Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

En RNA pull-down protokol er optimeret her til påvisning af interaktioner mellem RNA-bindende proteiner (RBP'er) og ikke-kodende samt kodende RNA'er. En RNA-fragment fra androgen receptor (AR) blev anvendt som et eksempel for at vise hvordan man kan hente sin RBP fra lystate af primære brune fedtceller.

Abstract

RNA-bindende proteiner (RBP'er) dukker op som en regulerende lag i udvikling og funktion af fedt. RBP'er spiller en central rolle i genekspression regulering på posttranskriptionel niveauer ved at påvirke stabiliteten og translationel effektivitet af target mRNA. RNA pull-down teknik er blevet meget anvendt til at studere RNA-protein-interaktion, der er nødvendige for at belyse den mekanisme underliggende (lncRNAs) funktion RBP'er 'samt lange ikke-kodende RNA'er «. Men den høje lipid overflod i adipocytter udgør en teknisk udfordring i at gennemføre dette forsøg. Her en detaljeret RNA pull-down protokol er optimeret til primær adipocyt kultur. Et RNA-fragment fra androgen receptors (AR) 3 'utranslaterede region (3'UTR) indeholdende en adenylat-uridylate-rige elementwas der anvendes som et eksempel for at vise, hvordan man kan hente sin RBP partner, Hur protein fra adipocyt lystate. Den her beskrevne metode kan anvendes til at detektere interaktioner mellemRBP'er og ikke-kodende RNA, samt mellem RBP'er og kodning RNA.

Introduction

RBP'er er proteiner, der binder til det dobbelte eller enkeltstrenget RNA i celler og deltager i dannelse af RNA-protein-komplekser. RBP'er kan binde en række RNA-arter, herunder mRNA og lange ikke-kodende RNA'er (lncRNAs), og udøve deres indflydelse på post-transkriptionelle niveau. Både RBP'er og lncRNAs dukker op som nye regulatorer i fedtvæv udvikling og funktion 1,2,3. For at forstå den mekanisme af RBP- og lncRNA-medieret regulering af cellulære veje, er det ofte nødvendigt at detektere interaktionen mellem en specifik RNA-molekyle og et eller flere RBP'er, og undertiden at identificere det fulde spektrum af proteinpartnere af en RNA udskrift. Imidlertid kan eksperimentet være udfordrende på grund af det høje indhold af lipider i adipocytter. Den her beskrevne RNA pull-down protokol kan anvendes til at hente de proteinpartnere af en specifik RNA fra adipocyt lysater af primære kulturer 4,5.

Baggrunden for denne protocol opsummeres som følger. Et RNA agn er in vitro transkriberet fra en DNA-skabelon, biotinmærket og konjugeret til streptavidin-belagte magnetiske perler 4. RNA agn inkuberes med cellelysater at tillade dannelsen af ​​RNA-protein-komplekser, der efterfølgende trukket ned på et magnetisk stativ. Mere specifikt RNA pull-down protokol beskrevet nedenfor anvender en RNA-fragment fra AR 3'UTR som lokkemad for at hente Hur protein, et universelt udtrykte RBP bundet til 3'UTR af mRNA'er 6,7, fra theadipocytelysate af primær kultur. For at teste bindingsspecificiteten af ​​denne analyse, er en ikke-relevante RNAas samt tomme streptavidinkugler inkluderet som kontrol. Denne protokol er kompatibel med western blotting eller massespektrometri (MS) for at bekræfte erobringen af en bestemt RBP eller til at identificere den fulde repertoire af tilfangetagne RBP'er henholdsvis 8.

