Introduction
Il midollo osseo è un importante organo coinvolto nella emopoiesi e regolazione immunitaria. Si compone di un componente ematopoietiche contenente cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e una componente stromale che contiene cellule progenitrici ematopoietiche non che danno origine a cellule mesenchimali 1. Due terzi di attività ematopoietiche è dedicato alla generazione di cellule mieloidi 2. In particolare, un gran numero di neutrofili sono prodotte nel midollo osseo, con 1-2 x 10 11 cellule generate al giorno in un normale umano adulto 2. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni microbiche e sono per lo più riservati nel midollo osseo fino lo stress innesca la loro mobilitazione per integrare i neutrofili periferici 1,3. Oltre ai loro effetti anti-microbici, studi recenti suggeriscono un ruolo importante dei neutrofili in biologia del cancro, avendo entrambi pro e fenotipi anti-cancerogeni a seconda della crescita trasformandofattore beta (TGF-β) di segnalazione nel 4,5 microambiente tumorale. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che i neutrofili che si accumulano nei tumori primari esercitano effetti pro-cancerogeni e metastatici sopprimendo la funzione citotossica delle cellule T 6,7, mentre i neutrofili in circolazione esercitano un citotossico, effetto anti-metastatico 8. Come tale, ricerca di cellule ematopoietiche del midollo osseo, in particolare neutrofili, è fondamentale per chiarire il loro ruolo nella regolazione immunitaria e tumore.
Istopatologia e un conteggio completo del sangue periferico sono abitualmente utilizzati per valutare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo 9. Tuttavia, questi metodi forniscono solo informazioni statiche di diverse popolazioni cellulari o tissutali microstrutture. Longitudinale imaging in vivo può essere utilizzato in combinazione con i metodi standard per valutare le dinamiche di molteplici componenti cellulari, vascolari e stromali e cellula-cinterazioni ell in modo longitudinale. Microscopia intravitale (IVM), definito come l'imaging di animali vivi con risoluzione microscopica 10, è particolarmente utile per valutare i processi cellulari dinamici nel tempo nello stesso campione, riducendo il numero di animali sperimentali richiesto. IVM è spesso combinato con una camera di finestra cronicamente trapiantato (WC) per accedere al organo di interesse per l'imaging su una durata di settimane o mesi. modelli WC cranici e dorsale-plica hanno la più lunga storia di utilizzo che risale alla metà degli anni 1990. Più recentemente, altri modelli WC organo-specifiche, quali quelle del pad grasso mammario e vari organi addominali sono stati sviluppati 11.
L'approccio tipico per l'imaging del midollo osseo in vivo ha l'esposizione occupa principalmente della calvaria di topi, dove l'osso assottigliata permette la visualizzazione diretta di singole cellule con un intervento chirurgico minimo 12-14. Tuttavia, il midollo osseo cranica May Be distinto da quello di altre ossa, come l'osso lungo, come dimostrato da un numero inferiore di HSPCs e cellule ipossiche in calvaria, che indica ridotta manutenzione e lo sviluppo HSPCs 15. Pertanto, approcci alternativi per la valutazione componenti cellulari nel lungo osso sono stati indagati. Questi includono l'esposizione diretta del midollo osseo femorale 16 e il trapianto ectopica di femore scissione dorsale plica WC 17. Tuttavia, il primo è un procedimento terminale che non consente il monitoraggio delle alterazioni cellulari, strutturali e funzionali su periodi di tempo più lunghi, e il secondo probabilmente disturba la normale funzione del midollo osseo a causa del trapianto di femore, a un sito ectopica all'interno del WC dorsali plica. Un altro metodo che permette l'imaging seriale ortotopico di midollo osseo femorale nel tempo è l'uso di un WC nell'osso femorale. Un rapporto precedente ha dimostrato l'imaging a lungo termine della microcircolazione nel midollo osseo femorale utilizzando unafemore WC nei topi 18. Inoltre, gli autori hanno dimostrato visualizzazione delle cellule tumorali nel femore, indicando la sua utilità nel monitoraggio midollo osseo metastasi. Tuttavia, questo motivo WC era limitata dalla sua grande dimensione (1,2 cm di diametro) e relativamente piccola area di esposizione (4 mm di diametro), che era adatto solo per grandi topi (26-34 g, 3-6 mesi di età) rendendo così la approccio pratico per l'uso di routine.
Pertanto, un nuovo bagno con un ingombro più piccolo e più grande area di esposizione interna creata per lo scopo di questo studio. L'obiettivo di questo studio era quello di fornire un metodo per l'imaging vari tipi di cellule nel midollo osseo femorale. Il modello di WC femore è stato sviluppato in-house ed è stato utilizzato per visualizzare e monitorare neutrofili all'interno della rete vascolare 3D. Utilizzando questo modello, IVM del midollo osseo può essere eseguito serialmente oltre 40 giorni. Questo approccio può essere applicato ad una varietà di campi per chiarire i processi di ematopoiesi, regolazione immunitaria unlo sviluppo del tumore ND.
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Protocol
NOTA: Tutto il lavoro animale è stato realizzato sotto il protocollo # 2615 approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa University Health Network.
1. Preparazione chirurgica del mouse
- Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e la camera di finestra (WC) in autoclave. Supplemento l'acqua potabile con 50 mg / kg di peso corporeo di amoxicillina 2 giorni prima dell'intervento. Iniettare il mouse con 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via intraperitoneale 4 ore prima dell'intervento.
- Anestetizzare il mouse nudo atimici mediante iniezione intraperitoneale di soluzione salina 350-400 ml contenente 80 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg xylazina (Nota: Questo è stato approvato dal comitato di assistenza istituzionale degli animali, e non abbiamo avuto alcuna esperienza con effetti negativi ). Verificare il corretto anestesia testando per riflessologia plantare. Continuare l'osservazione per il modello di respirazione, il colore delle mucose e di riflesso del piede durante la procedura.
- Eseguire la pr chirurgicaocedures sotto un armadio biosicurezza per mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico. Posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento elettrico coperto con un telo chirurgico per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Eseguire tutte le procedure chirurgiche con lo stereomicroscopio.
- Applicare una pomata oculare per mantenere gli occhi umidi durante l'intervento chirurgico. Ripetere se necessario durante la procedura chirurgica. Sterilizzare l'area di funzionamento del mouse strofinando con 7,5% iodopovidone, il 70% di alcol isopropilico e 10% iodopovidone consecutivamente, e ripetere la procedura due volte.
- Fare un 10 millimetri incisione cutanea longitudinale mediante bisturi con una lama (# 15), si avvicina il femore dalla parte laterale. Esporre il femore tra i muscoli flessori ed estensori per via smussa con pinze e pinze emostatiche per garantire la funzionalità muscolare.
- Inserire la barra a forma di U sotto l'osso, e installare il WC (Figura 1). Fissare la barra con la finestra con due dadi, e serrare i dadi perfunghi porcini. Riempire lo spazio tra l'osso e il WC con cemento dentale.
- Rettificare l'osso corticale in una regione 6 x 2 mm 2 con un micro-trapano per ottenere l'accesso ottico alla cavità midollare.
Nota: Ispezionare attentamente assottigliamento della corticale ossea sotto il microscopio durante l'esecuzione di questa procedura. Lasciare intatto, quasi trasparente strato periostale dell'osso. - Posizionare il coprioggetti 8 millimetri sulla finestra, e fissare il coprioggetti con un anello elastico per tenerlo in posizione.
- Regolare la muscolatura dei flessori ed estensori della schiena nelle loro posizioni originali, utilizzando una pinza per mantenere la loro funzione dopo l'intervento chirurgico. Suturare il derma utilizzando 5-0 di sutura e un porta aghi.
- Monitorare il mouse per il recupero, finché è cosciente ed è in grado di muoversi liberamente. Mettere l'animale in una nuova gabbia quando recuperati.
- Dopo il recupero, eseguire l'acquisizione di immagini sull'animale lo stesso giorno o nei giorni successivi (vedere la sezione 2). Monitorare il Physicondizioni cal del mouse quotidiana.
Nota: monitorare le condizioni fisiche, come ad esempio sostenere il peso sull'arto, incurvando, respirazione rapida e superficiale, posteriori gonfiore degli arti, automutilazione, cellulite e dermatite grave. - Dare iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per 3 giorni, e 1 mg / kg di peso corporeo di meloxicam per 5 giorni dopo l'intervento chirurgico per il trattamento del dolore post-operatorio e l'infiammazione. Continuare a fornire l'acqua amoxicillina-integrato per 5 giorni.
- Al endpoint sperimentale, eutanasia dell'animale da CO 2 narcosi seguita da un metodo secondario (ad esempio, dislocazione cervicale).
2. Acquisizione Immagine Usando combinata multi-fotone e Microscopia confocale
- Prima di imaging, anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione salina 350-400 microlitri contenente 80 mg / kg ketamina e 13 mg / kg xylazina. In alternativa, utilizzare anestetico inalabile, quando disponibile.Applicare una pomata oculare.
- Iniettare la miscela di coloranti intravascolari per l'etichettatura vascolare (0,65 mg di 2 MDa fluoresceina (FITC) -dextran) e neutrofili (4 mg di Allophycocyanine (APC) anticorpo -Anti-Ly6G).
- Utilizzare un montante combinato multi-photon e microscopio confocale equipaggiato con un laser multi-photon vanno da 705-980 nm per eccitazione a due fotoni, così come i laser di fotoni singoli che fornisce lunghezze d'onda di eccitazione dal blu al rosso.
- Impostare una fase di imaging su misura sul microscopio (Figura 1B). Fissare il mouse sul palco da serraggio le due estremità del WC con morsetti a coccodrillo.
Nota: i componenti critici della fase sono: due morsetti a coccodrillo per tenere il WC, ed un elemento di riscaldamento per mantenere la temperatura fisiologica (37 ° C) del mouse durante l'imaging. - Accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale, e avviare il software di acquisizione delle immagini cliccando su "Avvio del sistema". Una finestra con 4 schede (Locate,Acquisizione, elaborazione, e mantenere) si aprirà.
- Impostare i canali di imaging. Fai clic su "Smart Setup" nella scheda di acquisizione e scegliere le tinte che saranno utilizzati per l'imaging: FITC (488 nm di eccitazione, 493-588 nm di emissione) e APC (633 nm di eccitazione e di emissione 638-743 nm). Scegliere "miglior segnale" e fare clic su "Applica".
- Aggiungere la seconda immagine canale di acquisizione generazione armonica (SHG) manualmente. Accendere il laser a due fotoni sotto la finestra "laser" nella scheda di acquisizione. Sotto la finestra Canali, fare clic sul segno "+" per aggiungere una traccia.
- Impostare la pista SHG. Modificare la lunghezza d'onda di 840 nm sotto la finestra Canali utilizzando le frecce su e giù, e scegliere l'intervallo di rilevamento di essere 415-425 nm sotto la finestra "Percorso Light" utilizzando la barra di scorrimento.
- Clicca su "Oculari online" nella scheda Locate. Fare clic FITC sotto l'impostazione del filtro per FITC per visualizzare la regione di interesse e regolare la messa a fuoco manualmente girando tsi concentrano manopola sul lato del microscopio. Quando si trova la regione di interesse, cliccare su "Oculari Offline" nella scheda Locate.
- Fare clic sulla scheda di acquisizione. Selezionare FITC pista sotto la finestra dei canali e cliccare su "Live" per visualizzare in anteprima l'immagine di FITC-destrano con l'obiettivo 5X. Regolare la messa a fuoco, se necessario, e fare clic su "Stop" nella scheda di acquisizione per interrompere l'anteprima.
- girare manualmente a 20X obiettivo acqua spostando una ruota sopra le lenti. Visualizza l'immagine ancora per FITC-destrano con l'obiettivo 20X e regolare Maestro Gain e Pinhole sotto la finestra canali per ottenere ottimale del segnale e il contrasto. Ripetere l'operazione per gli altri canali selezionando APC e SHG tracce sotto la finestra Canali.
- Scegli i parametri di imaging. Clicca su "Modalità di acquisizione" per aprire la finestra. Impostare la dimensione del frame per essere 1.024 x 1.024 pixel, e una media di 4X per ottenere immagini di alta qualità.
- Acquisire una fotografia 2D. Selezionare tutti i canali sotto Canali vincereDow e clicca su "Snap" nella scheda di acquisizione. Controllare la qualità dell'immagine e modificare i parametri di imaging se necessario.
- immagini time-lapse 2D acquisire.
- Controllare off "Time Series" nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Time Series. Digitare 0 sotto gli intervalli, e 40 per il numero totale di scansioni a prendere 40 immagini in modo continuo, senza intervallo di tempo.
Nota: 40 scansioni genera circa 5 minuti lungo tempo serie con una velocità di scansione di 7,5 sec / telaio e le dimensioni dell'immagine di 600 micron x 600 micron. Regolare l'intervallo e il numero di scansioni seconda microscopio, impostazioni di acquisizione dell'immagine e il frame rate della telecamera. Un intervallo di tempo fisso (> 0 sec) può essere utilizzata per confrontare le immagini time-lapse acquisite in diversi momenti. Una durata time-lapse imaging più lungo può essere necessario in base alla velocità media attesa dei neutrofili (o altre cellule di interesse) nella condizione sperimentale.
- Controllare off "Time Series" nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Time Series. Digitare 0 sotto gli intervalli, e 40 per il numero totale di scansioni a prendere 40 immagini in modo continuo, senza intervallo di tempo.
- Acquisire immagini 3D.
- Controllare off "Z-Stack" nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Z-Stack. Avviare il "Live" modalità di anteprima per FITC-destrano. Focus sulla parte superiore del campione e clicca "Set First", e concentrarsi sull'altra estremità del campione e clicca "Set Ultimo" nella finestra Z-stack.
- Impostare l'intervallo per essere di 10 micron sotto la finestra Z-stack. A seconda della prima e l'ultima fetta ottica selezionato nel passaggio precedente, questo genererà 10-20 fette, con spessore ottico complessivo di 90-180 micron.
Nota: L'intervallo di z-stack dipende dalla dimensione del foro di spillo, che determina lo spessore della fetta ottica. Impostare l'intervallo di essere inferiore allo spessore della fetta ottica. - Fare clic su "Start Experiment" nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini.
- immagini time-lapse in 3D acquisire.
- Controllare off "Time Series" e "Z-stack" nella scheda di acquisizione per aprire la serie storicae le finestre Z-stack.
- Impostare le serie storiche e parametri di acquisizione Z-stack come descritto ai punti 2.14 e 2.15. Fare clic su "Start Experiment" nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini.
- Monitorare il mouse durante l'imaging per assicurarsi che sia stabile e privo di sensi. Se il mouse è instabile e / o cosciente durante l'imaging, rimuovere il mouse dal palco, iniettare ulteriore 100-150 ml di soluzione di anestetico per via intraperitoneale, e continuare l'imaging.
Nota: segni di instabilità includono respirazione veloce e il movimento del mouse, che può essere visto come spostamento artefatti in immagini acquisite. - Dopo l'acquisizione delle immagini, prendere il mouse fuori dal palco e restituirlo alla gabbia. Utilizzare una lampada riscaldante per mantenerlo caldo, e controllare il mouse fino a quando non è cosciente.
3. Immagine analisi e quantificazione
- Utilizzare immagine software di analisi per analizzare i dati 3D e di serie temporali. Aprire il software eaggiungere immagini trascinandole nella schermata aperta, che si chiama vista "Arena". Fare doppio clic su un file di immagine per aprirlo; l'immagine verrà aperta in vista "Surpass".
- Creare un'immagine 2D / 3D.
- Dalla barra "Altro" che si trova nell'angolo in alto a destra, fare clic su "Modifica / Mostra regolazione Display" per aprire la finestra "Regolazione Display". Ottimizzare la visualizzazione di fluorescenza regolando le soglie per ogni canale, e scattare un'istantanea per salvare l'immagine.
- Generare tracce degli oggetti utilizzando immagini time-lapse.
- Aprire l'immagine da analizzare in vista "Surpass". Fare clic sull'icona con l'immagine di puntini arancioni, che si trova sotto l'icona "Surpass". Si aprirà una nuova finestra "Spot".
- Controllare off "Spot Track (nel tempo)" e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Selezionare il canale che contiene gli oggetti da tracciare sotto "Channel Source", e impostare il diamet oggetto stimatoer under "Diametro XY stimato" digitando un numero. Clicca sulla freccia blu per andare al passaggio successivo.
Nota: per il monitoraggio dei neutrofili, selezionare il canale che contiene APC fluorescenza per neutrofili e impostare il diametro dell'oggetto da 12 micron in base alle dimensioni noto di neutrofili. - Nella finestra, trovare e selezionare il filtro "Qualità" facendo clic sulla freccia verso il basso. Osservare i punti definiti dal software e regolare manualmente la soglia per includere o escludere macchie. Una volta che la soglia è definita, cliccare sulla freccia blu per andare al passo "Tracking".
- Secondo l'algoritmo, trovare e selezionare "Motion Algoritmo Autoregressive" cliccando sulla freccia verso il basso. Digitare 10 micron per "Max Distance" e 3 per "Max Gap Size" trovato sotto Parametri. Controllare off "Riempire lacune con tutti gli oggetti rilevati" per iniziare a monitorare, e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo.
Nota: "algoritmo di movimento Autoregressive" è utilizzato fo oggetti che hanno diretto il movimento, dal momento che genera le tracce in base alla posizione prevista dal movimento precedente. "Max Distance" e "Max Gap Size" può essere regolata a seconda della dimensione prevista e velocità dell'oggetto essere monitorati, nonché la durata complessiva dell'immagine time-lapse. - In Tipo di filtro, selezionare il filtro "Durata". Fare clic sulla freccia verde per completare il monitoraggio, e controllare le tracce che sono stati generati. Torna al passaggio precedente, se necessario, per ordinare manualmente le tracce.
- Se le derive di immagini time-lapse generati, corretti per la deriva traslazionale.
- Fare clic sull'icona con l'immagine di una matita. Si tratta di una scheda di editing che si apre "Modifica Tracce" finestra. Esaminare l'immagine time-lapse e trovare un posto di riferimento che non dovrebbe essere in movimento per tutte le immagini.
- Nell'angolo in alto a sinistra dello schermo, trovare finestra "Pointer" e spuntare "Select" per attivare la cursor per la selezione di un posto. Fare clic sul posto di riferimento.
- Fai clic su "Drift corretta" nella finestra "Modifica Tracce". Controllare off "traslazionale Drift". Il software genera automaticamente la serie corretta di immagini.
- Misurare il movimento cellulare definito dalle tracce degli oggetti nelle immagini time-lapse.
- Sotto la finestra "Edit Tracks", spuntare "Tracce" e selezionare una traccia che rappresenta il movimento di una cellula. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo l'immagine di serie temporali in.
- Fare clic sull'icona con l'immagine di un grafico per aprire la finestra (scheda Statistiche) "Statistiche".
- Sotto "Selezione", selezionare "Track Media" facendo clic sulla freccia verso il basso per generare la velocità pista significa per la traccia selezionata. Scegli diverse tracce e ripetere la procedura per misurare la velocità pista significa per tutte le cellule di interesse.
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Representative Results
Murine midollo osseo femorale si accede con successo utilizzando il WC per consentire la visualizzazione individuale neutrofili e reti vascolari. La Figura 1 mostra lo strumento WC e descrive la procedura chirurgica, che comporta l'esposizione dell'osso femorale e assottigliamento dell'osso corticale per ottenere l'accesso ottico all'interno ossea. La chirurgia è ben tollerato nei topi; sono stati valutati per reazioni fisiche avverse, come gonfiore degli arti posteriori, non cuscinetto di peso sull'arto, automutilazione, cellulite e dermatiti, nonché danni al WC per 5 giorni post-operatorio, con nessun rapporto di angoscia. In particolare, la finestra rimane otticamente trasparente per IVM fino a 40 giorni, che può consentire la valutazione a lungo termine delle alterazioni cellulari e strutturali a seguito di un intervento.
Vasculature all'interno del midollo osseo può essere visualizzato mediante coloranti intravascolari, come FITC-destrano(Figura 2). Poiché il contrasto dipende l'iniezione del colorante, l'immagine acquisita rappresenta vascolare funzionale in cui vi è il flusso di sangue sufficiente. Oltre al sistema vascolare, neutrofili possono essere colorati in vivo utilizzando anticorpi anti-Ly6G. Figure 3A e 3B rappresentano la stessa area del midollo osseo osservata a differenti tempi, in cui i neutrofili sono visibili sia nel intravascolare e spazio extravascolare. Queste aree sono state caratterizzate da punti di riferimento vascolari. Rodamina 6G può essere utilizzata come alternativa al anti-Ly6G macchiare neutrofili in vivo; tuttavia, si diffonde fuori del sistema vascolare e macchie monociti nello spazio extravascolare in modo non specifico. Pertanto, anti-Ly6G è preferito perché permette l'imaging specifico di neutrofili. Figura 3C rappresenta l'imaging dell'osso corticale, che è composto principalmente da fibre di collagene. La profondità massima raggiunta per l'imagingin questo esperimento è di 180 micron (Figura 3C).
Time-lapse imaging di fluorescenza facilita il monitoraggio e la quantificazione di movimento cellulare in vivo. La figura 4A mostra monitoraggio dei neutrofili nella nicchia vascolare del midollo osseo. Imaging senza intervallo di tempo addizionale tra ciascuna scansione permette per un accurato monitoraggio delle cellule; tuttavia, alcuni input utente deve migliorare ulteriormente la precisione di brani generati dal software. Monitoraggio di macchie (cioè, le cellule di interesse) consente la quantificazione di vari parametri, quali la velocità pista medio (Figura 4B). Altri parametri che possono essere misurati includono, ma non sono limitati a, tenere traccia di lunghezza, cambiamento nella dimensione dello spot, la forma e l'intensità. Questo test fornisce quantificazione dei vari parametri che migliorano la caratterizzazione dei movimenti cellulari e interazioni.
Figura 1: Femore camera di finestra (WC), fase di imaging e la procedura chirurgica (A) su misura in titanio WC femore con una barra a forma di U che serve a fissare il femore in posizione.. Il WC tiene un vetro di copertura 8 mm di diametro, assicurato da un anello a scatto. (B) fase di imaging su misura. Un elemento riscaldante è posizionato sul fondo del palco per mantenere la temperatura fisiologica del mouse durante l'imaging. I due morsetti a coccodrillo sono usati per tenere il WC. (C - H) Procedura chirurgica per l'installazione del WC femore. (C) Il femore è esposto tra i muscoli flessori ed estensori. I muscoli non vengono rimossi durante la procedura. (D) La barra a forma di U è posto sotto il femore, e (E) il WC è installato e fissato con due dadi. Cemento (F) dentale viene applicato tra l'osso e laWC per riempire lo spazio. (G) Il derma viene suturata e (H) il vetro di copertura è fissato in posizione con l'anello di sicurezza. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: imaging di fluorescenza 3D della rete vascolare nel midollo osseo in vivo immagine Rappresentante della vascolarizzazione nel midollo osseo, ripreso attraverso il WC femore.. Vascolarizzazione (verde) viene visualizzato da coda vena iniezione di 2 MDa FITC-destrano. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini 3D di rete vascolare, neutrofili e matrice ossea in vivo immagini di vasi e neutrofili nel midollo osseo (A) 3 giorni e (B) 10 giorni dopo l'intervento chirurgico del femore WC.. I neutrofili, macchiate di coda vena iniezione di anticorpi Ly6G APC marcato, si vedono sia negli spazi intravascolari ed extravascolare. Le frecce indicano la struttura vascolare visto su entrambi i giorni, indicando la possibilità di monitorare la stessa posizione nel corso del tempo. Barra di scala = 50 micron. (C) della matrice ossea può essere visualizzato utilizzando SHG (bianco), oltre al sistema vascolare (verde) e neutrofili (rosso). L'immagine è stata acquisita 40 giorni dopo l'intervento chirurgico WC. Barra di scala = 70 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Monitoraggio circolazione neutrofili all'interno della rete vascolare del midollo osseo in vivo percorsi (A) traccia dei neutrofili all'interno della rete vascolare.. Le tracce vengono generati automaticamente utilizzando built-in Autoregressive algoritmo di movimento del software. Ogni punto bianco rappresenta un punto centrale di una particella viene monitorata (neutrofili). Barra di scala = 50 micron. (B) Velocità media pista misurato per intravascolari ed extravascolare neutrofili, che indica la differenza nel movimento di neutrofili (barra di errore = media + SD, * p = 0,0176, due code t-test). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In tempo reale, imaging seriale dei processi cellulari dinamici nel midollo osseo fornisce informazioni che altrimenti difficile da ottenere con tecniche convenzionali quali l'istologia e emocromo totale. Il modello di WC femore qui descritto fornisce opportunità uniche per indagare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo nel corso del tempo. Sebbene un modello femore WC è stato riportato in precedenza, il design innovativo fornisce un più grande campo di ripresa di vista e piccole dimensioni complessive WC, che sono più compatibili per l'uso in topi adulti. Il modello WC femore può essere utilizzato in una varietà di ceppi di topi immunocompetenti inclusi e / o topi reporter transgenici.
Ci sono passaggi critici durante l'intervento chirurgico che determinano la durata e la qualità delle immagini. Quando si espone il femore, viene eseguita solo una dissezione di muscoli tra flessori ed estensori; rimozione di questi muscoli può comportare ridotta mobilità del mouse e must essere evitato. Inoltre, molatura dell'osso corticale deve essere eseguita con attenzione. Macinare circa 50 micron è sufficiente per imaging ottico, mantenendo l'integrità strutturale della rete vascolare femorale. Applicazione del cemento dentale attorno all'osso è cruciale per sigillare la zona chirurgicamente esposta, evitando accumuli di fluido, e il mantenimento di una finestra trasparente imaging ottico per oltre un mese, riducendo il rischio di infezione. Il cemento dentale agisce anche per fissare il WC sul posto, impedendo il WC da ruotare attorno all'osso femorale. Infine, l'anello elastico utilizzato per contenere coprioggetti è adatto per l'uso con lenti acqua-immersion, fornisce acqua-sigillo. L'anello elastico è consigliato sopra gli adesivi per fissare coprioggetti al WC causa aggiunta di adesivi può aumentare la distanza tra l'osso e coprioggetti o posizionare coprioggetti con un angolo leggermente rispetto al piano dell'immagine, riducendo così la profondità di penetrazione ottenibile per imaging. per di più, L'anello elastico è utile quando il coprioggetti ha bisogno di essere pulito o sostituito.
Oltre alla chirurgia, ci sono diversi passaggi critici per ottenere imaging ottico successo del midollo osseo. Per immagine all'interno del WC femore, il WC è posto orizzontalmente alla fase di imaging per una corretta immersione della lente dell'obiettivo. La fase di imaging misura è adatto a questo scopo in quanto consente regolazioni dell'angolo del WC rispetto alla lente. Inoltre, il disegno del WC, in particolare la dimensione della barra a forma di U, mantiene l'osso in posizione orizzontale vicino al coprioggetti possibile per ottenere profondità di penetrazione ottimale. Durante l'imaging, i manufatti di respirazione possono essere osservati come linee orizzontali nelle immagini di fluorescenza. Oltre ad assicurare il WC alla fase di imaging, la temperatura dell'elemento di riscaldamento sotto il palco di imaging può essere regolata per riscaldare adeguatamente l'animale per minimizzare la respirazione eccessiva. Un sottile strato di garzapossono essere collocati tra il mouse e il palco riscaldato per aiutare ulteriormente a ridurre gli artefatti di respirazione durante l'imaging. A seconda della destinazione di imaging biologico, parametri di acquisizione come il frame rate, il volume di immagini e la durata delle immagini possono anche essere regolati per raccogliere le immagini sufficienti per affrontare le questioni sperimentali. Ad esempio, la velocità di migrazione dei neutrofili e scansione può essere diverso in varie condizioni sperimentali, da 2,8 micron / min per i neutrofili residenti in condizioni basali ovunque che vanno 5-10 micron / min per i neutrofili in condizioni infiammatorie 19-21. Così, la velocità di esposizione appropriata e la durata per il monitoraggio dei neutrofili in vivo sarebbe anche variano in base alle condizioni sperimentali. Inoltre, come si vede dai risultati, il monitoraggio di cellule all'interno del sistema vascolare richiederebbe una telecamera veloce con un frame rate elevato (30 fotogrammi / sec). Tuttavia, se le cellule bersaglio sono residenti nello spazio extravascolare, o se il interactio cellula-cellulaSi prevede n di interesse a verificarsi più lentamente, la qualità delle immagini dovrebbe essere la priorità sulla velocità delle immagini.
L'influenza di anticorpi iniettati in vivo per la colorazione delle cellule sulla funzione cellulare deve essere considerato. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato l'anticorpo anti-Ly6G (1A8 clone), che viene in genere utilizzato a dosi elevate (150-250 mcg) per esaurire i neutrofili dalla circolazione e studiare il loro ruolo in diversi modelli di malattia. Yipp e Kubes hanno dimostrato che l'anticorpo anti-Ly6G fluorocromo marcato non interrompe il reclutamento dei leucociti a basse dosi intravascolari di iniezione (1-40 mcg) 22. Tuttavia, uno studio più recente suggerisce che fluorocromi, avendo grandi differenze di peso molecolare e struttura chimica, possono influenzare in modo differenziale la funzione di anti-Ly6G 23. Lo studio ha dimostrato che FITC-marcato anti-Ly6G, ma non in PE e anticorpi APC-etichettati, esaurisce efficace neutrofili in vivo a bassa concentrazione (30 mg).Nel nostro studio, non abbiamo osservato neutrofili straordinari esaurimento con 4 mg di APC-marcato anti-Ly6G. Tuttavia, ulteriore caratterizzazione della funzione di fluorocromo anticorpo marcato anti-Ly6G in vivo è necessaria per convalidare l'uso nell'imaging intravitale. Questo vale anche per altri anticorpi che hanno la capacità funzionale di alterare interazioni cellulari. In alternativa in vivo colorazione delle cellule con anticorpi, topi transgenici reporter di 24 e / o cellule fluorescenti etichettati 25 può essere usato per visualizzare neutrofili o altra popolazione di cellule in vivo.
Il modello di femore WC descritto in questo protocollo permette l'imaging fino a 40 giorni dopo l'intervento chirurgico. Alcune delle sfide per l'imaging a lungo termine che utilizzano questo modello WC includono il processo di guarigione ossea ritardata e il mantenimento di una finestra di vetro pulito. In particolare, non abbiamo osservato segni evidenti di guarigione ossea dopo l'impianto WC, che includ avrebbee ispessimento del periostio; questo non è inaspettato dato che processo di guarigione ossea si verifica in genere dopo 1 ½-tre mesi 26,27. Mantenimento di una finestra pulita e otticamente trasparente può essere ottenuto mediante l'applicazione del cemento dentale, e l'uso di anello elastico e coprioggetti che forniscono un acqua-tenuta ferma con il tessuto. La coprioggetti può essere di tanto in tanto pulito con punte di cotone dall'esterno per rimuovere polvere e detriti. Il vaso ha un campo dell'imaging ampia, che copre quasi l'intera lunghezza della regione diafisi (circa 8.4-8.6 mm 28), che lo rende superiore al modello precedentemente pubblicato 18. Tuttavia, l'accesso alle regioni distali e la cavità midollare più profondo è limitato. In particolare, la metafisi ricco trabecolare, poste alle estremità distali della diafisi, è noto per essere ricco di HPSCs 29. Queste zone sono accessibili istologicamente, o IVM come procedura terminale. In alternativa, diverse modalità di imaging come la micro-compbuito tomografia può essere utilizzato per immagine regioni distali del midollo osseo in vivo 30. Tali metodi sono complementari IVM, fornendo un approccio integrato per valutare l'anatomia e le varie alterazioni cellulari e strutturali e interazioni all'interno del midollo osseo.
Il protocollo qui descritto offre un nuovo approccio a lungo termine di valutazione spazio-temporale del midollo osseo femorale in topi con risoluzione cellulare. I metodi presentati consentono imaging seriale vivo per seguire i movimenti di una singola cella o popolazioni cellulari su scale temporali biologicamente rilevanti, e contemporaneamente ottenere informazioni strutturali e funzionali del midollo osseo. Inoltre, l'analisi quantitativa delle immagini può essere effettuata per caratterizzare ulteriormente alterazioni cellulari e funzionali, quali il monitoraggio dei movimenti cellulari. L'applicazione di questo modello WC femore in vari ceppi di topi, in particolare nei topi reporter transgenici 31,può consentire ulteriori indagini di molteplici popolazioni di cellule singolarmente etichettati come quelli coinvolti nella emopoiesi. Pertanto, il protocollo descritto è ampiamente applicabile ad una vasta gamma di studi preclinici che coinvolgono vari processi biologici all'interno del vivente midollo osseo murino, comprese le indagini in ematopoiesi, la leucemia, il trapianto HPSC, regolazione immunitaria, il microambiente del midollo osseo (per esempio, di nicchia ipossia) e il contributo delle cellule immunitarie di progressione del tumore e metastasi.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la funzione avanzata microscopia ottica (www.aomf.ca) presso la University Health Network per l'assistenza con la microscopia, e Mr. Jason Ellis dalla principessa Margaret Cancer Center Machine Shop per la fabbricazione del WC e la fase di imaging. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Iris Kulbatski per l'editing manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
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