Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

التحقيق في التفاعلات بين مسببات الأمراض البكتيرية ومضيفيهم هو مجال هام من مجالات الأبحاث البيولوجية. هنا، نحن تصف التقنيات اللازمة لقياس النبات المستجيب من الكوكسيلا البورنيتية أثناء سيرنا إسكات الجينات باستخدام BlaM الركيزة.

Abstract

الكوكسيلا البورنيتية، العامل المسبب للحمى Q، هو الممرض داخل الخلايا التي تعتمد على الرابع نقطة / آي سي إم نظام إفراز نوع لتأسيس مكانة تنسخي. وtranslocated فوج من المؤثرات من خلال هذا النظام إلى داخل الخلية المضيفة للتلاعب عمليات المضيفة والسماح بإنشاء فجوة المستمدة يحلول فريدة للنسخ المتماثل. الطريقة المعروضة هنا يشمل الجمع بين اثنين من التقنيات راسخة: إسكات الجينات المحددة باستخدام سيرنا وقياس النبات المستجيب باستخدام الركيزة القائم على الحنق التي تعتمد على النشاط β-اكتاماز. تطبيق هذين النهجين، يمكننا أن نبدأ في فهم دور العوامل المضيفة في البكتيرية وظيفة نظام إفراز والنبات المستجيب. في هذه الدراسة درسنا دور Rab5A وRab7A، سواء منظمات هامة لمسار الاتجار التقامي. علينا أن نبرهن على إسكات التعبير عن أي نتائج البروتين في انخفاض في translocatio المستجيبكفاءة ن. هذه الأساليب يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مسببات الأمراض داخل الخلايا وخارج الخلية الأخرى التي تستخدم أيضا أنظمة إفراز. وبهذه الطريقة، صورة عالمية من العوامل المضيفة المعنية في النبات المستجيب البكتيرية يمكن الكشف عنها.

Introduction

الكوكسيلا البورنيتية هو الممرض داخل الخلايا الفريدة التي تسبب الحيوانية المصدر العدوى البشرية بالحمى. ويرتبط هذا المرض مع طائفة واسعة من العروض السريرية تمتد من الانقلاب المصلي بدون أعراض للعدوى تهدد الحياة المزمن الذي غالبا ما يظهر عن سنوات التهاب الشغاف بعد التعرض 1. تحدث العدوى البشرية في المقام الأول من خلال استنشاق هباء ملوثة المجترات الخزان الرئيسي للعدوى، ولا سيما، الأبقار والأغنام والماعز. على الرغم من أن العدوى الكوكسيلا في هذه الحيوانات عادة تحت الإكلينيكي، والعدوى قد تسبب الإجهاض والحمل البكتيري كبير داخل السائل الولادة والمشيمة يمكن أن تلوث البيئة المحلية 1. مثال على مثل هذا التلوث عبء هائل يمكن أن يكون على وحظ الصحة العامة والزراعة والصناعة مؤخرا في اندلاع حمى Q التي وقعت في هولندا 2. بين عامي 2007 وعام 2010، تم تشخيص أكثر من 4000 حالة إصابة بشرية بالحمى وترتبط هذه الفاشية إلى تلوث كبير من مزارع الماعز 3. بالإضافة إلى ذلك، الكوكسيلا هو سلاح بيولوجي محتمل، حسب تصنيف المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها، ويرجع ذلك إلى الاستقرار البيئي للبكتيريا والجرعة المعدية منخفضة اللازمة ليسبب الاعتلال والوفيات 4 الشديد.

يوجد الكوكسيلا على مرحلتين: أنا الكائنات المرحلة، المعزولة من المصادر الطبيعية، وضراوة للغاية والمرحلة الثانية الكائنات الحية والموهن للغاية في الجسم الحي. على سبيل المثال، وبعد عدة في ممرات المختبر من الكائنات الكوكسيلا البورنيتية تسعة مايل المرحلة الأولى، تم إنتاج المرحلة الثانية البكتيريا التي تحتوي على حذف الكروموسومات لا رجعة فيه مما أدى إلى lipopolysaccharide في اقتطاع (LPS) 5. هذه السلالة، C. البورنيتية NMII، يشبه ظاهريا إلى المرحلة الأولى في نماذج زراعة الأنسجة ويوفر طريقة أكثر أمانال للباحثين لدراسة المرضية الكوكسيلا في مختبرات 5. في السنوات الأخيرة عدة اختراقات تقدمت بسرعة مجال علم الوراثة الكوكسيلا. وأبرزها، وتطوير وسائل الإعلام ممحوضة (يحمض المتوسطة السيستين سترات - ACCM-2) سمحت النمو خالية من الخلايا من الكوكسيلا في كل من السائل وعلى وسائل الاعلام الصلبة 6،7. وأدى ذلك إلى تحسينات مباشرة من الأدوات الجينية المتاحة للالكوكسيلا بما في ذلك نظام التعبير الجيني محرض، ناقلات المكوك وأنظمة ينقول عشوائية 8-11. وفي الآونة الأخيرة، كما تم تطوير طريقتين لتثبيط الجين المستهدف، مما يمهد الطريق لفحص المرشحين الجينات الفوعة محددة 12.

وبعد استيعاب من قبل البلاعم السنخية، الكوكسيلا يعيد إلى أرقام عالية داخل حجرة بغشاء يسمى Coxiella- تحتوي على فجوة (لجنة تنسيق المفردات). لجنة تنسيق المفردات يتطلب الاتجار التقامي المضيف عشرالخام الإندوسومات المبكرة والمتأخرة حتى ينضج إلى المستمدة يحلول عضية 13. وطوال هذه العملية، لجنة تنسيق المفردات تستحوذ على العوامل المضيفة إما أن تظهر بشكل عابر أو تظل مرتبطة فجوة، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، Rab5، Rab7، CD63 وLAMP-13-15 يناير. تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة يعتمد كليا على نقطة / آي سي إم نوع IVB نظام إفراز تعمل بكامل طاقتها (T4SS) 8،16،17. هذا النظام إفراز هو بنية متعددة البروتينية ذات العلاقة أجدادهم لأنظمة التصريف وتمتد كل من الأغشية البكتيرية وفجوي لتقديم البروتينات البكتيرية، ووصف المؤثرات، في السيتوبلازم المضيف (18). والكوكسيلا T4SS وظيفيا تشبه الى حد بعيد نوع IVB نقطة / نظام إفراز آي سي إم تتميز كذلك من البكتيريا المستروحة 19،20. ومن المثير للاهتمام، لا تحدث تفعيل T4SS ولاحق المستجيب النبات حتى يصل الكوكسيلا والحمضية-يحلول المشتقةعضية، ما يقرب من 8 ساعات بعد العدوى 17،21. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 130 المؤثرات نقطة / آي سي إم 9،17،22-24. العديد من هذه المؤثرات على الأرجح تلعب أدوارا هامة خلال تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة؛ ومع ذلك، سوى عدد قليل من المؤثرات تم التعرف على وظيفيا 25-29.

في هذه الدراسة يمكننا الاستفادة من مضان أساس النبات فحص يعتمد على الانقسام الركيزة CCF2-AM الحنق (المشار إليه فيما بعد الركيزة BlaM) عن طريق النشاط β-اكتاماز داخل سيتوبلازم الخلية المضيفة (الشكل 1). وتنصهر في الجينات التي تهم تيم-1 β-اكتاماز (BlaM) على البلازميد المراسل أن يوفر التعبير التأسيسي. وتتألف الركيزة BlaM اثنين fluorophores (الكومارين وفلوريسئين) التي تشكل زوج الحنق. الإثارة من نتائج الكومارين في الحنق من فلوريسئين والانبعاثات مضان أخضر في غياب النبات المستجيب. ومع ذلك، إذا كان بلوخينتقل إلى M-المستجيب البروتين الانصهار في السيتوبلازم المضيف، الناتجة β-اكتاماز يشق نشاط عصابة β لاكتام الركيزة BlaM، يفصل الزوج الحنق إنتاج الانبعاثات مضان الأزرق بعد الإثارة. وقد تم هذا الاختبار النبات ثبت كذلك نهج لتحديد البروتينات المستجيب من مجموعة واسعة من مختلف البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية، بما في ذلك جيم البورنيتية، L. المستروحة، L. اللونغبيشية، الكلاميديا، ممرض للأمعاء E. القولونية والسالمونيلا والبروسيلا 17،30-35.

لتحديد دور العوامل المضيفة محددة بشأن الكوكسيلا المستجيب النبات نحن نستخدم طريقة راسخة لإسكات الجينات المعروفة تدخل الحمض النووي الريبي، وخاصة الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). حددت أصلا في ايليجانس انواع معينة، تدخل الحمض النووي الريبي هو عملية الخلوية الذاتية الحفظ المستخدمة لdefe الفطريةNSE ضد الفيروسات وكذلك الجين تنظيم 36،37. بعد ربط تسلسل معين سيرنا، وتدهور مرنا يحدث من خلال RISC (الناجم عن الحمض النووي الريبي مجمع إسكات) مما أدى إلى إسكات الجينات المحددة أو ضربة قاضية 38. في هذه الدراسة، تم استخدام سيرنا لاستهداف اثنين من البروتينات المضيفة، Rab5A وRab7A، وهي منظمات هامة لمسار التقامي. تم التأكد من تأثير إسكات Rab5A وRab7A على النبات المستجيب باستخدام C. البورنيتية pBlaM-CBU0077. وقد تم اختيار CBU0077 كما تبين أنه سبق أن translocated من قبل النظام إفراز نقطة / آي سي إم من الكوكسيلا 17.

الاستفادة من كل سيرنا إسكات الجينات وفحص النبات fluorescencebased الموصوفة هنا، بدأنا في إنشاء دور للعوامل المضيف في النبات البروتينات المستجيب من الكوكسيلا. ويمكن تطبيق هذا النهج إلى مجموعة واسعة من كل من البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية التي تمتلك secretio مماثلأنظمة ن المسؤولة عن النبات من البروتينات المستجيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على النمو أو التلاعب الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII في مستوى الاحتواء الجسدي 2 مختبر وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في الامتثال للمبادئ التوجيهية المحلية. ويرد رسم تخطيطي للالعكسي ترنسفكأيشن والفحص النبات سير العمل هو موضح أدناه في الشكل 2.

1. إعداد C. البورنيتية الثقافة تعرب عن CBU0077 تنصهر لبيتا لاكتاماز (pBlaM-CBU0077) (DAY 1)

  1. إعداد 1X ACCM-2 6:
    1. الجمع بين المكونات المدرجة في الجدول 1. ضبط درجة الحموضة إلى 4.75 مع 6 M هيدروكسيد الصوديوم وفلتر تعقيم (لا الأوتوكلاف). ACCM-2 غير مستقرة لنحو ثلاثة أسابيع تخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. توليد C. الأسهم البورنيتية pBlaM-CBU0077.
    1. تصيب هيلا 229 الخلايا التي تحتوي على C. سلالة البورنيتية تحمل pBlaM-CBU0077 والمرور حتى vacuol كبيرةويلاحظ وفاق في معظم الخلايا.
      1. زراعة C. سلالة البورنيتية تحمل pBlaM-CBU0077 في 20 مل ACCM-2 التي تحتوي على 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة مع غطاء تنفيس لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، 2.5٪ O 2.
      2. الطرد المركزي C. ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
      3. إعادة تعليق بيليه في 20 مل DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) + 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (وسائل الإعلام الصيانة). إزالة وسائل الاعلام من 50٪ متموجة 75 سم 2 قارورة من هيلا 229 الخلايا. إضافة جيم إعادة علقت البورنيتية إلى هيلا 229 الخلايا. احتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 للسماح للإصابة هيلا 229 الخلايا لإنشاء.
      4. تقسيم الخلايا إلى 175 سم 2 نسيج الثقافة قارورة.
        1. إزالة وسائل الاعلام من قارورة 75 سم 2، ويغسل أحادي الطبقة مرتين مع 10 مل قبل تحسنت برنامج تلفزيوني.
        2. إضافة 1 مل سو 0.05٪ التربسين-EDTA حل ومكان الخلايا عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 ل3-5 دقيقة لفصل الخلايا.
        3. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام الصيانة. إضافة 2 مل من الخلايا إعادة علقت في 175 سم 2 قارورة تحتوي على 38 مل من وسائل الاعلام الصيانة.
        4. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمزيد من 3-5 أيام حتى يتم التوصل إلى 100٪ confluency ولوحظ فجوات كبيرة.
    2. جمع طاف من سم 2 قارورة 175، إضافة 10 مل O 2 درهم لتغطية الخلايا المصابة هيلا 229 واحتضان لمدة 15 دقيقة لليز الخلايا المصابة.
    3. الجمع بين طاف والخلايا هي lysed وبيليه في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
    4. اعادة تعليق بيليه في 10 مل درهم 2 O. خلايا ليز مزيد عن طريق تمرير مرارا وتكرارا على اعادة تعليق من خلال إبرة 23G تعلق على حقنة 10 مل 20 مرات على الأقل. بيليه في 500 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
      5. <لى> إزالة وبيليه طاف في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT لجمع C. البورنيتية.
    5. إعادة تعليق C. البورنيتية في DMEM + 10٪ FCS وتحديد عدد من البكتيريا وفقا ل4. تمييع إلى 1 × 10 9 جينوم / مل باستخدام DMEM + 10٪ FCS + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، قسامة 50 سهما ميكرولتر في أنابيب microfuge ومخزن في -80 درجة مئوية.
  3. تطعيم 10 مل من قبل تحسنت ACCM-2 التي تحتوي على 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول مع 20 ميكرولتر من C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 السلالة 17 (من الأسهم ولدت في 1.2 المخزنة في -80 درجة مئوية) في 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة مع غطاء تنفيس. تنمو ثقافة البكتيرية لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، 2.5٪ O 2.

2. عكسي ترنسفكأيشن سيرنا والبذر من هيلا 229 خلايا (DAY 4)

  1. عند استخدام سيرنا التجريبية لأول مرة إعدادوسيرنا على النحو التالي:
    1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في سيرنا مجفف بالتجميد للتأكد من أن بيليه سيرنا يتم جمعها في الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. إعادة تعليق سيرنا مكعبات إلى تركيز المخزون النهائي من 20 ميكرومتر من قبل pipetting حجم مناسب من العازلة 1X سيرنا (الجدول 2).
    3. ماصة الحل صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط ومكان على خلاط المداري لمدة 30 دقيقة في RT، أنبوب عكس كل 5-10 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب لضمان أن يتم جمع سيرنا في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. قسامة سيرنا في 50 مكل في أنابيب microfuge ومخزن في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
    6. لتوليد 1 ميكرومتر تركيز سيرنا العمل، ماصة 950 ميكرولتر من 1X سيرنا العازلة في 50 ميكرولتر الأسهم قسامة (20 ميكرومتر) عند الضرورة. ملاحظة: هذا التركيز عمل 1 ميكرومتر يمكن تجميد إذابة عدة مرات لتعداء المتكررة.
  2. وضع DMEM + 10٪ FCS،، 0.05٪ التربسين-EDTA وبرنامج تلفزيوني في حمام 37 درجة مئوية الماء (أو ما يعادلها) لمدة 30 دقيقة لتسخين قبل الاستعمال.
  3. إعداد مكونات ترنسفكأيشن:
    ملاحظة: لقد تم تحسين البروتوكول التالي لهيلا 229 الخلايا في صفيحة 96-جيدا مع الجدران السوداء ومسطحة، أسفل شفافة. تعظيم الاستفادة من كمية كاشف ترنسفكأيشن، قد يكون من الضروري لخطوط مختلفة من الخلايا تركيز سيرنا والبذر كثافة الخلايا.
    1. لكل بئر، واستخدام 0.1 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن، 15.9 ميكرولتر المتوسطة انخفاض المصل (وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المستخدمة لتعداء، الرجوع إلى جدول المواد) و 4 ميكرولتر من 1 ميكرومتر سيرنا (مما أدى إلى تركيز سيرنا النهائي من 40 نانومتر). استخدام أنابيب microfuge منفصلة عن مكتب المدعي العام، PLK1، Rab5A وRab7A. قياس كل حالة فحص في ثلاث نسخ. ويرد مثال على تخطيط لوحة 96-جيدا في الشكل (3).
      ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول استخدام اثنين من الضوابط: مكتب المدعي العام وPLK1. مكتب المدعي العام هوتتألف من أربعة سيرنا المجمعة التي تم الأمثل للحد من خارج الهدف آثار، وبالتالي يستخدم مكتب المدعي العام كوسيلة لمراقبة سلبية، وعدم استهداف. سارعت سيرنا ويمكن أيضا أن تستخدم لمراقبة سلبية. ويؤدي فقدان التعبير PLK1 في موت الخلايا واسعة في عدد من خطوط الخلايا عن طريق الحث على مسارات الموالية لأفكارك وبالتالي يستخدم PLK1 سيرنا كما تحكم إيجابية للترنسفكأيشن حيث يرتبط موت الخلايا لكفاءة ترنسفكأيشن.
      1. لكل ترنسفكأيشن سيرنا التجريبية، والجمع بين 0.4 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن و 63.6 ميكرولتر المتوسطة انخفاض المصل في microfuge أنبوب الفردية. دوامة جميع أنابيب microfuge وتسمح المكونات إلى مجمع لمدة 5 دقائق على RT.
      2. إضافة 16μl من كل سيرنا التجريبية لأنابيب microfuge المقابلة التي تحتوي على مجمع ترنسفكأيشن. دوامة واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. ملاحظة: من المهم ألا تتجاوز 30 دقيقة، وكفاءة ترنسفكأيشن ستنخفض.
  4. خلال المؤتمر الوطني العراقي 20 دقيقةubation (2.3.1.2) إضافة 20 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن + متوسطة خفض المصل + سيرنا خلط في الآبار الملائمة للأسود أسفل علبة معقم، مسطحة واضحة 96-جيدا.
  5. بمجرد أن فترة الحضانة 20 دقيقة كاملة، بذور هيلا 229 الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3.92 × 10 3 خلايا / جيد.
    1. حصاد هيلا 229 الخلايا من متموجة أو شبه متموجة 75 سم 2 الأنسجة الثقافة قارورة في DMEM قبل حرارة + 10٪ FCS وإعادة تعليق الخلايا إلى الكثافة النهائية من 4.9 × 10 4 خلية / مل وفقا لأساليب القياسية. لضمان ترنسفكأيشن عدم المساس الكفاءة، وإعداد الخلايا خلال فترة الحضانة 20 دقيقة (2.3.1.2).
      1. غسل أحادي الطبقة من هيلا 229 الخلايا مرتين مع 10 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني.
      2. إضافة 1 مل من 0.05٪ حل التربسين-EDTA ومكان هيلا 229 الخلايا في CO 2 37 ° C + 5٪ عن 3-5 دقيقة لفصل الخلايا.
      3. جمع الخلايا في 9 مل من قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCس عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم وإعداد الخلايا لكثافة النهائية من 4.9 × 10 4 خلية / مل باستخدام DMEM + 10٪ FCS.
    2. ماصة 80 ميكرولتر من هيلا 229 الخلايا في كثافة 4.9 × 10 4 خلية / مل في كل بئر الذي يحتوي على كاشف ترنسفكأيشن + انخفاض المصل المتوسطة + سيرنا المزيج. وهذا يتوافق مع كثافة خلية من 3.92 × 10 3 خلايا / جيد.
      ملاحظة: مطلوب الطرح الخلفية لالركيزة BlaM.
      1. لا تقم بإضافة خلايا أو سيرنا إلى "فارغة" آبار (الشكل 3). بدلا من ذلك، إضافة 80 ميكرولتر من DMEM + 10٪ FCS لهذه الآبار أقيمت في ثلاث نسخ.
    3. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.

3. تغيير وسائل الإعلام (DAY 5)

  1. بعد 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام باستخدام محول متعدد القنوات تعلق على مصدر فراغ أو يدويا مع ماصة متعدد القنوات، واستبدالها مع 100 ميكرولتر من prewarm جديدةإد DMEM + 10٪ FCS.
  2. احتضان لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.
  3. في هذه المرحلة، والتحقق من سلامة الخلايا بصريا باستخدام المجهر الضوئي العادي. إذا كان ترنسفكأيشن العكسي ناجحا، سوف يلاحظ موت الخلايا كبيرا في الآبار التي تحتوي PLK1 سيرنا مقارنة مع مكتب المدعي العام سيرنا.

4. الكمي لالكوكسيلا البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة باستخدام QPCR (DAY 7)

  1. بعد 7 أيام من النمو في ACCM-2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، 2.5٪ O 2 (1.3)، الطرد المركزي 10 مل C. ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في 15000 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. إعادة تعليق بيليه الجرثومي في 10 مل من قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS. إعداد 1:10 و 1: 100 التخفيفات الثقافة (عينة) باستخدام درهم 2 O.
  3. إعداد المكونات المطلوبة لQPCR.
    ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها استخراج gDNA مقدما وتخزينها في -20 درجة مئوية الاتحاد الوطني للعمالمطلوب ايل.
    1. إعداد المعايير:
      1. استخراج gDNA من الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII نوع السلالة البرية التي تزرع في ACCM-2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، 2.5٪ O 2 لمدة 7 أيام باستخدام مجموعة استخراج gDNA، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. قياس تركيز gDNA (ز / ميكرولتر) باستخدام معمل NanoDrop (أو ما يعادلها) في أحد الامتصاصية من 260 نانومتر.
      3. حساب عدد النسخ الجينوم في ميكرولتر باستخدام الصيغة التالية أدناه، وتحويله إلى عدد من العوامل الوراثية / مل.
        معادلة
      4. ضبط عدد من العوامل الوراثية / مل إلى 10 9 / مل (في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر) في أنبوب microfuge جديدة باستخدام درهم 2 O. وهذا يمكن أن يكون المغلي لمدة 10 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      5. في يوم من العدوى، وتوليد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من 10 8 جينوم / مل إلى 10 5 جينوم / مل من الجينوم 10 9ق / الأسهم مل.
        1. ماصة 10 ميكرولتر من 10 9 جينوم / مل إلى 90 ميكرولتر من O 2 درهم لتوليد 10 8 جينوم / مل. دوامة لخلط. ماصة 10 ميكرولتر من 10 8 جينوم / مل إلى 90 ميكرولتر من O 2 درهم لتوليد 10 7 جينوم / مل. دوامة وتكرار حتى 10 5 جينوم / مل.
    2. إعداد رد فعل QPCR. خلق مزيج الرئيسي ل25 بئرا لحساب أي أخطاء pipetting ل. لكل بئر، استخدم 10 ميكرولتر QPCR ميكس ماجستير. 2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ompA (4.3.2.2) و 3 ميكرولتر من درهم 2 O.
      ملاحظة: OmpA هو بروتين الغشاء الخارجي، من C. وقد تم اختيار البورنيتية "39 والباب 82 قاعدة الزوج ضمن منطقة الحفظ جدا لاستخدامها بوصفها التحقيق كما هو موضح سابقا 40.
      1. إعداد كل مستوى (O 2 درهم، 10 5، 10 6، 10 7، 10 8، 10 9 جينوم / مل) وعينة (1:10 و 1: 100 تمييع) في 96-جيدا PCR المسيل للدموع بعيدا لوحة (غير متجنب) في نسختين أو ثلاث نسخ، على التوالي. إضافة 5 ميكرولتر من عينة أو معيار في آبار المناسبة.
      2. باستخدام درهم 2 O، وتمييع كل من التمهيدي إلى الأمام ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') وompA عكس التمهيدي (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر والجمع في نفس microfuge أنبوب.
        ملاحظة: مزيج التمهيدي ompA يمكن إعداد مقدما وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      3. الجمع بين 250 ميكرولتر QPCR ميكس ماجستير، 50 ميكرولتر ompA مزيج التمهيدي، 75 ميكرولتر درهم 2 O ودوامة لخلط. إضافة 15 ميكرولتر من هذا المزيج الرئيسي إلى الآبار التي تحتوي إما معايير أو العينات.
      4. وضع 8-غطاء قبعات الشريط PCR على الآبار المناسبة وأجهزة الطرد المركزي نبض أنابيب PCR لضمان كل شيء يتم جمعها في الجزء السفلي من الأنابيب.
      5. إعداد البرنامج التالي على ماجستير PCR الكميعمود فقري: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 1 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية (الشكل 4A).
    3. تحليل ط م (عتبة دورة) القيم من QPCR:
      1. نقل القيم ط م إلى جدول بيانات باستخدام وظيفة التصدير البرنامج.
      2. إنشاء مخطط التشتت من المعايير 10 5 جينوم / مل حتى 10 9 جينوم / مل (كنسبة القيم السجل). تجاهل أي القيم المتطرفة واضحة بين العينات ثلاث نسخ. توليد خط اتجاه لوغاريتمي وتحديد معادلة الرسم البياني.
      3. حساب العدد الإجمالي للجينوم / مل في العينة باستخدام المعادلة ولدت في 4.3.3.2. لا ننسى لحساب التخفيف الأولي (01:10 و 1: 100) من العينات.

5. إصابة عكسي Transfected الخلايا (DAY 7)

  1. بعد احتساب العوامل الوراثية الكلية / مل في C. حافة خشنةثقافة netii pBlaM-CBU0077 لاستخدامها للعدوى، وضبط إعادة علقت ثقافة البكتيرية لتصيب الخلايا في وزارة الداخلية من 300 في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر / جيدا باستخدام prewarmed DMEM + 10٪ FCS.
    ملاحظة: الكثافة المتوقعة للخلايا هيلا 229 المصنفة في زمن مضاعفة الطبيعي بعد 72 ساعة هو 3.136 × 10 4 خلايا / جيد. كمية البكتيريا اللازمة لنقل العدوى في وزارة الداخلية 300 هو 9.408 × 10 6 في 50 ميكرولتر، وهو ما يعادل 1.88 × 10 8 بكتيريا / مل.
    1. باستخدام القيمة المحسوبة من QPCR (جينوم / مل) (4.3.3.3)، يخفف من إعادة علقت البكتيريا باستخدام قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS في الحجم النهائي من 2 مل لتصيب الخلايا العكس transfected.
  2. إزالة وسائل الإعلام الموجودة من الفراغ وعكس الخلايا transfected.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من البكتيريا المخفف (1.88 × 10 8 بكتيريا / مل) إلى الآبار المناسبة. إضافة 50 ميكرولتر من DMEM + 10٪ FCS إلى كل من الفراغ وشآبار ninfected.
  4. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.

6. إضافة BlaM الركيزة لتحديد مستوى من إزفاء (DAY 8)

  1. إعداد الحلول لBlaM الركيزة حل 6X التحميل.
    ملاحظة: يتم توفير حلول A و B و C ضمن عدة الركيزة BlaM (انظر الجدول المواد). الحل B قد تشكل راسب في RT. تسخين هذا الحل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ويعجل يجب أن تذوب.
    1. عند استخدام عدة لأول مرة، إضافة 185 ميكرولتر من DMSO (مرفق مع عدة الركيزة BlaM) إلى الحل المجفف A. وفي وقت لاحق، وتخزين إعادة علقت الحل وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    2. إعداد 0.1 حل M بروبينسيد مقدما وتخزينها في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
      1. تحضير 0.4 M هيدروكسيد الصوديوم (1.6 غرام في 100 مل O 2 درهم).
      2. إعداد 100 ملي نا العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 8 (1.56 غ ناه 2 ص 4 .2H 2 هبو 4 في 100 مل O 2 درهم).
      3. حل 1.25 غرام من بروبينسيد في 22 مل من 0.4 هيدروكسيد الصوديوم M من الانفعالات قوية.
      4. إضافة 22 مل من 100 ملي نا العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 8 (الحل سوف تتحول غائم) ويحرك المزيج حتى يذوب الراسب أن الأشكال.
      5. ضبط درجة الحموضة إلى 8 (إذا لزم الأمر) باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك.
      6. يقلب بقوة وحرارة معتدلة (<50 درجة مئوية) حتى يكون الحل واضحا في الغالب.
      7. فلتر (0.2 ميكرون حجم المسام) وقسامة في 1 مل وحدات التخزين. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
  2. لكل بئر، استخدم 0.06 ميكرولتر الحل A، 0.54 ميكرولتر الحل B، 7.9 ميكرولتر الحل C و 1.5 ميكرولتر 0.1 M بروبينسيد. خلق مزيج الرئيسي ل30 بئرا من خلال الجمع بين الأول 1.8 ميكرولتر من الحل وو 16.2 ميكرولتر من الحل B معا في أنبوب microfuge. تخلط جيدا باستخدام الدوامة. إضافة 237 ميكرولتر من الحل مئوية و 45 ميكرولتر من 0.1 M بروبينسيد. دوامة من الجمع بين كل componenالخبر.
    ملاحظة: الحل 6X تحميل مستقرة لمدة تصل إلى 4 ساعات (في الظلام) ولكن ينبغي أن تكون مستعدة في أقرب وقت ممكن قبل الاستخدام.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من الحل 6X تحميل مباشرة في جميع الآبار فارغة وعكس transfected دون إزالة وسائل الإعلام الحالية.
  4. احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة في الظلام.
  5. لتحديد مستوى النبات، قياس كمية من مضان باستخدام قارئ صفيحة.
    ملاحظة: الإجراء التالي غير محددة للقارئ ClarioSTAR صفيحة. ويمكن أيضا أن القراء صفيحة أي ما يعادل استخدامها.
    1. إنشاء بروتوكول كثافة مضان جديد باستخدام نقطة النهاية في وضع القراءة.
    2. ضبط المعايير الأساسية على النحو التالي:
      1. اختر صفيحة 96-جيدا.
      2. ضمن إعدادات البصرية، حدد 2 multichromatics مع إعدادات المعرفة التالية: (1) المدخلات 410-10 الإثارة نانومتر و 520-10 الانبعاثات نانومتر. (2) إثارة الإدخال 410-10 نانومتر و 450-10 الانبعاثات نانومتر. ضمان المزيد الصورة جيدايتم تحديد ichromatics.
      3. اختر المتوسط ​​المداري التي يبلغ قطرها 3 مم.
      4. تحت البصرية، وتحديد البصرية السفلي.
      5. تحت السرعة والدقة، حدد دقة. وهذا يتوافق مع ثماني مناطق لكل بئر.
    3. ضبط تخطيط لوحة عن طريق تحديد الآبار المناسبة كما العينات.
    4. حدد قياس البداية.
    5. إزالة الغطاء ووضع صينية في قارئ لوحة. لتجنب الوصول إلى القيم مضان القصوى، وضمان يتم تعديل قيمة الربح. للقيام بذلك، إجراء تعديل ربح إحدى الآبار المصابة التي تم transfected العكس مع مكتب المدعي العام سيرنا. وهذا يتوافق مع أعلى النبات المتوقع.
    6. حدد قياس بداية لقياس جميع الآبار المناسبة باستخدام مضان السفلي في الإثارة من 410 نانومتر، وانبعاث كلا 450 نانومتر و 520 نانومتر لمضان الأزرق والأخضر، على التوالي.

7. تحليل النتائج:

  1. حساب نسبةمن 450 نانومتر إلى 520 نانومتر (الأزرق إلى اللون الأخضر) لجميع العينات بعد تقليل فارغة والتعبير بالنسبة للعينة مكتب المدعي العام غير المصابة.
    ملاحظة: يتم توفير الخطوات التحليل التالي لبرنامج جدول بيانات بسيطة.
    1. باستخدام وظيفة التصدير على القارئ صفيحة، ونقل القيم مضان الخام التي تم الحصول عليها لكل 520 نانومتر و 450 نانومتر انبعاث موجات (6.5) في جدول بيانات.
    2. حساب متوسط ​​قراءات "على بياض" (وسائل الإعلام فقط، أي الخلايا) لطول موجي 520 نانومتر بإضافة الخام 520 نانومتر القيم مضان وقسمة الناتج على عدد الآبار (3). تكرار استخدام فارغة 450 نانومتر قيم الطول الموجي. وتمثل هذه القيم مضان الخلفية نظرا لوحة 96 جيدا وسائل الإعلام.
    3. طرح مضان الخلفية. باستخدام القيم التي تم الحصول عليها في 7.1.2 طرح متوسط ​​فارغ الطول الموجي 520 نانومتر من كل القيم نانومتر مضان العينة 520. تكرار للقيم نانومتر طول موجي 450.
    4. للحصول على 450: نسبة نانومتر 520 تستخدم القيم تصحيح فارغة (7.1.3). تقسيم كل عينة من 450 نانومتر قيمة مضان من قبل في المقابلة 520 قيمة نانومتر.
    5. حساب متوسط ​​المعافين قيم النسبة مكتب المدعي العام بإضافة 450: 520 قيم نسبة نانومتر (من 7.1.4) وبقسمة عدد الآبار (3).
    6. حساب نسبة العينات النسبية لغير مصاب مكتب المدعي العام بقسمة 450: نسبة نانومتر 520 المحسوبة في 7.1.4 من متوسط ​​قيمة النسبة مكتب المدعي العام غير المصابة المحسوبة في 7.1.5.

8. إضافة نوى وصمة عار لتحديد ما عدد الخلايا بعد إزفاء الفحص (DAY 8)

  1. بعد الكمي لمضان، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على حل تحميل 6X من جميع الآبار باستخدام محول متعدد القنوات تعلق على مصدر فراغ أو يدويا مع ماصة متعدد القنوات.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ PFA (امتصاص العرق) حلفي برنامج تلفزيوني لجميع الآبار المناسبة لإصلاح الخلايا. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
  3. إزالة 4٪ PFA PBS الحل (كما في 8.1) وغسل خلايا مرتين مع 75 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من خلية وصمة عار النووية قابلة للاختراق، على سبيل المثال دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، إلى كل بئر. الحصول على صور مع المجهر الفلورسنت وتحديد عدد النوى الموجودة في كل بئر بعد العلاج سيرنا باستخدام برمجيات تحليل الصور المناسبة، مثل يماغيج 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لهذه الدراسة، وC. تم اختيار البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة كما CBU0077 ثبت سابقا أن يكون المستجيب translocated من نظام إفراز الكوكسيلا نقطة / آي سي إم 17. قبل الإصابة، فإن العدد الإجمالي للجينوم / مل في سبعة أيام C. وقد عددت ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 باستخدام QPCR الشكل 4 يوضح مثال على عتبة دورة (CT) القيم المتوقعة من كل من معايير ونماذج التالية QPCR. تم تصدير القيم ط (تمثيلها بيانيا في تضخيم قطعة أرض (الشكل 4B) وعدديا (الشكل 4C)) وتحليلها كما هو موضح في 4.3.3. واستنادا إلى بيانات تمثيلية مبين، كان هناك 2.31 ​​× 10 8 جينوم / مل في 10 مل إعادة علقت ثقافة البكتيرية (الشكل 4D). لتوليد تخفيف البكتيريا المناسب (1.88 × 10 8 جينوم / مل طن 2 مل)، 1.63 مل من البكتيريا معلق أضيف إلى 370 ميكرولتر من جديد، قبل تحسنت DMEM + 10٪ FCS. أصيب الخلايا عكس transfected مع سيرنا في وقت لاحق مع C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 في وزارة الداخلية من 300 لمدة 24 ساعة.

بعد مرور فترة الحضانة من العكس transfected الخلايا المصابة مع BlaM الركيزة الكمي من النبات المستجيب يمكن تحديد باستخدام قارئ لوحة مضان. بعد تحليل كما هو موضح في 7، كل القيم النسبة التي تم تطبيع إلى غير مصاب مكتب المدعي العام كما يمكن تطبيع للمصاب مكتب المدعي العام. ويمكن تصنيف مستوى النبات المستجيب بعد إسكات الجينات المضيف إلى ثلاث نتائج بعد مقارنة المصابة سيطرة مكتب المدعي العام: (1) لم يطرأ أي تغيير. (2) زيادة المستجيب النبات. (3) انخفاض المستجيب النبات. التحليل الإحصائي لاحق، على سبيل المثال الطالب اختبار (ت)، ويمكن استخدامها لتحديد أهمية أي اختلاف ر احظس المصابين سيطرة مكتب المدعي العام. يظهر نتيجة لإسكات أي Rab5A أو Rab7A على النبات المستجيب من ثلاث تجارب مستقلة في الشكل 5A. حدث انخفاض كبير في مستوى BlaM-CBU0077 النبات خلال إسكات كل من Rab5A وRab7A مقارنة للسيطرة مكتب المدعي العام (قيمة ص = 0.0088 (Rab5A) وقيمة ص = 0.0059 (Rab7A)، وإرفاقها، طالبة ر اختبار). وأنشئت أيضا تأثير العلاج سيرنا على بقاء الخلية. بعد فحص النبات، تم إصلاح الخلايا، ملطخة وصمة عار النوى وكميا في وقت لاحق. كما هو مبين في الشكل 5C، على الرغم من أن العلاج إما Rab5A أو Rab7A النتائج إلى انخفاض في بقاء الخلية مقارنة مع الشاهد مكتب المدعي العام (12٪ و 31٪ على التوالي)، هذا التخفيض ليس بالحدة التي PLK1 (97٪)، جين معروف أن يسبب موت الخلايا (ع القيمة = 0.0102 (Rab5A)؛ ف قيمة = 0.0081 (Rab7A)؛ ف قيمة <0.0001 (PLK1)، وإرفاقها، طالبة اختبار t). هذه النتائج تثبت كيف إسكات المضيف جنرال الكتريكالأخبار باستخدام سيرنا يمكن أن يغير سلبا على مستويات النبات المستجيب البكتيرية.

شكل 1
الشكل 1. آلية عمل BlaM الركيزة من خلال العدوى. C. والمنضوية البورنيتية بواسطة الخلايا المضيفة وتشكل فجوة المستمدة يحلول وصفته فجوة المحتوية الكوكسيلا. 24 ساعة بعد الإصابة، يتم تحميل الخلايا مع غشاء نفاذية الركيزة BlaM أن تمتلك اثنين fluorophores تشكيل الزوج الحنق (A). وفي غياب β-اكتاماز أي لا النبات من المستجيب BlaM-CBU0077، الإثارة من الكومارين في 410 النتائج نانومتر في الحنق إلى فلوريسئين، يحتفل به بوصفه مضان إشارة خضراء (520 نانومتر) (B). وفي حالة وجود نظام إفراز نقطة / آي سي إم الوظيفي، سيتم نقل البروتين الانصهار BlaM-CBU0077 في الخلية المضيفة وسوف CLإيف الركيزة BlaM، عبر النشاط β-اكتاماز، مما تسبب في فصل الأصباغ اثنين وأدى إلى الحنق الفوضى وإشارة مضان الأزرق (450 نانومتر) بعد الإثارة في 410 نانومتر (C). ويمكن لكل من إشارات مضان الأخضر والأزرق يكون الكشف باستخدام قارئ لوحة مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
. الشكل 2. تخطيطي لمحة عامة عن عكسي ترنسفكأيشن وإزفاء الفحص سير العمل يوم 1: إعداد C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة يوم 4: transfect عكسي باستخدام 40 نانومتر سيرنا والبذور هيلا 229 الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية من 3.92 × 10 3 خلايا / جيد في صينية 96-جيدا يوم 5: الفصلوسائل الإعلام أنج يوم 7: قياس مجموع العوامل الوراثية / مل من C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة باستخدام QPCR وبالتالي تصيب خلايا transfected العكس مع وزارة الداخلية من 300. يوم 8: إضافة 6X صبغ التحميل وقياس مضان وتحديد عدد الخلايا الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تخطيط لوحة 96-جيدا تستخدم لإعداد ترنسفكأيشن عكسي والبذر من هيلا 229 خلايا. آبار "على بياض" (كما هو موضح باللون الأحمر) تحتوي على وسائل الإعلام فقط، وليس في حاجة إلى إضافة أي سيرنا أو هيلا 229 الخلايا. يستخدم مكتب المدعي العام سيرنا (كما هو موضح باللون الأزرق الفاتح للآبار غير المصابة والأزرق الداكن للآبار المصابة) كوسيلة لمراقبة عدم استهداف، نظرا لأنه تم الأمثل للديهم عدد أقل من الآثار بعيدا عن الهدف. والمارون وآبار خضراء تمثل Rab5A وRab7A سيرنا، على التوالي. يستخدم PLK1 سيرنا (كما هو موضح باللون الأصفر) كمقياس للكفاءة ترنسفكأيشن عن فقدان التعبير PLK1 يمكن أن تحدث مسارات الموالية لأفكارك وموت الخلايا واسعة النطاق في الغالبية العظمى من خطوط الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. القيم الممثل QPCR ط المستعملة ل quantitate إجمالي عدد جينوم / مل في C. البورنيتية pBlaM-CBU0077 الثقافة. (A) الشروط دورة المستخدمة في QPCR تعداد عدد من العوامل الوراثية / مل في الثقافات الكوكسيلا. يتم تمثيل القيم ط لكل المعايير والعينات في رسومية (ب) والعددي (C)الأشكال. (D) وبلغ متوسط ​​قيم ط م القياسية، رسوم بيانية، وحسب خط اتجاه لوغاريتمي. باستخدام المعادلة ومتوسطات عينة ط م تقدر العدد الكلي للجينوم / مل في C. تم تحديد ثقافة البورنيتية pBlaM-CBU0077 لتكون 2.31 ​​× 10 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. إزفاء من نقطة / آي سي إم المستجيب BlaM-CBU0077 أثناء سيرنا إسكات Rab5A وRab7A. هيلا 229 الخلايا و transfected العكس مع سيرنا محددة لRab5A (الحانات المارون)، Rab7A (أشرطة خضراء)، مكتب المدعي العام (أشرطة زرقاء) أو PLK1 (أشرطة صفراء) وحضنت لمدة 72 ساعة قبل الإصابة مع C. سلالة البورنيتية pBlaM-CBU0077 في وزارة الداخلية من 300 لمدة 24 ساعة. بعد رانه إضافة الركيزة BlaM، وقد تم قياس مضان باستخدام قارئ صفيحة (أ) يوضح الجدول القيم مضان الخام تم الحصول عليها من تجربة واحدة جنبا إلى جنب مع 450: 520 نانومتر نسبة نسبة إلى سيطرة مكتب المدعي العام غير المصابة بعد الطرح القيم الفارغة (وسائل الإعلام فقط، أي الخلايا). يتم عرض مستوى النبات (ب) وبقاء الخلية (C) كنسبة مئوية يعني ± الانحراف المعياري بالنسبة لمكتب المدعي العام عكس الخلايا المصابة transfected من ثلاث تجارب مستقلة. * القيمة الاحتمالية <0.05. ** ف قيمة <0.01، **** ف قيمة <0.0001 (الاقتران، طالبة ر -test). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون تركيز أونج>
حمض الستريك 13.4 ملم
سترات الصوديوم 16.1 ملم
فوسفات البوتاسيوم 3.67 ملي
كلوريد المغنيسيوم 1 ملم
كلوريد الكالسيوم 0.02 ملي
كبريتات الحديد 0.01 ملي
كلوريد الصوديوم 125.4 ملم
L-السيستين 1.5 ملم
neopeptone 0.1 جم / لتر
الأحماض casamino 2.5 جم / لتر
الميثيل بيتا سيكلودكسترين 1 جم / لتر
RPMI 125 مل / لتر

الجدول 1. المكونات المطلوبة لجعل 1X ACCM-2.

xt.within صفحة = "دائما">

الجدول 2. حجم 1X سيرنا العازلة المطلوبة لترطيب المجففة بالتبريد سيرنا إلى التركيز المناسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظم إفراز، والبروتينات المستجيب البكتيرية هذه أنظمة النقل في سيتوبلازم الخلايا المضيفة، هي عنصر الفوعة المهم أن تستخدم العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض إنشاء العدوى داخل محاريب تنسخي فريدة من نوعها. وكانت محورا للعديد من المجموعات البحثية لتحقيق التفاعل بين المؤثرات البكتيرية والبروتينات المضيف وتأثير هذه المؤثرات لها على مسارات الخلوية المضيف. بحوث محدودة جدا، إن وجدت، وبحث إمكانية بروتينات المضيف ليكون من الضروري لنجاح النبات المستجيب البكتيرية.

في هذه الدراسة استخدمنا تلزم، الممرض داخل الخلايا الكوكسيلا البورنيتية، العامل المسبب للحمى Q الحيوانية المصدر. بعد دخول الخلايا المضيفة، والمحتوية على فجوة الكوكسيلا اتجار بشكل سلبي من خلال مسار التقامي الكنسي حتى التوصل إلى المستمدة يحلول فجوة الحمضية، حيث يعيد إلى أرقام عالية جدا. وبصرف النظر عن اتخاذ ADVANTAجنرال الكتريك من الطبيعي مسار الاتجار المضيف، وقدرة الكوكسيلا لتأسيس مكانة تنسخي ناجحة يعتمد أيضا على نوع وظيفية نظام IVB إفراز (T4SS) والمستجيب لاحق النبات 8،17. هذا النظام إفراز مماثل وظيفيا للجيدا اتسم نقطة / آي سي إم T4SS من البكتيريا. وقد تجلى ذلك على نحو مناسب من خلال استكمال المسوخ نقطة / ICM محددة من البكتيريا مع الجينات الكوكسيلا كل منها 19،20. على الرغم من أن T4SSs كل من البكتيريا والكوكسيلا ضرورية للنسخ المتماثل، توقيت عندما يتم تنشيط هذه الأنظمة هو مختلف تماما، ويعكس طبيعة متباينة من محاريب تنسخي لكل منهما. يتم تشغيل البكتيريا T4SS فور اتصال مع الخلايا المضيفة والنبات السريع للمؤثرات يسمح للبكتيريا لتجنب الافتراضي endosomal-الليزوزومية الطريق، وبدلا من خلق فريدة من نوعها المستمدة ER الخلاء تنسخيلو 42. في المقابل، لم يتم تنشيط T4SS من الكوكسيلا حتى ما يقرب من 8 ساعات بعد العدوى، بعد البكتيريا تصل إلى الحمضية المستمدة يحلول فجوة 21.

وبالنظر إلى أن الكوكسيلا تعبر بشكل سلبي من خلال مسار التقامي والنظام النبات لم يتم تنشيط حتى تصل إلى يحلول، تقدم فرصة فريدة نفسها لاستخدام الكوكسيلا كأداة لدراسة النضج التقامي. متطلبات لجنة تنسيق المفردات لتصبح يحمض قبل translocated المستجيبات يشير إلى أن عددا من البروتينات المضيف مهمة لإزفاء من البروتينات المستجيب في السيتوبلازم المضيفة، على وجه الخصوص، ولكن ليس على سبيل الحصر، البروتينات المشاركة في مسار الاتجار التقامي. الاستفادة من سيرنا بطريقة هادفة محددة يمكننا أن نبدأ في إلقاء الضوء على دور البروتينات المضيف معينة على النبات المستجيب. في هذه الدراسة ركزنا على اثنين من البروتينات التي تنظم trafficki التقامي حقيقية النواةوتوقع نانوغرام الطريق، وبالتالي لإحداث النبات من الكوكسيلا المستجيب CBU0077. Rab5A والسيطرة Rab7A الغشاء الانصهار مع الإندوسومات المبكرة والمتأخرة، على التوالي. إسكات أي من هذه البروتينات باستخدام سيرنا أدى إلى انخفاض ملحوظ في كفاءة النبات من CBU0077 عند مقارنة بالمجموعة الضابطة مكتب المدعي العام سيرنا (الشكل 5B). وتعكس هذه النتائج تمثيلية هو موضح هنا نتائجنا السابقة التي نشرت 21 وتوفر مزيدا من التحقق من صحة إلى أهمية هذه البروتينات راب الإنسان إلى الكوكسيلا المستجيب النبات. كما تم توظيف هذه التقنية لتوصيف تأثير عمليات المضيفة الأخرى على الكوكسيلا نقطة / آي سي إم المستجيب النبات. تم العثور على مجمع retromer إلى أن تكون مهمة للنسخ المتماثل بين الخلايا من الكوكسيلا. عن طريق إسكات مكونات retromer، وذلك باستخدام سيرنا، ثم إجراء فحص النبات نحن يمكن أن تظهر مطلوب أن retromer لخلق البيئة التي الحثالكوكسيلا المستجيب النبات 43.

على الرغم من أن نتائج ممثل المبين هنا هو المقارنة بين سيطرة مكتب المدعي العام المصابة وسيرنا استهداف Rab5A وRab7A، بروتوكول يمكن تعديلها وفقا لاحتياجات التجريبية. على سبيل المثال، يمكن أن تقارن مستوى النبات المستجيب للخلايا transfected مع سيرنا المجمعة أو خلايا غير transfected.

وكان التركيز في هذه الدراسة بالذات وإلزام، داخل الخلايا الممرض C. البورنيتية والبروتينات المتورطين في الاتجار التقامي، ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة ضمن يمكن تكييفها بسهولة لمسببات الأمراض داخل الخلايا وخارج الخلية الأخرى التي تستخدم أنظمة إفراز لالفوعة. في الواقع، وفحص النبات على أساس الفلورسنت التي تعتمد على النشاط β-اكتاماز داخل السيتوبلازم المضيف المستخدمة هنا، وقد تم بالفعل استخدام على نطاق واسع عبر مجموعة من مسببات الأمراض 30-32،35،44. وبطبيعة الحال، فإن ظروف إصابةخطوط الخلايا المحددة المستخدمة يجب أن تتكيف مع تعكس متطلبات عدوى البكتيريا محددة. بالإضافة إلى ذلك، تنصهر المستجيب الذاتية المعروف بيتا لاكتاماز أمر بالغ الأهمية لنجاح الأساليب المذكورة الداخل. وأوضح أحد الاعتبارات الهامة لنجاح تنفيذ البروتوكول هنا هو تأثير إسكات هدفا مضيف معين يمكن أن يكون على دخول البكتيريا وتكرارها لاحقا. هنا، يتم قياس المستجيب النبات من قبل الكوكسيلا 24 إصابة آخر ساعة. في هذه الحالة، والبكتيريا داخل الخلايا الأخرى، وقدرة الكائن الحي على الدخول إلى الخلايا المضيفة أمر حيوي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إسكات الجينات المحددة تؤثر أيضا تكرار البكتيرية وبالتالي تغيير مستوى النبات ملاحظتها. التأكيد على أن سيرنا إسكات لا تؤثر بشكل كبير على دخول البكتيريا و / أو تكرارها، وبالتالي كفاءة النبات، ويمكن تحقيق باستخدام المجهر أو ترقيم البكتيريا. والنباتيمكن أن تكون البيانات ثم تطبيع لعدد من الخلايا المصابة في العلاج سيرنا. وتكرار البكتيري لا مرتبك البيانات المقدمة هنا كما الكوكسيلا يخضع قليل من دون تكرارها خلال فترة الحضانة 24 ساعة.

يتطلب هذا الأسلوب ترنسفكأيشن كفاءة من سيرنا إلى الخلايا المضيفة لضمان إسكات كاف من الجينات في المصالح. مع هذا في الاعتبار، واختيار كاشف ترنسفكأيشن الصحيح أمر مهم للغاية. وبصرف النظر عن رد الفعل والظروف التي استخدمت في هذه الدراسة معينة، والتي تم الأمثل لهيلا 229 خلية، فإن هناك العديد من الكواشف الأخرى لاختيار من بينها. كفاءة ضربة قاضية باستخدام الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة يمكن أن يكون كميا باستخدام RT-QPCR لضمان أن يتم تحديد كل من كاشف الأنسب وأن سيرنا تم اختيارها خصيصا يستهدف نسخة من الفائدة. وإن لم يكن الواردة في هذه الدراسة، ونحن أثبتنا سابقا كفاءة ضربة قاضية لكل من Rab5A وRab7A باستخدام RT-qPCR 21. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام أجسام مضادة ضد هدف من الاهتمام والتأكيد من قبل لطخة غربية يمكن أيضا تأكيد سيرنا إسكات أهداف محددة.

تشمل اثنين من الاعتبارات الهامة الأخرى أن تأخذ علما عند استخدام سيرنا إمكانية الآثار بعيدا عن الهدف وبقاء الخلية من خلايا transfected. بعيدا عن الهدف تحدث الآثار عندما يتم تدميرها أيضا أهدافا غير مقصودة. هذا يمكن أن يؤدي إلى تغييرات المظهري وقد يؤدي إلى ايجابيات كاذبة. في هذه الدراسة يمكننا استخدام مجموعة من أربعة الدوبلكس سيرنا إسكات الهدف مضيف واحد. إذا إسكات هدف معين يؤدي إلى انخفاض في كفاءة النبات، التحقق من صحة أن هذه النتيجة ليست نتيجة لآثار بعيدا عن الهدف لا يمكن أن يتحقق عن طريق فصل الدوبلكس سيرنا أربعة وتكرار فحص النبات. ما لا يقل عن اثنين من أصل أربعة الدوبلكس سيرنا يجب أن يبرهن على وجود النمط الظاهري مماثلة إلى تجمع سيرنا الأصلي. وبهذه النتيجة، يمكن للمرء أن يكون واثقا للغاية أن آر احظكفاءة anslocation لا يرجع إلى الآثار بعيدا عن الهدف. صحة النتائج النبات تنتج هي أيضا تعتمد على بقاء الخلية. تطبيق وصمة عار النوى بعد فحص النبات يمكن تعداد بقاء الخلية التالية سيرنا إسكات. في حالة PLK1، موت الخلايا كبيرا يمكن ملاحظتها بسهولة دون تلطيخ. ومع ذلك، وذلك باستخدام epifluorescence المجهر تمثيل أكثر دقة يمكن تحقيقه. إذا كان عن طريق إسكات معين هدف المضيف موت الخلايا كبيرة ويلاحظ، على سبيل المثال 50٪ مقارنة بالمجموعة الضابطة، فإنه من غير المحتمل أن صورة دقيقة ويمكن الاستدلال على ذلك لأهمية هذا البروتين مضيف خاص لالنبات من المؤثرات. كما هو مبين في هذه الدراسة، على الرغم من إسكات إما Rab5A أو Rab7A له تأثير طفيف على بقاء الخلية (الشكل 5C)، لا ينطق هذا التخفيض بما فيه الكفاية لينفي صحة البيانات النبات ملاحظتها. وهناك اعتبار آخر فيما يتعلق الفل بقاء الخليةبسبب سيرنا إسكات هو ملاحظة أن موت الخلايا كبيرا في كثير من الأحيان يؤدي إلى زيادة في نسبة النبات. وأحسن دليل على ذلك البيانات النبات ذكرت لPLK1 (الشكل 5A). النتائج عدد الخلايا انخفاض في زيادة نسبية في تعدد العدوى. سيؤدي هذا إلى زيادة معدل الإصابة وبالتالي نسبة النبات.

وإن لم يكن الواردة في هذه الدراسة، والتصور من النبات المستجيب يمكن أيضا أن تسفر عن نتيجة الكمية مجانية. يمكن باستخدام المجهر epifluorescent مزودة تمريرة طويلة مزدوج اللون مرآة لمنفصل الإثارة وانبعاث ضوء توفر الملاحظة البصرية من الخلايا مضان BlaM الركيزة. وثمة بديل محتمل للنظام مراسل β-اكتاماز هو الاستفادة من نظام مراسل محلقة-محلقة. على غرار نظام مراسل وصفها هنا، وتنصهر في الجينات التي تهم جين محلقة الأدينيلات التي تعتمد على كالمودولين (cyaA البورديتيلة السعال الديكي. النبات المستجيب يمكن قياس الكمي من الخلايا دوري امبير (المخيم) باستخدام عدة ELISA المناعية. منذ نشاط CyaA يعتمد كليا على كالمودولين الخلية المضيفة، التي هي موجودة فقط في العصارة الخلوية المضيف، ويؤكد النبات المستجيب زيادة في مستويات المخيم. على الرغم من أن كما تم استخدام هذا الأسلوب بنجاح لقياس المستجيب النبات لمجموعة متنوعة من البكتيريا 45-47، وتحديد حجم مخيم داخل الخلايا يعتمد على تحلل الخلايا المضيفة لاستخراج المخيم، وهي عملية أكثر timeconsuming مقارنة مع الطريقة الموصوفة داخل. قياس النبات المستجيب باستخدام نظام مراسل β-اكتاماز القائم على الحنق أكثر كفاءة منذ الركيزة BlaM يمكن أن تضاف مباشرة إلى الخلايا ويمكن قياس مضان في غضون ساعات. بالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا يمكن أن تتكيف بسهولة أكبر لتحقيق نتائج عالية الإنتاجية، وخاصة في شكل 96-جيدافي.

تعتمد العديد من مسببات الأمراض البكتيرية على أنظمة بروتين النبات لإدخال البروتينات المستجيب في الخلايا المضيفة السماح تعديل وظائف الخلية المضيفة لصالح العامل الممرض. وتستخدم أنظمة الرابع إفراز نوع من البكتيريا داخل الخلايا مثل البكتيريا، الكوكسيلا والبروسيلا ونوع وتستخدم الثالث إفراز نظم من قبل مجموعة من مسببات الأمراض بما في ذلك الكلاميديا، ربط والأضواء E. كولاي والسالمونيلا. وبمقارنة تأثير إسكات التعبير عن البروتينات المضيف محددة على النبات المستجيب من قبل مجموعة من مسببات الأمراض، ويمكن إجمال فهم العوامل المضيفة اللازمة لالنبات المستجيب من أنواع معينة من أنظمة إفراز أو محددة إلى الممرض الفردية. وهذا يوفر نهجا فريدا لدراسة تعقيدات التفاعلات المضيف الممرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

تركيز الهدف
1μM 5 ميكرومتر 10μM 20μM
ابتداء من حيوانات الخلد
1 نانومول 1 مل 200 ميكرولتر 100 ميكرولتر 50 ميكرولتر
2 نانومول 2 مل 400 ميكرولتر 200 ميكرولتر 100 ميكرولتر
5 نانومول 5 مل 1 مل 500 ميكرولتر 250 ميكرولتر
10 نانومول 10 مل 2 مل 1 مل 500 ميكرولتر
20 نانومول 20 مل 4 مل 2 مل 1 مل
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

عدوى، العدد 113، التفاعلات الممرض المضيف، وأنظمة إفراز البكتيريا، بيتا لاكتاماز النبات الفحص، BlaM الركيزة، مضان، علم الأحياء الدقيقة ومسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا،
تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; أثناء سيرنا إسكات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter