Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Abstract

Coxiella burnetii, de verwekker van Q-koorts is een intracellulair pathogeen die is gebaseerd op een Type IV Dot / Icm secretiesysteem een replicatieve niche richten. Een cohort van effectoren van translocatie via dit systeem in de gastheercel gastheerprocessen manipuleren en kan de instelling van een uniek lysosoom afgeleide vacuole voor replicatie. De hier gepresenteerde methode omvat de combinatie van twee goed gevestigde technieken: specifiek gen silencing middels siRNA en meting van effector translocatie gebruik van een op FRET gebaseerde substraat dat is gebaseerd op β-lactamase-activiteit. De toepassing van deze twee benaderingen, kunnen we beginnen met de rol van gastheerfactoren in bacteriële secretie systeem functioneren en effector translocatie begrijpen. In deze studie onderzoeken we de rol van Rab5A en Rab7A, beide belangrijke regulatoren van de endocytische mensenhandel route. We tonen aan dat silencing de uitdrukking van eiwit resulteert in een afname van effector translocation efficiency. Deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere intracellulaire en extracellulaire pathogenen die ook secretie systemen gebruiken onderzoeken. Op deze wijze kan een globaal beeld van gastheerfactoren betrokken in bacteriële translocatie effector geopenbaard.

Introduction

Coxiella burnetii is een unieke intracellulaire ziekteverwekker die de zoönotische menselijke besmetting Q-koorts veroorzaakt. Deze ziekte wordt geassocieerd met een breed spectrum van klinische presentaties uitstrekt van asymptomatische seroconversie tot levensbedreigende chronische infectie die vaak manifesteert als endocarditis jaar na blootstelling 1. Menselijke besmetting ontstaat voornamelijk door inhalatie van gecontamineerde aërosolen met herkauwers grote reservoir van infectie, in het bijzonder melkkoeien, schapen en geiten. Hoewel Coxiella-infectie bij deze dieren is meestal subklinische, kan de infectie leiden tot abortus en de aanzienlijke bacteriële belasting in het geboorteproces vloeistof en placenta kan de lokale omgeving 1 besmetten. Een voorbeeld van de enorme last dergelijke vervuiling kan hebben op zowel de volksgezondheid en de landbouwindustrie onlangs waargenomen in de Q-koorts die zich in Nederland 2. Tussen 2007 en2010, meer dan 4.000 menselijke gevallen van Q-koorts werden gediagnosticeerd en deze uitbraak was gekoppeld aan significante besmetting van geitenhouderijen 3. Bovendien, Coxiella een potentieel biologisch wapen, zoals geclassificeerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention, vanwege de milieustabiliteit van de bacteriën en lage infectieuze dosis nodig ernstige morbiditeit en mortaliteit 4 veroorzaken.

Coxiella bestaat in twee fasen: Fase I organismen, geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zijn zeer virulent en Fase II organismen sterk verzwakt in vivo. Bijvoorbeeld, na een aantal overzettingen in vitro van Coxiella burnetii Nine Mile organismen Fase I, Fase II bacteriën werden geleverd dat een onomkeerbare chromosomale deletie bevatten waardoor afgeknotte lipopolysaccharide (LPS) 5. Deze stam C. burnetii NMII, fenotypisch vergelijkbaar met Fase I in weefselkweek modellen en zorgt voor een veiligere modusl voor onderzoekers om Coxiella pathogenese in laboratoria 5 bestuderen. De laatste jaren hebben verscheidene doorbraken snel gevorderd het gebied van Coxiella genetica. Het meest opvallend is de ontwikkeling van axenische media (aangezuurd citraat cysteine ​​midden - ACCM-2) heeft het celvrije groei van Coxiella toegestaan ​​in zowel vloeibare en vaste media 6,7. Dit resulteerde in de directe verbetering van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor Coxiella waaronder een induceerbare genexpressie systeem, shuttle vectoren en willekeurig transposon systemen 8-11. Meest recent, twee methoden voor doelgerichte geninactivatie zijn ook ontwikkeld, die de weg vrijmaakt voor de behandeling van specifieke virulentie-gen kandidaten 12.

Na internalisatie door alveolaire macrofagen, Coxiella gerepliceerd naar grote aantallen binnen een membraangebonden compartiment aangeduid als de Coxiella- met vacuole (CCV). Het CCV vereist gastheer endocytische mensenhandel thruwe vroege en late endosomen, totdat het rijpt in een lysosoom afgeleide organel 13. Gedurende dit proces, verkrijgt het CCV gastheer factoren die ofwel verschijnen tijdelijk of verbonden blijven met de vacuole, waaronder, maar niet beperkt tot, Rab5, Rab7, CD63 en LAMP-13-15 januari. Replicatie van Coxiella binnen gastheercellen is volledig afhankelijk van een volledig functionele Dot / Icm Type IVB Afscheiding System (T4SS) 8,16,17. Dit afscheidingssysteem is een multi-eiwitstructuur ancestrally betrekking conjugatie systemen en omvat zowel bacteriële als vacuolaire membranen bacteriële eiwitten leveren, genaamd effectoren, in de gastheercel cytoplasma 18. De Coxiella T4SS functioneel vergelijkbaar met de goed gekarakteriseerde Type IVB Dot / Icm afscheidingssysteem van Legionella pneumophila 19,20. Interessant is dat activering van de T4SS en daaropvolgende translocatie effector pas optreedt Coxiella de zure lysosoom afgeleide bereiktorganel, ongeveer 8 uur na infectie 17,21. Tot op heden hebben meer dan 130 Dot / Icm effectoren geïdentificeerd 9,17,22-24. Veel van deze effectoren waarschijnlijk een belangrijke rol spelen tijdens de replicatie van Coxiella binnen gastheercellen; Echter, slechts een paar effectoren zijn functioneel gekarakteriseerd 25-29.

In dit onderzoek gebruiken we een fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op splitsing van de CCF2-AM FRET substraat (hierna het BLAM substraat) via β-lactamase activiteit in de gastheercel cytoplasma (Figuur 1). Het gen van belang wordt gefuseerd aan TEM-1 β-lactamase (BLAM) op een reporterplasmide die constitutieve expressie verschaft. De BLAM substraat bestaat uit twee fluoroforen (coumarine en fluoresceïne), die een FRET-paar vormen. Excitatie van de cumarine in FRET resultaten van het fluoresceïne en groene fluorescentie-emissie in afwezigheid van effector translokatie; Indien de BlaM-effector-eiwit translocatie in de gastheer cytoplasma, de resulterende β-lactamase activiteit splitst de β-lactam ring van het BLAM substraat, het scheiden van het FRET paar producerende blauwe fluorescentie-emissie na excitatie. Deze translocatie assay is bewezen als een benadering van effector eiwitten te identificeren van een reeks verschillende intracellulaire en extracellulaire bacteriën, waaronder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropathogene E. coli, Salmonella en Brucella 17,30-35.

Om de rol van specifieke host factoren op Coxiella effector translocatie bepalen we gebruik van een bekende methode voor het gene silencing bekend als RNA-interferentie, in het bijzonder kleine interfererende RNA (siRNA). Oorspronkelijk geïdentificeerd in Caenorhabditis elegans, RNA-interferentie is een geconserveerd endogeen cellulair proces dat wordt gebruikt voor het aangeboren defense tegen virussen en genregulatie 36,37. Na binding van sequentie-specifieke siRNA, afbraak van mRNA vindt plaats via RISC (RNA-geïnduceerd silencing complex) waardoor specifiek gen silencing of 38 knockdown. In deze studie werd gebruikt siRNA targeten twee gastheereiwitten, Rab5A en Rab7A, die belangrijke regulatoren van de endocytische route zijn. De impact van zwijgen Rab5A en Rab7A op effector translocatie werd vastgesteld met behulp van C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 werd geselecteerd als zij eerder werd aangetoond dat getransloceerd door de Dot / Icm secretie systeem van Coxiella 17.

Gebruik makend van beide siRNA gene silencing en de fluorescencebased translocatie test hier beschreven, beginnen we een rol voor host factoren te vestigen in de translocatie van effector eiwitten door Coxiella. Deze benadering kan worden toegepast op een breed scala aan zowel intracellulaire als extracellulaire bacteriën die vergelijkbaar secretio bezittenn systemen verantwoordelijk voor de translocatie van effector eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Alle procedures met betrekking tot de groei of manipulatie van Coxiella burnetii RSA439 NMII moeten worden uitgevoerd in een Physical Containment Level 2 Laboratorium en binnen een biologische veiligheid kast in overeenstemming met de plaatselijke richtlijnen. Een schematisch diagram van de reverse transfectie en translocatie assay workflow hierna beschreven wordt getoond in figuur 2.

1. Bereiding van C. burnetii Cultuur uitdrukken CBU0077 gefuseerd aan ß-lactamase (pBlaM-CBU0077) (DAY 1)

  1. Bereid 1X ACCM-2 6:
    1. Combineer de in tabel 1 genoemde componenten. Pas de pH op 4,75 met 6 M NaOH en filter steriliseren (niet autoclaaf). ACCM-2 stabiel gedurende ongeveer drie weken opgeslagen bij 4 ° C.
  2. Genereer C. burnetii pBlaM-CBU0077 voorraden.
    1. Infect HeLa 229 cellen met C. burnetii stam die pBlaM-CBU0077 en doorgang tot grote vacuoles worden waargenomen in de meeste cellen.
      1. Groeien de C. burnetii stam die pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 met 3 ug / ml chlooramfenicol in een 75 cm2 weefselkweek kolf ontluchtingsdop gedurende 7 dagen bij 37 ° C in 5% CO2, 2,5% O 2.
      2. C. Centrifugeer de burnetii pBlaM-CBU0077 cultuur bij 15.000 xg gedurende 15 min bij RT.
      3. Resuspendeer de pellet in 20 ml DMEM + 10% foetaal kalfsserum (FCS) + 3 ug / ml chlooramfenicol (onderhoudsmedium). Verwijder het afdrukmateriaal uit een 50% confluente 75 cm 2 kolf van 229 HeLa-cellen. Opnieuw geschorst toevoegen C. burnetii om HeLa 229 cellen. Incubeer gedurende 2 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2 om infectie van HeLa 229 cellen te bepalen.
      4. Splits cellen in 175 cm2 weefselkweek kolf.
        1. Verwijder het afdrukmateriaal uit de 75 cm 2 kolf en was de monolaag tweemaal met 10 ml voorverwarmd PBS.
        2. Voeg 1 ml of 0,05% trypsine-EDTA-oplossing en plaats cellen bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 3-5 minuten om cellen los.
        3. Resuspendeer cellen in 10 ml onderhoudsmedium. Voeg 2 ml geresuspendeerde cellen in een 175 cm2 kolf die 38 ml onderhoudsmedium.
        4. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende nog eens 3-5 dagen tot 100% confluentie bereikt en grote vacuolen waargenomen.
    2. Verzamelen van de supernatant cm2 kolf 175, voeg 10 ml dH 2 O het geïnfecteerde HeLa 229 cellen te bedekken en incubeer gedurende 15 minuten op geïnfecteerde cellen te lyseren.
    3. Combineer supernatant en gelyseerde cellen en pellet bij 15.000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Re-schorten pellet in 10 ml dH 2 O. Lyse cellen verder door herhaaldelijk passeren van de re-suspensie door een 23G naald bevestigd aan een 10 ml injectiespuit ten minste 20 maal. Pellet bij 500 xg gedurende 5 minuten om cellulair afval te verwijderen.
      5. <li> Verwijder supernatant en pellet bij 15.000 xg gedurende 15 min bij RT C. verzamelen burnetii.
    5. Resuspendeer C. burnetii in DMEM + 10% FCS en kwantificeren van het aantal bacteriën per 4. Verdun tot 1 x 10 9 genomen / ml middels DMEM + 10% FCS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO), 50 pl aliquot voorraden in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C.
  3. Inoculeer 10 ml voorverwarmde ACCM-2 met 3 ug / ml chlooramfenicol bij 20 gl C. burnetii pBlaM-CBU0077 stam 17 (van de voorraden gegenereerd in 1.2 opgeslagen bij -80 ° C) in een 25 cm 2 weefselkweek kolf met geventileerde dop. Groeien bacteriële kweek gedurende 7 dagen bij 37 ° C in 5% CO2, 2,5% O 2.

2. Reverse Transfectie van siRNA en het zaaien van HeLa 229 cellen (DAG 4)

  1. Bij gebruik van de experimentele siRNA voor het eerst bereidende siRNA als volgt:
    1. Kort centrifuge de gevriesdroogde siRNA dat de siRNA pellet wordt verzameld op de bodem van de buis.
    2. Resuspendeer de pellet siRNA tot een uiteindelijke voorraad concentratie van 20 uM pipetteren de bijpassende hoeveelheid 1x siRNA buffer (tabel 2).
    3. Pipetteer de oplossing op en neer 3-5 keer te mengen en plaats op een orbitale menger gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, het buisje elke 5-10 minuten.
    4. Kort centrifugeer de buis zorgen siRNA wordt verzameld op de bodem van de buis.
    5. Aliquot het siRNA in 50 ui porties in microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
    6. Tot 1 uM werkconcentratie van siRNA genereren Pipetteer 950 ul 1X siRNA buffer in een 50 pi aliquot voorraad (20 uM) indien nodig. Opmerking: Deze 1 uM werkconcentratie kunnen worden bevroren en ontdooid meerdere malen voor herhaalde transfecties.
  2. Plaats DMEM + 10% FCS,0,05% trypsine-EDTA en PBS in een 37 ° C waterbad (of equivalent) gedurende 30 minuten opwarmen vóór gebruik.
  3. Bereiding van transfectie componenten:
    Opmerking: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor HeLa 229 cellen in een 96-well microplaat met zwarte wanden en vlakke, transparante bodem. Optimalisatie van de hoeveelheid transfectiereagens, Concentratie van siRNA en zaaidichtheid van de cellen nodig zijn voor verschillende cellijnen.
    1. Voor elk putje Gebruik 0,1 ul transfectiereagens, 15,9 ul verlaagde serum medium (minimaal essentieel media gebruikt voor transfecties, zie tabel van Materialen) en 4 ui van 1 uM siRNA (resulterend in een uiteindelijke siRNA concentratie van 40 nm). Gebruik aparte microcentrifugebuizen voor OTP, Plk1, Rab5A en Rab7A. Meet elke test staat in drievoud. Een voorbeeld van een 96-putjesplaat lay-out getoond in Figuur 3.
      Let op: Dit protocol omvat het gebruik van twee controles: OTP en Plk1. OTP isbestaat uit vier samengevoegde siRNA die zijn geoptimaliseerd voor off-target effecten verminderen en aldus OTP wordt gebruikt als een negatieve, niet-targeting control. Scrambled siRNA kan ook worden gebruikt als een negatieve controle. Verlies van Plk1 expressie leidt tot uitgebreide celdood in een aantal cellijnen door het induceren van pro-apoptotische routes en daardoor Plk1 siRNA wordt gebruikt als positieve controle voor transfectie waarbij celdood correleert met transfectie efficiency.
      1. Voor elke experimentele siRNA transfectie Combineer 0,4 gl transfectiereagens en 63,6 pl verlaagde serum medium per individuele microfugebuis. Vortex alle microfugebuizen en dat onderdelen complex gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Voeg 16μl van elke experimentele siRNA met de corresponderende microfuge buizen met de transfectie complex. Vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Het is van belang 30 minuten niet te overschrijden, zoals transfectie-efficiëntie zal afnemen.
  4. Tijdens de 20 min incubation (2.3.1.2) voeg 20 ul van de transfectiereagens + verlaagde serum medium + siRNA te mengen in de juiste putjes van een steriele zwarte, platte heldere bodem 96-well tray.
  5. Zodra de 20 min incubatietijd is voltooid, zaad HeLa 229 cellen bij een dichtheid van 3,92 x 10 3 cellen / putje.
    1. Oogst HeLa 229 cellen van een confluente of sub-samenvloeiende 75 cm2 weefselkweek kolf in voorverwarmde DMEM + 10% FCS en hersuspenderen cellen tot een uiteindelijke dichtheid van 4,9 x 10 4 cellen / ml volgens standaardwerkwijzen. Om transfectie-efficiëntie is niet in het gedrang te verzekeren, de voorbereiding van cellen tijdens de 20 minuten incubatieperiode (2.3.1.2).
      1. Was de monolaag van HeLa 229 cellen tweemaal met 10 ml voorverwarmde PBS.
      2. Voeg 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA-oplossing en plaats HeLa 229 cellen bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 3-5 minuten om cellen los.
      3. Verzamel cellen in 9 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS. Tel cellen met een hemocytometer en bereiden cellen tot een uiteindelijke dichtheid van 4,9 x 10 4 cellen / ml gebruikt DMEM + 10% FCS.
    2. Pipetteer 80 ul van HeLa 229 cellen bij een densiteit van 4,9 x 10 4 cellen / ml in elk putje dat de transfectiereagens + gereduceerd serum medium + siRNA mix bevat. Dit komt overeen met een celdichtheid van 3,92 x 10 3 cellen / putje.
      Opmerking: Achtergrond aftrekken is vereist voor het BLAM substraat.
      1. Niet cellen of siRNA toevoegen "blank" putjes (Figuur 3). In plaats daarvan, voeg 80 ul van DMEM + 10% FCS om deze opgezet in drievoudige putjes.
    3. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C + 5% CO2.

3. Media Change (Dag 5)

  1. Na 24 uur werd medium verwijderd met een multichannel adapter aangesloten op een vacuümbron of handmatig met een multi-kanaal pipet en vervangen door 100 ul vers voorverwarmened DMEM + 10% FCS.
  2. Incubeer nogmaals 48 uur bij 37 ° C + 5% CO2.
  3. Op dit punt, controleer de levensvatbaarheid van de cellen visueel gebruik van een standaard lichtmicroscoop. Als het omgekeerde transfectie slaagt, zal aanzienlijke celdood in de putjes die Plk1 siRNA opgemerkt vergeleken OTP siRNA.

4. Kwantificering van Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain met behulp van qPCR (DAY 7)

  1. Na 7 dagen groei in ACCM-2 bij 37 ° C in 5% CO2, 2,5% O 2 (1,3), gecentrifugeerd 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultuur bij 15.000 xg gedurende 15 min bij RT.
  2. Resuspendeer de bacteriële pellet in 10 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS. Bereid 1:10 en 1: 100 verdunningen van de cultuur (monster) met behulp van dH 2 O.
  3. Invoering van de vereiste componenten voor qPCR.
    Opmerking: gDNA extractie kan worden uitgevoerd op voorhand en opgeslagen bij -20 ° C until vereist.
    1. Voorbereiding van de normen:
      1. Uittreksel gDNA van Coxiella burnetii RSA439 NMII wild type stam gekweekt in ACCM-2 bij 37 ° C in 5% CO2, 2,5% O 2 gedurende 7 dagen onder toepassing van een gDNA extractie kit, volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Meet de gDNA-concentratie (g / ul) met een Nanodrop (of equivalent) bij een absorptie van 260 nm.
      3. Bereken het aantal exemplaren van het genoom per ul met behulp van onder de volgende formule, en om te zetten in het aantal genomen / ml.
        Vergelijking
      4. Pas het aantal genomen / ml tot 10 9 / ml (in een eindvolume van 100 ui) in een nieuwe microfugebuis behulp dH 2 O. Dit kan worden gekookt gedurende 10 min en bewaard bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
      5. Op de dag van de infectie, het genereren 10-voudige seriële verdunningen van 10 8 genomen / ml tot 10 5 genomen / ml van de 10 9 genooms / ml bouillon.
        1. Pipetteer 10 ul van 10 9 genomen / ml in 90 ul van dH 2 O tot 10 8 genomen / ml genereren. Vortex te mengen. Pipetteer 10 ul van 10 8 genomen / ml in 90 ul van dH 2 O tot 10 7 genomen / ml genereren. Vortex en herhaal tot 10 5 genomen / ml.
    2. Opgericht qPCR reactie. Maak een master mix voor 25 putten om eventuele pipetteerfouten. Voor elk putje, gebruiken 10 pi qPCR Master Mix; 2 pl ompA primermengsel (4.3.2.2) en 3 pl dH 2 O.
      Opmerking: OmpA is een buitenmembraan eiwit van C. burnetii '39 en een 82 baseparen sectie van een sterk geconserveerd gebied werd geselecteerd voor gebruik als een probe zoals hierboven 40 beschreven.
      1. Opgericht elke norm (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genomen / ml) en monster (1:10 en 1: 100 verdunning) in een 96-wells PCR scheuren plaat (niet-skirted) in duplo of triplo, respectievelijk. Voeg 5 ul monster of standaard in de geschikte putjes.
      2. Gebruik dH 2 O, verdund zowel de ompA voorwaartse primer (5'- CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') en reverse OmpA primer (5'- CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') tot een eindconcentratie van 4 uM en te combineren in dezelfde microfugebuis.
        Opmerking: Het ompA primer mengsel kan vooraf worden bereid en bewaard bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
      3. Combineer 250 pi qPCR Master Mix, 50 pi ompA primer mix, 75 pl dH 2 O en vortex te mengen. Voeg 15 ul van deze master mix aan putjes die ofwel standaarden of monsters.
      4. Plaats 8-deksel PCR strip caps op de juiste putjes en Pulscentrifugeer de PCR-buizen te zorgen dat alles wordt verzameld op de bodem van de buizen.
      5. Zet de volgende programma op een kwantitatieve PCR machine: 50 ° C gedurende 2 min, 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 45 cycli van 95 ° C gedurende 1 sec en 60 ° C gedurende 20 seconden (Figuur 4A).
    3. Analyseer de Ct (cyclus drempelwaarde) waarden uit de qPCR:
      1. Breng de Ct-waarden naar een spreadsheet met behulp van export-functie van het programma.
      2. Een spreidingsdiagram van de normen 10 5 genomen / ml tot 10 9 genomen / ml (uitgedrukt als log-waarden). Gooi geen duidelijke uitschieters tussen de monsters in drievoud. Genereer een logaritmische trendlijn te bepalen en de vergelijking van de grafiek.
      3. Bereken het aantal genomen / ml in het monster met de volgende formule gegenereerd 4.3.3.2. Vergeet niet om rekening te houden met de eerste verdunning (1:10 en 1: 100) van de monsters.

5. Infectie van Reverse getransfecteerde cellen (DAY 7)

  1. Na berekening van de totale genomen / ml in C. klisnetii pBlaM CBU0077-kweek wordt gebruikt voor infectie, passen geresuspendeerde bacteriekweek om cellen te infecteren met een MOI van 300 in een eindvolume van 50 gl / putje met behulp van voorverwarmde DMEM + 10% FCS.
    Opmerking: De verwachte dichtheid van de gezaaide HeLa 229 cellen met een normale verdubbeling tijd na 72 uur is 3,136 × 10 4 cellen / putje. De hoeveelheid bacteriën nodig te infecteren met een MOI van 300 is 9,408 x 10 6 in 50 pi, wat neerkomt op 1,88 x 10 8 bacteriën / ml.
    1. Met de waarde berekend uit de qPCR (genomen / ml) (4.3.3.3), vul de geresuspendeerde bacteriën via voorverwarmde DMEM + 10% FCS in een eindvolume van 2 ml met omgekeerde getransfecteerde cellen te infecteren.
  2. Verwijder de aanwezige media uit de blanco en reverse getransfecteerde cellen.
  3. Voeg 50 ul van de verdunde bacteriën (1,88 x 10 8 bacteriën / ml) aan de geschikte putjes. Voeg 50 ul DMEM + 10% FCS voor de lege en Uninfected putten.
  4. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C + 5% CO2.

6. Toevoeging van blam Substrate Onzeker Translocatie Bepaal (DAY 8)

  1. Bereid de oplossingen voor de blam substraat 6x laden oplossing.
    Opmerking: Oplossing A, B en C worden verschaft binnen de BLAM substraat kit (zie tabel of Materials). Oplossing B kan een precipitaat vormen bij KT. Warm deze oplossing tot 37 ° C voor gebruik en het neerslag moet lossen.
    1. Bij gebruik van de kit voor het eerst, voeg 185 pl DMSO (de BLAM substraat kit) aan de gedroogde oplossing A. Vervolgens slaan de geresuspendeerde Oplossing A bij -20 ° C.
    2. Bereid 0,1 M oplossing probenicid vooraf en bewaar in 1 ml porties bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
      1. Bereid 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH 2 O).
      2. Bereid 100 mM Na-fosfaatbuffer pH 8 (1,56 g NaH 2 PO 4 .2H 2 HPO 4 in 100 ml dH 2 O).
      3. Ontbinden 1,25 g probenicid in 22 ml 0,4 M NaOH door krachtig roeren.
      4. Voeg 22 ml 100 mM Na-fosfaatbuffer pH 8 (oplossing troebel) en roer het neerslag dat zich vormt lossen.
      5. Breng de pH op 8 (indien nodig) onder toepassing van 1 M NaOH / HCl.
      6. Roer krachtig en verwarm licht (<50 ° C) totdat de oplossing voornamelijk helder.
      7. Filter (0,2 urn poriegrootte) en aliquot in 1 ml volumes. WINKEL aliquots bij -20 ° C.
  2. Voor elk putje, gebruik 0,06 pl Oplossing A, 0,54 pl Oplossing B, 7,9 pi Solution C en 1,5 pi 0,1 M probenicide. Een master mix voor 30 putjes door eerst het combineren van 1,8 pl van oplossing A en 16,2 pl van oplossing B in een microfugebuis. Meng goed met behulp van een vortex. Voeg 237 ul van oplossing C en 45 gl 0,1 M probenicid. Vortex alle comp combinerents.
    Opmerking: De 6x loading oplossing is maximaal 4 uur (in het donker), maar moet worden bereid dicht mogelijk vóór gebruik.
  3. Voeg 10 ul van de 6x beladingsoplossing rechtstreeks in alle lege en achterzijde getransfecteerd putten zonder de bestaande media.
  4. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker.
  5. Om het niveau van translocatie bepalen kwantificeren van de hoeveelheid van fluorescentie met behulp van een microplaat-afleesinrichting.
    Let op: de volgende procedure is specifiek voor de ClarioSTAR microplaat reader. Equivalente microplaat lezer kan ook worden gebruikt.
    1. Maak een nieuwe fluorescentie-intensiteit protocol met behulp van endpoint als leesmodus.
    2. Pas de fundamentele parameters als volgt:
      1. Selecteer 96-well microplaat.
      2. Onder optische instellingen selecteren 2 multichromatics met de volgende door de gebruiker gedefinieerde instellingen: (1) Input 410-10 nm excitatie en 520-10 nm emissie. (2) Input 410-10 nm excitatie en 450-10 nm emissie. Zorgen voor goed multichromatics is geselecteerd.
      3. Selecteer orbitale middeling met een diameter van 3 mm.
      4. Onder optische Selecteer bodem optiek.
      5. Onder snelheid en precisie, selecteer nauwkeurig. Dit komt overeen met acht regio per putje.
    3. Pas de plaat lay-out door het selecteren van de juiste putten als monsters.
    4. Kies start de meting.
    5. Verwijder het deksel en plaats de lade in de plaat lezer. Om te voorkomen dat het bereiken van de maximale fluorescentie-waarden zorgen voor de gain-waarde wordt aangepast. Om dit te doen, het uitvoeren van een aanpassing van de versterking op één van de besmette waterputten die omgekeerde is getransfecteerd met OTP siRNA. Dit komt overeen met de hoogste verwachte translocatie.
    6. Selecteer start de meting om alle geschikte putjes met gebruikmaking van bodem- fluorescentie te meten bij een excitatie van 410 nm en de emissie van zowel de 450 nm en 520 nm voor blauwe en groene fluorescentie, respectievelijk.

7. Analyse van de resultaten:

  1. Bereken de verhoudingvan 450 nm tot 520 nm (blauw naar groen) voor alle monsters volgende lege verminderen en te uiten ten opzichte van de niet-geïnfecteerde OTP monster.
    Let op: de volgende analyse stappen zijn bedoeld voor een eenvoudige spreadsheet-programma.
    1. Met behulp van de export-functie op de microplaat lezer, overdracht van de ruwe fluorescentie waarden verkregen voor zowel de 520 nm en 450 nm emissie golflengtes (6.5) in een spreadsheet.
    2. Bereken het gemiddelde van de "lege" waarden (media, geen cellen) voor de golflengte 520 nm door toevoeging van het ruwe 520 nm fluorescentiewaarden en delen door het aantal putten (3). Herhaal dit met behulp van de blanco 450 nm golflengte waarden. Deze waarden vertegenwoordigen de achtergrondfluorescentie door de 96-well plaat en media.
    3. Trek de achtergrond fluorescentie. Met de waarden verkregen in 7.1.2 aftrekken van het gemiddelde van de blanco golflengte 520 nm van alle monster 520 nm fluorescentiewaarden. Herhaal dit voor de 450 nm golflengte waarden.
    4. Voor het verkrijgen van de 450: 520 nm-verhouding met de blanco gecorrigeerde waarden (7.1.3). Verdeel elk monster 450 nm fluorescentie waarde van de bijbehorende 520 nm waarde.
    5. Bereken het gemiddelde van de geïnfecteerde OTP ratiowaarden door toevoeging van de 450: 520 nm verhoudingswaarden (uit 7.1.4) en te delen door het aantal putten (3).
    6. Bereken de verhouding van de monsters ten opzichte van ongeïnfecteerde OTP wordt door het 450: 520 nm verhouding 7.1.4 berekend door het gemiddelde van de geïnfecteerde OTP verhouding berekende 7.1.5.

8. Toevoeging van kernen Stain om te bepalen aantal cellen na Translocatie Assay (DAY 8)

  1. Na kwantificering van fluorescentie Verwijder media bevattende 6x beladingsoplossing van alle putjes met behulp van een meerkanaals adapter bevestigd aan een vacuümbron of handmatig met een multi-kanaal pipet.
  2. Voeg 50 ul van 4% PFA (paraformaldehyde) -oplossingin PBS om alle geschikte putjes om cellen te repareren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
  3. Verwijderen 4% PFA PBS-oplossing (vanaf 8,1) en was cellen tweemaal met 75 pl PBS.
  4. Voeg 50 ul van een cel permeabele nucleaire kleuring, bijvoorbeeld DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) aan elk putje. Acquire beelden met een fluorescentiemicroscoop en kwantificeren van het aantal kernen aanwezig in elk putje na siRNA behandeling met geschikte software voor beeldanalyse, zoals ImageJ 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor deze studie, de C. burnetii pBlaM CBU0077-stam werd geselecteerd als CBU0077 Eerder is aangetoond een translocatie effector van Coxiella Dot / Icm secretiesysteem 17 zijn. Vóór infectie, het totale aantal genomen / ml in de zeven dagen C. burnetii pBlaM-CBU0077 kweek werd geteld middels qPCR. Figuur 4 toont een voorbeeld van de cyclus drempelwaarde (Ct) waarden verwacht beide standaarden en monsters na qPCR. De Ct-waarden (grafisch weergegeven in de Amplification Plot (figuur 4B) en numeriek (figuur 4C)) werden uitgevoerd en geanalyseerd zoals beschreven in 4.3.3. Gebaseerd op de representatieve gegevens getoond, waren 2,31 x 10 8 genomen / ml in 10 ml geresuspendeerd bacteriecultuur (figuur 4D). Om de juiste bacteriële verdunning genereren (1,88 x 10 8 genomen / ml in 2 ml), 1,63 ml geresuspendeerde bacteriën werd 370 pl vers voorverwarmde DMEM + 10% FCS toegevoegd. Cellen getransfecteerd met siRNA reverse werden vervolgens geïnfecteerd met C. burnetii pBlaM-CBU0077 bij een MOI van 300 gedurende 24 hr.

Na incubatie van de getransfecteerde omgekeerde geïnfecteerde cellen met BLAM substraat kwantificering van translocatie effector kan worden bepaald met een fluorescentie plaatlezer. Na analyse uit 7 kunnen alle verhouding waarden zijn genormaliseerd naar geïnfecteerde OTP ook genormaliseerd naar geïnfecteerde OTP. Het niveau van effector translocatie na silencing van ontvangende genen worden gegroepeerd in drie resultaten na vergelijking met geïnfecteerde OTP control: (1) Geen wijziging; (2) Toegenomen effector translocatie; (3) Afgenomen effector translocatie. Daaropvolgende statistische analyse, bijvoorbeeld een Student t test kan worden gebruikt om de significantie van elke gevonden verschil t bepaleno besmet OTP controle. Het resultaat van silencing hetzij Rab5A of Rab7A op effector translocatie van drie onafhankelijke experimenten is weergegeven in figuur 5A. Een significante daling van het niveau van blam-CBU0077 translocatie optrad tijdens silencing zowel Rab5A en Rab7A vergeleken OTP controle (p-waarde = 0,0088 (Rab5A) en p-waarde = 0,0059 (Rab7A), gepaarde, Student t-test). Het effect van siRNA behandeling op cellevensvatbaarheid werd vastgesteld. Na translocatie assay werden cellen gefixeerd, gekleurd met een kernen vlek en vervolgens gekwantificeerd. Zoals getoond in figuur 5C, hoewel behandeling met Rab5A of Rab7A leidt tot een vermindering van levensvatbaarheid van de cellen vergeleken met OTP controle (12% en 31%, respectievelijk), deze vermindering is niet zo ernstig als Plk1 (97%), een gen bekend om celdood te veroorzaken (p-waarde = 0,0102 (Rab5A), p-waarde = 0,0081 (Rab7A), p-waarde <0,0001 (Plk1), gepaarde, Student t-test). Deze resultaten tonen hoe silencing host genes middels siRNA kan negatief de niveaus van bacteriële translocatie effector veranderen.

Figuur 1
Figuur 1. Het werkingsmechanisme van de blam Substrate tijdens infectie. C. burnetii wordt geïnternaliseerd door gastheercellen en vormt een lysosoom afgeleide vacuole aangeduid als de Coxiella-bevattende vacuole. 24 uur na infectie worden cellen geladen met het membraan permeabel BLAM substraat dat twee fluoroforen die een FRET paren (A) bezit. Aangezien β-lactamase dat wil zeggen, geen translocatie van de BLAM-CBU0077 effector, excitatie van de cumarine in 410 nm resulteert in FRET fluoresceïne, waargenomen als een groene fluorescentiesignaal (520 nm) (B). bij een functionele Dot / Icm secretiesysteem de blam-CBU0077 fusieproteïne wordt getransloceerd in de gastheercel en cleave het BLAM substraat, via β-lactamase activiteit, waardoor de scheiding van de twee kleurstoffen en waardoor FRET verstoring en een blauwe fluorescentiesignaal (450 nm) na excitatie bij 410 nm (C). Zowel de groene en blauwe fluorescentie-signalen worden gedetecteerd met behulp van een fluorescentie plaatlezer. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
. Figuur 2. Schematisch overzicht van de Reverse Transfectie en Translocation Assay Workflow Dag 1: Bereid de C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultuur Dag 4:. achterzijde transfecteren middels 40 nM siRNA en zaden HeLa 229 cellen bij een uiteindelijke dichtheid van 3,92 x 10 3 cellen / putje in een 96-putjes Dag 5:. Change media Dag 7:. kwantificeren van de totale genoom / ml van de C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultuur met behulp van qPCR en vervolgens achteruit getransfecteerde cellen te infecteren met een MOI van 300. Dag 8:. Voeg 6x laden kleurstof, het meten van fluorescentie en kwantificeren van het aantal cellen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. De 96-well Plate Layout gebruikt voor het opzetten van de Reverse Transfectie en zaaien van HeLa 229 cellen. De "blanco" bronnen (in het rood) bevatten alleen de media en niet de toevoeging van ofwel siRNA of HeLa 229 cellen niet nodig. De OTP siRNA (getoond in lichtblauw voor geïnfecteerde putjes en donkerblauw op geïnfecteerde putjes) wordt gebruikt als een niet-targeting control, aangezien gebleken is geoptimaliseerdhebben minder off-target effecten. De bordeaux en groene putten vertegenwoordigen de Rab5A en Rab7A siRNA, respectievelijk. Plk1 siRNA (weergegeven in geel) wordt gebruikt als een maat voor de transfectie-efficiëntie als het verlies van Plk1 expressie pro-apoptotische routes en uitgebreide celdood in een overgrote meerderheid van de cellijnen kan induceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Vertegenwoordiger qPCR Ct waarden die worden gebruikt om het totale aantal van genomen / ml in C. kwantificeren burnetii pBlaM-CBU0077 Culture. (A) De cyclus omstandigheden die in de qPCR het aantal genomen / ml sommen in Coxiella culturen. De Ct-waarden voor beide standaarden en monsters worden grafisch voorgesteld met (B) en numerieke (C)formats. (D) De standaard Ct-waarden werden gemiddeld, een grafiek en een logaritmische trendlijn werd berekend. Met de vergelijking en de gemiddelden van het monster Ct waarden het totale aantal genomen / ml in C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultuur werd bepaald op 2,31 x 10 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. transplantaat van Dot / Icm Effector blam-CBU0077 tijdens siRNA Silencing van Rab5A en Rab7A. HeLa 229 cellen werden omgekeerde getransfecteerd met siRNA specifiek voor Rab5A (kastanjebruine bars), Rab7A (groene balken), OTP (blauwe balken) of Plk1 (gele balken) en gedurende 72 uur voor infectie met C. burnetii pBlaM-CBU0077 stam bij een MOI van 300 voor 24 uur. na tHij toevoeging van het BLAM substraat, werd fluorescentie gemeten met een microplaat reader (A) De tabel toont de ruwe fluorescentiewaarden verkregen uit een enkel experiment naast de 450. 520 nm verhouding ten opzichte van geïnfecteerde OTP controle na aftrekken van de blanco waarden (media , geen cellen). Het niveau van translocatie (B) en de cellevensvatbaarheid (C) worden voorgesteld als het percentage gemiddelde ± standaardafwijking ten opzichte van OTP reverse getransfecteerde geïnfecteerde cellen uit drie onafhankelijke experimenten. * P-waarde <0,05; ** P-waarde <0,01; **** P-waarde <0,0001 (gepaarde, Student t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

bestanddeel Concentratie
citroenzuur 13,4 mmol
natriumcitraat 16,1 mmol
kaliumfosfaat 3,67 mM
magnesium chloride 1 mM
calciumchloride 0,02 mM
ijzersulfaat 0,01 mM
natriumchloride 125,4 mM
L-cysteïne 1,5 mM
neopeptone 0,1 g / l
casaminozuren 2,5 g / l
methyl beta cyclodextrine 1 g / l
RPMI 125 ml / l

Tabel 1. De componenten die nodig zijn om te maken 1x ACCM-2.

Tabel 2. Volume van 1x siRNA buffer Vereist voor Hydrating gevriesdroogde siRNA naar de juiste concentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Secretiesystemen, en de bacteriële effector eiwitten deze transportsystemen in het cytoplasma van gastheercellen, zijn een belangrijke virulentie onderdeel dat vele pathogene bacteriën gebruiken om een ​​infectie in unieke replicatieve niches stellen. De focus van veel onderzoeksgroepen is om de interactie tussen bacteriële effectoren en gastheer- en de invloed van deze effectoren hebben voor talrijke cellulaire routes onderzocht. Zeer weinig onderzoek, eventueel, de mogelijkheid van gastheereiwitten noodzakelijk is voor succesvolle effector bacteriële translocatie worden onderzocht.

In deze studie hebben we de obligate, intracellulaire ziekteverwekker Coxiella burnetii, de verwekker van zoönotische Q-koorts. Na binnenkomst in gastheercellen, de Coxiella bevattende vacuole passief trafieken via de canonieke endocytische route tot het bereiken van een zuur-lysosoom afgeleid vacuole, waar het repliceert tot zeer hoge aantallen. Afgezien van het nemen van Advantage van de normale gastheer handel route, het vermogen van Coxiella een succesvolle replicatie niche vast steunt ook op een functionele soort IVB secretiesysteem (T4SS) en daaropvolgende translocatie effector 8,17. Dit afscheidingssysteem functioneel analoog aan de goed gekarakteriseerde Dot / Icm T4SS Legionella. Dit werd treffend gedemonstreerd door aanvulling van specifieke dot / icm mutanten van Legionella met hun respectieve Coxiella genen 19,20. Hoewel de T4SSs zowel Legionella en Coxiella essentieel zijn voor replicatie, het tijdstip wanneer deze systemen worden geactiveerd is heel anders en reflecteert de uiteenlopende aard van hun replicatieve niches. De Legionella T4SS wordt geactiveerd onmiddellijk na contact met gastheercellen en de snelle translocatie van effectoren kan de bacteriën aan de standaard endosomale-lysosomale route te vermijden en in plaats daarvan een unieke-ER afgeleid replicatieve vacuümle 42. Daarentegen wordt de T4SS van Coxiella niet geactiveerd tot ongeveer 8 uur na infectie, na de bacteriën de zure lysosoom afgeleide vacuole 21 te bereiken.

Gezien het feit dat Coxiella passief op doorreis is via de endocytische route en de translocatie niet is geactiveerd totdat het de lysosoom bereikt, een unieke gelegenheid zich voordoet om Coxiella te gebruiken als een hulpmiddel om endocytische rijping te bestuderen. De eis dat de CCV te worden aangezuurd voordat effectors translocatie blijkt dat een aantal gastheereiwitten belangrijk zijn voor de translocatie van effector eiwitten in het cytoplasma gastheer, in het bijzonder, maar niet beperkt tot, eiwitten die betrokken zijn in de handel endocytische route. SiRNA gebruik in een specifieke gerichte wijze kunnen we beginnen met de rol van bepaalde gastheer eiwitten op effector translocatie helderen. In deze studie hebben we ons gericht op twee eiwitten die de eukaryotische endocytische trafficki regulerenng route, en dus werden voorspeld dat translocatie van de Coxiella effector CBU0077 bewerkstelligen. Rab5A en Rab7A control membraanfusie met vroege en late endosomen, respectievelijk. Silencing één van deze eiwitten door het gebruik siRNA resulteerde in een significante afname in translocatie efficiëntie van CBU0077 vergelijking met de controlegroep OTP siRNA (figuur 5B). De hier getoonde representatieve resultaten weerspiegelen onze eerdere gepubliceerde bevindingen 21 en verdere validatie van het belang van deze menselijke Rab eiwitten aan Coxiella effector translocatie. Deze techniek is ook toegepast om het effect van andere gastheerprocessen op Coxiella Dot / Icm effector translocatie karakteriseren. De retromer complex bleek belangrijk voor intracellulaire replicatie van Coxiella zijn. Door silencing retromer componenten behulp siRNA, en vervolgens uitvoeren van een translocatie assay konden aantonen dat retromer nodig milieueisen induceert creërenCoxiella effector translocatie 43.

Hoewel de representatieve resultaten hier getoond is een vergelijking tussen geïnfecteerde OTP controle en siRNA gericht Rab5A en Rab7A Het protocol kan worden aangepast aan experimentele behoeften. Bijvoorbeeld kan het niveau van effector translocatie ook worden vergeleken met cellen die met scrambled siRNA of ongetransfecteerde cellen.

De focus van deze bijzondere studie was de obligate, intracellulaire pathogeen C. burnetii en eiwitten betrokken bij endocytische handel echter binnen de beschreven werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere intracellulaire en extracellulaire pathogenen die secretie systemen voor virulentie gebruiken. Inderdaad, de fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op β-lactamase activiteit in de ontvangende cytoplasma hier gebruikt, reeds uitvoerig gebruikt in verschillende pathogenen 30-32,35,44. Uiteraard is de infectie van de voorwaardenspecifieke cellijnen moeten aangepast zijn aan de infectie eisen van specifieke bacteriën reflecteren. Bovendien, een bekende endogene effector gefuseerd aan P-lactamase is essentieel voor het succes van de beschreven methoden in. Een belangrijke overweging voor een succesvolle uitvoering van het protocol hier beschreven is de impact silencing een bepaalde host doel op bacteriële binnenkomst en de daaropvolgende replicatie zou kunnen hebben. Hier wordt effector translocatie door Coxiella gemeten 24 uur na infectie. In dit geval, en andere intracellulaire bacteriën, het vermogen van het organisme om binnen te komen in gastheercellen essentieel. Bovendien kan specifiek gen silencing ook invloed bacteriële replicatie derhalve veranderen van de mate van translocatie waargenomen. Bevestiging dat siRNA silencing geen significant effect bacteriële binnenkomst en / of replicatie, en derhalve translocatie efficiëntie kan worden bereikt met behulp van microscopie of nummering bacteriën. de translocatiegegevens kunnen vervolgens worden genormaliseerd voor het aantal geïnfecteerde cellen per siRNA behandeling. Bacteriële replicatie is niet overtuigde de hier gepresenteerde gegevens als Coxiella ondergaat weinig tot geen replicatie tijdens de 24 uur incubatietijd.

Deze werkwijze vereist efficiënte transfectie van siRNA in gastheercellen voldoende onderdrukking van het gen van belang. Met het oog daarop kiezen van de juiste transfectiereagens is zeer belangrijk. Naast het reagens en omstandigheden die in dit onderzoek, die is geoptimaliseerd voor HeLa 229 cellen, zijn er tal van andere reagentia te kiezen. De knock-down efficiëntie met verschillende transfectie reagentia kunnen worden gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR te verzekeren dat de meest geschikte reagens wordt geselecteerd en dat de siRNA specifiek gekozen richt de transcriptie plaats. Hoewel niet in dit onderzoek hebben we eerder aangetoond dat de knockdown efficiëntie van zowel Rab5A en Rab7A middels RT-qPCR 21. Daarnaast kan het gebruik van antilichamen tegen het doelwit van belang en bevestiging door western blot bevestigen ook siRNA silencing van specifieke doelen.

Twee andere belangrijke overwegingen om kennis te nemen van de bij het gebruik van siRNA nemen onder meer de mogelijkheid van off-target effecten en de levensvatbaarheid van de cellen van de getransfecteerde cellen. Off-target effecten optreden bij onbedoelde doelen ook worden vernietigd. Dit kan leiden tot fenotypische veranderingen en kan leiden tot vals positieven. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van een pool van vier siRNA duplexen een enkele host doelwit zwijgen op te leggen. Als silencing een bepaald doel leidt tot een vermindering van translocatie efficiëntie validatie dat dit resultaat niet door off-target effecten kunnen worden bereikt door scheiding van de vier siRNA duplexen en herhalen van de translocatie assay. Ten minste twee van de vier siRNA duplexen moet een soortgelijke fenotype naar de originele siRNA zwembad aan te tonen. Met dit resultaat, kan men zeer zeker zijn dat de waargenomen translocation efficiëntie is niet te wijten aan off-target effecten. De geldigheid van de translocatie resultaten opgeleverd is ook afhankelijk van de levensvatbaarheid van de cellen. De toepassing van een kernen vlek na de translocatie assay maakt opsomming van de levensvatbaarheid van de cellen na siRNA silencing. Bij Plk1 kunnen aanzienlijke celdood gemakkelijk worden waargenomen zonder kleuring; Het gebruik van epifluorescentie microscopie een nauwkeurigere representatie kunnen worden bereikt. Als bij een bepaalde gastheer silencing doel significante celdood wordt waargenomen, bijvoorbeeld 50% vergeleken met de controle, is het onwaarschijnlijk dat een accuraat beeld kan worden afgeleid over het belang van die bepaalde gastheer eiwit translocatie effectors. Zoals getoond in deze studie, hoewel zwijgen ofwel Rab5A of Rab7A heeft een lichte invloed op de levensvatbaarheid van de cellen (figuur 5C), wordt deze verlaging niet voldoende uitgesproken om de geldigheid van de translocatie data waargenomen ontkrachten. Een andere overweging met betrekking tot de levensvatbaarheid van de cellen follvanwege siRNA silencing is de waarneming dat aanzienlijke celdood leidt vaak tot een toename van de translocatie ratio. Dit wordt treffend gedemonstreerd door de translocatie gegevens gerapporteerd voor Plk1 (Figuur 5A). Het verminderde aantal cellen resulteert in een evenredige toename van de multipliciteit van infectie. Dit zal de infectie en daarmee de translocatie-ratio te verhogen.

Hoewel niet in dit onderzoek, kunnen visualisatie van effector translocatie gratis kwantitatief resultaat ook verkregen. Met behulp van een epifluorescerende microscoop uitgerust met een lange pas dichroïsche spiegel om afzonderlijke excitatie en emissie licht kan een visuele waarneming van intracellulaire blam substraat fluorescentie te bieden. Een mogelijk alternatief voor het β-lactamase reporter systeem is het adenylaat-cyclase reportersysteem gebruiken. Vergelijkbaar met het reportersysteem beschreven, wordt het gen van interesse gefuseerd aan een calmoduline-afhankelijk adenylaatcyclase-gen (cyaA Bordetella pertussis. Effector translocatie kan worden gemeten door kwantificering van intracellulair cyclisch AMP (cAMP) door een immunoassay ELISA kit. Aangezien de activiteit van CyaA is geheel afhankelijk gastheercel calmodulin, dat alleen aanwezig is in de gastheer cytosol wordt effector translocatie bevestigd door een verhoging van cAMP niveaus. Hoewel deze methode is ook met succes gebruikt om effector translocatie maat voor een verscheidenheid van bacteriën 45-47, kwantificering van intracellulair cAMP afhankelijk van de lysis van gastheercellen cAMP, een proces dat meer tijdrovend dan de beschreven werkwijze binnen halen. Meting van effector translocatie via de FRET gebaseerde β-lactamase reporter systeem is efficiënter omdat de BLAM substraat direct aan de cellen worden toegevoegd en fluorescentie kan worden gemeten binnen enkele uren. Daarnaast kan de hier beschreven werkwijze gemakkelijker worden aangepast aan high-throughput resultaten oplevert, met name in een 96-well vormop.

Veel bacteriële pathogenen afhankelijk eiwit translocatie systemen effector eiwitten te introduceren in gastheercellen waarbij modulatie van talrijke celfuncties het pathogeen profiteren. Type IV secretie systemen worden gebruikt door intracellulaire bacteriën zoals Legionella, Brucella Coxiella en type III secretie systeem worden gebruikt door verschillende pathogenen, waaronder Chlamydia, het aan- en uitwissen E. coli en Salmonella. Door het effect van expressie van specifieke silencing gastheereiwitten op effector translocatie vergelijken door diverse pathogenen, zou inzicht gastheerfactoren noodzakelijk effector translocatie door bepaalde typen secretiesystemen of specifiek voor een individuele pathogeen worden toegelicht. Dit verschaft een unieke benadering van de complexiteit van gastheer-pathogeen interacties te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

doelconcentratie
1 M 5 uM 10 pM 20 uM
Vanaf Moles
1 nmol 1 ml 200 gl 100 gl 50 gl
2 nmol 2 ml 400 gl 200 gl 100 gl
5 nmol 5 ml 1 ml 500 gl 250 gl
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 gl
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

Infectie Host-pathogeen interacties bacteriële secretie systemen β-lactamase translocatie assay blam substraat fluorescentie microbiologie intracellulaire bacteriële pathogenen, Gene silencing siRNA moleculaire biologie
Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter