Introduction
Benmargs er et viktig organ som er involvert i hematopoiesis og immunregulering. Den består av en komponent som inneholder hematopoetisk hematopoietiske stamceller og forløperceller (HSPCs), og en stromal komponent inneholdende ikke-hematopoetiske stamceller som gir opphav til mesenchymale celler 1. To tredjedeler av blodkreft aktivitet er dedikert til produksjon av myeloide celler 2. Særlig er et stort antall nøytrofile celler som produseres i benmargen, med 1-2 x 10 11 celler ble generert per dag i et normalt voksent menneske 2. Neutrophils er den første forsvarslinje mot mikrobielle infeksjoner og er stort sett reservert i benmargen til stress utløser deres mobilisering for å supplere perifere nøytrofile 1,3. I tillegg til sine antimikrobielle effekter, nyere studier tyder på en viktig rolle nøytrofile i kreft biologi, har både pro- og anti-tumorigen fenotyper avhengig av trans vekstfaktor beta (TGF-β) signalering i svulsten mikromiljøet 4,5. Videre studier viste at neutrofiler som akkumuleres i primære svulster utøve pro-tumorigene og metastatiske virkninger ved å undertrykke den cytotoksiske funksjon av T-celler 6,7, mens nøytrofile i omløp utøve en cytotoksisk, anti-metastatisk effekt 8. Som sådan, er undersøkelse av hematopoetiske celler i benmargen, særlig neutrofiler, avgjørende for å belyse deres rolle i immunsystemet og tumor regulering.
Histopatologi og en fullstendig perifer blodtelling blir rutinemessig anvendt for å vurdere celle og strukturelle forandringer i benmargen 9. Imidlertid har disse fremgangsmåter bare gir statisk informasjon fra forskjellige cellepopulasjoner eller vev mikrostrukturer. Langsgående in vivo avbildning kan anvendes i kombinasjon med standard metoder for å vurdere dynamikken i flere cellulære, vaskulære og stromale komponenter samt celle-til-cell interaksjoner i en langsgående måte. Intravital mikroskopi (IVM), definert som avbildning av levende dyr ved mikroskopisk oppløsning 10, er spesielt nyttig for å vurdere dynamiske cellulære prosesser over tid i den samme prøven, å redusere antall forsøksdyr nødvendig. IVM er ofte kombinert med en kronisk transplantert vindu kammer (WC) for å få tilgang til orgel av interesse for avbildning over en varighet på uker til måneder. Hjerne og rygg-skinfold WC modellene har den lengste historien til bruk dateres tilbake til midten av 1990-tallet. I den senere tid har andre organspesifikke WC-modeller, slik som de i melkefettpute og forskjellige abdominale organer blitt utviklet 11.
Den typiske tilnærming for å avbilde benmarg in vivo har hovedsakelig involvert eksponering av calvaria mus, der tynnet bein muliggjør direkte visualisering av enkeltceller med minimal kirurgiske inngrep 12-14. Imidlertid kan calvarial benmargen be forskjellig fra andre ben, slik som den lange ben, som vist ved et lavere antall HSPCs og hypoksiske celler i calvaria, noe som indikerer redusert vedlikehold og utvikling av HSPCs 15. Derfor har alternative metoder for vurdering av cellulære komponenter i det lange ben blitt undersøkt. Disse inkluderer direkte eksponering av femoral benmarg 16 og ektopisk transplantasjon av split femur i rygg skinfold WC 17. Imidlertid er den tidligere en terminal prosedyre som ikke tillater sporing av cellulære, strukturelle og funksjonelle forandringer over lengre tidsperioder, og den sistnevnte sannsynligvis forstyrrer normale benmargsfunksjon på grunn av transplantasjon av femur til en ektopisk område inne i dorsal skinfold WC. En annen metode som gjør det mulig ortotopisk serie avbildning av femoral benmarg over tid er bruken av en WC i lårbenet. En tidligere rapport viste langsiktig avbildning av mikrosirkulasjon i femoral benmarg ved hjelp av enfemur WC i mus 18. I tillegg forfatterne viste visualisering av kreftceller i femur, noe som indikerer dens nytte i overvåkingsbenmargsmetastasering. Men dette WC motivet er begrenset av sin store størrelse (1,2 cm diameter) og relativt små bildeområdet (4 mm i diameter), som var bare egnet for stor-mus (26-34 g, 3-6 måneder gamle) og dermed gjøre nærme seg upraktisk for rutinemessig bruk.
Derfor ble et nytt toalett med en mindre total størrelse og større indre bildeområdet utformet for formålet med denne studien. Målet med denne studien var å tilveiebringe en fremgangsmåte for avbildning av forskjellige celletyper i den femorale benmargen. Femur WC Modellen ble utviklet i huset og ble brukt til å visualisere og spore nøytrofile innen 3D-vaskulære nettverket. Ved hjelp av denne modellen, kan IVM i benmargen utføres i serie over 40 dager. Denne tilnærmingen kan brukes på en rekke felt for å belyse de prosesser hematopoiesis, immunregulering ennd svulst utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: All dyr arbeidet ble utført under protokollen # 2615 godkjent av University Health Network Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Kirurgisk Utarbeidelse av Mouse
- Før kirurgi, sterilisere alle kirurgiske instrumenter og vinduet kammeret (WC) ved autoklavering. Supplere drikkevannet med 50 mg / kg kroppsvekt av amoksicillin 2 dager før kirurgi. Injisere mus med 0,1 mg / kg kroppsvekt av buprenorfin intraperitonealt 4 timer før operasjonen.
- Anesthetize atymiske nakne mus ved intraperitoneal injeksjon av 350-400 mL saltvann løsning som inneholder 80 mg / kg ketamin og 13 mg / kg xylazin (Merk: Dette ble godkjent av Institutional Animal Care komiteen, og vi har ikke hatt noen erfaring med skadevirkninger ). Bekreft riktig anestesi ved å teste for foten refleks. Fortsett å observere for åndedrettsmønster, slimhinner farge og fot refleks under prosedyren.
- Utfør kirurgisk procedures under ett biosikkerhet kabinett for å opprettholde sterile forhold under operasjonen. Plassere musen på en elektrisk varmepute dekket med et operasjonslaken for å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen. Utfør alle kirurgiske prosedyrer under stereomikroskop.
- Påfør øye salve for å holde øynene fuktige under operasjonen. Gjenta om nødvendig under den kirurgiske prosedyren. Steriliser arbeidsområdet for musen ved å tørke med 7,5% povidon-jod, 70% isopropylalkohol og 10% povidonjodid fortløpende, og gjenta denne prosedyren to ganger.
- Lage en 10 mm langsgående snitt i huden ved hjelp av skalpell med et blad (# 15), som nærmer seg femur fra den laterale side. Expose femur mellom flexor og extensor musklene ved stump disseksjon med tang og hemostats å sikre muskel funksjonalitet.
- Sett U-formet bar under beinet, og installere WC (figur 1). Fest bar med vinduet ved hjelp av to muttere og stram nøtter med forsteinsopp. Fyll mellomrommet mellom bein og WC med dental sement.
- Slipe ned det kortikale ben i en 6 x 2 mm 2 område med en mikro-drill for å få optisk adgang til margen hulrom.
Merk: inspisere nøye tynning av kortikale benet under mikroskopet mens du utfører denne prosedyren. La en intakt, nesten gjennomsiktige periosteal lag med beinet. - Plasser 8 mm coverglass på vinduet, og sikre dekkglass med en låsering for å holde den på plass.
- Juster muskulaturen flexors og extensors tilbake til den opprinnelige plasseringen ved hjelp av pinsett til å opprettholde sin funksjon etter operasjonen. Suturer dermis ved hjelp av 5-0 sutur og en nål holder.
- Overvåke mus for utvinning, inntil den er klar, og er i stand til å bevege seg fritt. Sette dyret inn i et nytt bur når gjenvunnet.
- Etter utvinning, utføre image oppkjøpet på dyret på samme dag eller neste dag (se kapittel 2). Overvåk physical tilstanden til mus hver dag.
Merk: Overvåk fysiske forhold som vekt peiling på lem, hunching, rask eller grunne pust, hind lem hevelse, selvskading, cellulitt og alvorlig eksem. - Gi intraperitoneal injeksjon av 0,1 mg / kg kroppsvekt av buprenorfin i 3 dager, og 1 mg / kg kroppsvekt av meloksikam til 5 dager etter kirurgi for behandling av post-operativ smerte og betennelse. Fortsette å levere den amoxicillin-supplert vann i 5 dager.
- På den eksperimentelle endepunktet, avlive dyret ved CO 2 narkose etterfulgt av en sekundær metode (for eksempel halshugging).
2. Image Acquisition Bruke Kombinert Multi-foton og konfokalmikroskopi
- Før avbildning, bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av en 350-400 pl saltløsning inneholdende 80 mg / kg ketamin og 13 mg / kg xylazin. Alternativt kan du bruke inhalerbar bedøvelse, når det er tilgjengelig.Påfør øye salve.
- Injisere blanding av intravaskulære fargestoffer for merking blodkar (0,65 mg to MDA Fluorescein (FITC) -dextran) og nøytrofile (4 mikrogram av Allophycocyanine (APC) -Anti-Ly6G antistoff).
- Bruke en oppreist kombinert multi-foton og konfokalt mikroskop utstyrt med en multi-foton laser-avstandsmåle 705-980 nm for to-foton eksitasjon, så vel som enkeltfoton lasere som gir eksitasjonsbølgelengdene fra blått til rødt.
- Sett en skreddersydd bildebehandling scenen på mikroskop (figur 1B). Fest musen på scenen ved å klemme de to endene av WC med krokodilleklemmer.
Merk: Kritiske komponenter av scenen er: to krokodilleklemmer for å holde WC, og et varmeelement for å opprettholde fysiologisk temperatur (37 ° C) av musen under bildebehandling. - Slå på to-foton laser og confocal system, og lansere bildeinnlastingen programvaren ved å klikke på "Start System". Et vindu med 4 faner (Finn,Innsamling, prosessering, og vedlikeholde) vil åpne.
- Sett opp imaging kanaler. Klikk "Smart Setup" under fanen Oppkjøp og velge fargestoffer som skal brukes for bildebehandling: FITC (488 nm eksitasjon, 493-588 nm utslipp) og APC (633 nm eksitasjon og 638-743 nm emisjon). Velg "Best Signal" og klikk "Apply".
- Legg den andre harmoniske generasjon (SHG) image oppkjøpet kanal manuelt. Slå på to-foton laser under "Laser" -vinduet i kategorien Acquisition. Under Kanaler vinduet, klikk på "+" tegnet for å legge til et spor.
- Sett opp SHG sporet. Endre bølgelengde til 840 nm under Kanaler vindu ved hjelp av opp- og ned-pilene, og velg registreringsområdet til å være 415-425 nm under "Lys Path" vinduet ved hjelp av glidebryteren.
- Klikk på "okulars Online" under Finn fanen. Klikk FITC under filterinnstillingen for FITC å se regionen av interesse og justere fokus manuelt ved å vri tHan fokuserer knotten på siden av mikroskopet. Når regionen av interesse ligger, klikk på "okulars Offline" under Finn fanen.
- Klikk på fanen Acquisition. Velg FITC spor under Kanaler vinduet og klikker på «Live" for å forhåndsvise bildet av FITC-dekstran med 5X objektiv. Juster fokus hvis det er nødvendig, og klikk på "Stop" under fanen Acquisition å stoppe forhåndsvisningen.
- manuelt slå til 20X vann objektiv ved å flytte et hjul over linsene. Se bildet på nytt for FITC-dekstran med 20X objektiv, og juster Master Gain og Pinhole under Kanaler vinduet for å oppnå optimal signal og kontrast. Gjenta for andre kanaler ved å velge APC og SHG spor under Channels vinduet.
- Velg bildeparametere. Klikk på "Acquisition Mode" for å åpne vinduet. Sett rammestørrelsen til å være 1024 x 1024 piksler, og gjennomsnitts av 4X å få bilder av høy kvalitet.
- Anskaffe et 2D bilde. Velg alle kanalene under Kanaler vinnedow og klikk på "Snap" under fanen Acquisition. Sjekk kvaliteten på bildet og endre bildeparametere ved behov.
- Acquire 2D time-lapse bilde.
- Kryss av "Time Series" i kategorien Acquisition å åpne Time Series vinduet. Skriv inn 0 under intervallene, og 40 for totalt antall skanninger å ta 40 bilder fortløpende uten tidsintervall.
Merk: 40 skanninger genererer ca 5 minutters lange tidsserier med en skannehastighet på 7,5 sek / ramme og bildestørrelsen på 600 mikrometer x 600 mikrometer. Juster intervall og antall skanninger avhengig av mikroskop, bildeinnhentings innstillinger og bildefrekvens på kameraet. Et fast intervall tid (> 0 sek) kan brukes til å sammenligne tids-lapse bilder ervervet på forskjellige tidspunkter. En lengre time-lapse imaging varighet kan være nødvendig, avhengig av forventet gjennomsnittlig hastighet på nøytrofile (eller andre celler av interesse) i den eksperimentelle tilstand.
- Kryss av "Time Series" i kategorien Acquisition å åpne Time Series vinduet. Skriv inn 0 under intervallene, og 40 for totalt antall skanninger å ta 40 bilder fortløpende uten tidsintervall.
- Innsamling av 3D bilde.
- Kryss av "Z-Stack" i kategorien Acquisition å åpne Z-Stack vinduet. Start «Live» forhåndsvisningsmodus for FITC-dekstran. Fokus på toppen av prøven og klikk på "Set First", og fokus på den andre enden av prøven og klikk på "Set Siste" i Z-stack vinduet.
- Sett intervall å være 10 mikrometer under Z-stack vinduet. Avhengig av den første og den siste optiske skive som er valgt i det foregående trinn, vil dette generere 10-20 stykker, med samlet optisk tykkelse på 90-180 um.
Merk: z-stabel intervallet er avhengig av størrelsen på hullet, som bestemmer tykkelsen til det optiske stykke. Sette intervallet til å være mindre enn tykkelsen av den optiske skive. - Klikk "Start Experiment" under fanen Acquisition å begynne å samle bilder.
- Innsamling av 3D time-lapse bilde.
- Kryss av "Time Series" og "Z-stack" i kategorien Acquisition å åpne Time Seriesog Z-stack vinduer.
- Sett opp tidsserier og Z-stack oppkjøp parametre som beskrevet i trinn 2.14 og 2.15. Klikk "Start Experiment" under fanen Acquisition å begynne å samle bilder.
- Overvåk musen under bildebehandling for å sørge for at den er stabil og bevisstløs. Hvis musen er ustabil og / eller bevisst under bildebehandling, fjerne musen fra scenen, injisere ytterligere 100-150 mL av narkosen løsning intraperitonealt, og fortsette bildebehandling.
Merk: Tegn på ustabilitet inkluderer rask pust og bevegelse av mus, og kan bli sett på som skiftende gjenstander i oppkjøpte bilder. - Etter bilde oppkjøpet, ta musen av scenen og returnere det til buret. Bruk en varmelampe for å holde den varm, og overvåke mus før det er bevisst.
3. Bildeanalyse og Kvantifisering
- Bruk bildeanalyse programvare for å analysere 3D og tidsserier. Åpne programvaren oglegge til bilder ved å dra dem inn i det åpne skjermen, som kalles "Arena" view. Dobbeltklikk på en bildefil for å åpne den; bildet vil bli åpnet under "overgå" visning.
- Opprett et 2D / 3D-bilde.
- Fra "Mer" bar funnet på øverst til høyre, klikk på "Rediger / Show Display justering" for å åpne "Display Adjustment" -vinduet. Optimalisere fluorescens skjermen ved å justere tersklene for hver kanal, og ta et stillbilde for å lagre bildet.
- Genererer objekt spor ved hjelp av tids-lapse bilder.
- Åpne bildet som skal analyseres under "overgå" visning. Klikk på ikonet med et bilde av oransje prikker, funnet under "overgå" -ikonet. Dette vil åpne en ny "Spots" -vinduet.
- Kryss av "Spor Spots (over tid)" og klikk på den blå pilen for å gå til neste trinn. Velg kanalen som inneholder objektene for å spore under "Source Channel", og sette den estimerte objektet diameter under "Beregnet XY Diameter" ved å skrive et tall i. Klikk på den blå pilen for å gå til neste trinn.
Merk: For nøytrofile sporing, velger du kanalen som inneholder APC fluorescens for nøytrofile og sette gjenstanden diameter på 12 mikrometer basert på den kjente størrelsen av nøytrofile. - I vinduet, finne og velge "Kvalitet" filter ved å klikke på pil ned. Observer flekker definert av programvaren og justere terskelen manuelt for å inkludere eller ekskludere flekker. Når terskelen er definert, klikk på den blå pilen for å gå til "Tracking" trinn.
- Under algoritme, finn og velg "autoregressiv Motion Algorithm" ved å klikke på pil ned. Skriv inn 10 mikrometer for "Max Distance" og tre for "Max Gap Size" finnes under Parametere. Kryss av "Fyll hullene med alle oppdagede objekter" for å begynne å spore, og klikk på den blå pilen for å gå til neste trinn.
Merk: "autoregressiv motion algoritme" brukes feller gjenstander som er rettet bevegelse, siden det genererer spor basert på forutsagte posisjonen fra foregående bevegelse. "Maks distanse" og "max Gap Size" kan bli justert, avhengig av den ventede dimensjon og hastighet av objektet som skal spores, så vel som den samlede varigheten av time-lapse bilde. - Under Filtertype, velg "Track Varighet" filter. Klikk på den grønne pilen for å avslutte sporing, og sjekk sporene som ble generert. Gå tilbake til forrige trinn om nødvendig for å manuelt sortere sporene.
- Hvis de genererte intervallbilde driver, riktig for translasjonell drift.
- Klikk på ikonet med et bilde av en blyant. Dette er en redigering fanen som åpner "Edit Tracks" -vinduet. Undersøk time-lapse bildet og finne en referanse sted som ikke bør være i bevegelse for alle bildene.
- I øvre venstre hjørne av skjermen, finner "Pointer" vinduet og krysse av "Select" for å aktivere cursor for å velge et sted. Klikk på referanse stedet.
- Klikk "Riktig Drift" i "Rediger Tracks" -vinduet. Sjekk ut "translasjonell Drift". Programvaren vil automatisk generere korrigerte bildeserie.
- Mål cellulær bevegelse definert av objektet spor i tids-lapse bilder.
- Under "Edit Tracks" vinduet, merk av "Spor" og velg et spor som representerer bevegelsen i en celle. Det valgte sporet vil bli merket med gult i tidsserier bildet.
- Klikk på ikonet med et bilde av en graf for å åpne "Statistikk" -vinduet (tab statistikk).
- Under "Valg", velg "Track Speed Mean" ved å klikke på pil ned for å generere sporet hastighet bety for det valgte sporet. Velg ulike spor og gjenta trinnene for å måle spor hastighet bety for alle celler av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine femoral benmarg er vellykket åpnes ved hjelp av WC for å muliggjøre visualisering av individuelle neutrofiler og vaskulære nettverk. Figur 1 viser WC instrumentet og beskriver den kirurgiske prosedyre, som innebærer eksponering av lårbenet og tynning av kortikalt ben til å skaffe optiske tilgang inne i bein. Operasjonen er godt tolerert hos mus; de ble vurdert for uheldige fysiske reaksjoner som hind lem hevelse, ikke-vektbærende på lem, selvskading, cellulitt og eksem, samt skade på WC i 5 dager etter kirurgi, med ingen rapport av nød. Spesielt, forblir vinduet optisk klart for IVM i opptil 40 dager, noe som kan gjøre det mulig langsiktig vurdering av mobilnettet og strukturelle endringer etter et inngrep.
Blodkar inne i benmargen kan visualiseres ved intravaskulære fargestoffer, slik som FITC-dekstran(Figur 2). Da kontrasten er avhengig av injeksjon av fargestoffet, representerer den ervervede bildet funksjonell vaskulatur hvor det er tilstrekkelig blodstrøm. I tillegg til blodkar, kan nøytrofile farges in vivo ved hjelp av anti-Ly6G antistoff. 3A og 3B representerer det samme området av benmargen observert ved ulike tidspunkt, hvor nøytrofile er sett både i intravaskulær og ekstravaskulær plass. Disse områdene ble preget av de vaskulære landemerker. Rodamin 6G kan brukes som et alternativ til anti-Ly6G å farge neutrofiler in vivo; imidlertid, diffunderer ut av vaskulaturen og flekker monocytter i ekstravaskulære rom i en ikke-spesifikk måte. Derfor er anti-Ly6G foretrukket fordi det muliggjør spesifikk avbildning av nøytrofile celler. Figur 3C viser avbildning av det kortikale ben, som består hovedsakelig av kollagenfibre. Den maksimale dybden for avbildning oppnåddi dette forsøket er 180 um (figur 3C).
Time-lapse fluorescens bildebehandling forenkler sporing og kvantifisering av cellulær bevegelse in vivo. Figur 4A viser sporing av nøytrofile i benmargen vaskulær nisje. Imaging uten ekstra tidsintervall mellom hver skanning muliggjør nøyaktig sporing av celler; imidlertid, er noe brukeren tilførselen som er nødvendig for ytterligere å forbedre nøyaktigheten av sporene som genereres av programvaren. Sporing av flekker (dvs. celler av interesse) muliggjør kvantifisering av ulike parametre, slik som midlere hastighet spor (figur 4B). Andre parametere som kan måles inkluderer, men er ikke begrenset til, spore lengde, endring i punktstørrelse, form og intensitet. Denne analyse gir kvantifisering av ulike parametere som forbedrer karakterisering av cellulære bevegelser og interaksjoner.
Figur 1: Femur vindu kammer (WC), bildebehandling scenen og det kirurgiske inngrepet (A) Skreddersydd titan femur WC med en U-formet bar som serverer å fikse femur på plass.. Toalettet har en 8 mm dekkdiameter glass, festet med en låsering. (B) Skreddersydd bildebehandling scenen. Et varmeelement er plassert på undersiden av trinnet for å opprettholde den fysiologiske temperatur på musen under avbildning. De to krokodilleklemmer brukes for å holde WC. (C - H) Kirurgisk prosedyre for å installere femur WC. (C) Det femur er eksponert mellom flexor og extensor muskler. Muskler fjernes ikke under prosedyren. (D) Den U-formede bar er plassert under femur, og (E) WC er installert og festes med to muttere. (F) Dental sement påføres mellom benet og denWC for å fylle rommet. (G) i dermis syes og (H) dekkglasset er festet på plass med låseringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: 3D fluorescens avbildning av vaskulære nettverk i benmargen in vivo Representant bilde av blodkar i benmargen, fotografert gjennom femur WC.. Blodkar (grønn) er visualisert ved halevenen injeksjon av to MDA FITC-dekstran. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: 3D-avbildning av vaskulære nettverk, nøytrofile granulocytter og benmatriks in vivo bilder fra vaskulaturen og nøytrofile i benmargen (A) 3 dager og (b) 10 dager etter at femur WC kirurgi.. Nøytrofile, farget av halevenen injeksjon av APC-merket Ly6G antistoff, er sett både i intravaskulære og ekstravaskulære mellomrom. Pilene peker til den vaskulære strukturen sett på begge dager, noe som indikerer muligheten til å spore den samme sted over tid. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Bone matrise kan visualiseres ved hjelp av SHG (hvit), i tillegg til vaskulaturen (grønn) og neutrofiler (rød). Bildet ble kjøpt 40 dager etter WC kirurgi. Scale bar = 70 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sporing nøytrofile bevegelse innenfor vaskulære nettverket i beinmargen in vivo (A) Sporing av banen av nøytrofile innenfor vaskulære nettverket.. Spor genereres automatisk ved hjelp av programvaren innebygde autoregressiv Motion algoritme. Hver hvit prikk representerer et midtpunkt av en partikkel som spores (nøytrofile). Scale bar = 50 mikrometer. (B) Mean spor hastighet målt til intravaskulære og ekstravaskulære nøytrofile, som indikerer forskjell i bevegelse av nøytrofile (Error bar = bety + SD, * p = 0,0176, tosidige t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Real-time, serie avbildning av de dynamiske cellulære prosesser i beinmarg inneholder informasjon som ellers er vanskelig å oppnå med konvensjonelle teknikker som histologi og totale blodverdier. Femur WC modellen beskrevet her gir unike muligheter til å undersøke cellulære og strukturelle endringer i benmargen over tid. Selv om en femur WC-modellen har tidligere blitt rapportert, vår romanen design gir en større bilde synsfelt og mindre generell WC størrelse, noe som er mer kompatible for bruk hos voksne mus. Femur WC modellen kan brukes i en rekke forskjellige musestammer inkludert immunkompetente og / eller transgene rapportør mus.
Det er viktige skritt i løpet av operasjonen som avgjør den totale varigheten og kvaliteten på bildebehandling. Når utsette femur, er bare en stump disseksjon av muskler mellom flexors og extensors utført; Fjerning av disse musklene kan føre til nedsatt mobilitet av mus og must unngås. Videre er oppmaling av det kortikale ben må utføres omhyggelig. Sliping ca. 50 um er tilstrekkelig for optisk avbildning og samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til den femorale vaskulære nettverk. Anvendelse av dental sement rundt benet er avgjørende for forsegling av kirurgisk eksponert område, hindrer væskeopphopning, og opprettholde en klar optisk avbildning vindu i over en måned, og reduserer faren for infeksjon. The dental sement fungerer også for å fikse WC på plass, hindrer WC rotere rundt lårbenet. Til slutt, snap ring brukes til å holde dekkglass er egnet for bruk med vann-nedsenking objektiv, og gir vann-forsegling. Snap ring anbefales fremfor lim for å feste coverglass til WC fordi tillegg av lim kan øke gapet mellom benet og dekkglass, eller plassere dekkglass i en liten vinkel i forhold til bildeplanet, og dermed redusere oppnåelig inntrengningsdybde for bildebehandling. Dessuten, Er det snap ring nyttig når dekkglass må renses eller skiftes.
I tillegg til kirurgi, er det flere viktige skritt for å oppnå vellykket optisk avbildning av benmargen. Å bilde inne i femur WC er WC plassert horisontalt til bildebehandling scenen for riktig nedsenking av objektiv. Den skreddersydde bilde fasen er egnet for dette formålet som det gir mulighet for justering av vinkelen på WC med hensyn til linsen. Videre er utformingen av WC, særlig størrelsen av den U-formede bar, opprettholder benet i en horisontal posisjon så nær dekkglass som mulig for å oppnå optimal inntrengningsdybden. Under bildebehandling, kan puste gjenstander observeres som horisontale linjer i fluorescens bilder. I tillegg til å sikre at WC til avbildningstrinnet, kan temperaturen på varmeelementet i henhold til avbildningstrinnet reguleres til tilstrekkelig varme til dyret for å minimalisere overdreven puste. Et tynt sjikt av gasbindkan plasseres mellom mus og oppvarmet scenen for å ytterligere bidra til å redusere puste gjenstander under bildebehandling. Avhengig av biologisk avbildning målet, kan innhentingsparametre som bilderate, bilde volum og avbildning varighet også bli justert for å samle tilstrekkelig bilder for å ta opp eksperimentelle spørsmål. For eksempel kan hastigheten nøytrofilmigrasjon og kryp forskjellig under ulike eksperimentelle forhold, fra 2,8 mikrometer / min for bosatte nøytrofile henhold basale forhold til hvor som helst varierer fra 5-10 mikrometer / min for nøytrofile henhold inflammatoriske tilstander 19-21. Dermed vil den aktuelle bildehastighet og varighet for nøytrofile sporing in vivo også variere basert på eksperimentelle forhold. I tillegg, som fremgår av resultatene, sporing av celler i vaskulaturen ville kreve en rask avbildning kamera med høy bildefrekvens (30 bilder / s). Imidlertid, hvis målcellene er bosatt i ekstravaskulære rom, eller hvis den celle-til-celle interaction av interesse forventes å skje saktere, bør bildekvalitet prioriteres fremfor bildehastighet.
Påvirkningen av injiserte antistoffer for in vivo-cellefarging på cellulær funksjon, må også tas i betraktning. I vår studie, brukte vi anti-Ly6G antistoff (1A8 klone), som vanligvis brukes ved høye doser (150-250 mikrogram) for å utarme nøytrofile granulocytter fra sirkulasjonen og studere deres rolle i ulike sykdomsmodeller. Yipp og Kubes vist at fluorokromkonjugerte merket anti-Ly6G antistoff ikke forstyrrer leukocytt rekruttering ved lave intravaskulær injeksjon doser (1-40 mikrogram) 22. Imidlertid tyder en nyere studie som fluorokromer, å ha store forskjeller i molekylvekt og kjemiske struktur, kan forskjellig påvirke funksjon av anti-Ly6G 23. Studien viste at FITC-merket anti-Ly6G, men ikke PE og APC-merkede antistoffer, effektivt tapper neutrofiler in vivo ved en lav konsentrasjon (30 ug).I vår studie har vi ikke observere nøytrofile uttømming overtid ved hjelp av fire mikrogram av APC-merket anti-Ly6G. Ikke desto mindre er ytterligere karakterisering av funksjonen til fluorkrom-merket anti-Ly6G-antistoff in vivo er nødvendig for å validere dens bruk i intra avbildning. Dette gjelder også for andre antistoffer som har funksjonell evne til å endre cellulære interaksjoner. Som et alternativ til in vivo celle farging med antistoffer, transgene mus 24 reporter og / eller merkede fluorescerende celler 25 kan anvendes for å visualisere nøytrofile celler eller andre cellepopulasjonen av interesse in vivo.
Femur WC modellen beskrevet i denne protokollen gjør bildebehandling i inntil 40 dager etter operasjonen. Noen av utfordringene for langsiktig bildebehandling ved hjelp av denne WC modellen inkluderer forsinket bein helbredelsesprosessen og vedlikehold av et rent glass vindu. Spesielt vi ikke observere tegn på åpenbare bein healing følgende WC implantering, som ville inklue fortykkelse av periosteum; Dette er ikke uventet gitt at bein healing skjer vanligvis etter 1 ½-3 måneder 26,27. Vedlikehold av en ren og optisk klart vindu kan oppnås ved bruk av dental sement, og bruken av snappringen og dekkglass som gir et fast vann-tetning med vevet. Den dekkglass kan tidvis rengjøres med bomulls tips fra utsiden for å fjerne støv og rusk. Toalettet har et bredt bildefelt, nesten dekker hele lengden av diaphysis regionen (ca. 8,4 til 8,6 mm 28), som gjør den overlegen i forhold til den tidligere publiserte modell 18. Men tilgang til de fjerntliggende områder og dypere marg hulrom er begrenset. Spesielt er det trabeklære rike metafyse, som ligger ved de distale endene av diaphysis, som er kjent for å være rike på HPSCs 29. Disse områdene kan aksesseres histologisk eller ved IVM som en terminal prosedyre. Alternativt ulike bildediagnostikk som mikro-kompUted tomografi kan brukes til å avbilde de distale regionene i benmargen in vivo 30. Slike metoder er komplementære til IVM, noe som gir en integrert tilnærming for å vurdere anatomi og de ulike cellulære og strukturelle endringer og interaksjoner i benmargen.
Protokollen er beskrevet her gir en ny metode for langvarig rom-tid-vurdering av den femorale benmargen hos mus på celle oppløsning. Metodene som presenteres aktivere in vivo seriebilde å spore bevegelsene til en enkelt celle eller celle populasjoner over biologisk relevante tidsskalaer, samtidig skaffe strukturell og funksjonell informasjon i beinmargen. I tillegg kan kvantitativ bildeanalyse utføres for ytterligere å karakterisere cellulære og funksjonelle forandringer slik som sporing av cellulære bevegelser. Anvendelse av denne femur WC modellen i ulike stammer av mus, særlig i transgene reporter mus 31,kan videre gjøre det mulig etterforskning av flere individuelt merket celle populasjoner som de som er involvert i hematopoiesis. Derfor er allment gjeldende for et bredt spekter av prekliniske studier med ulike biologiske prosesser i levende mus beinmarg, inkludert undersøkelser i hematopoiesis, leukemi, HPSC transplantasjon, immunregulering, mikromiljøet i benmargen (f.eks hypoksisk nisje) og den beskrevne protokollen bidraget av immunceller til tumorprogresjon og metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Avansert optisk mikros Facility (www.aomf.ca) ved University Health Network for å få hjelp med mikroskopi, og Mr. Jason Ellis fra Princess Margaret Cancer Center Machine Shop for produksjon av WC og bilde scenen. Vi ønsker også å takke Dr. Iris Kulbatski for manuskript redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
