Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning av RNA-bindende proteiner etter Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

En RNA pull-down-protokollen er optimalisert her for påvisning av vekselvirkninger mellom RNA-bindende proteiner (RBPs) og ikke-kodende samt koding RNA. Et RNA-fragment fra androgenreseptoren (AR) ble anvendt som et eksempel for å vise hvordan man skal hente sine RBP fra lystate av primære brune adipocytter.

Abstract

RNA-bindende proteiner (RBPs) er fremstår som en regulerende lag i utvikling og funksjon av adipose. RBPs spille en nøkkelrolle i genuttrykk regulering på posttranskripsjonelt nivåer ved å påvirke stabiliteten og translasjonsforskning effektiviteten av målet mRNA. RNA pull-down teknikken har blitt mye brukt for å studere RNA og protein, noe som er nødvendig for å belyse mekanismen bak RBPs 'samt lang ikke-kodende RNA' (lncRNAs) funksjon. Men den høye lipid overflod i adipocytter utgjør en teknisk utfordring i å gjennomføre dette eksperimentet. Her en detaljert RNA pull-down-protokollen er optimalisert for primær adipocyte kultur. En RNA-fragment fra androgen reseptor-tallet (AR) 3 'ikke-translatert område (3'UTR) som inneholder en adenylate-uridylate rike elementwas brukt som et eksempel for å demonstrere hvordan du henter sin RBP partner, Hur protein, fra adipocyte lystate. Den fremgangsmåte som er beskrevet her kan anvendes for å påvise interaksjonen mellomRBPs og ikke-kodende RNA, samt mellom RBPs og koding RNA.

Introduction

RBPs er proteiner som binder seg til det dobbelte eller enkelt-trådet RNA i celler og deltar i dannelse av RNA-proteinkomplekser. RBPs kan binde en rekke RNA arter, inkludert mRNA og lange ikke-kodende RNA (lncRNAs), og utøve sin innflytelse på post-transkripsjonsnivåer. Begge RBPs og lncRNAs er fremstår som nye regulatorer i adipose utvikling og funksjon 1,2,3. For å forstå mekanismen for RBP- og lncRNA-medierte regulering av cellulære veier, det er ofte nødvendig for å påvise interaksjon mellom et spesifikt RNA-molekyl og ett eller flere RBPs, og, noen ganger, for å identifisere hele spekteret av proteinpartnere for en RNA transkripsjon. Imidlertid kan eksperimentet være utfordrende på grunn av det høye innhold av lipider i adipocytter. RNA pull-down protokollen som er beskrevet her kan anvendes for å hente proteinpartnere for en spesifikk RNA fra fettceller lysatene av primære kulturer 4,5.

Begrunnelsen for dette protocol er oppsummert som følger. Et RNA agn er in vitro transkribert fra et DNA-templat, biotin-merket og konjugert til streptavidin-belagte magnetiske kuler 4. RNA agn inkuberes med cellelysatene for å muliggjøre dannelse av RNA-proteinkomplekser, som deretter trekkes ned på en magnetisk stativ. Mer spesielt beskrives det RNA-pull-down-protokollen nedenfor bruke et RNA-fragment fra AR 3'UTR som agn for å hente Hur protein, et universelt uttrykt RBP bundet til 3'UTR av mRNA 6,7, fra theadipocytelysate av primær kultur. For å teste bindende spesifisitet av denne analysen, er en ikke-relevante RNAas samt tomme streptavidin perler inkludert som kontroll. Denne protokollen er kompatibel med western blotting eller massespektrometri (MS) for å bekrefte fangst av en spesifikk RBP eller for å identifisere den fullstendige repertoar av fangede RBPs, henholdsvis 8.

Flere teknikker er tilgjengelige for å studere RNA-proteininteraksjons. For å avdekke RNA er bundet av en gitt RBP, RIP (RNA immunoprecipitation) og CLIP (UV kryssbinding og immunoprecipitation) kan brukes. I motsetning til å identifisere protein partnere i et gitt RNA, RNA pull-down, kvitre (kromatin isolering av RNA rensing), SKJEMA (fangst hybridisering analyse av RNA mål) og RAP (RNA anti rensing) kan brukes. Sammenlignet med de senere meldinger, tar RNA rullegardin teknikk mindre innsats for å sette opp. Den kan benyttes for å fange proteiner in vitro og in vivo. In vivo tilnærming av RNA pull-down, som er teknisk mer krevende enn in vitro motstykke, bevarer RNA-protein interaksjoner ved kryssbinding i celler, fanger aptamer-merket RNA av interesse fra cellene, og senere oppdager innbundne RBPs. RNA pull-down kan anvendes for å berike lave rikelig RBPs, og for å isolere og identifisere RNA-proteinkomplekser som har forskjellige funksjonelle roller i å kontrollere celleregulering 9,10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: RNA av interesse i forbindelse med denne studien er et fragment av AR 3'UTR.

1. Fremstilling av biotin-merket RNA

  1. For å få RNA, forsterke T7-AR-oligo med PCR, etterfulgt av in vitro transkripsjon ved å bruke et kommersielt kit og følge produsentens instruksjoner 11.
    MERK: Grunning for PCR er oppført i Tabell 4: T7-AR-F og T7-AR-R.
  2. For ikke-spesifikk binding kontroll, forsterke en partiell sekvens av ildflueluciferase (FL) DNA ved hjelp av PCR fra psiCHECK-2 plasmid, etterfulgt av in vitro transkripsjon.
    MERK: Grunning for PCR er oppført i Tabell 4: hluc (+) - T7-probe-F og hluc (+) - probe-R Tabell 4 Sekvenser av mal og primere for PCR forsterkning...
  3. For en 50 pl PCR-reaksjon, bland 50 ng DNA (oligo eller plasmid), 4 pl dNTPs (2,5 mM av hver enkelt dNTP), 5 pl 10x reaksjonsbuffer, 1 pl 2,5 U / & #181; l DNA polymerase, 2 ul 10 uM forover primer, 2 ul 10 uM revers primer, og nuklease-fri vann.
    1. Drevet PCR-amplifikasjon i en termosykler ved bruk av følgende program. Trinn 1: en syklus på 95 ° C i 2 minutter; Trinn 2: 35 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek (AR) eller 60 sekunder (FL); Trinn 3: en syklus på 72 ° C i 10 min.
  4. Syntetisere biotinylerte RNA ved hjelp av en in vitro transkripsjon kit følge produsentens instruksjoner 11. I dette eksperimentet ved å bruke PCR-produkter som maler for RNA-syntese. For en 20 ul in vitro transkripsjonsreaksjon, bland 200 ng PCR-amplifisert DNA, 2 pl av hver enkelt NTP, 1 pl 10 mM biotin-CTP, 2 pl 10x reaksjonsbuffer og 2 ul T7 RNA polymerase. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 4 timer.
  5. Etter in vitro transkripsjon, behandler reaksjonsblandingen med en ul 2 U / mL DNase ved 37 & #176 C i 15 minutter for å nedbryte templat DNA. Til slutt fortynnes den biotinylerte RNA til et totalvolum på 60 ul for etterfølgende rensing.
  6. Rens biotinylerte RNA for å fjerne salter og kommunefritt nukleotider ved hjelp av rensing kolonner følge produsentens instruksjoner 12. Mål RNA konsentrasjon og oppbevares ved -80 ° C for påfølgende rullegardin analyser.
  7. For å sikre riktig sekundær struktur for RNA av interesse i RNA-proteininteraksjon, varme 50 ul biotinylert RNA (50 pM) ved 90 ° C i 2 min, chill på is i 2 minutter, og deretter forsyne med 50 pl 2x RNA struktur buffer (tabell 3), og tillate for RNA folding ved romtemperatur i 30 minutter 13,14.

2. Fremstilling av RNA-konjugerte perler

MERK: Bruk en magnetisk stativ for separasjon av magnetiske kuler og supernatant.

  1. Suspender streptavidin-belagte magnetiske kuler i originalt hetteglass med kort vortexing følge produsentens instruksjoner. Overfør 150 ul resuspenderes perler til et 1,5 ml rør. Plasser røret på magneten i 1 min. Kast supernatant. Hold perle pellet.
    MERK: I RNA rullegardin analyser, når alikvoteringsprosessen resuspendert perler fra originalemballasjen, må du bruke 50 mL perler for en analyse etterfulgt av western blotting, og 200 mL perler for en analyse etterfulgt av MS.
  2. Vask kulene gang ved å re-suspende vulst pellet med 1 ml av produsentens anbefalte 1x W & B (binding og vasking) buffer (tabell 3), etterfulgt av rotasjon av røret i 5 min ved værelsestemperatur i en rotator. Kast supernatant. Hold perle pellet.
  3. For å inaktivere RNase på perlene, vasker perler to ganger, hver gang ved å re-suspende vulst pellet med 400 ul buffer A. Buffer A er en alkalisk oppløsning inneholdende 0,1 M NaOH og 0,05 M NaCl (tabell 3). Rotere røret i 2 minutter ved romtemperatur i en rotator. Kast supernatant. Hold perle pellet.
    4. <li> For å fjerne NaOH fra perlene, vasker perler to ganger, hver gang ved å re-suspende vulst pellet med 400 pl buffer B (tabell 3), etterfulgt av rotasjon av røret i 2 minutter ved romtemperatur i en rotator. Kast supernatant. Hold perle pellet.
  4. Resuspender perle pellet med 300 mL 2x W & B buffer, split perler like og overføre inn i tre 1,5 ml rør (100 mikroliter perler per tube). Forsyne perle holdige rør med 100 mL RNase fritt vann, 100 pl biotinylert FL RNA og 100 pl biotinylert AR 3'UTR RNA, henholdsvis.
  5. Inkuber hver perle-blandingen i 1 time ved romtemperatur med rotasjon. Plasser rørene på magnet i 1 min. Kast all supernatant. Hold perle pellets.
  6. Vask kulene to ganger, hver gang ved å re-suspende hver perle pellet med 400 pl 1 x W & B-buffer, etterfulgt av roterende rør i 5 minutter ved romtemperatur i en rotator.
  7. Plasser rørene på magnet i 1 min. Kast all supernatant. Resuspender hver perle pellet med 50 ul atomisolasjonsbuffer (tabell 3).

3. Preadipocyte Isolering og adipogenesen Induksjon

  1. Som beskrevet i tidligere publikasjoner 5, dissekere preadipocytes fra interscapular brunt fett pad (C57BL6 villtype mus, 3 uker gamle).
  2. Vokse og in vitro skille preadipocytes 5. Cellene er klar for nedstrøms applikasjon 4-5 dager etter oppstart av differensiering.

4. Utarbeidelse av Cellular Lysate fra Primær Adipocytter

MERK: Sørg for at alle prosedyrer cellelysat forberedelser er gjort på is, og alle buffere er kjølt på is. Pre-kulden dounce glasshomogenisatorer på is.

  1. Vokse og differensiere preadipocytes i 15 cm retter 5 (se avsnitt 3.2). Hver tallerken gir tilstrekkelige celler for en RNA pull-down analysen. På dag 4 eller dag 5 av differensiering, kast cellekulturmedium, og vaske ceLLS gang med 1x PBS.
  2. For å høste celler, tilsett 10-15 ml 1 x PBS til cellene skrapes for å samle cellene i et 50 ml rør, og pellets celler ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten ved anvendelse av 1 ml pipette.
  3. Resuspender cellepelleten i 2 ml hypotonisk buffer (tabell 3), og inkubere cellene på is i 15 min. Overføre celler til en 15 ml Dounce-glasshomogenisator, og skjær celler mekanisk på is med 20 slag.
  4. Pellet cellekjerner ved sentrifugering ved 3300 xg i 15 min ved 4 ° C. Hold kjerner pellet på is for videre bruk (se pkt 4.6). Overfør supernatanten til 1,5 ml rør, tilsett 3M KCl til supernatanten for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 150 mM, og sentrifugering ved 20 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
  5. Etter sentrifugering, forsiktig fjerne lipidlayeron toppen ved hjelp av en ml pipette, og samle supernatanten som cytoplasma mobil lysat.
  6. Suspender kjerner pellet (se punkt 4.4) i 1 ml atom isolasjon buffer. Transfer atomkjerner til en 15 ml Dounce glass homogenisator bruker en ml pipette, og skjær kjerner mekanisk på is med 100 slag. Pellet kjernefysisk avfall ved sentrifugering ved 20 000 xg i 15 min ved 4 ° C, og samle supernatanten som den kjernefysiske cellulære lysatet.
  7. Enten kombinere de nukleære og cytoplasmiske cellulære lysatene, eller bruke hver fraksjon separat, for nedstrøms rullegardin søknad. I denne demonstrasjonen forsøk ble disse to fraksjoner av cellelysat kombinert i et volumforhold på 1: 1.
  8. Legg RNase inhibitor til denne ufraksjonerte cellelysat for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 U / pl. Sett til side 100 mL av celle lysat som input kontroll for western blotting 15.

5. Binding og Elution av RBP

  1. Delt cellelysat i tre like porsjoner (1 ml cellelysat i et 1,5 ml rør), og inkuber med blank, FL RNA-konjugert og AR 3'UTR RNA-konjugerte kuler (se avsnitt 2.8), respektivt, i 3 timer ved 4 ° Cmed rotasjon.
  2. Plasser rørene på magnet i 1 min. Samle supernatant ved anvendelse av en 1 ml-pipette, etterfulgt av RNA isolering fra supernatanten for å bekrefte at RNA integrality. Isolere RNA ved å anvende en syre guanidiniumtiocyanat-fenol-løsningen etter produsentens instruksjoner (tabell 2). Vurdere RNA intakt ved å analysere 28S og 18S subenheter av ribosomalt RNA. Hold perle pellets på is.
  3. Vask de magnetiske kuler seks ganger, hver gang ved resuspendering hver perle pellet med 1 ml atomisoleringsbuffer inneholdende 40 U RNase inhibitor og 0,25% IGEPAL, etterfulgt av å dreie rørene i 2 minutter ved romtemperatur i en rotator. Bruker et magnetisk stativ for separasjon av magnetiske kuler og supernatant. Kast all supernatant. Hold perle pellets på is.
  4. Bruk følgende fremgangsmåte for å eluere RNA-proteinkomplekser fra perler for western blotting. Først resuspender hver perle pellet i 75 mL atom isolasjon buffer; deretter, legger 25 mL 4x western blot lasting buffer (inneholdende SDS) for å oppnå et totalt volum på 100 ul. Til slutt koker perler i denne 100 ul oppløsning ved 95 ° C i 5 min.
    MERK: Bruk følgende trinn for å eluere RNA-proteinkomplekser fra perler for MS. Trinn 1: resuspender hver perle pellet i 100 ul elueringsbuffer (tabell 3); Trinn 2: inkuber kuleprøver i 2-3 timer ved romtemperatur med rotasjon; Trinn 3: sentrifuge og samle protein-inneholdende supernatant; Trinn 4: konsentrere proteinløsninger til 20-30 mL før innlevering for MS.
  5. Sentrifuger hver 100 ul av vulsten prøve ved 12.000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C, og samle supernatanten. Delmengde 15 mL supernatant for western blot analyse (se avsnitt 6.1 og 6.2). Probe den resulterende membran med fortynnet HUR mus monoklonalt antistoff (1: 1000 fortynning), over natten.

6. Western blotting for verifikasjon av RBP

  1. Separate RBPs av SDS-PAGE ved hjelp av standard teknikker.
  2. gjennomfører viakterblotting ved anvendelse av standard teknikker ved sentret for de RBPs forbundet med RNA av interesse.
    MERK: I denne demoen eksperiment ble Hur monoklonalt antistoff som brukes for immundeteksjon av HUR protein.
  3. Inkuber den resulterende membran med fortynnet Hur antistoff (1: 1000 fortynning) i 5% vekt / volum fettfri tørrmelk, 1 x TBS, 0,1% Tween - 20 ved 4 ° C med forsiktig risting, over natten. Vask membran tre ganger med 1x TBST. Inkuber membran med det sekundære antistoff (geite-anti-muse-IgG-HRP) ved romtemperatur i 1 time. Vask membran. Utvikle og ta opp signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne demoen eksperiment ble en AR RNA fragment brukt som agn for å fange sin bindende protein Hur. Både en FL RNA agn som er ikke-relevant for Hur protein, og en porsjon av konjugerte tomme streptavidin perler tjente som negative kontroller. RNA-protein interaksjoner kan skje enten i kjernen eller i cytoplasma, og denne rullegardin protokoll kan anvendes enten samlet eller fraksjonerte (nukleær eller cytoplasmatiske) cellelysater. Analyse av proteiner ved western blotting viser at prøven på 15 ul ufraksjonert cellelysat (se punkt 4.8), som ingen perle inngangskontroll, ga et positivt resultat, noe som indikerer at Hur protein er oppdaget i adipocyte lysat av mus primærkultur ved hjelp det monoklonale antistoff. AR RNA eluert fraksjon ga et positivt resultat, noe som indikerer at Hur protein er detektert i adipocytt-lysatet ved hjelp av AR RNA-konjugerte perler for den RNA-pull-down-analyse. Både FL RNA eluering fraksjonen og blank vulst prøven ga negative resultater, noe som indikerer at ikke-spesifikke interaksjoner mellom FL RNA-fragment og Hur protein, så vel som mellom de tomme perler og hur protein er ikke påvises ved denne RNA pull-down tilnærming. Resultatene fra disse to negative kontroller indikerer også at en spesifikk interaksjon mellom det AR RNA-fragment og Hur protein er vellykket detektert av RNA rullegardin protokoll beskrevet her.

Figur 1
Figur 1: Western Blot Verifikasjon av Hur fanget av RNA rullegardin Analyser Input: rekonstituert cellelysat (cytoplasma + atom lysat);. Perler: prøven fra tomme streptavidin-belagte magnetiske perler; FL RNA: streptavidin perler bundet med FL mRNA; AR 3'UTR RNA: streptavidin perler bundet med AR 3'UTR mRNA; Primære antistoff: Hur muse-monoklonalt antistoff; Sekundært antistoff: geit anti-mouse IgG-HRP; Forkortelse, FL: ildflue luciferase, AR: androgen reseptor; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

sentrifuger
termosykler
spektrofotometer
Rotator
Protein-gel-elektroforese og blotting anordningen
Magnet

Tabell 1: Major Utstyr brukt i denne studien viktigste utstyret som brukes i denne studien..

In vitro transkripsjon kit
Biotinylated RNA
Spin-kolonne for utvinning av DNA- og RNA-fragmenter
Streptavidin magnetiske kuler
Hur monoklonalt antistoff
Geit-anti-mus-IgG-HRP
Nukleasefritt molekylærbiologi grade vann
Fosfatbuffer saltvann
RNase inhibitor
proteasehemmer
PFU DNA polymerase
Acid guanidiumtiocyanat-fenol løsning

Tabell 2: Store reagenser brukt i denne studien Store reagenser som brukes i denne studien..

<tr>
2x RNA struktur buffer
20 mM Tris-HCl (pH 7,4)
0,2 M KCl
20 mM MgCl2
2 mM DTT
0,8 U / mL RNase inhibitor
buffer A
0,1 M NaOH
0,05 M NaCl
buffer B
0,1 M NaCl
1x W & B (Binding og vask) buffer
5 mM Tris-HCl (pH 7,4)
1 M NaCl
1x Hypoton buffer
10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
10 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM DTT
1 mM PMSF
1x proteasehemmer
1x Nuclear isolasjon buffer
25 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM DTT
0,5% IGEPAL (eller 0,25% IGEPAL for eluering av RBPs)
1 mM PMSF
1x proteasehemmer
0,4 U / pl RNase-inhibitor (eller 40 U / ml RNase inhibitor for eluering av RBPs)
1x elusjonsbuffer
2 mM biotin i 1x PBS

. Tabell 3: Store Solutions brukt i denne studien 2x RNA struktur buffer (se avsnitt 1.7); Buffer A (se avsnitt 2.3); Buffer B (se punkt 2.4); 1x W & B (Binding og vask) buffer (se avsnitt 2.2, 2.5, 2.7); 1x Hypoton buffer (se avsnitt 4.3); 1x Nuclear isolasjon buffer (se pkt 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x elueringsbuffer (se MERK følgende avsnitt 5.4).

lways "> Mal og primere sekvenser T7-AR-oligo 5'TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT TCT CTT TCT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3 ' T7-AR-F 5'CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 ' T7-AR-R 5'AGA CTG CCA CGG TCA TAA GC -3 ' hluc (+) - T7-sonde-F 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 ' hluc (+) - sonde-R 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 '

Tabell 4: Sekvenser av Mal og primere for PCR Amplification T7-AR-oligo. DNA mal for PCR forsterkning (se kapittel 1.1); T7-AR-F: fremover primer for PCR forsterkning (se avsnitt 1.1); T7-AR-R: reverse primer for PCR forsterkning (se avsnitt 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: fremover primer for PCR forsterkning (se avsnitt 1.2); hluc (+) - probe-R: reverse primer for PCR forsterkning (se avsnitt 1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs og RBPs har viktige roller i helse og sykdom, men de molekylære mekanismene for disse molekylene er dårlig forstått. Identifisering av proteiner som samhandler med lncRNA molekyler er et viktig skritt mot å belyse de reguleringsmekanismer. Anrikning av RBPs av RNA pull-down analysesystem er basert på in-oppløsning fangst til å samvirke komplekset slik at proteiner fra et cellelysat selektivt kan ekstraheres ved bruk av biotinylerte RNA agn som er bundet til streptavidin magnetiske kuler. Flere andre metoder som kvitre, diagram og RAP kan oppnå samme mål, men disse metodene tar flere forsøk på å sette opp enn RNA rullegardin teknikk 16,17,18.

Den største styrken av RNA pull-down er at det er relativt en enkel protokoll og lett å utføre. Både CHIRP og RAP bære en tverrbindings skritt som bevarer naturlig forekommende RNA-proteinkomplekser og utforming av et komplett sett med antisense oligonukleotider (90 nucleotides lenge i RAP, og 20 nukleotider lang i kvitre) flislegging hele målet RNA 16,17,18. RNA folding er et kritisk trinn i RNA-pull-down-analyser. Den viktigste begrensning av denne protokollen er at mål RNA syntetiseres in vitro, og kan ikke være riktig foldet til egen struktur for å tillate riktig binding med sin RBP (e). Misfoldede ikke-innfødte RNA kan enten ikke klarer å danne RNA-protein interaksjoner og ugyldig funksjonelle analyser, eller skjema interaksjoner som bare oppstår i vitro henhold nonphysiological forhold. Selv om rullegardin protokollen beskrevet her vedtatt en velkjent prosedyre for RNA folding 13,14 (se avsnitt 1.7), det garanterer ikke riktig folding for andre RNA transkripsjoner.

RNA pull-down er ofte kombinert med RIP som en komplementær måte for å påvise RNA (e) bundet av RBP av interesse 19. Et annet kritisk punkt i denne protokollen er fjerning av lipid fraksjon fra total cellelysat (se avsnitt 4.5) fordi den høye lipid overflod i modne adipocytter presenterer en stor teknisk utfordring. Protokollen er beskrevet her er spesielt utviklet for bruk med adipocytter. Imidlertid kan de grunnleggende komponenter i denne protokollen og nivåene av alle bufferne som ble anvendt endres og tilpasses for anvendelse til andre cellekulturmodeller. For vev som har høye nivåer av endogen RNase kan forskjellige RNA-pull-down-protokoller anvendes.

RNA rullegardin, som bruker RNA av interesse for å identifisere de tilknyttede RBPs, er en effektiv teknikk for å undersøke de viktige funksjoner og mekanismer for lncRNAs, som har et bredt spekter av roller i humane celler. Fremtidig utvikling av RNA-baserte fangst, inkludert RNA pull-ned, vil være nødvendig for å løse utfordringene med å definere komponenter, montering og funksjon av RNA-proteinkomplekser, samt generere tilstrekkelige RBPs fra lave rikelig RNA-proteinkomplekser for MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Singapore NRF fellesskap (NRF-2011NRF-NRFF001-025) samt CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

Molecular Biology RNA pull-down RNA-bindende protein fettceller noncoding koding

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Påvisning av RNA-bindende proteiner etter<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down i adipocyte Culture
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter