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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由 Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

调查细菌病原体和宿主之间的相互作用是生物学研究的一个重要领域。在这里，我们描述了必要的技术测量使用布拉姆基板的siRNA的基因沉默过程中贝氏柯克斯体效应易位。

Abstract

贝氏柯克斯体 ，Q热的病原体，是一种细胞内病原体依赖于IV型点/ ICM分泌系统建立一个复制的利基。效应的队列，通过该系统转移进入宿主细胞来操纵主机进程和允许建立用于复制一个独特溶酶体衍生的液泡的。这里提出的方法涉及的两个成熟的技术相结合：使用的siRNA特异性基因沉默和使用依赖于β内酰胺酶活性的基于FRET的衬底效应易位测定。运用这两种方法，我们可以开始了解宿主因素在细菌分泌系统的功能和效应易位的作用。在此研究中，我们检查RAB5A和Rab7A，无论是内吞贩卖通路的重要调节器的作用。我们表明，沉默在效应translocatio下降或者蛋白质结果的表达氮效率。这些方法可以很容易地修改，以研究其他细胞内外的病原体也利用分泌系统。以这种方式，所涉及的细菌效应易位宿主因子的全局图像可以显现出来。

Introduction

贝氏柯克斯体是一种独特的细胞内病原体引起人畜共患的人类感染Q热。此疾病与延伸从无症状的血清转化到威胁生命的慢性感染，往往表现为心内膜炎年曝光1后临床 ​​表现的广谱相关联。人类感染主要通过与反刍动物感染的主要储存器，特别是奶牛，绵羊和山羊污染气溶胶的吸入发生。虽然感染贝氏在这些动物通常是亚临床型，感染可能引发流产和分娩流体和胎盘中的相当细菌量会污染当地环境1。巨大的负担，这种污染的一个例子可能对公共健康和农业产业化中的Q热疫情发生在荷兰2最近观察。 2007年之间，2010年，Q热4000人感染病例被确诊，这爆发挂山羊养殖场3显著污染。另外， 贝氏是潜在的生物武器，如划分由美国疾病控制和预防中，由于细菌的和必要的低感染剂量的环境稳定性造成严重的发病率和死亡率4。

贝氏存在于两个阶段：第一阶段的生物体，从天然来源分离的，是非常强毒和II期生物体在体内高度衰减。例如，在贝氏柯克斯体九里期生物体几个体外通路，制作了第二阶段的细菌包含一个不可逆转的染色体缺失导致截短的脂多糖（LPS）5。本品系，C. burnetii NMII，是表型上类似的I期的组织培养模型，并提供一个更安全的模式l对于研究人员研究实验室5发病贝氏 。近年来几个突破进展迅速贝氏遗传学领域。最值得注意的是，无菌媒体的发展（酸化柠檬酸半胱氨酸介质- ACCM-2）已经允许贝氏的无细胞生长在液体和固体培养基上6,7。这导致了包括可诱导的基因表达系统，穿梭载体和随机转座子系统8-11可贝氏遗传工具直接改进。最近，两种方法靶向的基因的失活也已经开发铺平用于检查特定毒力基因的候选12的方式。

肺泡巨噬细胞以下内化， 贝氏复制到高号码的膜-结合的隔室中称为含液泡（CCV）的Coxiella-。该CCV需要主机内吞贩运日粗糙的早期和晚期内涵体，直到成熟为溶酶体衍生的细胞器13。在这整个过程中，CCV获得，要么出现瞬时或保持与液泡相关联，包括但不限于，Rab5的，RAB7，CD63和LAMP-1月13日至15日宿主因素。在宿主细胞内的贝氏复制完全依赖于一个全功能点/ ICM型IVB分泌系统（T4SS）8,16,17。此分泌系统是祖先相关的共轭系统多蛋白质结构和跨越细菌和液泡膜提供细菌蛋白，称为效应，到宿主细胞质18。在贝氏 T4SS在功能上非常相似的特点以及IVB型点/ ICM分泌嗜肺军团菌 19,20制度。有趣的是，不会发生T4SS和随后的效应易位激活直到贝氏达到酸性溶酶体衍生细胞器，大约8小时后感染17,21。迄今为止，已有超过130点/ ICM效应已经确定9,17,22-24。许多这些效应的宿主细胞内的贝氏在复制过程中可能发挥重要作用;然而，只有少数的效应已在功能上表征25-29。

在这项研究中，我们利用依赖于通过在宿主细胞的细胞质内的β内酰胺酶的活性的CCF2-AM FRET底物（以下简称为BLAM基板）（ 图1）的裂解的基于荧光易位测定。感兴趣的基因融合到TEM-1上的报道质粒，提供组成型表达β内酰胺酶（BLAM）。的BLAM基板由两种荧光团（香豆素和荧光素），该形成FRET对。在荧光素和在不存在效应易位绿色荧光发射的FRET香豆素结果的激励;然而，如果该布拉M-效应融合蛋白易位到宿主胞质，所得β内酰胺酶活性裂解BLAM基板的β内酰胺环，分离FRET对生产下列激发的蓝色荧光发射。这种易位试验得到了证明作为一种方法，从各种不同的细胞内外的细菌，其中包括C.确定的效应蛋白burnetii，L.肺 ，L. longbeachae， 沙眼衣原体 ，肠致病性大肠杆菌 ， 沙门氏菌和布鲁氏菌 17,30-35。

为了确定对效应贝氏易位主机特定因素的作用下，我们采用了称为RNA干扰基因沉默一套行之有效的方法，特别是小干扰RNA（siRNA）。原本在秀丽隐杆线虫鉴定，RNA干扰是用于先天防卫厅一个保守的内源性细胞过程对病毒NSE以及基因调节36,37。序列特异性的siRNA结合后，mRNA的降解通过RISC发生（RNA诱导的沉默复合物），导致特异性基因沉默或击倒38。在这项研究中，将siRNA用于靶向两个主机的蛋白质，RAB5A和Rab7A，这是内吞途径的重要调节剂。沉默的效应易位RAB5A和Rab7A的影响是用C.确定burnetii pBlaM-CBU0077。 CBU0077被选定为它以前被证明由17 贝氏的点/ ICM分泌系统易位。

同时利用siRNA的基因沉默和这里所描述的fluorescencebased易位检测，我们开始建立的效应蛋白通过在贝氏的易位宿主因素的作用。这种方法可以适用于宽范围的具有类似secretio细胞内和细胞外的细菌N个系统负责效应蛋白的易位。

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Protocol

注：所有涉及贝氏柯克斯体 RSA439 NMII的生长或操作过程应在物理遏制二级实验室，并在遵守当地指南的生物安全柜中进行。下面描述的反向转染和易位试验工作流程的示意图示于图2。

1. C.制备burnetii文化表达CBU0077融合到β-内酰胺酶（pBlaM-CBU0077）（第1天）

  1. 准备1X ACCM-2 6：
    1. 结合表1中列出的组分。调整用6M的NaOH pH至4.75和过滤消毒（不高压灭菌）。 ACCM-2是稳定储存在4℃下约三个星期。
  2. C.生成burnetii pBlaM-CBU0077股票。
    1. 感染的HeLa细胞229与C. burnetii株携带pBlaM-CBU0077和通道，直到大vacuolES是在大多数细胞观察。
      1. 成长C. burnetii应变在5％CO 2，2.5％O 2的携带pBlaM-CBU0077在20ml ACCM-2含3微克/ ml氯霉素与7天排气帽的75cm 2的组织培养瓶中，在37℃。
      2. 离心机C. burnetii pBlaM-CBU0077培养以15,000×g下在室温下15分钟。
      3. 重悬在20毫升的DMEM + 10％胎牛血清（FCS）+3微克/毫升氯霉素（维持培养基）的颗粒。从50％汇合75cm 2的烧瓶的HeLa细胞229的取出介质。加入重悬C. burnetii到海拉细胞229。孵育2天，在37℃在5％CO 2，以允许的HeLa 229细胞的感染来建立。
      4. 单元格拆分为175厘米2组织培养瓶。
        1. 从75cm 2的烧瓶中除去介质和用10毫升的预温热的PBS洗单层两次。
        2. 加入1毫升邻˚F0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液，并发生细胞在37℃+ 5％CO 2的3 - 5分钟以分离细胞。
        3. 重悬的细胞在10ml维持培养基的。加2ml重悬细胞到含38毫升维持培养基的175 cm 2的烧瓶中。
        4. 孵育在37℃下在5％CO 2再3 - 5天，直到达到100％汇合和大液泡观察。
    2. 收集从175 平方厘米烧瓶上清液，加入10 mL的dh 2 O以覆盖感染的HeLa 229细胞孵育15分钟，以裂解感染的细胞。
    3. 结合的上清液和溶解的细胞和沉淀，15,000×g下在室温下15分钟。
    4. 重悬在10毫升卫生署2 O.颗粒裂解细胞进一步通过反复经过重新悬浮，通过附连到10ml的注射器的至少20倍23G针。粒料在500×g下5分钟以除去细胞碎片。
      5. <李>删除和沉淀上清液15,000× 克在室温下15分钟，收集C. burnetii。
    5. 重新暂停C. burnetii在DMEM + 10％FCS和量化细菌作为每4的数。稀释使用DMEM + 10％FCS + 10％二甲亚砜（DMSO）中，分装50μl的股成微量离心管并储存于-80℃1×10 9的基因组/毫升。
  3. 接种10毫升预热ACCM-2含3微克/ ml氯霉素的20微升℃。 burnetii pBlaM-CBU0077 17株（从保存在-80℃下1.2生成库存量）与排气帽的25cm 2组织培养瓶。生长细菌培养7天，在37℃在5％CO 2，2.5％ 的 O 2。

2的siRNA的反向转和HeLa的播种229细胞（第4天）

  1. 当使用试验的siRNA首次准备所述siRNA如下：
    1. 短暂离心冻干的siRNA，以确保该siRNA沉淀在试管底部收集。
    2. 吹打1倍的siRNA缓冲液（ 表2）的适当体积再悬浮沉淀的siRNA至最终储存浓度为20μM。
    3. 吸取的溶液上下3 - 5次在RT在轨道混合器混合并进行30分钟，颠倒试管每5 - 10分钟。
    4. 短暂离心所述管，以确保该siRNA是在管的底部收集。
    5. 分装siRNA导入在微量离心管中并储存50微升等分在-20℃下直到需要。
    6. 要产生1μM工作的siRNA浓度，吸管950微升1X的siRNA缓冲到50微升等份的股票（20μM）必要时。注：此1μM工作浓度可冻融多次重复转染。
  2. 放置DMEM + 10％FCS，0.05％胰蛋白酶-EDTA和PBS在37℃水浴（或等同物）30分钟，以在使用前预热。
  3. 染组分的制备：
    注意：以下协议已经在黑壁平底，透明底96孔微孔板为海拉优化229细胞。转染试剂的量最优化，细胞接种的siRNA浓度和密度可能有必要对不同的细胞系。
    1. 对于每个孔，使用0.1微升转染试剂，15.9微升减少血清培养基（用于转染最小基本介质，请参阅材料表 ）和4微升1μM的siRNA（导致40纳米的最终的siRNA浓度）。使用OTP，PLK1，RAB5A和Rab7A独立的离心管。衡量一式三份每个检测条件。一个96孔板布局的一个例子示于图3。
      注：此协议包括使用两个控件：OTP和PLK1。 OTP是已经优化，减少脱靶效应，从而OTP用作负，非瞄准控制四台汇集的siRNA组成。加扰的siRNA也可以用作阴性对照。通过诱导促凋亡途径，因此，PLK1的siRNA被用作用于转染，其中细胞死亡关联到转染效率的阳性对照在广泛的细胞死亡，PLK1的表达的结果在许多细胞系中的损失。
      1. 每个实验的siRNA转染，在个体中离心管结合0.4微升转染试剂和63.6微升减少血清培养基。涡所有离心管并允许组件复为室温下5分钟。
      2. 16μl每个实验的siRNA添加到含有转染复合物的相应离心管。涡孵育在室温下20分钟。注意：不超过30分钟，这是重要的，因为转染效率将降低。
  4. 在20分钟INCubation（2.3.1.2）添加转染试剂的20微升+降低血清培养基+混合的siRNA进入无菌黑色，扁平透明底96孔盘的适当的孔。
  5. 只要20分钟孵育期结束后，种子的HeLa 229细胞以3.92×10 3细胞/孔的密度。
    1. 收获的HeLa从汇合或亚汇合75cm 2的组织培养瓶229细胞在预热DMEM + 10％FCS和重新悬浮细胞以4.9×10 4细胞/ ml的根据标准方法的最终密度。为了确保转染效率不受损害，在20分钟的潜伏期（2.3.1.2）准备细胞。
      1. 用10毫升的预温热的PBS洗涤HeLa细胞的单层229细胞两次。
      2. 加入1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液和地点的HeLa 229细胞，在37℃+ 5％CO 2的3 - 5分钟以分离细胞。
      3. 收集细胞的9ml预热DMEM + 10％的FC的S.计数使用血球细胞和制备细胞使用DMEM + 10％FCS的4.9×10 4细胞/ ml的终密度。
    2. 吸移管80微升的HeLa 229细胞以4.9×10 4细胞/ ml的密度到包含转染试剂+还原血清培养基+的siRNA混合各孔中。这对应于3.92×10 3个细胞的细胞密度/孔。
      注：需要为布拉姆衬底背景减法。
      1. 不要添加细胞或siRNA以“空白”井（ 图3）。相反，添加80μl的DMEM + 10％FCS中的这些孔中，一式三份建立。
    3. 在37℃+ 5％CO 2孵育24小时。

3.更改媒体（第五天）

  1. 24小时后，取出使用连接到一个真空源或手动用多通道移液器多信道适配器介质，并用100微升新鲜prewarm的替换编DMEM + 10％FCS中。
  2. 在37℃+ 5％CO 2孵育另外48小时。
  3. 在这一点上，检查细胞的存活率视觉上使用标准的光学显微镜。如果反向转染已经成功，显著细胞死亡将在含有PLK1 siRNA的孔观察相比OTP的siRNA。

使用qPCR 4. 贝氏柯克斯体 pBlaM-CBU0077应变的定量（第7天）

  1. 后在5％CO 2，2.5％O 2（1.3），离心机10毫升C. 7天37℃生长在ACCM-2的burnetii pBlaM-CBU0077培养以15,000×g下在室温下15分钟。
  2. 重悬在10ml预热的DMEM + 10％FCS中的细菌沉淀。准备1:10 1：100稀释使用DH 2 O.文化（样品）
  3. 建立起来用于定量PCR所需的组件。
    注意：可以提前执行的gDNA提取并储存在-20℃下UNT金正日要求。
    1. 标准的准备工作：
      1. 从在5％CO 2，2.5％ 的 O 2中ACCM-2在37℃下生长使用7天的gDNA提取试剂盒，按照制造商的说明贝氏柯克斯体 RSA439 NMII野生型菌株中提取基因组DNA。
      2. 测量在260吸光度使用NanoDrop（或同等学历）的基因组DNA浓度（g /微升）。
      3. 计算基因组拷贝的数目每微升使用以下以下公式，并转换为的基因组/毫升数。
        方程
      4. 在使用DH 2 O一个新的离心管调节的基因组/毫升数到10 9 /毫升（在100μl的最终体积）这可煮10分钟，直到需要在-20℃下储存。
      5. 在感染当天，生成10倍连续的10 8个基因组/毫升至10 5基因组/毫升，从10 9基因组稀释液S / ml的股票。
        1. 移取10微升9基因组/毫升到90微升的dh 2 O的生成10 8基因组/毫升。旋涡混合。移取10微升10 8基因组/毫升到90微升的dh 2 O的生成10 7基因组/毫升。涡和重复，直到10 5基因组/毫升。
    2. 建立qPCR实验。创建一个主结构25井占到任何移液误差。对于每个孔，使用10微升的qPCR预混; 2微升的ompA引物混合物（4.3.2.2）和3微升的dh 2 O的
      注意：外膜蛋白A是C的外膜蛋白burnetii'39和一个高度保守的区域内的82个碱基对部分被选择为用作探针如前面40所描述。
      1. 设置每个标准（DH 2 O，10 5，10 6，10 7，10 8，10 9基因组/毫升）和样品（1：10和1：100稀释）在96孔PCR分别撕离板（非裙）一式两份或一式三份。加入5微升样品或标准的到适当的孔中。
      2. 使用DH 2 O稀释两者的ompA正向引物（5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3'）和OMPA反向引物（5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3'），以4μM的终浓度和结合到相同的离心管。
        注意： 的ompA引物混合物可以预先制备并且直到需要在-20℃下储存。
      3. 结合250微升定量PCR预混液，50微升的ompA引物混合，75微升卫生署2 O和旋涡混匀。加入15微升该预混含有任何标准或样品井。
      4. 放置8盖的PCR条帽到PCR管，以确保所有被收集在管底部的适当的孔中和脉冲离心机。
      5. 设置以下程序的定量PCR马折角：50℃2分钟，95℃进行10分钟，接着为1秒45个循环的95℃和60℃20秒（ 图4A）。
    3. 分析从定量PCR的Ct（周期阈）值：
      1. 转移Ct值使用该程序的导出功能的电子表格。
      2. 通过对109基 ​​因组/毫升（表示为log值）创建标准105基因组/ ml的散点图。丢弃三份样品之间的任何明显的异常值。产生的对数的趋势线，并确定该图的方程。
      3. 通过使用在4.3.3.2所产生的方程计算样品中的基因组/毫升的总数。不要忘了占初始稀释：样品（1:10和1 100）。

5.逆向感染转染细胞（第7天）

  1. 在C.计算总基因组/毫升后柏迪用于感染netii pBlaM-CBU0077培养，调整再悬浮细菌培养在300 MOI在50μl/孔用预热的DMEM + 10％FCS的终体积来感染细胞。
    注意：种子的HeLa 229细胞与后72小时的正常倍增时间的预期密度是3.136×10 4个细胞/孔。在300 MOI感染所需的细菌的量为9.408×10 6在50μl，相当于1.88×10 8细菌/毫升。
    1. 使用从定量PCR（基因组/毫升）计算值（4.3.3.3）的值，使用预热的DMEM + 10％FCS中以2毫升的最终体积来感染反向转染的细胞稀释再悬浮细菌。
  2. 从空白删除现有的媒体和反向转染的细胞。
  3. 加入50μl的稀释细菌（1.88×10 8细菌/毫升）到适当的孔中。加入50微升DMEM + 10％FCS的这两个空白和uninfected井。
  4. 在37℃+ 5％CO 2孵育24小时。

6.增加布拉姆底物确定易位的水平（第8天）

  1. 准备用于BLAM基板6倍加载溶液的解决方案。
    注：溶液A，B和C的布拉姆底物试剂盒（请参阅材料表 ）中提供。溶液B可以形成在RT沉淀。温热此溶液至37℃，使用前将沉淀应该溶解。
    1. 当使用第一次的试剂盒，添加DMSO中185微升（与BLAM底物试剂盒提供）到干燥的溶液A.接着，存储所述再悬浮溶液A在-20℃。
    2. 在-20准备在1毫升等分提前和存储0.1M的丙磺舒解决方案°C，直到需要。
      1. 准备0.4 M氢氧化钠（100毫升卫生署2 O1.6克）。
      2. 制备的100mM磷酸钠缓冲液pH 8（1.56克的NaH 2 PO 4 .2H 2 HPO 4在100毫升卫生署2 O）。
      3. 溶解1.25克丙磺舒的在22ml的0.4M的NaOH剧烈搅拌。
      4. 加22毫升100mM的磷酸钠缓冲液pH 8（溶液会变成混浊）并搅拌以溶解沉淀物形成。
      5. 调节pH至8（如果需要）使用1M的NaOH / HCl中。
      6. 剧烈搅拌和轻度发热（<50℃），直到解决方案主要是明确的。
      7. 过滤器（孔径0.2μm），并等分试样在1毫升体积。商店等分于-20℃。
  2. 对于每个孔，使用0.06微升解决方案A，0.54微升B溶液，7.9微升C液和1.5微升0.1M的丙磺舒。首先在离心管相结合的解决方案A的1.8微升和16.2微升溶液B一起创建了30口井的主结构。拌匀，用旋涡。加入C液237微升和45微升0.1M的丙磺舒的。涡所有组合的直流电阻TS。
    注意：6×加载溶液是稳定长达4小时（在黑暗中），但应尽可能接近在使用前制备。
  3. 加10μl的6倍样溶液直接进入所有的空白和反向转染井而不删除现有的媒体。
  4. 孵育在室温在板在黑暗中2小时。
  5. 为了确定易位的水平，用酶标仪量化荧光的量。
    注：以下步骤是特定于ClarioSTAR酶标仪。等效酶标仪也可以使用。
    1. 创建使用端点读数模式新的荧光强度的协议。
    2. 调整基本参数如下：
      1. 选择96孔微量。
      2. 在光学设置中，选择2 multichromatics具有以下用户定义的设置：（1）输入410-10纳米激发和520-10 nm发射。 （2）输入410-10 nm激发和450-10 nm发射。保证良好MULTichromatics被选中。
      3. 选择具有直径为3毫米的轨道平均。
      4. 在光纤中，选择底部光学元件。
      5. 在速度和精度，选择精确。这对应于每孔八个区域。
    3. 通过选择适当的孔中作为样本调整板布局。
    4. 选择开始测量。
    5. 拆下盖板，将托盘放入酶标仪。避免达到最大荧光值，确保增益值被调整。要做到这一点，就已经与OTP的siRNA被反向转染感染井之一进行增益调整。这对应于最高预期易位。
    6. 选择开始测量，测量使用荧光底所有适当的井在410纳米的激发和发射都450 nm和蓝色和绿色荧光520纳米，分别。

7.结果分析：

  1. 计算比例的450纳米至520纳米（蓝绿色），对所有的样品下列空白减少，并表示相对于未感染的OTP样品。
    注意：提供一个简单的电子表格程序下面的分析步骤。
    1. 在酶标仪使用导出函数，转移为520纳米和450纳米的发射波长（6.5）到电子表格中获得的原始荧光值。
    2. 通过将原料520纳米的荧光值并通过井的数量除以计算“空白”读数（媒体只，无细胞）为520纳米波长的平均值（3）。重复使用空白450nm的波长的值。这些值表示背景荧光，由于96孔板和介质。
    3. 减去背景荧光。利用在7.1.2中获得的值从所有样品520nm处的荧光值中减去空白520纳米波长的平均值。重复的450纳米波长值。
    4. 要获得450：520纳米比使用空白修正值（7.1.3）。除以其对应的520纳米值每个样品450纳米荧光值。
    5. （从7.1.4）520纳米比率值和通过孔（3）的数量除以：通过添加450计算未感染的OTP比率值的平均值。
    6. 通过平均在7.1.5计算出的未感染的OTP比值在7.1.4计算520nm处比：通过将450计算相对于未感染的OTP样品的比例。

8.增加核染色的易位检测后确定细胞数（第8天）

  1. 以下荧光的定量，取出含有使用连接到一个真空源或手动用多通道移液器多信道适配器所有孔中任一6×加载溶液介质。
  2. 加入50微升4％PFA（多聚甲醛）解决方案在PBS所有适当的水井修复细胞。孵育在室温20分钟。
  3. 除去4％PFA的PBS溶液（按照8.1）中，用75微升的PBS洗涤细胞两次。
  4. 加入50μl的细胞可渗透核染色，例如DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基），每个孔中。获取图像用荧光显微镜和量化使用适当的图像分析软件，如ImageJ的41存在于每个细胞核siRNA处理后井的数量。

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Representative Results

对于这项研究中，C.被选定burnetii pBlaM-CBU0077菌株作为CBU0077先前已经证明是贝氏点/ ICM分泌系统17的易位效应。在感染前，的基因组/毫升在七天C.总数burnetii pBlaM-CBU0077培养，使用qPCR列举。 图4展示了循环阈值的一个例子来自标准和样品定量PCR如下预期（CT）的值。如在4.3.3中描述的Ct值（在扩增曲线（ 图4B）和数字（ 图4C）以图形方式表示）分别出口和分析。根据示出的有代表性的数据，有在10毫升重悬浮细菌培养物（ 图4D）2.31×10 8的基因组/毫升。产生适当的细菌稀释液（1.88×10 8的基因组/毫升我N 2毫升）中，1.63毫升再悬浮细菌加到370微升新鲜，预热的DMEM + 10％FCS中的。细胞转染反向用siRNA随后感染了C. burnetii pBlaM-CBU0077在300 24小时的MOI。

反向的孵育后可以使用荧光板读数器来测定转染感染的细胞与效应易位BLAM衬底定量。按照如在7所述的分析中，已经标准化为未感染的OTP所有比的值也可以被归一化到受感染的OTP。效应易位的宿主基因沉默后的水平可以比较受感染的OTP控制后可分为三种结果：（1）没有变化; （2）增加的效应易位; （3）降低的效应易位。随后的统计分析，例如，学生t检验，可用于确定任何观察到差t的意义Ø感染OTP控制。沉默要么RAB5A或Rab7A来自三个独立实验的效应易位的结果示于图5A。在布拉姆- CBU0077易位的A级显著相比减少OTP控制（p值= 0.0088（RAB5A）和p值= 0.0059（Rab7A），配对，学生t检验）都RAB5A和Rab7A沉默期间发生。 siRNA处理的细胞存活率的影响也被建立。以下易位测定，将细胞固定，用核染色剂染色并随后定量。 如图5C所示 ，虽然与在细胞活力的降低相比OTP控制（12％和31％，分别地）或者RAB5A或Rab7A结果处理，这种减少是不作为PLK1（97％），基因已知为严重以引起细胞死亡（p值= 0.0102（RAB5A）; p值= 0.0081（Rab7A）; p值<0.0001（PLK1），配对，学生t-检验）。这些结果表明主机如何GE沉默使用的siRNA未列名会负面改变细菌效应易位的水平。

图1
图 1. 布拉姆底物作用机理期间感染。C. burnetii由宿主细胞内化，形成溶酶体衍生液泡称为含贝氏液泡。 24小时后感染，将细胞加载有具有两种荧光团形成FRET对（A）在没有β内酰胺酶即没有BLAM-CBU0077效应的易位，在香豆素的激励膜可渗透BLAM基板410nm的结果在FRET荧光素，观察为绿色荧光信号（520纳米）（B）中，在功能性点/ ICM分泌系统的情况下，将BLAM-CBU0077融合蛋白将被转移进入宿主细胞，将CL檐的BLAM基板，通过β内酰胺酶的活性，从 ​​而导致两种染料的分离和导致FRET中断和在410nm（C）的激发后蓝色荧光信号（450纳米）。无论是绿色和蓝色荧光信号可以是使用荧光酶标仪检测。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图 2. 反向转染和易位检测工作流程的示意图 1天：准备C. burnetii pBlaM-CBU0077培养4天：使用40纳米siRNA和种子的HeLa 229细胞以3.92×10 3个细胞的最终密度/孔的96孔托盘反向转染5天：通道安格媒体7日：量化总基因组/毫升的C.文化使用qPCR，随后感染反向转染的细胞用8天 300的MOI burnetii pBlaM-CBU0077：添加6X样染料，荧光测量和量化手机号码，请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图 3. 96孔板布局用于建立反向转染和HeLa 229细胞接种。“空白”井（显示为红色）只包含媒体，不需要加任何siRNA或海拉细胞229的。在OTP的siRNA（浅蓝色为未感染的孔中，并为受感染的井深蓝示出）被用来作为非靶向对照，因为它已被优化，以有较少的脱靶效应。栗色和绿色井分别代表RAB5A和Rab7A的siRNA。 PLK1的siRNA（以黄色显示）作为转染效率的措施，因为PLK1表达的缺失诱导促凋亡途径和广泛的细胞死亡的绝大多数细胞系。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.代表的qPCR CT值用于定量的C.基因组/毫升总数burnetii pBlaM-CBU0077文化。（A）在定量PCR用于枚举文化贝氏的基因组/毫升数的循环条件。为标准品和样品的Ct值在图形（B）和数值（C）表示格式（D）标准的Ct值的平均值，作图并计算对数趋势线。使用方程和样品的平均值CT值在C.基因组/毫升的总数burnetii pBlaM-CBU0077文化被确定为2.31×10 8。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5. RAB5A的siRNA沉默和Rab7A。海拉细胞229 在点/ ICM效应布拉姆- CBU0077的易位与特定的siRNA RAB5A（栗色条），Rab7A（绿柱线），OTP（蓝色条）或PLK1进行反向转（黄色条）并温育72小时的感染与C.前burnetii pBlaM-CBU0077应变300 24小时的MOI。 to后他加入BLAM衬底，荧光用酶标仪测定（A）中的表说明从一个实验450一起获得的原始荧光值：520纳米相对于未感染的OTP控制比的空白值的减法之后（媒体只，无细胞）。易位（B）和细胞活力（C）的水平表示为百分比平均值±标准相对于OTP反向转染的病毒感染的细胞偏差来自三个独立的实验。 * p值<0.05; ** p值<0.01; **** p值<0.0001（配对，学生t-检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。

零件 浓度
柠檬酸 13.4毫米
柠檬酸钠 16.1毫米
磷酸钾 3.67毫米
氯化镁 1毫米
氯化钙 0.02毫米
硫酸铁 0.01毫米
氯化钠 125.4毫米
L-半胱氨酸 1.5毫米
蛋白胨 0.1克/ L的
酪蛋白氨基酸 2.5g / L的
的甲基-β-环糊精 1g / L的
RPMI 125毫升/ L的

表1. 组件所需制作1X ACCM-2。

表2. 1X siRNA的缓冲量所需的保湿冻干的siRNA至适当浓度。

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Discussion

分泌系统，以及细菌效应蛋白这些系统输送到宿主细胞的细胞质中，是许多致病性细菌利用独特复制壁龛内建立的感染的重要毒力的组成部分。许多研究小组的重点是研究细菌效应和宿主蛋白和宿主细胞通路的影响，这些效应都之间的相互作用。非常有限的研究，如果有的话，已研究了宿主蛋白是必要成功细菌效应易位的潜力。

在这项研究中，我们使用了专，细胞内病原体贝氏柯克斯体 ，人畜共患Q热的病原体。进入宿主细胞后，含贝氏被动液泡通过规范的内吞途径贩卖，直到达到酸性溶酶体衍生的液泡，它复制到非常高的数字。除了服用的Advanta主机正常贩卖通路的GE， 贝氏建立了成功的复制利基的能力还依赖于一个功能性IVB型分泌系统（T4SS）及其后续效应易位8,17上。这种分泌系统在功能上类似于军团的良好的特点点/ ICM T4SS。这是恰当地通过补充军团的具体点/ ICM突变体各自的基因贝氏 19,20证明。虽然这两个军团菌和贝氏的T4SSs是复制所必需的，当这些系统被激活的定时是完全不同的，反映了他们各自的复制龛的发散性质。 军团 T4SS是在与宿主细胞和效应的快速易位接触立即触发使细菌避免默认内体-溶酶体途径，而是创建一个唯一的ER衍生的复制真空乐42。与此相反， 贝氏的T4SS未激活，直到大约8小时，感染后，后细菌达到酸性溶酶体衍生的液泡21。

鉴于贝氏通过内吞途径和易位系统被动过境没有被激活，直到它到达溶酶体，一个独特的机会展现给使用贝氏作为工具来研究内吞成熟。成为酸化的CCV要求效应被易位之前表示一个号码宿主蛋白质是效应蛋白的易位到宿主胞质重要，特别是，但不限于，涉及内吞贩卖途径蛋白。在一个特定针对性地利用siRNA的我们就可以开始阐明特定主机蛋白对效应易位的作用。在此研究中，我们侧重于调节真核吞trafficki两种蛋白质纳克通路，并因此进行了预测，以实现贝氏效应CBU0077的易位。分别RAB5A和Rab7A控制膜融合与早期和晚期内涵体。相比于对照的OTP的siRNA（ 图5B）时沉默或者使用的siRNA这些蛋白质导致CBU0077易位效率显著降低。这里显示的代表结果反映了我们先前公布调查结果21和这些人饶蛋白质效应贝氏易位的重要性提供了进一步验证。这种技术也被用于表征在贝氏点/ ICM效应易位其他主机进程的影响。该Retromer Complex上被认为是为贝氏细胞内复制重要。通过沉默retromer元件，采用的siRNA，然后在进行易位检测，我们可以表明，retromer是需要创造环境，诱导效应贝氏易位43。

虽然这里示出的代表性的结果是被感染的OTP控制和siRNA靶向RAB5A和Rab7A之间的比较，所述协议可以根据实验需要进行修改。例如，效应易位的水平，也可以与具有加扰的siRNA或非转染的细胞转染的细胞。

这个特殊研究的重点是专，细胞内的病原体C. burnetii和涉及内吞运输蛋白，但是，内描述的方法可以很容易地适应，利用毒力分泌系统的其他细胞内和细胞外的病原体。实际上，依赖于这里所用的宿主细胞质内β内酰胺酶活性的基于荧光易位测定法，已经被广泛地在一系列病原体30-32,35,44使用。自然，在感染的条件使用的特定细胞系必须适应反映特定细菌的感染的要求。此外，已知的内源性效应稠合到β-内酰胺酶是极为重要的的内描述的方法的成功。成功实施该协议的一个重要的考虑因素解释这里是冲击沉默特定主机目标可能会有细菌进入和随后的复制。这里，由贝氏效应易位测定24小时后的感染。在这种情况下，对于其他细胞内细菌，生物体来获得进入宿主细胞的能力是至关重要的。此外，特定的基因沉默也可能影响细菌复制因此改变观察易位的水平。确认的siRNA沉默不显著影响细菌进入和/或复制，因此转运效率，可以使用任一显微镜或细菌的记数来实现。易位然后数据可以是归一化的每siRNA处理受感染的细胞的数目。如贝氏在24小时温育期间经历很少或几乎没有复制的细 ​​菌复制尚未混淆此处呈现的数据。

这种方法需要的siRNA有效转染到宿主细胞中，以确保感兴趣的基因的足够沉默。考虑到这一点，选择正确的转染试剂是非常重要的。除了使用的试剂和在这个特定的研究中，已对的HeLa 229细胞优化使用的条件下，有无数的其它试剂，从选择。使用不同的转染试剂的击倒效率可以利用RT-qPCR的，以确保两个最适当的试剂被选择进行量化，并且该siRNA专门选择靶向感兴趣的转录。虽然在本研究中没有出现，之前我们已经证实双方RAB5A击倒效率和使用RT Rab7A-qPCR 21。此外，使用针对的通过western印迹兴趣和确认目标抗体还可以确认的具体的目标的siRNA沉默。

两个注意到使用的siRNA时的其它重要因素包括的脱靶效应的可能性，并转染细胞的细胞生存力。脱靶意外时的目标也被破坏发生作用。这可能导致表型的改变，并可能导致误报。在这项研究中，我们采用四个siRNA双链池沉默一台主机的目标。如果沉默特定靶引起转运效率，验证的降低，这一结果是不是由于脱靶效应可以通过分离的四个siRNA双链以及重复易位试验来实现。的至少两个出四个siRNA双链体应当表现出相似的表型到原来的si​​RNA池。有了这个结果，你可以非常有信心，所观察到TRanslocation效率不由于脱靶效应。产生的移位结果的有效性也取决于细胞生存力。易位化验后，核染色的应用使得下面的siRNA沉默细胞活力的枚举。在PLK1的情况下，显著的细胞死亡可容易地不染色观察到然而，使用荧光显微镜的更精确的表示可以实现的。如果由沉默特定宿主靶显著细胞死亡是观察，例如50％相比于对照，这是不可能的准确情况可以推断，以该特定主机蛋白与效应物易位的重要性。如在本研究中所示，虽然沉默要么RAB5A或Rab7A对细胞生存力（ 图5C）有轻微的影响，这种减少是不发音足够否定观察易位数据的有效性。至于细胞活力FOLL另一个考虑由于siRNA的沉默是显著细胞死亡通常导致增加的易位比率观察。这很贴切地报道PLK1（ 图5A）易位数据显示。的细胞数量减少导致在感染复数成比例地增加。这会增加感染速率并且因此易位比率。

虽然在本研究中没有出现，效应易位的可视化也可以产生一个免费的量化结果。用装有长通分色镜分离的激发和发射光啶显微镜可以提供细胞内BLAM衬底荧光的目测观察。一种可能的替代方案的β内酰胺酶报告系统是利用腺苷酸环化酶报告系统。到这里所描述的报告系统类似，感兴趣的基因融合到钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶基因（cyaA 百日咳博德特氏菌的。效应易位可以通过细​​胞内环AMP（cAMP）的定量使用免疫ELISA试剂盒进行测量。自CyaA的活性是完全依赖于宿主细胞钙调蛋白，​​这是唯一在宿主细胞质中存在，效应易​​位通过增加cAMP水平证实。虽然这种方法也被成功地用于测量效应易位为多种细菌45-47的，细胞内cAMP的定量依赖于宿主细胞的裂解以提取cAMP的，一过程相比于所描述的方法，该方法是更费时。使用基于FRET的β内酰胺酶报告系统效应易位测量更有效，因为BLAM衬底可直接加入到细胞中，荧光可在数小时内进行测量。此外，这里所描述的方法可以更容易地适合于产生高通量的结果，尤其是在96孔形式在。

许多细菌病原体依靠蛋白转运系统引进的效应蛋白进入宿主细胞允许宿主细胞功能的调节，以造福于病原体。 IV型分泌系统被用于由细胞内细菌如军团菌 ， 贝氏和布鲁氏菌和III型分泌系统通过一系列的病原体，包括衣原体利用，附接和谦让E.大肠杆菌和沙门氏菌 。通过一系列的病原体比较对效应易位特定宿主蛋白质的沉默表达的效果，给个体病原体所需的由特定类型的分泌系统或特定的效应易位宿主因素的理解，可以阐明。这提供了一种独特的方法来研究宿主 - 病原体相互作用的复杂性。

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Materials

目标浓度
1μM 5μM 10μM 20μM
开始痣
1纳摩尔 1毫升 200微升 100微升 50微升
2纳摩尔 2毫升 400微升 200微升 100微升
5纳摩尔 5毫升 1毫升 500微升 250微升
10纳摩尔 10毫升 2毫升 1毫升 500微升
20纳摩尔 20毫升 4毫升 2毫升 1毫升
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

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感染，第113，主机 - 病原体相互作用，细菌分泌系统，β内酰胺酶的易位测定，BLAM衬底，荧光，微生物学，细胞内细菌病原体，
应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由<em&gt;贝氏柯克斯体</em&gt; siRNA沉默中
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Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

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