Flere teknikker er tilgængelige til at studere RNA-protein-interaktions. At afsløre RNA'er bundet af en given RBP, RIP (RNA immunpræcipitation) og CLIP (UV tværbinding og immunpræcipitation) kan anvendes. I modsætning til at identificere protein partnere i en given RNA, RNA pull-down, kan anvendes Chirp (kromatin isolation af RNA oprensning), CHART (capture hybridisering analyse af RNA-mål) og RAP (RNA antisense rensning). I sammenligning med de senere dem, RNA pull-down teknik tager mindre indsats for at sætte op. Det kan anvendes til at indfange proteiner in vitro og in vivo. In vivo tilgang af RNA pull-down, som er teknisk mere udfordrende end dens in vitro modstykke, bevarer RNA-protein interaktioner ved tværbinding i celler, indfanger aptamer-mærkede RNA af interesse fra cellerne, og efterfølgende opdager bundne RBP'er. RNA pull-down kan anvendes til at berige lave rigelige RBP'er og at isolere og identificere de RNA-protein-komplekser, der har forskellige funktionelle roller i at kontrollere cellulær regulering 9,10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: RNA'et af interesse i forbindelse med denne undersøgelse er et fragment af AR 3'UTR.

1. Fremstilling af biotin-mærket RNA

  1. For at opnå den RNA, forstærke T7-AR-oligo ved PCR, efterfulgt af in vitro transkription ved anvendelse af et kommercielt kit og følge producentens instruktioner 11.
    BEMÆRK: Primere til PCR er anført i tabel 4: T7-AR-F og T7-AR-R.
  2. For ikke-specifik binding kontrol, amplificere en delsekvens af ildflue luciferase (FL) DNA ved PCR fra psiCHECK-2 plasmid, efterfulgt af in vitro transkription.
    BEMÆRK: Primere til PCR er anført i tabel 4: hluc (+) - T7-probe-F og hluc (+) - probe-R Tabel 4 Sekvenser af skabelon og primere til PCR-amplifikation...
  3. For en 50 pi PCR-reaktion, blande 50 ng DNA (oligo- eller plasmid), 4 pi dNTP'er (2,5 mM af hver enkelt dNTP), 5 pi 10 x reaktionsbuffer, 1 pi 2,5 U / & #181; l-DNA-polymerase, 2 pi 10 pM forward primer, 2 pi 10 pM revers primer og nuclease-frit vand.
    1. Køre PCR-amplifikation i en thermal cycler under anvendelse af følgende program. Trin 1: en cyklus på 95 ° C i 2 min; Trin 2: 35 cykler af 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek (AR) eller 60 sekunder (FL); STEP3: en cyklus af 72 ° C i 10 min.
  4. Syntetisere biotinylerede RNA'er under anvendelse af et in vitro transcription kit ifølge producentens anvisninger 11. I dette eksperiment anvende PCR-produkter som skabeloner for RNA-syntese. For en 20 pi in vitro transcription reaktionen, blandes 200 ng PCR-amplificeret DNA, 2 pi af hver enkelt NTP, 1 pi 10 mM biotin-CTP, 2 pi 10x reaktionsbuffer, og 2 pi T7 RNA-polymerase. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 4 timer.
  5. Efter in vitro-transskription, behandler reaktionsblandingen med 1 pi 2 U / pl DNase ved 37 & #176; C i 15 minutter for at nedbryde template-DNA. Endelig fortyndes den biotinylerede RNA til et samlet volumen på 60 pi til efterfølgende oprensning.
  6. Oprens biotinylerede RNA'er for at fjerne salte og ikke-inkorporerede nukleotider ved anvendelse oprensningssøjler efter producentens anvisninger 12. Mål RNA koncentration og opbevares ved -80 ° C til efterfølgende pull-down-analyser.
  7. For at sikre korrekt sekundære struktur for RNA af interesse i RNA-protein-interaktion, varme 50 pi biotinyleret RNA (50 pM) ved 90 ° C i 2 min, chill på is i 2 min, derefter forsyne med 50 pi 2x RNA struktur buffer (tabel 3), og gøre det muligt at RNA foldning ved stuetemperatur i 30 minutter 13,14.

2. Fremstilling af RNA-konjugeret Beads

BEMÆRK: Brug et magnetisk stativ til separation af de magnetiske perler og supernatant.

  1. Resuspendere streptavidin-coatede magnetiske perler i det originale hætteglas ved kort vortexing efter producentens anvisninger. Overfør 150 ul resuspenderede kugler til et 1,5 ml rør. Glasset anbringes på magnet for 1 min. Supernatanten kasseres. Hold perle pellet.
    BEMÆRK: I RNA pull-down-analyser, når alikvotere resuspenderede perler fra originale glas, bruge 50 pi perler til en analyse efterfulgt af western blotting, og 200 pi perler for en analyse efterfulgt af MS.
  2. Vask perler én gang ved at resuspendere perle pellet med 1 ml af producentens anbefalede 1x W & B (binding og vask) buffer (tabel 3), efterfulgt af at dreje røret i 5 minutter ved stuetemperatur i en rotator. Supernatanten kasseres. Hold perle pellet.
  3. At inaktivere RNase på perler, vask perler to gange, hver gang ved at resuspendere perle pellet med 400 pi buffer A. Buffer A er en alkalisk opløsning indeholdende 0,1 M NaOH og 0,05 M NaCl (tabel 3). Rotere røret i 2 minutter ved stuetemperatur i en rotator. Supernatanten kasseres. Hold perle pellet.
    4. <li> vil fjerne NaOH fra perler, vask perler to gange, hver gang ved at resuspendere perle pellet med 400 pi puffer B (tabel 3), efterfulgt af at dreje røret i 2 minutter ved stuetemperatur i en rotator. Supernatanten kasseres. Hold perle pellet.
  4. Resuspender perle pellet med 300 pi 2x W & B buffer, split perler ligeligt og overføre i tre 1,5 ml rør (100 pi perler pr rør). Levere perle-holdige rør med 100 pi RNase frit vand, 100 pi biotinyleret FL RNA og 100 pi biotinyleret AR 3'UTR RNA hhv.
  5. Inkuber hver perle blandingen i 1 time ved stuetemperatur under rotation. Placer rør på magnet i 1 min. Kassér alle supernatanten. Hold perle pellets.
  6. Vask perlerne to gange, hver gang ved at resuspendere hver perle pellet med 400 pi 1x W & B-buffer, efterfulgt af roterende rør i 5 minutter ved stuetemperatur i en rotator.
  7. Placer rør på magnet i 1 min. Kassér alle supernatanten. Resuspender hver perle pellet med 50 pi isolation buffer nukleare (tabel 3).

3. Preadipocyte Isolering og adipogenese Induktion

  1. Som beskrevet i tidligere publikationer 5, dissekere præadipocytter fra interscapular brunt fedt pad (C57BL6 vildtypemus, 3 uger gamle).
  2. Grow og in vitro differentiere præadipocytter 5. Celler er klar til nedstrøms anvendelse 4-5 dage efter påbegyndt differentiering.

4. Fremstilling af Cellular Lysat fra Primære Adipocyter

BEMÆRK: Sørg for alle procedurer for cellelysat forberedelse er lavet på is, og alle buffere afkølet på is. Pre-chill dounce glas homogenisatorer på is.

  1. Grow og differentiere præadipocytter i 15 cm skåle 5 (se afsnit 3.2). Hver skål giver tilstrækkelige celler til en RNA pull-down assay. På dag 4 eller dag 5 af differentiering, discard cellekulturmedium, og vask ceLLS gang med 1x PBS.
  2. At høste celler tilsættes 10-15 ml 1x PBS til cellerne, skrabe at indsamle celler i en 50 ml rør, og pellet cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten ved anvendelse af 1 ml pipette.
  3. Resuspender cellepelleten i 2 ml hypotonisk puffer (tabel 3), og der inkuberes celler på is i 15 min. Overfør celler til en 15 ml Dounce glashomogenisator og shear celler mekanisk på is med 20 slag.
  4. Pellet cellekerner ved centrifugering ved 3.300 x g i 15 min ved 4 ° C. Hold kerner pellet på is til videre brug (se afsnit 4.6). Overfør supernatanten til 1,5 ml rør, tilføje 3M KCI til supernatanten til opnåelse af en slutkoncentration på 150 mM, og centrifugering ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  5. Efter centrifugering, forsigtigt fjerne lipidlayeron toppen ved hjælp af en ml pipette, og samle bundfald som cytoplasmatisk cellulære lysat.
  6. Resuspender kerner pellet (se afsnit 4.4) i 1 ml nukleare isolation buffer. Transfer kerner til en 15 ml Dounce glashomogenisator anvendelse af 1 ml pipette, og shear kerner mekanisk på is med 100 slag. Pelletere nukleare debris ved centrifugering ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, og indsamle supernatanten som den nukleare cellulære lysat.
  7. Enten kombinere de nukleare og cytoplasmatiske cellelysater, eller bruge hver fraktion for sig, for downstream pull-down ansøgning. I denne demo eksperiment blev disse to fraktioner af cellelysat kombineres ved et volumenforhold på 1: 1.
  8. Tilføj RNase inhibitor til denne ufraktioneret cellelysat for at opnå en slutkoncentration på 0,5 U / pl. Set bort 100 ul cellelysat som input kontrol for western blotting 15.

5. Binding og Eluering af RBP

  1. Split cellelysat i tre lige store portioner (1 ml cellelysat i et 1,5 ml rør), og der inkuberes med blank, FL RNA-konjugeret og AR 3'UTR RNA-konjugerede perler (se afsnit 2.8), henholdsvis i 3 timer ved 4 ° Cmed rotation.
  2. Placer rør på magnet i 1 min. Samle bundfald anvendelse af en 1 ml pipette, efterfulgt af RNA-isolering fra supernatanten at bekræfte RNA fuldstændighed. Isoler RNA ved anvendelse af en syre guanidiniumthiocyanat-phenol-opløsning efter fabrikantens instruktioner (tabel 2). Vurdere RNA intakt ved at analysere 28S og 18S underenheder af ribosomale RNA. Hold perle pellets på is.
  3. Vask de magnetiske perler seks gange, hver gang ved resuspendering hver perle pellet med 1 ml nuklear isolation puffer indeholdende 40 U RNase-inhibitor og 0,25% IGEPAL, efterfulgt af roterende rør i 2 minutter ved stuetemperatur i en rotator. Brug et magnetisk stativ til separation af de magnetiske perler og supernatant. Kassér alle supernatanten. Hold perle pellets på is.
  4. Brug følgende trin til at eluere RNA-protein-komplekser fra perler til western blotting. Først resuspendere hver perle pellet i 75 pi nuklear isolation buffer; derefter tilsættes 25 pi 4x western blot lastning buffer (indeholdende SDS) for at opnå et samlet volumen på 100 pi. Endelig koges perler i denne 100 pi opløsning ved 95 ° C i 5 min.
    BEMÆRK: Brug følgende trin til eluering af RNA-protein-komplekser fra perler til MS. STEP1: resuspendere hver perle pellet i 100 ul elueringspuffer (tabel 3); Trin 2: inkuber perle prøver til 2-3 timer ved stuetemperatur med rotation; STEP3: centrifuge og indsamle proteinholdige supernatant; Step4: koncentrere proteinopløsninger til 20-30 pi før indsendelse til MS.
  5. Centrifuger hvert 100 pi bead prøve ved 12.000 x g i 30 sekunder ved 4 ° C, og samle bundfald. Portion 15 pi supernatant til Western blot analyse (se afsnit 6.1 og 6.2). Sonde resulterende membran med den fortyndede Hur muse-monoklonalt antistof (1: 1.000 fortynding), natten over.

6. vestlige Blotting for Verifikation af RBP

  1. Separate RBP'er ved SDS-PAGE under anvendelse af standardteknikker.
  2. Gennemføre vistern blotting ved anvendelse af standardteknikker ved at probe for RBP'er forbundet med RNA'et af interesse.
    BEMÆRK: I denne demo forsøg blev HUR muse monoklonalt antistof, der anvendes til immundetektering af HUR protein.
  3. Inkubér den resulterende membran med det fortyndede Hur antistof (1: 1000 fortynding) i 5% vægt / volumen fedtfri tørmælk, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 ved 4 ° C under forsigtig omrystning natten over. Vask membran tre gange med 1x TBST. Inkuber membranen med det sekundære antistof (gede-anti-muse-IgG-HRP) ved stuetemperatur i 1 time. Wash membran. Udvikle og optage signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne demo eksperiment blev en AR RNA-fragment anvendes som lokkemad for at fange dets bindende protein Hur. Både en FL RNA lokkemad, der er ikke-relevant for Hur protein og en alikvot af ukonjugerede datoer streptavidinkugler tjente som negative kontroller. RNA-protein-interaktioner kan forekomme enten i kernen eller cytoplasmaet, og dette pull-down protokol kan anvendes til enten total eller fraktioneret (nukleare eller cytoplasmatiske) cellelysater. Analyse af proteiner ved western blotting viser, at prøven på 15 pi ufraktioneret cellelysat (se afsnit 4.8), som ingen perle input kontrol, gav et positivt resultat, hvilket indikerer, at HUR protein detekteres i fedtcellerne lysat af mus primær kultur ved at bruge det monoklonale antistof. Elueringsfraktionen AR RNA gav et positivt resultat, hvilket indikerer, at Hur protein påvises i fedtcellerne lysat ved hjælp af AR RNA-konjugerede perler for RNA pull-down assay. Både FL RNA elueringsfraktion og blank perle prøve gav negative resultater, hvilket indikerer, at uspecifikke interaktioner mellem FL RNA-fragment og Hur protein, samt mellem de tomme perler og Hur protein ikke påvises ved denne RNA pull-down tilgang. Resultaterne af disse to negative kontroller viser også, at en specifik interaktion mellem AR-RNA-fragment og Hur protein med held, detekteres af den her beskrevne RNA pull-down protokol.

figur 1
Figur 1: Western Blot Verifikation af HUR Captured af RNA pull-down Analyser Input: rekonstituerede cellelysat (cytoplasmatisk + nuklear lysat). Perler: prøven fra datoer streptavidin-belagte magnetiske perler; FL RNA: streptavidinkugler bundet med FL mRNA; AR 3'UTR RNA: streptavidinkugler bundet med AR 3'UTR mRNA; Primært antistof: Hur monoklonalt muse-antistof; Sekundært antistof: gede-anti-mouse IgG-HRP; Forkortelse, FL: ildflueluciferase, AR: androgen receptor, venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Centrifuge
Termisk cycler
Spektrofotometer
Rotator
Protein gelelektroforese og blottingapparat
Magnet

Tabel 1: Major Udstyr anvendt i denne undersøgelse Major udstyr, der anvendes i denne undersøgelse..

In vitro transcription kit
biotinyleret RNA
Spin kolonne til genvinding af DNA og RNA-fragmenter
Streptavidin magnetiske perler
Hur muse monoklonalt antistof
Gede-anti-muse-IgG-HRP
Nuclease-free molekylærbiologisk kvalitet vand
Phosphatpuffersaltopløsning
RNase-hæmmer
proteaseinhibitor
Pfu DNA-polymerase
Syreguanidiniumthiocyanat-phenol-opløsning

Tabel 2: Større reagenser, der anvendes i denne undersøgelse Større reagenser, der anvendes i denne undersøgelse..

<tr>
2x RNA struktur buffer
20 mM Tris-HCI (pH 7,4)
0,2 M KCI
20 mM MgCl2
2 mM DTT
0,8 U / pl RNase-inhibitor
buffer A
0,1 M NaOH
0,05 M NaCl
puffer B
0,1 M NaCl
1x W & B (Indbinding og Washing) buffer
5 mM Tris-HCl (pH 7,4)
1 M NaCl
1x Hypotonisk buffer
10 mM Tris-HCI (pH 7,4)
10 mM KCI
2 mM MgCI2
1 mM DTT
1 mM PMSF
1x protease inhibitor
1x Nuklear isolering puffer
25 mM Tris-HCI (pH 7,4)
150 mM KCI
2 mM MgCI2
1 mM DTT
0,5% IGEPAL (eller 0,25% IGEPAL til eluering af RBP'er)
1 mM PMSF
1x protease inhibitor
0,4 U / pl RNase inhibitor (eller 40 U / ml RNase inhibitor til eluering af RBP'er)
1x Elueringsbuffer
2 mM biotin i 1x PBS

. Tabel 3: Større Solutions anvendt i denne undersøgelse 2x RNA struktur buffer (se afsnit 1.7); Buffer A (se afsnit 2.3); Buffer B (se afsnit 2.4); 1x W & B (Indbinding og Washing) buffer (se afsnit 2.2, 2.5, 2.7); 1x Hypotonisk buffer (se afsnit 4.3); 1x Nuclear isolation buffer (se afsnit 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x Elution buffer (se OBS følgende afsnit 5.4).

lways "> Skabelon og primere Sekvenser T7-AR-oligo 5'TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT TCT CTT TCT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC FTT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3 ' T7-AR-F 5'CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 ' T7-AR-R 5'AGA CTG CCA CGG TCA TAA GC -3 ' hluc (+) - T7-probe-F 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 ' hluc (+) - probe-R 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 '

Tabel 4: Sekvenser af Template og Primere til PCR-amplifikation T7-AR-oligo:. DNA skabelon til PCR-amplifikation (se afsnit 1.1); T7-AR-F: forward primer til PCR-amplifikation (se afsnit 1.1); T7-AR-R: reverse primer til PCR-amplifikation (se afsnit 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: forward primer til PCR-amplifikation (se punkt 1.2); hluc (+) - probe-R: reverse primer til PCR-amplifikation (se afsnit 1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs og RBP'er har afgørende roller i sundhed og sygdom, men de molekylære mekanismer i disse molekyler er dårligt forstået. Identifikation af proteiner, der interagerer med lncRNA molekyler er et vigtigt skridt i retning af at belyse de regulatoriske mekanismer. Berigelse af RBP'er af RNA pull-down assay er baseret på in-opløsning indfangning af interagerende kompleks, således at proteiner fra et cellelysat selektivt kan ekstraheres under anvendelse af biotinylerede RNA lokkemad bundet til streptavidin magnetiske perler. Flere andre metoder såsom Chirp, diagram og RAP kan nå det samme mål, men disse metoder tager større indsats for at etablere end RNA pull-down teknik 16,17,18.

Den største styrke i RNA pull-down er, at det er relativt simpelt protokol og let at udføre. Både CHIRP og RAP indebærer en tværbinding trin, der bevarer naturligt forekommende RNA-protein komplekser og design af et komplet sæt af antisense-oligonukleotider (90 Nucleotides længe i RAP, og 20 nukleotider lange i Chirp) flisebelægning hele mål-RNA 16,17,18. RNA foldning er et afgørende skridt i RNA pull-down-analyser. Den største begrænsning ved denne protokol er, at mål-RNA'er syntetiseres in vitro og kan ikke foldes korrekt i native struktur at muliggøre en korrekt binding med dens RBP (s). Fejlfoldet ikke-indfødte RNA kan enten undlade at danne RNA-protein interaktioner og afkræfter funktionelle assays, eller danner samspil, der kun forekommer i vitro under ikke-fysiologiske betingelser. Selvom den her beskrevne pull-down-protokollen vedtaget en velkendt procedure for RNA folde 13,14 (se afsnit 1.7), betyder det ikke garantere korrekt foldning for andre RNA-transkripter.

RNA pull-down er ofte kombineret med RIP som en tilgang til at detektere RNA (r) bundet af RBP af interesse 19. Et andet afgørende skridt i denne protokol er fjernelse af lipid fraktion fra total cellelysat (se afsnit 4.5), da den høje lipid overflod i modne adipocytter udgør en stor teknisk udfordring. Protokollen beskrevet her er særligt udviklet til anvendelse med adipocytter. Dog kan de grundlæggende elementer i denne protokol og strengheden af alle anvendte buffere ændres og tilpasses til anvendelse på andre cellekultur-modeller. For væv, der har høje niveauer af endogen RNase kan forskellige RNA pull-down-protokoller anvendes.

RNA pull-down, som bruger RNA'er af interesse at identificere de tilknyttede RBP'er, er en effektiv teknik til at undersøge de centrale funktioner og mekanismer lncRNAs, som har en lang række roller i humane celler. Fremtidig udvikling af RNA-baserede capture, herunder RNA pull-down, vil der være behov for at løse udfordringerne med at definere komponenter, montage og funktion af RNA-protein-komplekser, samt at generere tilstrækkelige RBP'er fra lave rigelige RNA-protein-komplekser for MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Singapore NRF fællesskab (NRF-2011NRF-NRFF001-025) samt CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

Molekylærbiologi RNA pull-down RNA-bindende protein fedtcellerne ikke-kodende kodning

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved<em&gt; In vitro</em&gt; RNA Pull-down i fedtcellerne Kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter