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Immunology and Infection

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Indagare le interazioni tra batteri patogeni ei loro ospiti è un'area importante della ricerca biologica. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per misurare effettrici traslocazione da Coxiella burnetii durante siRNA silenziamento genico mediante substrato Blam.

Abstract

Coxiella burnetii, l'agente eziologico della febbre Q, è un patogeno intracellulare che si basa su un tipo IV Dot / Icm secrezione di sistema per stabilire una nicchia replicativa. Una coorte di effettori sono traslocato attraverso questo sistema nella cellula ospite per manipolare i processi di accoglienza e consentire la creazione di un vacuolo lisosoma di derivazione unica per la replica. Il metodo qui presentato comporta la combinazione di due tecniche ben consolidate: specifica silenziamento genico con siRNA e misura di traslocazione effettore utilizzando un substrato FRET-based che si basa sull'attività β-lattamasi. L'applicazione di questi due approcci, possiamo cominciare a comprendere il ruolo dei fattori di accoglienza in batterico funzione del sistema di secrezione e traslocazione effettrici. In questo studio abbiamo esaminato il ruolo di Rab5A e Rab7A, entrambi importanti regolatori del percorso traffico endocitico. Abbiamo dimostrato che il silenziamento dell'espressione di una proteina risultati in una diminuzione della effettori translocatioefficienza n. Questi metodi possono essere facilmente modificati per esaminare altri agenti patogeni intracellulari ed extracellulari che utilizzano anche sistemi di secrezione. In questo modo, un quadro globale dei fattori di accoglienza che partecipano batterica traslocazione effettrici può essere rivelata.

Introduction

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l'esposizione 1. L'infezione umana avviene principalmente attraverso l'inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l'infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l'infezione può innescare l'aborto e la notevole carica batterica all'interno del fluido parto e la placenta può contaminare l'ambiente locale 1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi 2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra 3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità 4.

Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) 5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori 5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato - ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi 6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali 8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l'inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l'esame specifico di virulenza geni candidati 12.

A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all'interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione 13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell'ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) 8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante 18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila 19,20. È interessante notare che l'attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l'acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l'infezione 17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati 9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata 25-29.

In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all'interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l'emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l'anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella 17,30-35.

Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell'RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell'RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione 36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento 38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L'impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella 17.

Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.

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Protocol

Nota: Tutte le procedure che coinvolgono la crescita o la manipolazione di Coxiella burnetii RSA439 NMII devono essere eseguite in un livello di contenimento fisico 2 Laboratorio e all'interno di una cappa di sicurezza biologica in conformità con le linee guida locali. Un diagramma schematico del flusso di lavoro trasfezione e dosaggio traslocazione inversa descritto di seguito è mostrata in figura 2.

1. Preparazione di C. burnetii cultura Esprimendo CBU0077 fusa al beta-lattamasi (pBlaM-CBU0077) (giorno 1)

  1. Preparare 1X ACCM-2 6:
    1. Combinare i componenti elencati nella tabella 1. Regolare il pH a 4,75 con 6 M NaOH e sterilizzare il filtro (non autoclave). ACCM-2 è stabile per circa tre settimane se conservato a 4 ° C.
  2. Genera C. scorte burnetii pBlaM-CBU0077.
    1. Infettare HeLa 229 cellule con il C. ceppo burnetii portando pBlaM-CBU0077 e il passaggio fino grande vacuoles si osservano nella maggior parte delle cellule.
      1. Far crescere la C. ceppo burnetii portando pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 contenente 3 mg / ml cloramfenicolo in 75 cm 2 tessuti pallone di coltura con tappo ventilato per 7 giorni a 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.
      2. Centrifugare la C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.
      3. Risospendere il pellet in 20 ml di DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS) + 3 mg / ml cloramfenicolo (mezzi di manutenzione). Rimuovere i supporti da un 50% confluenti 75 centimetri 2 fiasco di HeLa 229 cellule. Aggiungere ri-sospeso C. burnetii a HeLa 229 celle. Incubare per 2 giorni a 37 ° C in 5% CO 2 per consentire infezione di HeLa 229 cellule per stabilire.
      4. Suddiviso in cellule 175 centimetri 2 pallone di coltura tissutale.
        1. Rimuovere i supporti dal pallone 75 centimetri 2 e lavare il monostrato due volte con 10 ml di pre-riscaldato PBS.
        2. Aggiungere 1 ml of soluzione e posizionare le cellule 0,05% tripsina-EDTA a CO 2 37 ° C + 5% per 3 - 5 minuti per staccare le cellule.
        3. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di mantenimento. Aggiungere 2 ml di cellule risospese in un 175 centimetri 2 pallone contenente 38 ml di mezzi di manutenzione.
        4. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per altri 3 - 5 giorni fino a raggiungere il 100% di confluenza e si osservano grandi vacuoli.
    2. Raccogliere il surnatante dal cm 2 fiasco 175, aggiungere 10 ml di dH 2 O per coprire i infettate HeLa 229 cellule e incubare per 15 minuti per lisare le cellule infette.
    3. Combinare surnatante e cellule lisate e pellet a 15.000 xg per 15 minuti a RT.
    4. Risospendere pellet in 10 ml di dH 2 O. cellule Lisare ulteriormente volte passando dalla risospensione attraverso un ago 23G attaccato ad una siringa da 10 ml almeno 20 volte. Pellet a 500 g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
      5. <li> Rimuovere e surnatante pellet a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente per raccogliere C. burnetii.
    5. Risospendere C. burnetii in DMEM + 10% FCS e quantificare il numero di batteri come da 4. Diluire a 1 × 10 9 genomi / ml utilizzando DMEM + 10% FCS + 10% dimetilsolfossido (DMSO), le scorte microlitri aliquota 50 in tubi microcentrifuga e conservare a -80 ° C.
  3. Seminare 10 ml di pre-riscaldato ACCM-2 contenente 3 mg / ml cloramfenicolo con 20 ml di C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo 17 (dalle scorte generate in 1,2 conservati a -80 ° C) in 25 cm 2 tessuti pallone di coltura con tappo ventilato. Grow coltura batterica per 7 giorni a 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.

2. inversione trasfezione di siRNA e semina dei HeLa 229 cellule (Giorno 4)

  1. Quando si utilizza il siRNA sperimentale per la prima volta preparareil siRNA come segue:
    1. centrifugare brevemente il siRNA liofilizzato per garantire che il pellet siRNA viene raccolto sul fondo della provetta.
    2. Risospendere il pellet siRNA ad una concentrazione finale magazzino di 20 micron pipettando il volume appropriato di 1x siRNA tampone (Tabella 2).
    3. Pipettare la soluzione su e giù 3 - 5 volte per mescolare e posto su un mixer orbitale per 30 minuti a RT, invertendo il tubo ogni 5 - 10 min.
    4. Centrifugare brevemente il tubo per garantire la siRNA viene raccolto sul fondo della provetta.
    5. Aliquota del siRNA in 50 aliquote microlitri in tubi microcentrifuga e conservare a -20 ° C fino al momento.
    6. Per generare 1 micron concentrazione di siRNA di lavoro, pipetta 950 ml di 1X siRNA tampone in un magazzino aliquota 50 microlitri (20 micron) quando necessario. Nota: Questa concentrazione di lavoro 1 micron può essere freeze-scongelati più volte per trasfezioni ripetuti.
  2. Posizionare DMEM + 10% FCS,0,05% tripsina-EDTA e PBS in un bagno 37 ° C di acqua (o equivalente) per 30 minuti per riscaldare prima dell'uso.
  3. Preparazione di componenti di trasfezione:
    Nota: Il seguente protocollo è stato ottimizzato per HeLa 229 celle di una 96 pozzetti micropiastra con pareti nere e TV, fondo trasparente. Ottimizzazione della quantità di reagente di trasfezione, concentrazione di siRNA e semina densità delle cellule può essere necessario per differenti linee cellulari.
    1. Per ogni bene, usare 0,1 ml di reagente di trasfezione, 15,9 ml di medio ridotto di siero (supporti essenziali minimi utilizzati per trasfezioni, fare riferimento alla tabella dei materiali) e 4 ml di 1 micron siRNA (con una conseguente concentrazione di siRNA finale di 40 Nm). Utilizzare tubi microcentrifuga separate per OTP, Plk1, Rab5A e Rab7A. Misurare ogni condizione di test in triplice copia. Un esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti è mostrato in figura 3.
      Nota: Questo protocollo incorpora l'uso di due comandi: OTP e Plk1. OTP ècomposto da quattro siRNA pool che sono stati ottimizzati per ridurre gli effetti off-target e quindi OTP viene utilizzato come controllo non-targeting negativo. Rimescolate siRNA potrebbe anche essere usato come controllo negativo. Perdita di risultati di espressione Plk1 in vasta morte cellulare in un certo numero di linee cellulari inducendo percorsi pro-apoptotici e quindi Plk1 siRNA viene utilizzato come controllo positivo per trasfezione in cui la morte delle cellule è correlato alla efficienza di trasfezione.
      1. Per ogni trasfezione di siRNA sperimentale, si combinano 0,4 ml di trasfezione reagente e 63,6 ml di medio ridotto di siero in una provetta per microcentrifuga individuale. Vortex tutti i tubi microcentrifuga e permettono componenti complesse per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Aggiungere 16μl di ogni siRNA sperimentale per i tubi microcentrifuga corrispondenti contenenti il ​​complesso trasfezione. Vortex e incubare per 20 minuti a RT. Nota: è importante non superare 30 min, l'efficienza di trasfezione diminuirà.
  4. Durante la 20 min incubation (2.3.1.2) aggiungere 20 ml di reagente di trasfezione + medio ridotto di siero + siRNA mescolare nei pozzetti appropriati di un sterili nero, piatto chiaro vassoio a 96 pozzetti fondo.
  5. Non appena il periodo di incubazione di 20 min è completa, seme HeLa 229 cellule ad una densità di 3,92 × 10 3 cellule / pozzetto.
    1. Harvest HeLa 229 cellule da un confluenti o sub-confluenti 75 centimetri pallone di coltura tissutale 2 in DMEM pre-riscaldato + 10% FCS e risospendere le cellule ad una densità finale di 4,9 × 10 4 cellule / ml secondo metodi standard. Per garantire trasfezione l'efficienza non è compromessa, preparare cellule durante il periodo di incubazione 20 min (2.3.1.2).
      1. Lavare il monostrato di HeLa 229 cellule due volte con 10 ml di PBS preriscaldata.
      2. Aggiungere 1 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA e posto HeLa 229 cellule a 37 ° C + 5% CO 2 da 3 - 5 minuti per staccare le cellule.
      3. Raccogliere cellule in 9 ml di pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. conte cellule utilizzando un emocitometro e preparare cellule ad una densità finale di 4,9 × 10 4 cellule / ml utilizzando DMEM + 10% FCS.
    2. Pipettare 80 ml ​​di HeLa 229 cellule a densità di 4,9 × 10 4 cellule / ml in ciascun pozzetto che contiene il reagente di trasfezione + ridotto di siero media + siRNA mix. Ciò corrisponde ad una densità cellulare di 3,92 × 10 3 cellule / pozzetto.
      Nota: è necessario sottrazione del fondo per il substrato Blam.
      1. Non aggiungere celle o siRNA per pozzi "in bianco" (Figura 3). Invece, aggiungere 80 ml di DMEM + 10% FCS a questi pozzetti allestiti in triplice copia.
    3. Incubare per 24 ore a 37 ° C + 5% CO 2.

3. Variazione media (giorno 5)

  1. Dopo 24 ore, rimuovere il supporto utilizzando un adattatore multicanale collegato a una sorgente di depressione o manualmente con una pipetta multicanale, e sostituirlo con 100 ml di Preriscaldare frescoed DMEM + 10% FCS.
  2. Incubare per altri 48 ore a 37 ° C + 5% CO 2.
  3. A questo punto, verificare la vitalità delle cellule visivamente utilizzando un microscopio ottico standard. Se la trasfezione inverso ha avuto successo, la morte cellulare significativo sarà osservato nei pozzetti contenenti Plk1 siRNA rispetto al OTP siRNA.

4. Quantificazione di Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain utilizzando qPCR (Giorno 7)

  1. Dopo 7 giorni di crescita in ACCM-2 a 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2 (1.3), centrifugare il 10 ml C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.
  2. Risospendere il pellet batterico in 10 ml di pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. Preparare 1:10 e 1: 100 diluizioni della cultura (campione) con dH 2 O.
  3. Impostare i componenti necessari per la qPCR.
    Nota: Estrazione gDNA può essere eseguita in anticipo e conservato a -20 ° C untIl necessario.
    1. Preparazione di norme:
      1. Estratto gDNA da Coxiella burnetii RSA439 NMII wild type ceppo coltivato in ACCM-2 a 37 ° C in 5% di CO 2, 2,5% O 2 per 7 giorni utilizzando un kit di estrazione gDNA, secondo le istruzioni del produttore.
      2. Misurare la concentrazione gDNA (g / ml) usando un NanoDrop (o equivalente) in assorbanza a 260 nm.
      3. Calcolare il numero di copie del genoma per microlitri utilizzando la seguente formula seguente, e convertire in numero di genomi / ml.
        Equazione
      4. Regolare il numero di genomi / ml a 10 9 / ml (in un volume finale di 100 microlitri) in una nuova provetta per microcentrifuga utilizzando dH 2 O. Questo può essere bollita per 10 minuti e conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
      5. Il giorno dell'infezione, generare 10 diluizioni seriali di 10 8 genomi / ml a 10 5 genomi / ml del genoma 10 9s / magazzino ml.
        1. Pipettare 10 ml di 10 9 genomi / ml in 90 ml di dH 2 O per generare 10 8 genomi / ml. Vortex per miscelare. Pipettare 10 ml di 10 8 genomi / ml in 90 ml di dH 2 O per generare 10 7 genomi / ml. Vortex e ripetere fino a 10 5 genomi / ml.
    2. Impostare reazione qPCR. Creare un master mix per 25 pozzi per tenere conto di eventuali errori di pipettamento. Per ogni bene, utilizzare 10 ml qPCR Master Mix; 2 ml di ompA miscela di primer (4.3.2.2) e 3 ml di dH 2 O.
      Nota: OmpA è una proteina membrana esterna di C. burnetii '39 ed una sezione 82-base-pair in una regione altamente conservata è stato selezionato per essere utilizzato come sonda come descritto in precedenza 40.
      1. Impostare ogni standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genomi / ml) e del campione (1:10 e diluizione 1: 100) in un 96 pozzetti PCR strappare piastra (non-gonna) in due o tre esemplari, rispettivamente. Aggiungere 5 ml di campione o standard nei rispettivi pozzetti.
      2. Utilizzando dH 2 O, diluire sia il primer forward ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') e ompA primer reverse (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') ad una concentrazione finale di 4 mM e combinare nella stessa provetta per microcentrifuga.
        Nota: La miscela di primer ompA può essere preparata in anticipo e conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
      3. Unire 250 ml qPCR Master Mix, 50 microlitri ompA Primer Mix, 75 ml dH 2 O e vortex per miscelare. Aggiungere 15 ml di questo master mix di pozzetti contenenti sia standard o campioni.
      4. Mettere 8-coperchio tappi striscia PCR sui pozzetti e centrifugare impulso le provette PCR per garantire che tutto è raccolto nel fondo delle provette.
      5. Impostare il seguente programma su un ma PCR quantitativachine: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 minuti, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 sec e 60 ° C per 20 sec (Figura 4A).
    3. Analizzare il Ct (soglia di ciclo) valori dal qPCR:
      1. Trasferire i valori Ct di un foglio di calcolo utilizzando la funzione di esportazione del programma.
      2. Creare un grafico a dispersione dei principi 10 5 genomi / ml fino al 10 9 genomi / ml (espressi come valori di registro). Eliminare eventuali valori anomali evidenti tra i campioni in triplicato. Genera una linea di tendenza logaritmica e determinare l'equazione del grafico.
      3. Calcolare il numero totale dei genomi / ml del campione utilizzando l'equazione generato in 4.3.3.2. Non dimenticare di spiegare la diluizione iniziale (1:10 e 1: 100) dei campioni.

5. infezione di inversione trasfettate cellule (Giorno 7)

  1. Dopo aver calcolato il totale genomi / ml in C. burcultura netii pBlaM-CBU0077 da utilizzare per l'infezione, regolare coltura batterica risospeso per infettare cellule ad una MOI di 300 in un volume finale di 50 ul / pozzetto utilizzando preriscaldata DMEM + 10% FCS.
    Nota: La densità atteso delle teste di serie HeLa 229 cellule con un tempo di raddoppio normale dopo 72 ore è 3.136 × 10 4 cellule / pozzetto. La quantità di batteri necessari per infettare ad una MOI di 300 è 9,408 × 10 6 a 50 microlitri, che equivale a 1,88 × 10 8 batteri / ml.
    1. Utilizzando il valore calcolato dai qPCR (genomi / ml) (4.3.3.3), diluire i batteri risospese mediante pre-riscaldato DMEM + 10% FCS in un volume finale di 2 ml di infettare le cellule transfettate inversa.
  2. Rimuovere il supporto esistente dal vuoto e invertire cellule trasfettate.
  3. Aggiungere 50 ml di batteri diluito (1,88 × 10 8 batteri / ml) nei rispettivi pozzetti. Aggiungere 50 ml di DMEM + 10% FCS sia al vuoto e upozzi ninfected.
  4. Incubare per 24 ore a 37 ° C + 5% CO 2.

6. L'aggiunta di Blam substrato per determinare il livello di traslocazione (Giorno 8)

  1. Preparare le soluzioni per la soluzione 6x carico di substrato Blam.
    Nota: Soluzione A, B e C sono forniti nel kit substrato Blam (fare riferimento alla tabella dei materiali). Soluzione B può formare un precipitato a RT. Scaldare questa soluzione a 37 ° C prima dell'uso e il precipitato dovrebbe sciogliere.
    1. Quando si utilizza il kit per la prima volta, aggiungere 185 ml di DMSO (fornite con il kit substrato Blam) per la soluzione essiccata A. Successivamente, memorizzare la ri-sospensione Soluzione A a -20 ° C.
    2. Preparare 0,1 soluzione M probenicid in anticipo e conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C fino al momento.
      1. Preparare 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH 2 O).
      2. Preparare 100 mM Na tampone fosfato pH 8 (1,56 g di NaH 2 PO 4 .2H 2 HPO 4 in 100 ml dH 2 O).
      3. Sciogliere 1,25 g di probenicid in 22 ml di 0,4 M di NaOH di agitazione vigorosa.
      4. Aggiungere 22 ml di 100 tampone fosfato a pH 8 mm Na (soluzione diventerà torbida) e mescolare per sciogliere il precipitato che si forma.
      5. Portare il pH a 8 (se necessario) con 1 M NaOH / HCl.
      6. Mescolare vigorosamente e riscaldare leggermente (<50 ° C) fino a quando la soluzione è prevalentemente sereno.
      7. Filtro (0,2 micron dimensione dei pori) e aliquota in 1 ml di volume. aliquote conservare a -20 ° C.
  2. Per ogni bene, usare 0,06 ml Soluzione A, 0,54 ml Soluzione B, 7,9 ml Soluzione C e 1,5 ml 0,1 M probenicid. Creare un master mix per i 30 pozzi per primo combinando 1,8 ml di soluzione A e 16.2 ml di soluzione B insieme in una provetta per microcentrifuga. Mescolare bene con un vortice. Aggiungere 237 ml di soluzione di C e 45 ml di 0,1 M probenicid. Vortex di combinare tutti i components.
    Nota: La soluzione 6x carico è stabile fino a 4 ore (al buio) ma deve essere preparato come vicino possibile prima dell'uso.
  3. Aggiungere 10 ml di soluzione di 6x carico direttamente in tutti i pozzetti vuoti e retromarcia trasfettate senza rimuovere il supporto esistente.
  4. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore al buio.
  5. Per determinare il livello di traslocazione, quantificare la quantità di fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre.
    Nota: la seguente procedura è specifica per il lettore ClarioSTAR micropiastre. lettori di micropiastre equivalenti possono anche essere utilizzati.
    1. Creare un nuovo protocollo di intensità di fluorescenza utilizzando endpoint come la modalità di lettura.
    2. Regolare i parametri di base come segue:
      1. Selezionare 96 pozzetti micropiastra.
      2. In Impostazioni ottiche, selezionare 2 multichromatics con le seguenti impostazioni definite dall'utente: (1) Ingresso 410-10 nm di eccitazione e di emissione 520-10 nm. (2) l'eccitazione di ingresso 410-10 nm e 450-10 nm di emissione. Assicurare bene multviene selezionato ichromatics.
      3. Selezionare media orbitale con un diametro di 3 mm.
      4. In ottica, selezionare ottica fondo.
      5. Sotto velocità e precisione, seleziona precisa. Ciò corrisponde a otto regioni per pozzetto.
    3. Regolare il layout della piastra selezionando pozzetti appropriati come campioni.
    4. Seleziona la misura di inizio.
    5. Togliere il coperchio e inserire il vassoio nella lettore di piastre. Per evitare di raggiungere valori massimi di fluorescenza, garantire il valore del guadagno viene regolato. Per fare ciò, eseguire una regolazione del guadagno su uno dei pozzi infetti che è stato inverso trasfettate con siRNA OTP. Ciò corrisponde alla massima traslocazione previsto.
    6. Seleziona la misura di inizio di misurare tutti i pozzetti utilizzando la fluorescenza di fondo ad una eccitazione di 410 nm ed emissione sia di 450 nm e 520 nm per la fluorescenza blu e verde, rispettivamente.

7. Analisi dei risultati:

  1. Calcolare il rapportodi 450 nm a 520 nm (blu al verde) per tutti i campioni a seguito della riduzione in bianco ed esprimere rispetto al campione non infetto OTP.
    Nota: le seguenti fasi di analisi sono forniti per un semplice foglio di calcolo.
    1. Utilizzando la funzione di esportazione sul lettore di micropiastre, trasferire i valori di fluorescenza grezzi ottenuti sia per 520 nm e 450 nm lunghezza d'onda di emissione (6,5) in un foglio di calcolo.
    2. Calcolare la media dei valori "vuote" (supporto solo, senza cellule) per la lunghezza d'onda 520 nm aggiungendo i valori 520 nm fluorescenza prime e dividendo per il numero di pozzetti (3). Ripetere utilizzando i vuoti 450 valori nm. Questi valori rappresentano la fluorescenza di fondo a causa della piastra a 96 pozzetti e dei media.
    3. Sottrarre la fluorescenza di fondo. Utilizzando i valori ottenuti al punto 7.1.2 sottrarre la media del fustellato lunghezza d'onda di 520 nm da tutti campione 520 nm valori di fluorescenza. Ripetere l'operazione per i valori di 450 nm di lunghezza d'onda.
    4. Per ottenere il 450: rapporto di 520 nm utilizzare i valori corretti vuoti (7.1.3). Dividere ogni campione di 450 nm valore di fluorescenza per il corrispondente valore di 520 nm.
    5. Calcolare la media dei valori non infetti rapporto OTP aggiungendo i 450: valori del rapporto nm 520 (da 7.1.4) e dividendo per il numero di pozzetti (3).
    6. Calcolare il rapporto dei campioni relativi a non infetto OTP dividendo il 450: rapporto nm 520 calcolato 7.1.4 per la media del valore del rapporto OTP non infetta calcolato 7.1.5.

8. L'aggiunta di Nuclei Stain per determinare il numero delle cellule dopo traslocazione Assay (Giorno 8)

  1. Dopo quantificazione della fluorescenza, rimuovere i supporti contenenti soluzione loading 6x da tutti i pozzetti utilizzando un adattatore multicanale collegato a una sorgente di vuoto o manualmente con una pipetta multicanale.
  2. Aggiungere 50 ml di soluzione al 4% PFA (paraformaldeide)in PBS a tutti i pozzetti opportuno fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  3. Rimuovere 4% soluzione PFA PBS (come da 8.1) e lavare le cellule due volte con 75 ml di PBS.
  4. Aggiungere 50 ml di una colorazione nucleare permeabile cellula, per esempio DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo), in ciascun pozzetto. Acquisire le immagini con un microscopio a fluorescenza e quantificare il numero di nuclei presenti in ogni pozzetto dopo il trattamento con siRNA utilizzando opportuni software di analisi delle immagini, come ad esempio ImageJ 41.

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Representative Results

Per questo studio, la C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo è stato selezionato come CBU0077 è stato precedentemente dimostrato di essere un effettore traslocato del sistema di secrezione coxiella Dot / Icm 17. Prima di infezione, il numero totale dei genomi / ml in i sette giorni d'C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stato enumerato utilizzando qPCR. La figura 4 dimostra un esempio della soglia di ciclo valori (Ct) attesi da entrambi gli standard e campioni seguenti qPCR. I valori Ct (rappresentati graficamente nella Amplification Plot (Figura 4B) e numericamente (Figura 4C)) sono stati esportati e analizzati come descritto in 4.3.3. Sulla base dei dati rappresentativi riportati, c'erano 2,31 × 10 8 genomi / ml a 10 ml coltura batterica risospeso (Figura 4D). Per generare la diluizione appropriata batterica (1,88 × 10 8 genomi / ml in 2 ml), 1.63 ml di batteri risospeso è stato aggiunto a 370 ml di fresco, pre-riscaldato DMEM + 10% FCS. Le cellule retromarcia trasfettate con siRNA sono stati successivamente infettati con C. burnetii pBlaM-CBU0077 ad una MOI di 300 per 24 ore.

Dopo l'incubazione del rovescio cellule infettate trasfettate con Blam substrato quantificazione dei effettori traslocazione può essere determinato utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. A seguito di analisi come descritto in 7, tutti i valori del rapporto che sono stati normalizzati per non infetto OTP possono essere normalizzati a infetto OTP. Il livello di effettori traslocazione dopo silenziamento dei geni ospitanti possono essere raggruppati in tre risultati dopo il confronto a infetto controllo OTP: (1) Nessun cambiamento; (2) è aumentato effettori traslocazione; (3) Diminuzione effettori traslocazione. Analisi statistica successivo, per esempio, un test t di Student, può essere utilizzato per determinare la significatività della differenza t osservatao infettato il controllo OTP. Il risultato di silenziamento sia Rab5A o Rab7A su effettore traslocazione da tre esperimenti indipendenti è mostrato in Figura 5A. Una diminuzione significativa del livello di Blam-CBU0077 traslocazione si sono verificati durante il silenziamento di entrambi Rab5A e Rab7A rispetto al controllo OTP (valore p = 0,0088 (Rab5A) e il valore p = 0.0059 (Rab7A), in coppia, test t di Student). è stato anche stabilito l'impatto del trattamento siRNA sulla vitalità cellulare. Dopo il test traslocazione, le cellule sono state fissate, colorate con una macchia nuclei e successivamente quantificati. Come mostrato in Figura 5C, anche se il trattamento sia con Rab5A o Rab7A determina una riduzione della vitalità cellulare rispetto al controllo OTP (12% e 31%, rispettivamente), tale riduzione non è così grave come Plk1 (97%), un gene noto a causare la morte delle cellule (p-value = 0,0102 (Rab5A); p-value = 0,0081 (Rab7A); p-value <0,0001 (Plk1), in coppia, Student t-test). Questi risultati dimostrano come tacere di serie genes utilizzando siRNA possono alterare negativamente i livelli di batteri traslocazione effettrici.

Figura 1
Figura 1. Il meccanismo d'azione del Blam substrato durante l'infezione. C. burnetii è interiorizzato da cellule ospiti e forma un vacuolo lisosoma-derivato chiamato vacuolo -aventi tenore Coxiella. Dopo l'infezione 24 ore, le cellule vengono caricati con la membrana permeabile substrato Blam che possiede due fluorofori che formano una coppia FRET (A). In assenza di β-lattamasi cioè non traslocazione del effettore BLAM-CBU0077, eccitazione della cumarina a 410 risultati nm in FRET a fluoresceina, osservati come segnale di fluorescenza verde (520 nm) (B). Nel caso di un sistema di secrezione Dot / Icm funzionali, la proteina di fusione blam-CBU0077 saranno traslocato nella cellula ospite e sarà clgronda substrato BLAM, tramite l'attività β-lattamasi, provocando la separazione dei due coloranti e conseguente FRET interruzione ed un segnale di fluorescenza blu (450 nm) dopo eccitazione a 410 nm (C). Entrambi i segnali di fluorescenza verde e blu possono essere rilevato utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
. Figura 2. Schema Panoramica del Reverse Transfection e la traslocazione del test del flusso di lavoro Giorno 1: Preparare il C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura Giorno 4:. transfect inversione usando 40 nm siRNA e di semi di HeLa 229 cellule ad una densità finale di 3,92 × 10 3 cellule / pozzetto in un vassoio a 96 pozzetti Giorno 5: Ch.mezzi ange Giorno 7:. quantificare il totale dei genomi / ml di C. burnetii pBlaM-CBU0077 cultura utilizzando qPCR e successivamente infettare le cellule inverso trasfettate con una MOI di 300. 8 ° giorno:. Aggiungere tintura carico 6x, misurare la fluorescenza e quantificare il numero di cellule prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Il layout delle piastre a 96 pozzetti utilizzato per impostare l'inversione Transfection e semina di HeLa 229 cellule. I pozzi "in bianco" (in rosso) contiene solo i media e non è necessario l'aggiunta di una siRNA o HeLa 229 cellule. Il OTP siRNA (mostrato in azzurro per pozzi non infetti e blu scuro per pozzi infettati) viene usato come controllo non-targeting, dal momento che è stato ottimizzato peravere meno effetti la porta. Il marrone e pozzi verdi rappresentano la Rab5A e Rab7A siRNA, rispettivamente. Plk1 siRNA (mostrato in giallo) è usato come una misura di efficienza trasfezione come la perdita di espressione Plk1 può indurre percorsi pro-apoptotici e ampie morte cellulare in una vasta maggioranza delle linee cellulari. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Valori rappresentante qPCR Ct Usato per quantificare il numero totale dei genomi / ml in C. burnetii Cultura pBlaM-CBU0077. (a) le condizioni di ciclo utilizzato nella qPCR per enumerare il numero dei genomi / ml nelle culture Coxiella. I valori Ct per entrambi gli standard ei campioni sono rappresentati in grafico (B) e numerico (C)formati. (D) I valori standard Ct sono stati mediati, rappresentati graficamente e una linea di tendenza logaritmica è stato calcolato. Utilizzando l'equazione e le medie del campione Ct valori del numero totale dei genomi / ml nel C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stata determinata da 2.31 ​​× 10 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. La traslocazione del Dot / Icm Effector Blam-CBU0077 durante siRNA silenziamento di Rab5A e Rab7A. HeLa 229 cellule sono state inverso trasfettate con siRNA specifico per Rab5A (bar marrone), Rab7A (barre verdi), OTP (blu bar) o Plk1 (barre gialle) e incubate per 72 ore prima dell'infezione con il C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo ad una MOI di 300 per 24 ore. Dopo tegli aggiunta del substrato Blam, la fluorescenza è stata misurata usando un lettore per micropiastre (A) La tabella mostra i valori di fluorescenza grezzi ottenuti da un singolo esperimento a fianco del 450:. 520 nm rapporto relativo al controllo non infetto OTP dopo la sottrazione dei valori del bianco (i media solo, senza cellule). Il livello di traslocazione (B) e vitalità cellulare (C) sono rappresentati come percentuale media ± deviazione standard relativa alle cellule infettate transfettate OTP inversa da tre esperimenti indipendenti. * P-value <0.05; ** Valore p <0,01; **** P-value <0,0001 (appaiati, Student t-test). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Componente Concentrazione
acido citrico 13.4 mM
citrato di sodio 16.1 mM
potassio fosfato 3.67 mM
cloruro di magnesio 1 mM
Cloruro di calcio 0,02 mm
solfato di ferro 0,01 mm
cloruro di sodio 125,4 mM
L-cisteina 1.5 mM
neopeptone 0,1 g / L
acidi Casamino 2,5 g / L
metil beta ciclodestrina 1 g / L
RPMI 125 ml / L

Tabella 1. I componenti necessari per fare 1x ACCM-2.

Tabella 2. Volume di 1x siRNA Buffer Richiesto per idratante liofilizzato siRNA alla concentrazione adeguata.

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Discussion

sistemi di secrezione, e le proteine ​​effettrici batteriche questi sistemi di trasporto nel citoplasma delle cellule ospiti, sono una componente importante di virulenza che molti batteri patogeni utilizzano per stabilire una infezione all'interno di nicchie replicative unici. L'attenzione di molti gruppi di ricerca è stato quello di indagare l'interazione tra effettori batterici e proteine ​​host e l'influenza di questi effettori hanno sui percorsi cellulari ospitanti. la ricerca molto limitata, se del caso, ha esaminato il potenziale di proteine ​​dell'ospite ritiene necessari per il successo traslocazione effettori batterica.

In questo studio abbiamo usato il obbligato, intracellulare patogeno Coxiella burnetii, l'agente eziologico della febbre Q zoonotici. Dopo l'entrata in cellule ospiti, la -contenenti vacuolo coxiella traffici passivamente attraverso la via endocitico canonica fino a raggiungere un vacuolo lisosomi-derivato acido, dove si replica a un numero molto elevato. Oltre a prendere Advantage del normale percorso di traffico di accoglienza, la capacità di Coxiella di stabilire una nicchia replicativa di successo si basa anche su un tipo funzionale sistema di secrezione IVB (T4SS) e successiva traslocazione effettori 8,17. Questo sistema di secrezione è funzionalmente analogo al ben caratterizzato Dot / Icm T4SS di Legionella. Ciò è stato giustamente dimostrato integrando specifici mutanti dot / ICM di Legionella con i loro rispettivi geni Coxiella 19,20. Anche se il T4SSs sia di Legionella e coxiella sono essenziali per la replicazione, i tempi di quando si attivano questi sistemi è molto diversa e riflette la natura divergente delle rispettive nicchie replicative. La Legionella T4SS viene attivato immediatamente a contatto con le cellule ospiti e la rapida traslocazione di effettori permette ai batteri di evitare la via endosomal-lisosomiale di default e invece di creare un unico vuoto replicativa ER-derivatoLe 42. Al contrario, la T4SS di Coxiella non viene attivato fino post-infezione circa 8 ore, dopo che i batteri raggiungono l'acido vacuolo lisosoma derivato 21.

Dato che Coxiella transita passivamente attraverso la via endocytic e il sistema di traslocazione non viene attivato fino a raggiungere il lisosoma, un'occasione unica si presenta a usare coxiella come strumento per studiare la maturazione endocitico. Il requisito per il CCV per diventare acidificato prima effettori si trasferiscano indica che un certo numero di proteine ​​di accoglienza sono importanti per la traslocazione di proteine ​​effettrici nel citoplasma di accoglienza, in particolare, ma non limitatamente a, proteine ​​coinvolte nella via traffico endocitico. Utilizzando siRNA in modo specifico mirato possiamo cominciare a chiarire il ruolo di particolari proteine ​​ospite su effettrici traslocazione. In questo studio ci siamo concentrati su due proteine ​​che regolano la trafficki endocytic eucarioticang percorso, e, quindi, sono stati previsti per effettuare la traslocazione della Coxiella effettori CBU0077. Rab5A e controllo Rab7A fusione della membrana con endosomi precoci e tardive, rispettivamente. Mettere a tacere una di queste proteine ​​utilizzando siRNA ha comportato una riduzione significativa in termini di efficienza traslocazione di CBU0077 rispetto al controllo OTP siRNA (Figura 5B). I risultati rappresentativi riportati qui riflettono i nostri risultati pubblicati precedenti 21 e forniscono un'ulteriore conferma l'importanza di queste proteine ​​Rab umani alla Coxiella effettori traslocazione. Questa tecnica è stata anche impiegata per caratterizzare l'impatto di altri processi di accoglienza in Coxiella Dot / Icm effettrici traslocazione. Il complesso retromer è risultata essere importante per la replica intracellulare di Coxiella. Mettendo a tacere i componenti retromer, utilizzando siRNA, e quindi lo svolgimento di un test traslocazione abbiamo potuto dimostrare che retromer è necessario per creare l'ambiente che induceCoxiella effettrici traslocazione 43.

Anche se i risultati rappresentativi riportati ecco un confronto tra il controllo infetto OTP e siRNA Rab5A targeting e Rab7A, il protocollo può essere modificato in base alle esigenze sperimentali. Ad esempio, il livello di effettore traslocazione può essere paragonato a cellule trasfettate con scrambled siRNA o cellule non transfettate.

Il focus di questo studio particolare è stato il obbligato, intracellulare patogeno C. burnetii e proteine ​​coinvolte nel traffico endocitico, tuttavia, i metodi descritti all'interno può essere facilmente adattato ad altri agenti patogeni intracellulari ed extracellulari che utilizzano sistemi di secrezione per la virulenza. In effetti, il test traslocazione fluorescente-based che si basa su attività di β-lattamasi all'interno del citoplasma host utilizzato qui, è già stato ampiamente utilizzato in una vasta gamma di agenti patogeni 30-32,35,44. Naturalmente, le condizioni di infezione dellinee cellulari specifici utilizzati devono essere adattati in modo da riflettere le esigenze di infezione di batteri specifici. Inoltre, un noto effettore endogena fusa beta-lattamasi è fondamentale per il successo dei metodi descritti all'interno. Una considerazione importante per la corretta attuazione del protocollo spiegato qui è l'impatto a tacere un obiettivo particolare host potrebbe avere in entrata batterica e la successiva replica. Qui, effettrici traslocazione da Coxiella è misurata 24 ore dopo l'infezione. In questo caso, e per altri batteri intracellulari, la capacità dell'organismo per entrare nelle cellule ospiti è vitale. Inoltre, specifica silenziamento genico potrebbe anche influenzare replicazione batterica quindi alterare il livello di traslocazione osservato. La conferma che siRNA silenziamento non influisce in modo significativo l'ingresso di batteri e / o la replica, e di conseguenza l'efficienza traslocazione, potrebbe essere raggiunto utilizzando la microscopia o numerazione di batteri. la traslocazionedati possono poi essere normalizzati per il numero di cellule infettate per trattamento siRNA. Replica batterica non ha smentito i dati presentati qui come Coxiella subisce poco o nessun replica durante il periodo di incubazione 24 ore.

Questo metodo richiede efficiente trasfezione di siRNA in cellule ospiti per garantire una sufficiente silenziamento del gene di interesse. Con questo in mente, la scelta del reagente di trasfezione corretta è estremamente importante. A parte il reagente e condizioni utilizzate in questo studio particolare, che è stato ottimizzato per HeLa 229 cellule, ci sono numerosi altri reagenti cui scegliere. L'efficienza atterramento utilizzando diversi reagenti di trasfezione può essere quantificata mediante RT-qPCR per garantire che sia selezionato sia il reagente più appropriato e che il siRNA scelto specificamente si rivolge la trascrizione di interesse. Anche se non presentate in questo studio, abbiamo precedentemente dimostrato l'efficienza atterramento di entrambi Rab5A e Rab7A usando RT-qPCR 21. Inoltre, l'uso di anticorpi contro il bersaglio di interesse e conferma da parte di Western Blot può anche confermare siRNA silenziamento di specifici obiettivi.

Altre due considerazioni importanti per prendere nota di quando si utilizza siRNA includono la possibilità di effetti fuori bersaglio e la vitalità cellulare delle cellule trasfettate. Fuori bersaglio si verificano effetti quando vengono distrutti anche obiettivi non intenzionali. Questo può portare a cambiamenti fenotipici e potrebbe comportare falsi positivi. In questo studio abbiamo utilizzato un pool di quattro duplex siRNA per mettere a tacere un singolo bersaglio host. Se silenziando un bersaglio particolare provoca una riduzione dell'efficienza traslocazione, convalida che questo risultato non è dovuto agli effetti off bersaglio può essere ottenuto separando le quattro duplex siRNA e ripetendo il saggio di traslocazione. Almeno due delle quattro duplex siRNA dovrebbe dimostrare un fenotipo simile alla piscina siRNA originale. Con questo risultato, si può essere estremamente fiduciosi che il TR osservatoefficienza anslocation non è dovuto agli effetti off-target. La validità dei risultati di traslocazione prodotti dipende anche dalla vitalità cellulare. L'applicazione di una macchia nuclei dopo il dosaggio traslocazione consente censimento della vitalità cellulare dopo siRNA silenziamento. In caso di Plk1, morte cellulare significativa può essere facilmente osservato senza colorazione; Tuttavia, utilizzando epifluorescenza una rappresentazione più precisa può essere raggiunto. Se silenziando una morte cellulare significativa bersaglio particolare ospitante si osserva, per esempio il 50% rispetto al controllo, è improbabile che un quadro accurato può dedurre come l'importanza di quella particolare proteina ospite alla traslocazione di effettori. Come mostrato in questo studio, anche se silenziamento sia Rab5A o Rab7A ha un leggero impatto sulla vitalità cellulare (Figura 5C), tale riduzione non si pronuncia sufficiente per negare la validità dei dati di traslocazione osservati. Un'altra considerazione per quanto riguarda la vitalità cellulare follgrazie siRNA silenziamento è l'osservazione che la morte cellulare significativa spesso porta ad un aumento del rapporto traslocazione. Questo è giustamente dimostrato dai dati riportati per traslocazione Plk1 (Figura 5A). Il numero di cellule ridotta si traduce in un aumento proporzionale nella molteplicità di infezione. Ciò aumenterà il tasso di infezione e quindi il rapporto traslocazione.

Anche se non presentate in questo studio, la visualizzazione di effettrici traslocazione può anche produrre un risultato quantitativo gratuito. Utilizzando un microscopio epifluorescente dotato di un bypass lungo dicroico specchio di eccitazione ed emissione luminosa separata può fornire una osservazione visiva intracellulare fluorescenza substrato BLAM. Una possibile alternativa al sistema reporter β-lattamasi è di utilizzare il sistema reporter adenilato-ciclasi. Simile al sistema reporter qui descritto, il gene di interesse è fuso al gene adenilato ciclasi calmodulina-dipendenti (cyaA Bordetella pertussis. Effector traslocazione può essere misurata quantificazione intracellulare AMP ciclico (cAMP) utilizzando un kit ELISA immunodosaggio. Poiché l'attività di CyaA dipende interamente calmodulin cellula ospite, che è presente solo nel citosol ospitante, effettore traslocazione è confermato da un aumento dei livelli di cAMP. Anche se questo metodo è anche stato usato con successo per misurare effector traslocazione per una varietà di batteri 45-47, quantificazione di cAMP intracellulare invoca la lisi delle cellule ospiti per estrarre cAMP, un processo che è più dispendiose rispetto al metodo descritto all'interno. Misurazione della traslocazione effettore utilizzando il sistema β-lattamasi giornalista FRET-based è più efficiente in quanto il substrato Blam può essere aggiunto direttamente alle cellule e della fluorescenza può essere misurato in poche ore. Inoltre, il metodo descritto qui può essere più facilmente adattato per generare risultati high-throughput, soprattutto in una forma da 96 pozzettia.

Molti batteri patogeni dipendono da sistemi di proteine ​​traslocazione di introdurre le proteine ​​effettrici nelle cellule ospiti consentendo modulazione delle funzioni cellulari di accoglienza a beneficio del patogeno. Tipo sistemi di secrezione IV sono utilizzati da batteri intracellulari come la Legionella, Coxiella e Brucella e di tipo III sistemi di secrezione sono utilizzati da una vasta gamma di agenti patogeni tra cui Chlamydia, attaccare e effacing E. coli e Salmonella. Confrontando l'effetto di silenziamento dell'espressione delle proteine ​​di accoglienza specifici sulla effettrici traslocazione da una serie di agenti patogeni, la comprensione dei fattori dell'ospite necessarie per effettori traslocazione da particolari tipi di sistemi di secrezione o specifici per un patogeno individuo potrebbe essere chiarito. Ciò fornisce un approccio unico per studiare la complessità delle interazioni ospite-patogeno.

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Materials

concentrazione target
1μM 5 pM 10 micron 20μM
A partire Moles
1 nmol 1 ml 200 ml 100 pl 50 microlitri
2 nmol 2 ml 400 ml 200 ml 100 pl
5 nmol 5 ml 1 ml 500 microlitri 250 microlitri
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 microlitri
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

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References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

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Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing
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Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

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