप्त करने का वर्णन हड्डी। सर्जरी चूहों में अच्छी तरह से सहन किया है; वे इस तरह के 5 दिनों के बाद सर्जरी के लिए हिंद अंग में सूजन, गैर वजन अंग पर असर, आत्म विकृति, cellulitis और जिल्द की सूजन, साथ ही WC को होने वाले नुकसान के रूप में प्रतिकूल शारीरिक प्रतिक्रियाओं, के लिए मूल्यांकन किया गया संकट का कोई रिपोर्ट के साथ। विशेष रूप से, खिड़की ऑप्टिकली अप करने के लिए 40 दिन है, जो एक हस्तक्षेप के बाद सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन की लंबी अवधि के मूल्यांकन के लिए सक्षम हो सकता है IVM के लिए साफ रहता है।

अस्थि मज्जा के भीतर Vasculature ऐसे FITC-dextran के रूप में intravascular रंजक, द्वारा देखे जा सकते हैं(चित्रा 2)। चूंकि इसके विपरीत डाई के इंजेक्शन पर निर्भर है, अधिग्रहीत छवि कार्यात्मक वाहिका जहां पर्याप्त रक्त प्रवाह है प्रतिनिधित्व करता है। वाहिका के अलावा, न्यूट्रोफिल विरोधी Ly6G एंटीबॉडी का उपयोग विवो में दाग जा सकता है। चित्रा 3 ए और 3 बी अस्थि मज्जा अलग अलग समय बिंदुओं, जहां न्यूट्रोफिल दोनों intravascular और extravascular अंतरिक्ष में देखा जाता है पर मनाया के एक ही क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन क्षेत्रों में संवहनी स्थलों की विशेषता थे। Rhodamine 6G विरोधी Ly6G के लिए एक विकल्प विवो में न्यूट्रोफिल दाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह एक गैर विशिष्ट ढंग से extravascular अंतरिक्ष में वाहिका और दाग monocytes के बाहर diffuses। इसलिए, विरोधी Ly6G पसंद है क्योंकि यह न्यूट्रोफिल के विशिष्ट इमेजिंग सक्षम बनाता है। चित्रा -3 सी cortical हड्डी, जो मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर से बना है की इमेजिंग का प्रतिनिधित्व करता है। इमेजिंग के लिए अधिक से अधिक गहराई हासिल कीइस प्रयोग में 180 माइक्रोन (चित्रा 3 सी) है।

समय चूक प्रतिदीप्ति इमेजिंग vivo में ट्रैकिंग और सेलुलर आंदोलन की मात्रा का ठहराव की सुविधा। चित्रा -4 ए अस्थि मज्जा संवहनी आला में न्यूट्रोफिल की ट्रैकिंग से पता चलता है। प्रत्येक स्कैन के बीच कोई अतिरिक्त समय अंतराल के साथ इमेजिंग कोशिकाओं की सटीक ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है; हालांकि, कुछ उपयोगकर्ता इनपुट आगे सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न पटरियों की सटीकता में सुधार करने की आवश्यकता है। स्पॉट की ट्रैकिंग (यानी, ब्याज की कोशिकाओं) ऐसे मतलब ट्रैक गति (चित्रा 4 बी) के रूप में विभिन्न मापदंडों की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। अन्य मापदंडों मापा जाता है कि हो सकता है शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, स्थान आकार, आकृति और तीव्रता में लंबाई, परिवर्तन ट्रैक। इस परख विभिन्न मापदंडों कि सेलुलर आंदोलनों और बातचीत के लक्षण वर्णन में सुधार की मात्रा का ठहराव प्रदान करता है।


चित्रा 1: फीमर खिड़की कक्ष (WC), इमेजिंग मंच और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया (ए) एक यू के आकार बार उस जगह में फीमर ठीक करने के लिए कार्य करता है के साथ कस्टम-टाइटेनियम फीमर WC।। WC एक 8 मिमी व्यास कवर ग्लास, एक तस्वीर की अंगूठी द्वारा सुरक्षित रखती है। (बी) के कस्टम-इमेजिंग मंच। एक हीटिंग तत्व चरण इमेजिंग के दौरान माउस के शारीरिक तापमान को बनाए रखने के तल पर रखा गया है। दो मगरमच्छ क्लिप WC धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है। (सी - एच) सर्जिकल फीमर WC स्थापित करने के लिए प्रक्रिया। (सी) फीमर flexor और extensor मांसपेशियों के बीच संपर्क में है। स्नायु प्रक्रिया के दौरान नहीं हटा रहे हैं। (डी) यू के आकार बार फीमर के तहत रखा गया है, और (ई) WC स्थापित किया है और दो ​​पागल का उपयोग कर सुरक्षित है। (एफ) दंत सीमेंट की हड्डी और के बीच लागू किया जाता हैWC स्थान को भरने के लिए। (G) डर्मिस सिलाई की जाती है और (एच) कवर कांच बनाए रखने की अंगूठी के साथ जगह में तय हो गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: विवो में अस्थि मज्जा में संवहनी नेटवर्क के 3 डी प्रतिदीप्ति इमेजिंग अस्थि मज्जा में वाहिका के प्रतिनिधि छवि, फीमर WC के माध्यम से imaged।। Vasculature (हरा) 2 एमडीए FITC-dextran की पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा कल्पना की है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: संवहनी नेटवर्क, न्यूट्रोफिल और vivo में हड्डी मैट्रिक्स के 3 डी इमेजिंग अस्थि मज्जा (ए) 3 दिन और (बी) के 10 दिनों फीमर WC सर्जरी के बाद में वाहिका की छवियों और न्यूट्रोफिल।। न्यूट्रोफिल, एपीसी लेबल Ly6G एंटीबॉडी की पूंछ नस में इंजेक्शन से सना हुआ, intravascular और extravascular रिक्त स्थान में दोनों में देखा जाता है। तीर संवहनी संरचना दोनों दिनों पर देखा करने के लिए बात है, समय पर एक ही स्थान ट्रैक करने की क्षमता का संकेत है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (सी) हड्डी मैट्रिक्स स्वयं सहायता समूह (सफेद) का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं, वाहिका (हरा) और न्यूट्रोफिल (लाल) के अलावा। चित्र को 40 दिनों WC सर्जरी के बाद अधिग्रहण कर लिया था। स्केल बार = 70 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4: न्यूट्रोफिल आंदोलन पर नज़र रखने विवो में अस्थि मज्जा का संवहनी नेटवर्क के भीतर संवहनी नेटवर्क के भीतर neutrophils के (ए) ट्रैक रास्तों।। पटरियों सॉफ्टवेयर बनाया है autoregressive मोशन एल्गोरिथ्म का उपयोग कर स्वचालित रूप से उत्पन्न कर रहे हैं। प्रत्येक सफेद डॉट एक कण का एक केंद्र बिंदु लगाया जा रहा है (न्यूट्रोफिल) का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (बी), ट्रैक स्पीड intravascular और extravascular न्यूट्रोफिल के लिए मापा मतलब न्यूट्रोफिल के आंदोलन में अंतर का संकेत (= त्रुटि बार मतलब + एसडी, * पी ​​= 0.0176, दो पूंछ टी परीक्षण)। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वास्तविक समय, अस्थि मज्जा में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के सीरियल इमेजिंग जानकारी है कि अन्यथा ऐसे ऊतक विज्ञान और कुल रक्त की गिनती के रूप में पारंपरिक तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए चुनौती दे रहा है प्रदान करता है। फीमर WC मॉडल यहाँ वर्णित समय के साथ अस्थि मज्जा में सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। हालांकि एक फीमर WC मॉडल पहले से सूचित कर दिया गया है, हमारे उपन्यास डिजाइन दृश्य और छोटे समग्र WC आकार का एक बड़ा इमेजिंग क्षेत्र है, जो वयस्क चूहों में उपयोग के लिए अधिक संगत कर रहे हैं प्रदान करता है। फीमर WC मॉडल असुरक्षित और / या ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों सहित माउस उपभेदों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है।

वहाँ सर्जरी कि समग्र अवधि और इमेजिंग की गुणवत्ता निर्धारित दौरान महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। जब फीमर उजागर, केवल flexors और extensors के बीच की मांसपेशियों के एक कुंद विच्छेदन किया जाता है; इन मांसपेशियों को हटाने के लिए माउस और मुसलमानों की कम गतिशीलता में हो सकता हैटी बचा जा। इसके अलावा, cortical हड्डी के पीस सावधानी से किया जाना चाहिए। पीस लगभग 50 माइक्रोन ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए पर्याप्त है, जबकि ऊरु संवहनी नेटवर्क के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए है। हड्डी के चारों ओर दंत सीमेंट के अनुप्रयोग, शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर क्षेत्र सील तरल पदार्थ जमा रोकने, और एक महीने से अधिक के लिए एक स्पष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग खिड़की को बनाए रखते हुए संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। दंत सीमेंट भी जगह में WC ठीक करने के लिए, ऊरु हड्डी के चारों ओर घूर्णन से WC को रोकने में कार्य करता है। अन्त में, तस्वीर coverglass पकड़ करने के लिए इस्तेमाल की अंगूठी पानी मुहर उपलब्ध कराने, पानी विसर्जन लेंस के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है। तस्वीर की अंगूठी चिपकने से अधिक की सिफारिश की है WC को coverglass संलग्न करने के लिए है क्योंकि चिपकने के अलावा इमेजिंग विमान के लिए एक मामूली कोण रिश्तेदार पर हड्डी और coverglass के बीच की खाई को बढ़ा सकता है, या जगह coverglass, जिससे के लिए प्राप्त प्रवेश गहराई को कम करने इमेजिंग। और भी, तस्वीर अंगूठी उपयोगी है जब coverglass या साफ किया जा करने के लिए बदल की जरूरत है।

सर्जरी के अलावा, वहाँ अस्थि मज्जा का सफल ऑप्टिकल इमेजिंग प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। फीमर WC अंदर छवि के लिए, WC उद्देश्य लेंस की उचित विसर्जन के लिए इमेजिंग चरण के लिए क्षैतिज रखा गया है। के रूप में यह लेंस के लिए सम्मान के साथ WC के कोण के समायोजन के लिए अनुमति देता है कस्टम बनाया इमेजिंग चरण इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, शौचालय, विशेष रूप से यू के आकार पट्टी के आकार, डिजाइन का इष्टतम प्रवेश गहराई प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में coverglass के करीब एक क्षैतिज स्थिति में हड्डी बनाए रखता है। इमेजिंग के दौरान सांस लेने में कलाकृतियों प्रतिदीप्ति छवियों में क्षैतिज लाइनों के रूप में देखा जा सकता है। इमेजिंग चरण के लिए WC हासिल करने के अलावा, इमेजिंग चरण के तहत हीटिंग तत्व के तापमान पर्याप्त रूप से पशु गर्म करने के लिए अत्यधिक सांस लेने को कम से कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। धुंध की एक पतली परतमाउस और गर्म मंच आगे मदद करने के लिए इमेजिंग के दौरान सांस लेने की कलाकृतियों को कम के बीच रखा जा सकता है। जैविक इमेजिंग लक्ष्य पर निर्भर करता है, इस तरह के फ्रेम दर, इमेजिंग मात्रा और इमेजिंग अवधि के रूप में अधिग्रहण के मानकों को भी प्रयोगात्मक सवालों को संबोधित करने के लिए पर्याप्त छवियों को इकट्ठा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल प्रवास और रेंगने के वेग विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 2.8 माइक्रोन / मिनट से बेसल शर्तों के तहत निवासी न्यूट्रोफिल के लिए कहीं भी भड़काऊ शर्तों के तहत 19-21 5-10 माइक्रोन / न्यूट्रोफिल के लिए न्यूनतम से लेकर अलग हो सकता है। इस प्रकार, उचित इमेजिंग गति और vivo में न्यूट्रोफिल नज़र रखने के लिए अवधि भी प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर अलग होगा। इसके अलावा, के रूप में परिणाम से देखा, वाहिका के भीतर कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए एक उच्च फ्रेम दर के साथ एक तेज इमेजिंग कैमरा (30 फ्रेम / सेक) की आवश्यकता होगी। हालांकि, लक्ष्य कोशिकाओं extravascular अंतरिक्ष में रह रहे हैं, या यदि सेल करने वाली सेल interactioब्याज के एन इमेजिंग गति और धीरे धीरे, छवि गुणवत्ता पर प्राथमिकता के आधार पर किया जाना चाहिए होने की उम्मीद है।

सेलुलर समारोह पर इन विवो सेल धुंधला के लिए इंजेक्शन एंटीबॉडी के प्रभाव पर भी विचार किया जाना चाहिए। हमारे अध्ययन में, हम विरोधी Ly6G एंटीबॉडी (1A8 क्लोन) है, जो आम तौर पर उच्च खुराक (150-250 माइक्रोग्राम) में प्रयोग किया जाता है प्रचलन से न्यूट्रोफिल व्यय करना और विभिन्न रोग मॉडल में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया। Yipp और Kubes प्रदर्शन किया है कि fluorochrome लेबल विरोधी Ly6G एंटीबॉडी कम intravascular इंजेक्शन खुराक (1-40 माइक्रोग्राम), 22 पर ल्युकोसैट भर्ती को बाधित नहीं करता। हालांकि, एक अधिक हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि fluorochromes, आणविक द्रव्यमान और रासायनिक संरचना में काफी मतभेद होने, विभिन्न विरोधी Ly6G 23 के समारोह को प्रभावित कर सकते हैं। अध्ययन दिखा दिया है कि FITC लेबल विरोधी Ly6G, लेकिन पे- नहीं और एपीसी लेबल एंटीबॉडी, प्रभावी रूप से एक कम एकाग्रता (30 माइक्रोग्राम) में विवो में न्यूट्रोफिल depletes।हमारे अध्ययन में, हम एपीसी लेबल विरोधी Ly6G के 4 माइक्रोग्राम का उपयोग कर न्युट्रोफिल कमी ओवरटाइम का पालन नहीं किया। फिर भी, विवो में fluorochrome लेबल विरोधी Ly6G एंटीबॉडी के समारोह के आगे लक्षण वर्णन intravital इमेजिंग में इसके उपयोग को मान्य करने के लिए आवश्यक है। यह भी अन्य एंटीबॉडी सेलुलर बातचीत को बदलने के लिए कार्य करने की क्षमता है करने के लिए लागू होता है। एंटीबॉडी के साथ इन विवो सेल धुंधला के लिए एक विकल्प, ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों 24 और / या लेबल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के रूप में 25 न्यूट्रोफिल या विवो में ब्याज की अन्य सेल आबादी कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

फीमर WC मॉडल इस प्रोटोकॉल में वर्णित सर्जरी के बाद 40 दिनों के लिए इमेजिंग सक्षम बनाता है। इस WC मॉडल का उपयोग लंबे समय तक इमेजिंग के लिए चुनौतियों में से कुछ देरी हड्डी चिकित्सा की प्रक्रिया और एक साफ कांच की खिड़की के रखरखाव शामिल हैं। विशेष रूप से, हम WC आरोपण के बाद स्पष्ट हड्डी चिकित्सा के संकेत का पालन नहीं किया है, जो समेत होगाperiosteum की ई उमड़ना; यह देखते हुए कि हड्डी चिकित्सा की प्रक्रिया आम तौर पर 1 साढ़े 3 महीने 26,27 के बाद होता है अप्रत्याशित नहीं है। एक स्वच्छ और ऑप्टिकली स्पष्ट खिड़की का रखरखाव दंत सीमेंट के आवेदन, और तस्वीर की अंगूठी और coverglass के उपयोग जो ऊतक के साथ एक फर्म पानी मुहर प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है। coverglass कभी कभी बाहर से कपास सुझावों के साथ साफ किया जा सकता धूल और मलबे को हटाने के लिए। WC लगभग diaphysis क्षेत्र (लगभग 8.4-8.6 मिमी 28) है, जो इसे पहले प्रकाशित मॉडल 18 से बेहतर बनाता है की पूरी लंबाई को कवर करने के लिए एक विस्तृत इमेजिंग क्षेत्र है। हालांकि, बाहर के क्षेत्रों के लिए उपयोग और गहरी मज्जा गुहा सीमित है। विशेष रूप से, घरनदार अमीर रक्ताधान, diaphysis के बाहर का सिरों पर स्थित है, hPSCs 29 में अमीर होने के लिए जाना जाता है। इन क्षेत्रों में histologically पहुँचा जा सकता है, या एक टर्मिनल प्रक्रिया के रूप में IVM द्वारा। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के सूक्ष्म कंप्यूटर अनुप्रयोग के रूप में विभिन्न इमेजिंग रूपात्मकताuted टोमोग्राफी विवो 30 में अस्थि मज्जा के बाहर क्षेत्रों की छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के तरीकों अस्थि मज्जा के भीतर शरीर रचना विज्ञान और विभिन्न सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन और बातचीत का आकलन करने के लिए एक एकीकृत दृष्टिकोण प्रदान IVM के पूरक हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेलुलर संकल्प पर चूहों में ऊरु अस्थि मज्जा की लंबी अवधि के स्थानिक-सामयिक आकलन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। प्रस्तुत तरीकों, एक एकल कोशिका या जैविक रूप से प्रासंगिक समय तराजू पर सेलुलर आबादी की गतिविधियों पर नज़र रखने के लिए, जबकि एक साथ अस्थि मज्जा की संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने विवो सीरियल इमेजिंग में सक्षम बनाते हैं। इसके अलावा, मात्रात्मक छवि विश्लेषण आगे इस तरह सेलुलर आंदोलनों की ट्रैकिंग के रूप में सेलुलर और कार्यात्मक परिवर्तन, चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। चूहों के विभिन्न प्रकारों, विशेष रूप से ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों 31 में इस फीमर WC मॉडल के आवेदन,आगे इस तरह hematopoiesis में शामिल लोगों के रूप में कई अलग-अलग लेबल सेल आबादी की जांच के लिए सक्षम हो सकती है। इसलिए, वर्णित प्रोटोकॉल व्यापक रूप से रहने वाले murine अस्थि मज्जा के भीतर विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं, hematopoiesis, ल्यूकेमिया, hPSC प्रत्यारोपण, प्रतिरक्षा विनियमन, अस्थि मज्जा microenvironment (जैसे, hypoxic आला) में जांच सहित शामिल preclinical अध्ययन और की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं का योगदान।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

लेखकों माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क पर उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा (www.aomf.ca) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और WC और इमेजिंग चरण के निर्माण के लिए राजकुमारी मार्गरेट कैंसर केंद्र मशीन शॉप से ​​श्री जेसन एलिस। हम यह भी पांडुलिपि संपादन के लिए डॉ आइरिस Kulbatski को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NRCNU-F athymic nude mice Taconic Ncr nude 8-10 weeks old, female
Saline Baxter JB1302P
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc.  DIN 01989529
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Surgical drape Proxima DYNJP2405
Electric heating pad Life Brand 57800827375
Stereomicroscope Leica Leica M60
Eye ointment (tear gel) Novartis  T296/2
7.5% betadine Purdue Frederick Co 67618-151-16
70% isopropyl alcohol GreenField P010IP7P
10% betadine Purdue Frederick Co 67618-150-05
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#15) VWR 89176-368
Spring Scissors curved Fine science Tools 15023-10
Baby-Mixter Hemostat Fine science Tools 13013-14
Fine Scissors Fine science Tools 14094-11
Extra Fine Graefe Forceps Fine science Tools 11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats Fine science Tools 13008-12
Micro-drill Harvard Apparaus 72-6065
Micro-drill burrs Fine Science Tools 19007-14
Femur window chamber PMCC machine shop custom design 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness)
U-shaped bar PMCC machine shop custom design 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height)
Coverglass (8 mm) Warner Instruments  HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8 mm) ACKLANDS GRAINGER UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel) Fastenal 70701
Dental cement 3M RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black) Covioien SN-5698
Halsey needle holder Fine Science Tools 12501-13
Buprenorphine (Temgesic) Reckitt Benckiser DIN 0281251
Meloxicam (Metacam) Boehringer Ingelheim DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox) Pfizer DIN 02027879
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)  eBioscience 17-9668
Two-photon microscope LSM 710 Carl Zeiss Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage PMCC machine shop custom design 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height)
Imaris software Bitplane Imaris 8.0 Image analysis software described in Section 3 of the Protocol 
Zen 2012 Zeiss Zen 2012 Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  3. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  4. Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
  5. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
  6. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
  7. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  8. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
  10. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
  12. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
  13. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
  14. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
  15. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  16. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
  17. Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
  18. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
  19. Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
  20. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  21. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  22. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  23. Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
  24. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  25. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
  26. Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
  27. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  28. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  31. Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 113 intravital इमेजिंग multiphoton प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी खिड़की कक्ष ऊरु अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल सेल ट्रैकिंग
के लिए फीमर विंडो चैंबर मॉडल<em&gt; Vivo</em&gt; Murine अस्थि मज्जा में सेल ट्रैकिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Maeda, A., Bu, J.,… More

Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter