Introduction
La médula ósea es un órgano importante que participa en la hematopoyesis y la regulación inmune. Se compone de un componente hematopoyético que contiene las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs), y un componente del estroma que contiene células progenitoras no hematopoyéticas que dan lugar a células mesenquimales 1. Dos tercios de la actividad hematopoyética se dedica a la generación de células mieloides 2. En particular, un gran número de neutrófilos se producen en la médula ósea, con 1-2 x 10 11 células generadas por día en un ser humano adulto normal 2. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones microbianas y son en su mayoría reservados en la médula ósea hasta que el estrés desencadena su movilización para complementar los neutrófilos periféricos 1,3. Además de sus efectos anti-microbianos, estudios recientes sugieren un papel importante de los neutrófilos en la biología del cáncer, que tiene tanto pro- y anti-fenotipos tumorigénicos en función de crecimiento transformantefactor beta (TGF-β) de señalización en el 4,5 microambiente tumoral. Por otra parte, los estudios demostraron que los neutrófilos que se acumulan en los tumores primarios ejercen efectos pro-tumorigénicas y metastásicas mediante la supresión de la función citotóxica de las células T 6,7, mientras que los neutrófilos en circulación ejercen un efecto citotóxico anti-metastásico 8. Como tal, la investigación de las células hematopoyéticas en la médula ósea, en particular los neutrófilos, es crucial para la aclaración de su papel en la regulación inmune y tumor.
Histopatología y un recuento completo de sangre periférica se utilizan habitualmente para evaluar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea 9. Sin embargo, estos métodos sólo proporcionan información estática de diferentes poblaciones de células o de tejidos microestructuras. Longitudinal de imágenes in vivo se puede utilizar en combinación con los métodos estándar para evaluar la dinámica de múltiples componentes celulares, vasculares y del estroma, así como la célula a-cell interacciones de manera longitudinal. Microscopía intravital (IVM), definido como formación de imágenes de animales que viven en la resolución microscópica 10, es particularmente útil para la evaluación de los procesos celulares dinámicos en el tiempo en la misma muestra, lo que reduce el número de animal experimental requerido. IVM se combina a menudo con una cámara de ventana trasplantado crónicamente (WC) para acceder al órgano de interés para obtener imágenes de más de una duración de semanas a meses. modelos WC craneal y dorsal-pliegue de la piel tienen la más larga historia de uso se remonta a mediados de la década de 1990. Más recientemente, otros modelos de WC de órganos específicos, tales como las de la almohadilla de grasa mamaria y varios órganos abdominales se han desarrollado 11.
El enfoque típico para obtener imágenes de la médula ósea in vivo tiene la exposición participa principalmente de la bóveda craneal de ratones, donde el hueso adelgazada permite la visualización directa de las células individuales con una intervención quirúrgica mínima 12-14. Sin embargo, la médula ósea de calota puede be distinta de la de otros huesos, tales como el hueso largo, como se demuestra por un menor número de HSPCs y células hipóxicas en bóveda craneal, lo que indica mantenimiento y desarrollo de HSPCs 15 reduce. Por lo tanto, se han investigado enfoques alternativos para evaluar los componentes celulares en el hueso largo. Estos incluyen la exposición directa de la médula ósea del fémur 16 y el trasplante ectópica de fémur fractura en el pliegue cutáneo dorsal 17 WC. Sin embargo, el primero es un procedimiento del terminal que no permite el rastreo de alteraciones celulares, estructurales y funcionales durante períodos de tiempo más largos, y el segundo probable perturba la función normal de la médula ósea debido a el trasplante de fémur a un sitio ectópico en el interior del WC dorsal del pliegue cutáneo. Otro método que permite formación de imágenes de serie ortotópico de médula ósea femoral en el tiempo es el uso de un WC en el hueso femoral. Un informe anterior demostró imágenes a largo plazo de la microcirculación en la médula ósea del fémur usando unaWC fémur en ratones 18. Adicionalmente, los autores demostraron la visualización de las células tumorales en el fémur, lo que indica su utilidad en la metástasis ósea de monitoreo hueso. Sin embargo, este diseño WC estaba limitado por su gran tamaño (1,2 cm de diámetro) y área de imagen relativamente pequeña (4 mm de diámetro), que fue sólo es adecuado para los ratones grandes (26 a 34 g, de 3-6 meses de edad) con lo que el acercarse poco prácticos para su uso rutinario.
Por lo tanto, un nuevo WC con un tamaño general más pequeño y el área de formación de imágenes interno más grande fue diseñada con el propósito de este estudio. El objetivo de este estudio era proporcionar un método para obtener imágenes de diversos tipos de células en la médula ósea femoral. El modelo WC fémur fue desarrollado internamente y se utiliza para visualizar y realizar un seguimiento de los neutrófilos dentro de la red vascular 3D. Usando este modelo, IVM de la médula ósea se puede realizar en serie de más de 40 días. Este enfoque se puede aplicar a una variedad de campos para elucidar los procesos de la hematopoyesis, la regulación inmune unand el desarrollo de tumores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo el protocolo # 2615 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network.
1. Preparación quirúrgica de ratón
- Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y la cámara de ventana (WC) por tratamiento en autoclave. Complementar el agua potable con 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina 2 días antes de la cirugía. Inyectar el ratón con 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por vía intraperitoneal 4 h antes de la cirugía.
- Anestesiar el ratón nude atímicos mediante inyección intraperitoneal de solución salina 350-400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina (Nota: Esto fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional, y no hemos tenido ninguna experiencia con los efectos adversos ). Confirmar la anestesia adecuada mediante pruebas de reflejo del pie. Para continuar observando el patrón respiratorio, color de las mucosas y el reflejo del pie durante el procedimiento.
- Realice la pr quirúrgicaocedures bajo una campana de bioseguridad para mantener condiciones estériles durante la cirugía. Coloque el ratón sobre una manta eléctrica cubierto con un paño quirúrgico para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo el microscopio estereoscópico.
- Aplicar ungüento para los ojos para mantener los ojos húmedos durante la cirugía. Repetir si es necesario durante el procedimiento quirúrgico. Esterilizar la zona de funcionamiento del ratón limpiando con un 7,5% de povidona yodada, el 70% de alcohol isopropílico y 10% de povidona yodada en forma consecutiva, y repetir este procedimiento dos veces.
- Hacer una incisión en la piel longitudinal 10 mm usando escalpelo con una cuchilla (# 15), se acerca el fémur desde el lado lateral. Exponer el fémur entre los músculos flexores y extensores mediante disección roma con unas pinzas hemostáticas y para asegurar la funcionalidad muscular.
- Inserte la barra en forma de U por debajo del hueso, e instalar el WC (Figura 1). Asegurar la barra con la ventana con dos tuercas y apriete las tuercas porceps. Llenar el espacio entre el hueso y el WC con cemento dental.
- Triturar el hueso cortical en una región 6 x 2 mm 2 con un micro-taladro para tener acceso óptico a la cavidad ósea.
Nota: Inspeccione cuidadosamente el adelgazamiento del hueso cortical bajo el microscopio, mientras que la realización de este procedimiento. Deja una capa de periostio intacto, casi transparente del hueso. - Coloque el cubreobjetos 8 mm en la ventana, y asegurar el cubreobjetos con un anillo de retención para mantenerlo en su lugar.
- Reajuste la musculatura de los músculos flexores y extensores de la espalda a sus ubicaciones originales mediante el uso de fórceps para mantener su función después de la cirugía. Suturar la dermis utilizando 5-0 sutura y un soporte de aguja.
- Monitorear el ratón para la recuperación, hasta que está consciente y es capaz de moverse libremente. Poner el animal en una jaula nueva cuando se recuperan.
- Después de la recuperación, realice la adquisición de imágenes en el animal en el mismo día o los días siguientes (véase la sección 2). Supervisar el physicondición de cal del ratón diaria.
Nota: Monitorear las condiciones físicas, tales como la carga de peso en el miembro, encorvando, rápida o poco profunda respiración, hinchazón de las extremidades posteriores, la automutilación, celulitis y dermatitis severa. - Dar la inyección intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina durante 3 días, y 1 mg / kg de peso corporal de meloxicam durante 5 días después de la cirugía para el tratamiento de dolor post-quirúrgico y la inflamación. Continuar proporcionando el agua amoxicilina-complementado por 5 días.
- En el punto final experimental, la eutanasia a los animales por CO 2 narcosis seguido de un método secundario (por ejemplo, la dislocación cervical).
2. Adquisición de imágenes por Combinada multi-fotón y microscopía confocal
- Antes de la formación de imágenes, anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de una solución salina 350 a 400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, utilice anestésico inhalable, cuando esté disponible.Aplicar ungüento para los ojos.
- Inyectar la mezcla de colorantes intravasculares para vasculatura etiquetado (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) dextrano) y los neutrófilos (4 g de aloficocianina (APC) de anticuerpo-Ly6G -anti).
- Utilice un multi-fotón vertical combinada y el microscopio confocal equipado con un láser de múltiples fotones que van desde 705 hasta 980 nm para la excitación de dos fotones, así como láseres de fotones individuales que proporciona longitudes de onda de excitación de azul a rojo.
- Establecer una etapa de formación de imágenes a medida en el microscopio (Figura 1B). Asegure el ratón en la etapa de sujeción por los dos extremos del WC con pinzas de cocodrilo.
Nota: Los componentes críticos de la etapa son: dos pinzas de cocodrilo para mantener el aseo, y un elemento de calefacción para mantener la temperatura fisiológica (37 ° C) del ratón durante la exploración. - Encienda el láser de dos fotones y el sistema confocal, y poner en marcha el software de adquisición de la imagen haciendo clic en "Inicio del sistema". Una ventana con 4 pestañas (Localizar,Adquisición, procesamiento, y Mantener) se abrirá.
- Configurar los canales de imagen. Haga clic en "Configuración inteligente" en la pestaña de Adquisición y elegir los colorantes que se utilizarán para la imagen: FITC (488 nm de excitación, 493 a 588 nm de emisión) y APC (633 nm de excitación y 638 a 743 nm de emisión). Elija "mejor señal" y haga clic en "Aplicar".
- Añadir el segundo canal de adquisición de imágenes generación armónica (SHG) manualmente. Encienda el láser de dos fotones debajo de la ventana "láser" en la pestaña de Adquisición. Bajo la ventana de Canales, haga clic en el signo "+" para añadir una pista.
- Configure la pista SHG. Cambiar la longitud de onda de 840 nm bajo la ventana de canales con las flechas hacia arriba y hacia abajo, y elegir el rango de detección para ser 415-425 nm bajo la ventana "Light Path" usando la barra deslizante.
- Haga clic en "oculares en línea" en la pestaña Buscar. Haga clic FITC con la configuración de filtro para FITC para ver la región de interés y ajustar el enfoque manualmente girando tque se centran perilla en el lado del microscopio. Cuando se encuentra la región de interés, haga clic en "oculares fuera de línea" en la pestaña Buscar.
- Haga clic en la ficha Adquisición. Seleccionar la pista FITC bajo la ventana Canales y hacer clic en "vivo" para previsualizar la imagen de FITC-dextrano, con el objetivo de 5X. Ajuste el enfoque si es necesario, y haga clic en "Stop" en la pestaña de Adquisición para detener la vista previa.
- gire manualmente a 20X objetivo agua moviendo una rueda por encima de los lentes. Ver la imagen de nuevo por FITC-dextrano usando el objetivo 20X, y ajuste maestro de ganancia y del agujero de alfiler bajo la ventana de canales para lograr la señal y un contraste óptimo. Repita para otros canales mediante la selección de APC y los grupos de autoayuda pistas debajo de la ventana Canales.
- Elija los parámetros de imagen. Haga clic en "Modo de adquisición" para abrir su ventana. Ajuste el tamaño del cuadro sea 1.024 x 1.024 píxeles, y el promedio de 4X para obtener imágenes de alta calidad.
- Adquirir una instantánea 2D. Seleccionar todos los canales bajo Canales gananDow y haga clic en "Snap" en la pestaña de Adquisición. Comprobar la calidad de la imagen y cambiar los parámetros de imagen si es necesario.
- Adquirir imagen de lapso de tiempo 2D.
- Marque "series de tiempo" en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de series temporales. Escriba 0 en virtud de los intervalos, y 40 para el número total de exploraciones para tomar 40 imágenes continuas sin intervalo de tiempo.
Nota: 40 exploraciones genera aproximadamente 5 minutos largo de series de tiempo con una velocidad de barrido de 7,5 seg / bastidor y el tamaño de la imagen de 600 micras x 600 micras. Ajuste el intervalo y número de análisis en función del microscopio, la configuración de adquisición de imágenes y la velocidad de cuadros de la cámara. Un intervalo de tiempo fijo (> 0 seg) se puede usar para comparar las imágenes con lapso de tiempo adquiridos en diferentes puntos temporales. Una duración de imagen de lapso de tiempo más largo puede ser necesario en función de la velocidad media esperada de los neutrófilos (u otras células de interés) en la condición experimental.
- Marque "series de tiempo" en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de series temporales. Escriba 0 en virtud de los intervalos, y 40 para el número total de exploraciones para tomar 40 imágenes continuas sin intervalo de tiempo.
- Adquirir imagen en 3D.
- Marque "Z-Stack" en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de Z-Stack. Iniciar el modo de vista previa "en vivo" de FITC-dextrano. Se centran en la parte superior de la muestra y haga clic en "Set primero", y se centran en el otro extremo de la muestra y haga clic en "Último conjunto" en la ventana de Z-pila.
- Establecer el intervalo a ser de 10 micras bajo la ventana de Z-pila. Dependiendo de la primera y la última rebanada óptico seleccionado en el paso anterior, esto generará 10-20 rebanadas, con espesor óptico global de 90 a 180 micras.
Nota: El intervalo z-pila depende del tamaño de la del agujero de alfiler, que determina el espesor de la rebanada óptica. Ajuste el intervalo de ser menor que el espesor de la rebanada de óptica. - Haga clic en "Experimento de inicio" en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes.
- Adquirir imagen de lapso de tiempo 3D.
- Marque "Time Series" y "Z-pila" en la pestaña de Adquisición para abrir la serie temporaly las ventanas Z-pila.
- Creó la serie de tiempo y parámetros de adquisición de pila Z como se describe en los pasos 2.14 y 2.15. Haga clic en "Experimento de inicio" en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes.
- Monitorear el ratón durante la formación de imágenes para asegurarse de que es estable e inconsciente. Si el ratón es inestable y / o consciente durante la exploración, quite el ratón desde el escenario, inyectar 100-150 l adicional de la solución anestésica por vía intraperitoneal, y continuar imágenes.
Nota: Los signos de inestabilidad incluyen respiración rápida y el movimiento del ratón, que puede ser visto como el cambio artefactos en las imágenes adquiridas. - Después de la adquisición de imágenes, tomar el ratón fuera del escenario y devolverlo a la jaula. Utilice una lámpara de calentamiento para mantener el calor, y controlar el ratón hasta que esté consciente.
Análisis de Imagen y 3. Cuantificación
- Utilice el software de análisis de imágenes para analizar los datos en 3D y de series de tiempo. Abra el programa yañadir imágenes arrastrándolas a la pantalla abierta, que se llama punto de vista "Arena". Haga doble clic en un archivo de imagen para abrirla; la imagen se abrirá bajo la vista "Supera".
- Crear una imagen de 2D / 3D.
- En la barra de "Más" que se encuentra en la esquina superior derecha, haga clic en "Editar / exhibición de la demostración de ajuste" para abrir "de ajuste de visualización" de la ventana. Optimizar la visualización de fluorescencia mediante el ajuste de los umbrales para cada canal, y tomar una instantánea para guardar la imagen.
- Generar pistas de objetos a partir de imágenes con lapso de tiempo.
- Abra la imagen que se analiza en la vista "Supera". Haga clic en el icono con una imagen de puntos de color naranja, que se encuentra debajo del icono "Supera". Esto abrirá una nueva ventana "Spots".
- Marque "de los puntos de pista (en el tiempo)" y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Seleccione el canal que contiene los objetos para realizar un seguimiento en "Channel Fuente", y establecer el objeto Diamet estimadoer en "XY diámetro estimado" escribiendo un número en. Haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso.
Nota: Para el seguimiento de los neutrófilos, seleccionar el canal que contiene APC de fluorescencia para los neutrófilos y establecer el diámetro objeto a 12 micras sobre la base del tamaño conocido de neutrófilos. - En la ventana, buscar y seleccionar el filtro "Calidad" haciendo clic en la flecha hacia abajo. Observe los puntos definidos por el software y ajustar el umbral manualmente para incluir o excluir puntos. Una vez que se define el umbral, haga clic en la flecha azul para ir a la "Pista" paso.
- Conforme al algoritmo, buscar y seleccionar "Autoregresivo Movimiento Algoritmo" haciendo clic en la flecha hacia abajo. Tipo de 10 micras para "Distancia máxima" y 3 para "Tamaño máximo de Gap" que se encuentra en Parámetros. Marque "Rellenar los huecos con todos los objetos detectados" para iniciar el seguimiento, y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso.
Nota: "algoritmo de movimiento Autoregresivo" se utiliza fu objetos que han dirigido el movimiento, ya que genera pistas basados en localización predicha por el movimiento anterior. "Max Distancia" y "Tamaño Max Gap" puede ser ajustada en función de la dimensión esperada y la velocidad del objeto que está siendo rastreado, así como la duración total de la imagen de lapso de tiempo. - Bajo Tipo de filtro, seleccione el filtro "Duración total". Haga clic en la flecha verde para finalizar el seguimiento, y comprobar las pistas que se han generado. Volver al paso anterior si es necesario para ordenar manualmente las pistas.
- Si las derivas de imágenes con lapso de tiempo generados, corregir la deriva de la traducción.
- Haga clic en el icono con una imagen de un lápiz. Se trata de una pestaña de edición que se abre "Edición de Pistas" ventana. Examinar la imagen de lapso de tiempo y encontrar un punto de referencia que no debe estar en movimiento para todas las imágenes.
- En la esquina superior izquierda de la pantalla, encontrará ventana "Puntero" y marque "Seleccionar" para activar el cursor para la selección de un punto. Haga clic en el punto de referencia.
- Haga clic en "Drift correcta" en la ventana "Editar pistas". Marque "traslacional Drift". El software generará automáticamente la serie corregida de imágenes.
- Medir el movimiento celular definido por las pistas de objetos en imágenes con lapso de tiempo.
- Bajo la ventana "Editar pistas", marque "Tracks" y seleccione una pista que representa el movimiento de una célula. La pista seleccionada se resalta en amarillo en la imagen de series de tiempo en.
- Haga clic en el icono con una imagen de un gráfico para abrir la ventana (pestaña estadísticas) "estadísticas".
- En "Selección", seleccionar "Track velocidad media" haciendo clic en la flecha hacia abajo para generar significa que la velocidad de la pista para la pista seleccionada. Elegir diferentes pistas y repita los pasos para medir significa que la velocidad de la pista para todas las células de interés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murino médula ósea femoral se accede con éxito utilizando el WC para permitir la visualización de los neutrófilos individuales y redes vasculares. La figura 1 muestra el instrumento WC y se describe el procedimiento quirúrgico, que consiste en la exposición del hueso femoral y el adelgazamiento de hueso cortical para obtener acceso óptico dentro de la hueso. La cirugía es bien tolerado en ratones; que se evaluaron para las reacciones físicas adversas, tales como hinchazón de las extremidades posteriores, no soportan el peso en el miembro, automutilación, celulitis y dermatitis, así como daños en el inodoro durante 5 días después de la cirugía, sin informe de angustia. En particular, la ventana permanece ópticamente claro para IVM para un máximo de 40 días, lo que puede permitir la evaluación a largo plazo de las alteraciones celulares y estructurales tras una intervención.
Vasculatura dentro de la médula ósea puede ser visualizado por los tintes intravasculares, tales como FITC-dextrano(Figura 2). Dado que el contraste es dependiente de la inyección del colorante, la imagen adquirida representa vasculatura funcional donde hay suficiente flujo de sangre. Además de la vasculatura, los neutrófilos se pueden teñir in vivo usando el anticuerpo anti-Ly6G. Figura 3A y 3B representan la misma área de la médula ósea observada en diferentes puntos de tiempo, donde se ven los neutrófilos, tanto en el intravascular y espacio extravascular. Estas zonas se caracterizan por los puntos de referencia vasculares. Rodamina 6G se puede utilizar como una alternativa a los anti-Ly6G para teñir los neutrófilos in vivo; sin embargo, se difunde fuera de los monocitos vasculatura y manchas en el espacio extravascular de una manera no específica. Por lo tanto, anti-Ly6G se prefiere, ya que permite formación de imágenes específica de neutrófilos. La Figura 3C representa la imagen del hueso cortical, que se compone principalmente de fibras de colágeno. La profundidad máxima para formación de imágenes logradoen este experimento es 180 m (Figura 3C).
Imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo facilita el seguimiento y cuantificación de movimiento celular in vivo. La Figura 4A muestra el seguimiento de los neutrófilos en el nicho vascular de la médula ósea. Imaging sin intervalo de tiempo adicional entre cada exploración permite un seguimiento preciso de las células; sin embargo, se requiere algo de la entrada del usuario para mejorar aún más la precisión de pistas generados por el software. Seguimiento de las manchas (es decir, células de interés) permite la cuantificación de varios parámetros, tales como la velocidad media pista (Figura 4B). Otros parámetros que se pueden medir incluyen, pero no están limitados a, pista de larga duración, cambio de tamaño de punto, forma e intensidad. Este ensayo proporciona la cuantificación de los diversos parámetros que mejoran la caracterización de los movimientos y de las interacciones celulares.
Figura 1: cámara de ventana fémur (WC), la etapa de formación de imágenes y el procedimiento quirúrgico (A) por encargo WC fémur de titanio con una barra en forma de U que sirve para fijar el fémur en su lugar.. El WC tiene una cubierta de vidrio de 8 mm de diámetro, asegurado por un anillo de retención. (B) la etapa de formación de imágenes por encargo. Un elemento de calentamiento se coloca en la parte inferior de la etapa de mantener la temperatura fisiológica del ratón durante la formación de imágenes. Las dos pinzas de cocodrilo se utilizan para mantener el aseo. (C - H) Procedimiento quirúrgico para la instalación del WC fémur. (C) El fémur está expuesta entre los músculos flexores y extensores. Los músculos no se retiran durante el procedimiento. (D) La barra en forma de U se coloca bajo el fémur, y (E) el WC se instala y se fija con dos tuercas. Se aplica el cemento (F) Dental entre el hueso y laWC para llenar el espacio. (G) La dermis se sutura y (H) de la cubierta de vidrio se fija en su lugar con el anillo de retención. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen de fluorescencia 3D de la red vascular en la médula ósea in vivo imagen representativa de la vasculatura en la médula ósea, reflejado a través de la WC fémur.. Vasculatura (verde) se visualiza mediante inyección en la vena de la cola de 2 MDA FITC-dextrano. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: formación de imágenes 3D de la red vascular, neutrófilos y matriz ósea in vivo Imágenes de vasculatura y neutrófilos en la médula ósea (A) 3 días y (B) 10 días después de la cirugía fémur WC.. Los neutrófilos, manchados por inyección en la vena de la cola del anticuerpo Ly6G marcado con APC, se ven tanto en los espacios intravasculares y extravasculares. Las flechas apuntan a la estructura vascular visto en ambos días, lo que indica la capacidad de seguir la misma ubicación en el tiempo. Barra de escala = 50 micras. (C) de la matriz ósea puede ser visualizado utilizando SHG (blanco), además de la vasculatura (verde) y los neutrófilos (rojo). La imagen fue tomada 40 días después de la cirugía WC. Barra de escala = 70 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Seguimiento de movimiento de neutrófilos dentro de la red vascular de la médula ósea in vivo caminos (A) de la pista de neutrófilos dentro de la red vascular.. Las pistas se generan automáticamente utilizando una función de Autoregresivo algoritmo de movimiento del software. Cada punto blanco representa un punto central de una partícula siendo rastreado (neutrófilos). Barra de escala = 50 micras. (B) La media de velocidad en pista medido para intravasculares y extravasculares neutrófilos, lo que indica la diferencia en el movimiento de los neutrófilos (barras de error = media + SD, * p = 0,0176, de dos colas t-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En tiempo real, de imágenes en serie de los procesos celulares dinámicos en la médula ósea proporciona información que de otro modo un reto para obtener usando técnicas convencionales tales como la histología y los recuentos sanguíneos totales. El modelo WC fémur descrito aquí ofrece oportunidades únicas para investigar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea con el tiempo. Aunque un modelo de fémur WC se ha informado anteriormente, nuestro nuevo diseño proporciona un campo de la imagen de visión más amplio y el tamaño general más pequeño WC, que son más compatible para su uso en ratones adultos. El modelo de WC fémur se puede utilizar en una variedad de cepas de ratón incluyendo inmunocompetentes y / o reportero ratones transgénicos.
Hay pasos críticos durante la cirugía que determinan la duración total y la calidad de las imágenes. Al exponer el fémur, sólo se realiza una disección roma de los músculos flexores y extensores entre; eliminación de estos músculos puede resultar en la movilidad reducida del ratón y must ser evitado. Además, la molienda del hueso cortical debe realizarse con cuidado. Molienda aproximadamente 50 micras es adecuado para la formación de imágenes ópticas, manteniendo la integridad estructural de la red vascular femoral. Aplicación de cemento dental alrededor del hueso es crucial para el sellado de la zona expuesta quirúrgicamente, evitando la acumulación de líquido, y el mantenimiento de una ventana de imagen óptica clara durante más de un mes al tiempo que reduce el riesgo de infección. El cemento dental también actúa para fijar el inodoro en su lugar, evitando que el WC gire alrededor del hueso femoral. Por último, el anillo de retención se utiliza para mantener el cubreobjetos es adecuado para su uso con la lente de inmersión en agua, proporcionando sello de agua. El anillo de retención se recomienda sobre adhesivos para unir el cubreobjetos a la WC porque adición de adhesivos puede aumentar la distancia entre el hueso y el cubreobjetos, o colocar el cubreobjetos en un ángulo ligero con respecto al plano de la imagen, reduciendo así la profundidad de penetración alcanzable para formación de imágenes. además, El anillo de resorte es útil cuando el cubreobjetos necesita ser limpiado o cambiado.
Además de la cirugía, hay varios pasos críticos para lograr la formación de imágenes ópticas con éxito de la médula ósea. Para imagen dentro del WC fémur, el WC se coloca horizontalmente a la etapa de formación de imágenes para la inmersión adecuada de la lente objetivo. La etapa de formación de imágenes a medida es adecuado para este propósito, ya que permite ajustes del ángulo de la WC con respecto a la lente. Por otra parte, el diseño del WC, particularmente el tamaño de la barra en forma de U, mantiene el hueso en una posición horizontal como cerca del cubreobjetos como sea posible para conseguir la profundidad de penetración óptima. Durante estas pruebas, los artefactos de respiración pueden ser observados como líneas horizontales en las imágenes de fluorescencia. Además de asegurar el WC a la etapa de formación de imágenes, la temperatura del elemento de calentamiento en la etapa de formación de imágenes puede ajustarse para calentar adecuadamente el animal para minimizar la respiración excesiva. Una fina capa de gasapuede ser colocado entre el ratón y la etapa se calienta para ayudar aún más a reducir los artefactos de respiración durante la exploración. Dependiendo del objetivo de formación de imágenes biológicas, los parámetros de adquisición, tales como velocidad de fotogramas, el volumen de formación de imágenes y la duración de formación de imágenes también se pueden ajustar para recoger suficientes imágenes para tratar preguntas experimentales. Por ejemplo, la velocidad de la migración de neutrófilos y de rastreo puede ser diferente en diversas condiciones experimentales, a partir de 2,8 m / min para los neutrófilos residentes bajo condiciones basales a cualquier parte que va desde 5 hasta 10 m / min para los neutrófilos en condiciones inflamatorias 19-21. Por lo tanto, la velocidad de formación de imágenes adecuado y la duración para el seguimiento de los neutrófilos in vivo también diferir en función de las condiciones experimentales. Además, como se ve a partir de los resultados, el seguimiento de las células dentro de la vasculatura requeriría una cámara de imagen rápida con una alta frecuencia de imagen (30 cuadros / seg). Sin embargo, si las células diana están residiendo en el espacio extravascular, o si el Interactio de célula a célulaSe espera n de interés que se produzca más lentamente, la calidad de imagen debería tener prioridad sobre la velocidad de formación de imágenes.
La influencia de los anticuerpos inyectados para la tinción de células in vivo sobre la función celular también debe ser considerado. En nuestro estudio, se utilizó anticuerpo anti-Ly6G (1A8 clon), que se utiliza típicamente a dosis altas (150 a 250 g) para agotar los neutrófilos de la circulación y de estudiar su papel en diversos modelos de enfermedad. Yipp y Kubes demostraron que el anticuerpo anti-Ly6G marcado con fluorocromo no interrumpe el reclutamiento de leucocitos en dosis bajas intravasculares de inyección (1-40 mg) 22. Sin embargo, un estudio más reciente sugiere que los fluorocromos, que tiene grandes diferencias en la masa molecular y estructura química, pueden influir diferencialmente la función de anti-Ly6G 23. El estudio demostró que marcado con FITC anti-Ly6G, pero no PE y anticuerpos APC-etiquetado, agota con eficacia los neutrófilos in vivo a una concentración baja (30 mg).En nuestro estudio, no observamos las horas extraordinarias depleción de neutrófilos usando 4 g de marcado con APC anti-Ly6G. Sin embargo, se requiere la caracterización adicional de la función de anticuerpo anti-Ly6G marcado con fluorocromo in vivo para validar su uso en formación de imágenes intravital. Esto también se aplica a otros anticuerpos que tienen la capacidad funcional para alterar las interacciones celulares. Como alternativa a la tinción de células in vivo con anticuerpos, los ratones transgénicos reportero 24 y / o las células fluorescentes marcadas 25 se puede utilizar para visualizar los neutrófilos o la otra población de células de interés in vivo.
El modelo de fémur WC se describe en este protocolo permite obtener imágenes de hasta 40 días después de la cirugía. Algunos de los desafíos para la formación de imágenes a largo plazo utilizando este modelo WC incluyen el proceso de cicatrización ósea retrasada y el mantenimiento de una ventana de vidrio limpio. En particular, no observamos signos de cicatrización ósea obvia después de la implantación de aseo, lo que haría INCLUYENDOe engrosamiento de periostio; Esto no es inesperado dado que proceso de curación del hueso se produce normalmente después de 1 ½-3 meses 26,27. El mantenimiento de una ventana limpia y ópticamente claro se puede lograr mediante la aplicación del cemento dental, y el uso de anillo de retención y cubreobjetos que proporcionar un sello de agua firme con el tejido. El cubreobjetos se puede limpiar de vez en cuando con puntas de algodón desde el exterior para eliminar el polvo y los escombros. El WC tiene un campo de la imagen de ancho, cubriendo casi toda la longitud de la región de la diáfisis (aproximadamente 8.4 a 8.6 mm 28), que hace que sea superior al modelo publicado previamente 18. Sin embargo, el acceso a las regiones distales y la cavidad ósea más profunda es limitado. En particular, la metáfisis trabecular-rico, situados en los extremos distales de la diáfisis, es conocida por ser rica en hPSCs 29. Estas áreas pueden ser accedidos histológicamente o por IVM como procedimiento terminal. Por otra parte, diferentes modalidades de imágenes tales como micro-compbuido tomografía se puede utilizar para la imagen de las regiones distales de la médula ósea in vivo 30. Tales métodos son complementarios a IVM, proporcionando un enfoque integrado para evaluar la anatomía y las diversas alteraciones celulares y estructurales y las interacciones dentro de la médula ósea.
El protocolo descrito aquí ofrece un nuevo enfoque a largo plazo de evaluación espacio-temporal de la médula ósea del fémur en ratones a celulares de resolución. Los métodos presentados permiten en serie de imágenes in vivo para seguir los movimientos de una sola célula o poblaciones celulares en escalas de tiempo biológicamente relevantes, mientras que la obtención simultánea de información estructural y funcional de la médula ósea. Además, el análisis cuantitativo de imágenes se puede realizar para caracterizar mejor las alteraciones celulares y funcionales, tales como el seguimiento de los movimientos celulares. La aplicación de este modelo de WC fémur en diferentes cepas de ratones, en particular en reportero ratones transgénicos 31,puede permitir una mayor investigación de múltiples poblaciones de células marcadas de forma individual tales como los implicados en la hematopoyesis. Por lo tanto, el protocolo descrito es ampliamente aplicable a una amplia gama de estudios preclínicos que implican diversos procesos biológicos dentro del hueso vivo ósea murina, incluidas las investigaciones en la hematopoyesis, la leucemia, el trasplante de HPSC, la regulación inmune, el microambiente de la médula ósea (por ejemplo, el nicho de hipoxia) y la contribución de las células inmunes para la progresión tumoral y la metástasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Fondo para Microscopía Óptica Avanzada (www.aomf.ca) en la Red de Salud de la Universidad para obtener ayuda con la microscopía, y el Sr. Jason Ellis de la princesa Margarita Centro de Cáncer de máquinas para la fabricación del WC y la etapa de formación de imágenes. También nos gustaría agradecer al Dr. Iris Kulbatski para la edición de manuscritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
