Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54210
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

Summary

Gransker samspillet mellom bakterielle patogener og deres verter er et viktig område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker for å måle effektor trans av Coxiella burnetii under siRNA genet Slå hjelp Blam underlaget.

Abstract

Coxiella burnetii, den utløsende agent for Q-feber er en intracellulær patogen som er avhengig av en type IV Dot / Icm Sekresjon System for å etablere en replicative nisje. En kohort av effektorer er translokaliseres gjennom dette systemet inn i vertscellen for å manipulere vertsprosesser, og tillate etablering av en unik lysosom-avledet vacuole for replikasjon. Metoden som presenteres her omfatter en kombinasjon av to godt etablerte teknikker: spesifikk genet Slå ved hjelp av siRNA og måling av effektoren translokasjon ved å bruke et FRET-basert substrat som er avhengig av β-laktamase-aktivitet. Bruk av disse to tilnærmingene, kan vi begynne å forstå hvilken rolle vertsfaktorer i bakterie sekresjon systemets funksjon og effektor trans. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle Rab5A og Rab7A, både viktige regulatorer av endocytic menneskehandel veien. Vi viser at stanse ekspresjonen av enten protein resulterer i en reduksjon i effektor translocation effektivitet. Disse metodene kan enkelt endres til å undersøke andre intracellulære og ekstracellulære patogener som også utnytter sekresjon systemer. På denne måte kan et globalt bilde av vertsfaktorer som er involvert i bakteriell translokasjon effektor bli avslørt.

Introduction

Coxiella burnetii er en unik intracellulær patogen som forårsaker zoonotiske menneske-smitte Q-feber. Denne sykdommen er assosiert med et vidt spektrum av kliniske presentasjoner som strekker seg fra asymptomatisk serokonversjon til livstruende kronisk infeksjon som ofte manifesterer seg som endokarditt år etter eksponering 1. Humant infeksjon skjer først og fremst ved inhalering av aerosoler forurenset med drøvtyggere den store reservoar for infeksjon, spesielt melkekyr, sauer og geiter. Selv Coxiella infeksjon i disse dyrene er vanligvis subklinisk, kan infeksjonen utløse abort og betydelig bakteriemengden i birthing væske og morkaken kan forurense nærmiljøet en. Et eksempel på den enorme byrden slik forurensning kan ha på både folkehelsen og landbruket ble nylig observert i Q-feber utbrudd som skjedde i Nederland to. Mellom 2007 og2010 ble over 4000 menneskelige tilfeller av Q-feber diagnostisert og dette utbruddet var knyttet til betydelig forurensning av geit gårder 3. I tillegg er Coxiella en potensiell biologisk våpen, som klassifisert av US Centers for Disease Control and Prevention, på grunn av de miljømessige stabiliteten av bakterier og lav smittedose er nødvendig for å forårsake alvorlig sykdom og død fire.

Coxiella finnes i to faser: Fase I organismer, isolert fra naturlige kilder, er svært virulente og fase II organismer er sterkt svekket in vivo. For eksempel, etter flere in vitro passasjer av Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, ble Fase II bakterier produsert som inneholder en irreversibel kromosom sletting resulterer i forkortet lipopolysakkarid (LPS) 5. Denne belastningen, C. burnetii NMII, er fenotypisk lik fase I i vevskultur modeller og gir et sikrere modusl for forskere å studere Coxiella patogenesen i laboratorier 5. I de senere årene har flere gjennombrudd har raskt avanserte innen Coxiella genetikk. Mest spesielt utviklingen av axenic media (surgjort sitrat cystein medium - ACCM-2) har tillatt den cellefrie vekst av Coxiella både i flytende og på faste medier 6,7. Dette resulterte i direkte forbedringer av genetiske verktøy tilgjengelig for Coxiella inkludert en induserbar genuttrykksystem transporttjenester vektorer og tilfeldige transposon systemer 8-11. Nå nylig, har to metoder for målrettet genet inaktive også blitt utviklet, banet vei for å undersøke spesifikke virulens gen kandidater 12.

Etter internalisering av alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høye tall innenfor et membranbundet rommet kalt Coxiella- inneholder vakuole (CCV). CCV krever verts endocytic menneskehandel thgrove tidlige og sene endosomer før den modnes inn i en lysosome-avledet organ 13. Gjennom hele denne prosessen, kjøper CCV vertsfaktorer som enten vises forbigående eller forbli knyttet til vakuole, inkludert, men ikke begrenset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-13 til 15 januar. Replikering av Coxiella innenfor vertsceller er helt avhengig av et fullt funksjonelt Dot / Icm Type IVB Sekresjon System (T4SS) 8,16,17. Dette sekret system er et multi-proteinstruktur slektsmessig relatert til konjugering systemer og strekker seg over både bakterielle og vacuolar membraner for å levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i verten cytoplasma 18. Den Coxiella T4SS er funksjonelt svært lik den godt karakterisert Type IVB Dot / Icm Sekresjon System of Legionella pneumophila 19,20. Interessant, aktivering av T4SS og påfølgende effektor trans ikke skje før Coxiella når den sure lysosomet-avlededeorganelle, ca 8 timer etter infeksjon 17,21. Hittil har over 130 Dot / ICM effektorer blitt identifisert 9,17,22-24. Mange av disse effektorer sannsynlig spiller viktige roller under replikering av Coxiella innenfor vertsceller; men har bare noen få effektorer blitt funksjonelt preget 25-29.

I denne studien benytter vi en fluorescens-basert assay translokasjon som er avhengig av spalting av CCF2-AM FRET substrat (heretter referert til som BLAM substrat) via β-laktamase-aktivitet i vertscellen cytoplasma (figur 1). Genet av interesse fusjonert til TEM-1 β-laktamase (BLAM) på en reporter plasmid som gir konstitutiv ekspresjon. Den BLAM substratet er sammensatt av to fluoroforer (kumarin og fluorescein) som danner et FRET par. Eksitasjon av kumarin resulterer i FRET av fluorescein og grønne fluorescensemisjonen i fravær av effektoren translokasjon; Hvis imidlertid BlaM-effektor-fusjonsprotein blir translokert inn i verts cytoplasma, den resulterende β-laktamase-aktivitet spalter β-laktam-ring av BLAM substratet, separering av FRET paret fremstilling blå fluorescens-emisjon etter eksitasjon. Denne trans analysen har blitt godt dokumentert som en tilnærming for å identifisere effektor proteiner fra en rekke forskjellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella og Brucella 17,30-35.

For å finne ut hvilken rolle spesifikke vertsfaktorer på Coxiella effektor trans vi benytter en veletablert metode for genet Slå kjent som RNA-interferens, særlig små interfererende RNA (siRNA). Opprinnelig identifisert i Caenorhabditis elegans, er RNA interferens en konservert endogen cellulær prosess som brukes for medfødt defense mot virus, så vel som genregulering 36,37. Etter binding av sekvens-spesifikk siRNA, degradering av mRNA skjer gjennom RISC (RNA-induced Slå kompleks) som resulterer i spesifikke genet Slå eller knockdown 38. I denne studien ble siRNA brukes til å målrette to verts proteiner, Rab5A og Rab7A, som er viktige regulatorer av endocytoseveien. Virkningen av stanse Rab5A og Rab7A på effektor trans ble konstatert ved hjelp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ble valgt som det var tidligere vist seg å være translocated av Dot / Icm sekresjon system av Coxiella 17.

Utnytte både siRNA genet Slå og fluorescencebased trans analysen beskrevet her, er vi i ferd med å etablere en rolle for vertsfaktorer i trans av effektor proteiner ved Coxiella. Denne tilnærmingen kan brukes på et stort utvalg av både intracellulære og ekstracellulære bakterier som innehar lignende secretion-systemer som er ansvarlig for translokasjon av effektor proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle prosedyrer som involverer vekst eller manipulering av Coxiella burnetii RSA439 NMII bør utføres i en fysisk Containment Nivå 2 Laboratory og innenfor en biologisk sikkerhetskabinett i samsvar med lokale retningslinjer. Et skjematisk diagram av den reverserte transfeksjon og trans assay arbeidsflyten beskrevet nedenfor, er vist i figur 2.

1. Fremstilling av C. burnetii Kultur Uttrykke CBU0077 Fused p-laktamase (pBlaM-CBU0077) (DAG 1)

  1. Forbered 1X ACCM-2 6:
    1. Kombiner de komponentene som er oppført i tabell 1. Juster pH til 4,75 med 6 M NaOH og filter sterilisere (ikke autoklaver). ACCM-2 er stabil for cirka tre uker lagret ved 4 ° C.
  2. Generer C. burnetii pBlaM-CBU0077 aksjer.
    1. Infisere HeLa 229 celler med C. burnetii stamme som bærer pBlaM-CBU0077 og passasje til stor vacuoles er observert i de fleste celler.
      1. Grow C. burnetii stamme som bærer pBlaM-CBU0077 i 20 ml ACCM-2 inneholdende 3 pg / ml kloramfenikol i en 75 cm2 vevskulturkolbe med ventilert hette i 7 dager ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O 2.
      2. Sentrifuger C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved 15.000 x g i 15 min ved RT.
      3. Re-suspendere pelleten i 20 ml DMEM + 10% kalvefosterserum (FCS) + 3 ug / ml kloramfenicol (opprettholdelsemedia). Ta ut mediet fra en 50% konfluent 75 cm 2 kolbe HeLa 229 celler. Legg re-suspendert C. burnetii til HeLa 229 celler. Inkuber i 2 dager ved 37 ° C i 5% CO2 for å tillate infeksjon av HeLa-celler 229 for å etablere.
      4. Dele celler i 175 cm 2 vev kultur kolbe.
        1. Fjern media fra 75 cm 2 kolbe og vaske monolaget to ganger med 10 ml forvarmet PBS.
        2. Tilsett 1 ml of 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning og plassere cellene ved 37 ° C + 5% CO2 i 3 - 5 minutter for å løsne cellene.
        3. Re-suspendere celler i 10 ml opprettholdelsemedia. Tilsett 2 ml re-suspendert celler i en 175 cm 2 kolbe som inneholder 38 ml vedlikehold medier.
        4. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i ytterligere 3 - 5 dager til 100% konfluens er nådd og store vakuoler er observert.
    2. Samle supernatanten fra 175 cm2 kolbe tilsettes 10 ml dH 2 O for å dekke den infiserte HeLa 229 celler og inkuber i 15 minutter for å lysere infiserte celler.
    3. Kombiner supernatant og lyserte celler og pellet ved 15.000 x g i 15 min ved RT.
    4. Re-suspendere pellet i 10 ml dH 2 O. Lyse-celler ytterligere ved gjentatte ganger å føre den re-suspensjonen gjennom en 23G nål festet til en 10 ml sprøyte minst 20 ganger. Pellet ved 500 x g i 5 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale.
      5. <li> Fjern supernatant og pellet ved 15.000 x g i 15 minutter ved romtemperatur for å samle C. burnetii.
    5. Re-suspendere C. burnetii i DMEM + 10% FCS og kvantifisere antall bakterier pr 4. Fortynn til 1 × 10 9 genom / ml ved hjelp av DMEM + 10% FCS + 10% dimetylsulfoksid (DMSO), delmengde 50 mL aksjer i mikrofugerør og oppbevares ved -80 ° C.
  3. Inokulere 10 ml forvarmet ACCM-2 inneholdende 3 pg / ml kloramfenikol med 20 pl C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme 17 (fra lager generert på 1,2 lagret ved -80 ° C) i en 25 cm2 vevskulturkolbe med ventilert hette. Dyrke bakteriekultur i 7 dager ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O 2.

2. Snu transfeksjon av siRNA og såing av HeLa 229 celler (DAY 4)

  1. Ved bruk av den eksperimentelle siRNA for første gang å forberedesiRNA som følger:
    1. I korthet Sentrifuger den lyofiliserte siRNA for å sikre at siRNA pellet blir samlet ved bunnen av røret.
    2. Re-suspendere pelletisert siRNA til en endelig lager-konsentrasjon på 20 uM ved pipettering det passende volumet av 1x siRNA-buffer (tabell 2).
    3. Pipettere løsningen opp og ned 3 - 5 ganger for å blande og sted på en orbital mixer i 30 minutter ved RT, røret ble snudd hver 5 - 10 min.
    4. I korthet sentrifuger røret for å sikre at siRNA oppsamles ved bunnen av røret.
    5. Delmengde av siRNA i 50 ul porsjoner i mikrofugerør og oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig.
    6. For å generere 1 mikrometer arbeider konsentrasjon av siRNA, pipette 950 mL 1X siRNA buffer i en 50 mL delmengde lager (20 mm) ved behov. Merk: Denne 1 mikrometer arbeidskonsentrasjon kan fryse-tint flere ganger for gjentatte trans.
  2. Plasser DMEM + 10% FCS,0,05% trypsin-EDTA og PBS i et 37 ° C vannbad (eller tilsvarende) i 30 minutter for å varme før bruk.
  3. Utarbeidelse av transfeksjon komponenter:
    Merk: Følgende protokoll er optimalisert for HeLa 229 celler i en 96-brønns mikro med sorte vegger og flat, gjennomsiktig bunn. Optimalisering av mengden av transfeksjon reagens, kan konsentrasjonen av siRNA og poding tetthet av celler være nødvendig for forskjellige cellelinjer.
    1. For hver brønn ved å bruke 0,1 pl transfeksjon reagens, 15,9 pl redusert serummedium (minimale essensielle medier anvendt for transfeksjoner, se tabell of Materials) og 4 pl av 1 pM siRNA (noe som resulterer i en endelig siRNA konsentrasjon på 40 nM). Bruk separate mikrofugerør for OTP, PLK1, Rab5A og Rab7A. Måle hver analysebetingelser i tre eksemplarer. Et eksempel på en 96-brønns plate layout er vist i Figur 3.
      Merk: Denne protokollen omfatter bruk av to kontroller: OTP og PLK1. OTP ersammensatt av fire sammenslåtte siRNA som har blitt optimalisert for å redusere off-target-effekter og således OTP blir brukt som en negativ, ikke-målsøkende kontroll. Egge siRNA kan også bli brukt som en negativ kontroll. Tap av PLK1 ekspresjon resulterer i utstrakt celledød i en rekke cellelinjer ved å indusere pro-apoptotiske reaksjonsveier og derfor PLK1 siRNA anvendes som positiv kontroll for transfeksjon hvor celledød korrelerer til transfeksjonseffektivitet.
      1. For hver forsøks siRNA transfeksjon, kombinere 0,4 pl transfeksjon-reagens og 63,6 ul redusert serummedium i et individ mikrosentrifugerør. Vortex alle mikrofugerør og tillate komponenter til komplekse i 5 min ved RT.
      2. Legg 16μl av hver forsøks siRNA til de tilsvarende mikrofugerør inneholdende transfeksjon komplekset. Vortex og inkuberes i 20 min ved RT. Merk: Det er viktig å ikke overstige 30 min, som transfeksjon effektivitet vil avta.
  4. I løpet av 20 min incubation (2.3.1.2) legge til 20 pl av transfeksjon reagens + redusert serum medium + siRNA bland inn de aktuelle brønnene av en steril svart, flat klar bunn 96-brønns brett.
  5. Så snart 20 min inkubasjonstid er fullført, frø HeLa 229-celler ved en tetthet på 3,92 x 10 3 celler / brønn.
    1. Høste HeLa 229 celler fra en konfluent eller sub-konfluente 75 cm 2 vev kultur kolbe i forvarmet DMEM + 10% FCS og re-suspendere cellene til en endelig tetthet på 4,9 × 10 4 celler / ml pr standard metoder. For å sikre transfeksjon effektivitet ikke er svekket, forberede celler i løpet av 20 min inkubasjonstid (2.3.1.2).
      1. Vask monolag av HeLa 229 cellene to ganger med 10 ml forvarmet PBS.
      2. Tilsett 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning og sted HeLa-229-celler ved 37 ° C + 5% CO2 i 3 - 5 minutter for å løsne cellene.
      3. Samle celler i 9 ml forvarmet DMEM + 10% FCS. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og forberede celler til en endelig tetthet på 4,9 x 10 4 celler / ml ved bruk av DMEM + 10% FCS.
    2. Pipetter 80 ul av HeLa 229 celler ved tetthet på 4,9 x 10 4 celler / ml til hver brønn som inneholder transfeksjon reagens + redusert serummedium + siRNA blanding. Dette svarer til en celletetthet på 3,92 x 10 3 celler / brønn.
      Merk: Bakgrunn subtraksjon er nødvendig for Blam underlaget.
      1. Ikke legg til celler eller siRNA til "tomme" brønner (figur 3). I stedet legger 80 mL av DMEM + 10% FCS til disse brønnene er satt opp i tre eksemplarer.
    3. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C + 5% CO2.

3. Endre Media (DAY 5)

  1. Etter 24 timer fjerne medier med en flerkanals adapter koblet til en vakuumkilde eller manuelt med en flerkanals pipette, og erstatte med 100 ul frisk prewarmed DMEM + 10% FCS.
  2. Inkuber i ytterligere 48 timer ved 37 ° C + 5% CO2.
  3. På dette punktet, kontrollere levedyktigheten av celler visuelt ved bruk av et standard lysmikroskop. Hvis den omvendte transfeksjon har vært vellykket, vil signifikant celledød bli observert i brønnene som inneholdt PLK1 siRNA sammenlignet med OTP siRNA.

4. Kvantifisering av Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain hjelp qPCR (dag 7)

  1. Etter 7 dagers vekst i ACCM-2 ved 37 ° C i 5% CO2, 2,5% O 2 (1,3), sentrifuger 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved 15.000 x g i 15 min ved RT.
  2. Re-suspen bakteriepelleten i 10 ml forvarmet DMEM + 10% FCS. Forbered 1:10 og 1: 100 fortynninger av kulturen (prøve) med dH 2 O.
  3. Sett opp komponentene som kreves for qPCR.
    Merk: gDNA utvinning kan bli utført på forhånd og lagret ved -20 ° C until nødvendig.
    1. Utarbeidelse av standarder:
      1. Utdrag gDNA fra Coxiella burnetii RSA439 NMII villtypestammen vokst i ACCM-2 ved 37 ° C i 5% CO 2, 2,5% O 2 i 7 dager ved hjelp av en gDNA utvinning kit, i henhold til produsentens anvisninger.
      2. Mål gDNA konsentrasjon (g / il) ved hjelp av et Nanodrop (eller tilsvarende) ved en absorbans på 260 nm.
      3. Beregn antall genom eksemplarer per fil ved hjelp av følgende formel nedenfor, og konvertere til antall genom / ml.
        ligning
      4. Juster antall genom / ml til 10 9 / ml (i et endelig volum på 100 ul) i et nytt mikrofuge-rør ved hjelp av dH 2 O. Dette kan kokes i 10 minutter og lagret ved -20 ° C inntil anvendelse.
      5. På dagen for infeksjonen, genererer 10-gangers seriefortynninger av 10 8 genom / ml til 10 5 genom / ml fra 10 9 genomets / ml lager.
        1. Pipetter 10 mL av 10 9 genom / ml i 90 mL av dH 2 O for å generere 10 8 genom / ml. Vortex å blande. Pipetter 10 mL av 10 8 genom / ml i 90 mL av dH 2 O for å generere 10 7 genom / ml. Vortex og gjenta inntil 10 5 genom / ml.
    2. Sett opp qPCR reaksjon. Lag en master mix for 25 brønner for å ta høyde for eventuelle pipettering feil. For hver brønn, bruke 10 mL qPCR Master Mix; 2 mL av ompA primer mix (4.3.2.2) og 3 mL av dH 2 O.
      Merk: OmpA er en ytre-membran protein C. burnetii '39 og en 82-basepar seksjon innenfor et sterkt konservert region ble valgt for anvendelse som en probe, som beskrevet tidligere 40.
      1. Sette opp hver standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 genom / ml) og prøven (1:10 og 1: 100 fortynning) i en 96-brønners PCR rive løs plate (ikke-skirted) i duplikat eller triplikat, respektivt. Tilsett 5 ul prøve eller standard i de aktuelle brønner.
      2. Ved hjelp av dH 2 O, fortynne både ompA forover primeren (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') og ompA revers primer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') til en sluttkonsentrasjon på 4 pM og kombinere inn i den samme mikrofuge-rør.
        Merk: ompA primerblandingen kan fremstilles på forhånd og lagret ved -20 ° C inntil anvendelse.
      3. Kombiner 250 pl qPCR Master Mix, 50 pl ompA primer mix, 75 mL dH 2 O og virvle å blande. Tilsett 15 mL av denne master mix til brønner som inneholder enten standarder eller prøver.
      4. Plasser 8-lokk PCR stripe caps på de aktuelle brønnene og puls sentrifuge PCR rør for å sikre at alt er samlet i bunnen av rørene.
      5. Sett opp følgende program på en kvantitativ PCR machine: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 1 sek og 60 ° C i 20 sekunder (figur 4A).
    3. Analyser Ct (syklus terskel) verdier fra qPCR:
      1. Overfør Ct-verdiene til et regneark ved hjelp av programmets eksportfunksjonen.
      2. Lag et spredningsplott av standardene 10 5 genomer / ml gjennom 10 9 genom / ml (uttrykt som logg verdier). Kast noen åpenbare uteliggere blant tredoble prøvene. Generere en logaritmisk trendlinje og bestemme ligningen for grafen.
      3. Beregn det totale antall genom / ml i prøven ved hjelp av formelen generert på 4.3.3.2. Ikke glem å ta høyde for den første fortynning (1:10 og 1: 100) av prøvene.

5. Infeksjon av Reverse transfekterte celler (dag 7)

  1. Etter beregning av totale genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur som skal brukes for infeksjon, justere re-suspendert bakteriekultur for å infisere celler ved en MOI på 300 i et endelig volum på 50 ul / brønn med forvarmet DMEM + 10% FCS.
    Merk: forventet tetthet av seeded HeLa 229 celler med en normal dobling tid etter 72 timer er 3.136 × 10 4 celler / brønn. Mengden av bakterier som kreves for å infisere ved en MOI på 300 er 9,408 x 10 6 i 50 ul, noe som tilsvarer 1,88 x 10 8 bakterier / ml.
    1. Ved å bruke verdien beregnet fra qPCR (genom / ml) (4.3.3.3), fortynn re-suspenderes bakteriene ved hjelp av forvarmet DMEM + 10% FCS i et endelig volum på 2 ml for å infisere den omvendte transfekterte celler.
  2. Fjern eksisterende medier fra den tomme og omvendt transfekterte celler.
  3. Tilsett 50 ul av de fortynnede bakterier (1,88 x 10 8 bakterier / ml) til de passende brønner. Tilsett 50 ul DMEM + 10% FCS til både den tomme og uninfected brønner.
  4. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C + 5% CO2.

6. Tilsetting av Blam Substrat fastslår Nivå Translokasjon (Dag 8)

  1. Klargjør løsninger for Blam underlaget 6x lasting løsning.
    Merk: Løsning A, B og C er gitt innenfor Blam underlaget kit (Se tabell for material). Oppløsning B kan danne et bunnfall ved RT. Varm denne løsningen til 37 ° C før bruk og bunnfallet skal oppløses.
    1. Når du bruker kit for første gang, legge 185 mL av DMSO (følger med Blam underlaget kit) til uttørket Løsning A. Deretter lagre re-suspendert Solution A ved -20 ° C.
    2. Forbered 0,1 M probenecid løsning på forhånd og oppbevares i 1 ml porsjoner ved -20 ° C inntil nødvendig.
      1. Fremstille 0,4 M NaOH (1,6 g i 100 ml dH 2 O).
      2. Forbered 100 mM Na-fosfatbuffer pH 8 (1,56 g NaH 2PO 4 .2H 2 HPO 4 i 100 ml dH 2 O).
      3. Oppløs 1,25 g av probenecid i 22 ml 0,4 M NaOH med kraftig omrøring.
      4. Legg 22 ml 100 mM Na-fosfatbuffer pH 8 (oppløsning blir grumsete) og omrør for å oppløse bunnfallet som dannes.
      5. Juster pH-verdien til 8 (om nødvendig) ved hjelp av en M NaOH / HCl.
      6. Omrør kraftig og oppvarm svakt (<50 ° C) inntil løsningen er stort sett klar.
      7. Filter (0,2 um porestørrelse) og aliquot i 1 ml volumer. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
  2. For hver brønn, bruker 0,06 mL løsning A, 0,54 mL løsning B, 7,9 mL løsning C og 1,5 mL 0,1 M probenecid. Lag en master mix for de 30 brønnene ved først å kombinere 1,8 mL av løsning A og 16,2 mL av løsning B sammen i en mikro tube. Bland godt ved hjelp av en vortex. Legg 237 mL av løsning C og 45 ul 0,1 M probenecid. Vortex å kombinere alle komponenter;ts.
    Merk: 6x lasteløsningen er holdbar i opptil 4 timer (i mørket), men bør være forberedt på så nært som mulig før bruk.
  3. Tilsett 10 mL av 6x lasteløsning direkte inn alle tomme og omvendt transfekterte brønner uten å fjerne eksisterende medier.
  4. Inkuber platen ved RT i 2 timer i mørket.
  5. For å bestemme nivået av translokasjon, kvantifisere mengden av fluorescens ved anvendelse av en mikroplateleser.
    Merk: Følg denne fremgangsmåten er spesifikk for ClarioSTAR -mikroplateleser. Tilsvarende mikro leserne kan også benyttes.
    1. Opprett en ny fluorescens intensitet protokollen med endepunkt som lesemodus.
    2. Juster rammebetingelsene som følger:
      1. Velg 96-brønns mikro.
      2. Under optiske innstillingene, velger du 2 multichromatics med følgende brukerdefinerte innstillinger: (1) Inngangs 410-10 nm eksitasjon og 520-10 nm emisjon. (2) Inngangs 410-10 nm eksitasjon og 450-10 nm emisjon. Sørg for godt multichromatics er valgt.
      3. Velge orbital i snitt med en diameter på 3 mm.
      4. Under optikk, velg bunnen optikk.
      5. Under fart og presisjon, velg presis. Dette tilsvarer åtte områder per brønn.
    3. Juster plate layout ved å velge de riktige brønnene som prøver.
    4. Velg start måling.
    5. Ta av lokket og sett skuffen inn i plateleser. For å unngå å nå maksimal fluorescens verdier, sikre gevinsten verdien korrigeres. For å gjøre dette, må du utføre en justering av forsterkning på en av de infiserte brønner som har blitt omvendt transfektert med OTP siRNA. Dette tilsvarer den høyest forventede translokasjon.
    6. Velg start måling for å måle alle aktuelle brønnene med bunn fluorescens ved en eksitasjon av 410 nm og utslipp av både 450 nm og 520 nm for blå og grønn fluorescens hhv.

7. Analyse av resultater:

  1. Beregn forholdetfra 450 nm til 520 nm (blått til grønt) for alle prøver følgende blank reduksjon og uttrykker i forhold til infisert OTP prøven.
    Merk: følgende analyse trinnene er gitt for et enkelt regneark program.
    1. Ved hjelp av eksportfunksjonen på mikroplateleser, overføre rå fluorescens verdiene oppnådd for både 520 nm og 450 nm emisjonsbølgelengder (6,5) i et regneark.
    2. Beregn gjennomsnittet av "tomme" målinger (media bare, ingen celler) for bølgelengde på 520 nm ved å legge rå 520 nm fluorescens verdier og dividere med antall brønner (3). Gjenta med de tomme 450 nm bølgelengde verdier. Disse verdiene representerer bakgrunnsfluorescens på grunn av den 96-brønns plate og media.
    3. Trekk bakgrunnen fluorescens. Ved å bruke verdiene oppnådd i 7.1.2 subtrahere gjennomsnittet av emnet bølgelengde 520 nm fra alle prøve 520 nm fluorescens-verdier. Gjenta for de 450 nm bølgelengde verdier.
    4. For å oppnå 450: 520 nm forholdet bruke tomme korrigerte verdier (7.1.3). Del hver prøve 450 nm fluorescens verdien av den tilsvarende 520 nm verdi.
    5. Beregn gjennomsnittet av uinfiserte OTP forholdet verdier ved å legge til 450: 520 nm ratio verdier (fra 7.1.4) og dividere med antall brønner (3).
    6. Beregne forholdet av prøvene i forhold til uinfisert OTP ved å dividere 450: 520 nm-forholdet beregnes 7.1.4 Gjennomsnitt av infisert OTP forholdsverdi beregnet i 7.1.5.

8. Tilsetting av Nuclei Stain fastslår Cell Number etter trans analysen (Dag 8)

  1. Etter kvantifisering av fluorescens, fjerne medier som inneholder 6x lasteløsning fra alle brønnene ved hjelp av enten en multikanaladapter koblet til en vakuumkilde eller manuelt med en flerkanals pipette.
  2. Tilsett 50 pl av 4% PFA (paraformaldehyd) løsningi PBS til alle passende brønner for å løse celler. Inkuber ved RT i 20 min.
  3. Fjern 4% PFA PBS-løsning (som per 8.1) og vask celler to ganger med 75 mL PBS.
  4. Tilsett 50 ul av en cellepermeabel nukleær flekk, for eksempel DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol), til hver brønn. Hente bilder med et fluorescerende mikroskop og kvantifisere antall kjerner tilstede i hver brønn etter siRNA behandling ved hjelp av passende bildeanalyse programvare, for eksempel ImageJ 41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For denne studien, C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme ble valgt som CBU0077 tidligere er blitt vist å være en translokert effektor av Coxiella Dot / Icm sekresjon system 17. Før infeksjon, det totale antall genom / ml i syv dagers C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen ble nummerert ved hjelp av qPCR. Figur 4 viser et eksempel av syklusen terskel (Ct-verdier) forventet fra begge standarder og prøver etter qPCR. De Ct verdier (representert grafisk i Amplification Plot (figur 4B) og numerisk (figur 4C)) ble eksportert og analysert som beskrevet i 4.3.3. Basert på representative data vist, var det 2,31 × 10 8 genom / ml i 10 ml re-suspendert bakteriekultur (Figur 4D). For å generere den aktuelle bakterie fortynning (1,88 × 10 8 genomer / ml in 2 ml), 1,63 ml resuspenderte bakterier ble tilsatt til 370 ul frisk, forvarmet DMEM + 10% FCS. Celler omvendt transfektert med siRNA ble deretter infisert med C. burnetii pBlaM-CBU0077 på en MOI på 300 i 24 timer.

Etter inkubasjon av den reverserte transfekterte infiserte celler med BLAM substrat kvantifisering av effektoren translokasjon kan bestemmes ved bruk av en fluorescens plateleser. Etter analyse som beskrevet i 7, kan alle ratio verdier som har blitt normalisert til infisert OTP også være normalisert til infiserte OTP. Nivået av effektor trans etter å kneble av vertsgener kan grupperes i tre utfall etter sammenligning til infiserte OTP kontroll: (1) Ingen endring; (2) Økt effektor translokasjon; (3) Redusert effektor trans. Etterfølgende statistisk analyse, for eksempel en Student t-test, kan brukes til å bestemme betydningen av en hvilken som helst observerte forskjell to smittet OTP kontroll. Resultatet av tie enten Rab5A eller Rab7A på effektor translokasjon fra tre uavhengige eksperimenter er vist i figur 5A. En betydelig reduksjon i nivået av Blam-CBU0077 trans skjedde under stanse både Rab5A og Rab7A forhold til OTP-kontroll (p-verdi = 0,0088 (Rab5A) og p-verdi = 0,0059 (Rab7A), paret, Student t-test). Virkningen av siRNA behandling på celle levedyktighet ble også etablert. Etter den trans analysen ble cellene fiksert, farget med en flekk kjerner og deretter kvantifisert. Som vist i figur 5C, selv om behandling med enten Rab5A eller Rab7A resulterer i en reduksjon i celleviabilitet i forhold til OTP kontroll (12% og 31%, respektivt), er denne reduksjon ikke er så alvorlig som PLK1 (97%), et gen kjent å forårsake celledød (p-verdi = 0,0102 (Rab5A), p-verdi = 0,0081 (Rab7A), p-verdi <0,0001 (PLK1), paret, Student t-test). Disse resultatene viser hvordan stanse vert genes ved hjelp av siRNA kan negativt endre nivåene av bakteriell effektor trans.

Figur 1
Figur 1. Virkningsmekanismen av Blam substratet under infeksjon. C. burnetii blir internalisert av vertsceller og danner et lysosom-avledet vakuole betegnet Coxiella holdige vakuolen. 24 timer etter infeksjon blir cellene ladet med den membran som er gjennomtrengelig BLAM substrat som besitter to fluoroforer som danner et FRET par (A). I fravær av β-laktamase dvs. ingen translokasjon av den BLAM-CBU0077 effektor, magnetisering av kumarin i 410 nm resulterer i FRET til fluorescein, observert som en grønn fluorescens-signal (520 nm) (B). i tilfelle av en funksjonell Dot / Icm sekresjon system, BLAM-CBU0077 fusjonsprotein blir translokert inn i vertscellen og vil cleave den BLAM substratet, via β-laktamase-aktivitet, slik at separasjon av de to farvestoffer og resulterer i FRET avbrudd og en blå fluorescens-signal (450 nm) etter eksitasjon ved 410 nm (C). Både de grønne og blå fluorescens-signalene kan bli oppdages ved hjelp av en fluorescens plateleser. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
. Figur 2. Skjematisk oversikt over Reverse Transfeksjon og trans analysen arbeidsflyt Dag 1: Klargjør C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur Dag 4:. Omvendt transfeksjon ved bruk av 40 nM siRNA og frø HeLa-229-celler ved en endelig densitet på 3,92 x 10 3 celler / brønn i en 96-brønns brett Dag 5:. Change media Dag 7:. Kvantifisere de totale genom / ml av C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ved hjelp av qPCR og deretter infisere omvendt transfekterte celler med en MOI på 300. Dag 8:. Legg 6x lasting fargestoff, måle fluorescens og kvantifisere celle nummer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. 96-brønns plate Layout brukes til å sette opp Reverse Transfeksjon og Seeding av HeLa 229 celler. De "tomme" brønner (vist i rødt) inneholder bare media og ikke trenger tillegg av enten siRNA eller HeLa 229 celler. Den OTP siRNA (vist i lys blå for ikke-infiserte brønner og mørk blå for infiserte brønner) anvendes som en ikke-målsøkende kontroll, siden det har blitt optimalisert for åhar færre off-target effekter. Den rødbrun og grønn brønner representerer Rab5A og Rab7A siRNA, henholdsvis. PLK1 siRNA (vist i gult) brukes som et mål på transfeksjon effektivitet som tap av PLK1 uttrykk kan indusere pro-apoptotiske trasé og omfattende celledød i et stort flertall av cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representant qPCR Ct verdier anvendt for å kvantifisere det totale antall genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 Culture. (A) Syklusbetingelsene anvendt i qPCR å nummerere antall genom / ml i Coxiella kulturer. De Ct-verdien for begge standarder og prøver er representert grafisk i (B) og numerisk (C)formater. (D) Standard Ct-verdier ble gjennomsnitt, grafer og en logaritmisk trendlinje ble beregnet. Ved hjelp av ligningen, og gjennomsnitt av prøven Ct verdier totalt antall genom / ml i C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur ble bestemt til 2,31 × 10 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Translokasjon av Dot / Icm Effector Blam-CBU0077 under siRNA stanse av Rab5A og Rab7A. HeLa 229 celler ble omvendt transfektert med siRNA spesifikke for Rab5A (rødbrun barer), Rab7A (grønne søyler), OTP (blå søyler) eller PLK1 (gule søyler) og inkubert i 72 timer før infeksjon med C. burnetii pBlaM-CBU0077 belastningen ved en MOI på 300 i 24 timer. etter than tilsetning av BLAM substratet, fluorescens ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (A) Tabellen viser den rå fluorescens-verdier oppnådd fra et enkelt eksperiment ved siden av 450.: 520 nm-forholdet i forhold til uinfiserte OTP kontroll etter subtraksjon av blindverdier (media bare, ingen celler). Nivået av translokasjon (B) og celle-levedyktighet (C) er presentert som prosent middelverdi ± standardavvik i forhold til OTP omvendt transfekterte infiserte celler fra tre uavhengige eksperimenter. * P-verdi <0,05; ** P-verdi <0,01; **** P-verdi <0,0001 (paret, Student t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Komponent Konsentrasjon
sitronsyre 13.4 mm
natriumsitrat 16,1 mm
kaliumfosfat 3,67 mM
magnesiumklorid 1 mm
kalsiumklorid 0,02 mM
jernsulfat 0,01 mm
natriumklorid 125,4 mm
L-cystein 1,5 mm
neopeptone 0,1 g / l
kasaminosyrer 2,5 g / l
metyl beta cyklodekstrin 1 g / l
RPMI 125 ml / L

Tabell 1. komponentene som kreves for å gjøre 1x ACCM-2.

Tabell 2. Volum av 1x siRNA Buffer Kreves for Hydra Lyophilized siRNA til passende konsentrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sekresjon systemer, og de bakterielle effektor proteiner disse systemene transport inn i cytoplasma av vertsceller, er en viktig virulens komponent som mange patogene bakterier benytter for å etablere en infeksjon i unike replikative nisjer. Fokus for mange forskningsgrupper har vært å undersøke samspillet mellom bakterielle effektorer og verts proteiner og innflytelsen disse effektorer har på vertscelle veier. Meget begrenset forskning, om noen, har undersøkt muligheten for vertsproteiner for å være nødvendig for vellykket bakteriell translokasjon effektor.

I denne studien brukte vi obligat, intracellulær patogen Coxiella burnetii, den utløsende agent for zoonotiske Q-feber. Etter inntreden i vertsceller, den Coxiella holdige vakuole passivt traffics gjennom kanoniske endocytoseveien inntil nå en syrlig lysosome-avledet vacuole, hvor det replikerer til svært høye tall. Bortsett fra å ta Advantage av den normale vert handel svei, evne til Coxiella til å etablere en vellykket replikative nisje er også avhengig av et IVB sekresjon system funksjonell type (T4SS) og etterfølgende translokasjon effektor 8,17. Dette sekret system er funksjonelt analog til den godt karakterisert Dot / Icm T4SS av Legionella. Dette ble treffende demonstrert ved å supplere spesifikke punkter / ICM mutanter av Legionella med sine respektive Coxiella gener 19,20. Selv om T4SSs av både Legionella og Coxiella er avgjørende for replikering, er tidspunktet for når disse systemene er aktivert ganske annerledes og gjenspeiler den avvikende innholdet i sine respektive replikative nisjer. Den Legionella T4SS utløses umiddelbart ved kontakt med vertsceller og den raske translokasjon av effektorer gjør at bakterier for å unngå mislighold endosomal-lysosomal sti og i stedet skape en unik ER-avledet replicative vakuumle 42. I motsetning til dette er T4SS av Coxiella ikke aktivert før ca 8 timer etter infeksjon, etter at bakterier kommer den sure lysosome-avledet vacuole 21.

Gitt at Coxiella passivt transporter gjennom endocytoseveien og trans systemet er ikke aktivert før den når lysosome, presenterer en unik mulighet til selv å bruke Coxiella som et verktøy for å studere endocytic modning. Kravet for CCV for å bli surgjort før effektorer blir translokert indikerer at et antall verts proteiner er viktig for translokasjon av effektor-proteinene i verts cytoplasma, i særdeleshet, men ikke begrenset til, proteiner involvert i den endocytiske vei handelen. Utnytte siRNA i en bestemt målrettet måte kan vi begynne å klargjøre rollen av bestemte vertsproteiner på effektor trans. I denne studien har vi fokusert på to proteiner som regulerer eukaryote endocytic trafficking vei, og følgelig ble forutsagt å bevirke translokasjon av den Coxiella effektor CBU0077. Rab5A og Rab7A kontroll membran fusjon med tidlige og sene endosomer, henholdsvis. Dempe en av disse proteiner ved anvendelse siRNA resulterte i en signifikant reduksjon i trans effektiviteten av CBU0077 når sammenlignet med kontrollen OTP siRNA (figur 5B). De representative resultatene vist her gjenspeiler våre tidligere publiserte funn 21 og gi ytterligere validering til betydningen av disse menneskelige Rab proteiner til Coxiella effektor trans. Denne teknikken har også vært ansatt for å karakterisere virkningen av andre verts prosesser på Coxiella Dot / Icm effektor trans. Den retromer Komplekset ble funnet å være viktig for intracellulær replikering av Coxiella. Ved å stanse retromer komponenter, ved hjelp av siRNA, og deretter gjennomføre en trans analysen vi kunne vise at retromer er nødvendig for å skape det miljøet som indusererCoxiella effektor trans 43.

Selv om de representative resultatene vist her er en sammenligning mellom infisert OTP-kontroll og siRNA rettet mot Rab5A og Rab7A, kan protokollen endres i henhold til eksperimentelle behov. For eksempel kan nivået av effektoren trans også bli sammenlignet med celler transfektert med egge siRNA eller ikke-transfekterte celler.

Fokuset i denne studien var obligat, intracellulær patogen C. burnetii og proteiner involvert i endocytic menneskehandel, men metodene som er beskrevet innen lett kan tilpasses andre intracellulære og ekstracellulære patogener som utnytter sekresjon systemer for virulens. Faktisk, den fluorescerende baserte trans analysen som er avhengig av β-laktamase aktivitet i verten cytoplasma brukt her, har allerede blitt mye brukt på tvers av en rekke patogener 30-32,35,44. Naturligvis infeksjonen forholdene ispesifikke cellelinjer som benyttes må være tilpasset til å reflektere infeksjonen kravene spesifikke bakterier. I tillegg er en kjent endogen effektor smeltet p-laktamase er avgjørende for å lykkes med de metodene som er beskrevet innenfor. En viktig faktor for en vellykket gjennomføring av protokollen forklart her er virkningen stanse en bestemt vert målet kunne ha på bakteriell oppføring og påfølgende replikering. Her er effektor trans av Coxiella målt 24 timer etter infeksjon. I dette tilfellet, og for andre intracellulære bakterier, er evnen til organismen for å få innpass i vertsceller avgjørende. I tillegg kan spesifikk genet Slå også påvirke bakteriell replikasjon derfor å endre nivået av trans observert. Bekreftelse på at siRNA lyddemping ikke signifikant innvirkning bakteriell oppføring og / eller replikering, og dermed trans effektivitet, kan oppnås ved hjelp av enten mikroskopi eller numeration av bakterier. den transDataene kan deretter normaliseres for antallet infiserte celler per siRNA behandling. Bakteriell replikering har ikke skamme dataene som presenteres her som Coxiella gjennomgår lite eller ingen replikering i løpet av 24 timers inkubasjonstid.

Denne fremgangsmåten krever effektiv transfeksjon av siRNA inn i vertsceller for å sikre tilstrekkelig stanse av genet av interesse. Med dette i bakhodet, velge riktig transfeksjon reagens er ekstremt viktig. Bortsett fra reagenset og betingelsene som anvendes i denne studien, som har blitt optimalisert for HeLa-229-celler, er det mange andre reagenser for å velge fra. Knockdown effektivitet ved hjelp av ulike transfeksjon reagenser kan kvantifiseres ved hjelp av RT-qPCR å sikre at både den mest passende reagens er valgt og at siRNA valgt spesielt rettet transkripsjon av interesse. Selv om det ikke presentert i denne studien har vi tidligere vist knockdown effektiviteten av både Rab5A og Rab7A hjelp RT-qPCR 21. I tillegg kan bruken av antistoffer mot målet av interesse og bekreftelse ved western blot også bekrefte siRNA stanse av spesifikke mål.

To andre viktige hensyn å ta til etterretning når du bruker siRNA inkluderer muligheten for off-target effekter og cellen levedyktighet av transfekterte celler. Off-target effekter oppstår når utilsiktede mål er også ødelagt. Dette kan føre til fenotypiske endringer og kan føre til falske positiver. I denne studien benyttet vi en pool av fire siRNA tomannsboliger for å dempe en enkelt vert mål. Hvis tie et spesielt mål fører til en reduksjon i trans effektivitet, validering at dette resultatet ikke skyldes off-target effekter kan oppnås ved separering av de fire duplekser siRNA og gjenta trans analysen. I det minste to av fire siRNA duplekser bør vise en lignende fenotype til det opprinnelige siRNA bassenget. Med dette resultatet, kan man være svært trygg på at den observerte translocation effektivitet er ikke på grunn av off-target effekter. Gyldigheten av trans resultatene produsert er også avhengig av celle levedyktighet. Anvendelsen av et kjerner flekk etter trans analysen muliggjør bestemmelse av cellelevedyktigheten etter siRNA demping. I tilfelle av PLK1, kan betydelig celledød lett observeres uten farging; imidlertid, ved hjelp av epifluorescens mikros en mer nøyaktig representasjon kan oppnås. Hvis ved stanse en bestemt vert mål signifikant celledød observeres, for eksempel 50% sammenlignet med kontrollen, er det usannsynlig at et riktig bilde kan utledes med hensyn til betydningen av den bestemte vert proteinet til translokasjon av effektorer. Som vist i denne studien, selv om stanse enten Rab5A eller Rab7A har en liten innvirkning på celle levedyktighet (figur 5C), er denne reduksjonen ikke uttalt nok til å oppheve gyldigheten av trans data observert. En annen vurdering med hensyn til celle levedyktighet Føllpå grunn siRNA stanse er den observasjon at betydelig celledød fører ofte til en økning i transforhold. Dette er treffende demonstrert av trans data rapportert for PLK1 (figur 5A). Den reduserte celleantall resulterer i en proporsjonal økning i den mangfold av infeksjon. Dette vil øke den infeksjonsraten og dermed transforhold.

Selv om det ikke presentert i denne studien, kan visualisering av effektor trans også gi et gratis kvantitativt resultat. Ved hjelp av en epifluorescent mikroskop utstyrt med en langpasning dichroic speil til separat magnetisering og utslipp lys kan gi en visuell observasjon av intracellulær Blam underlaget fluorescens. Et mulig alternativ til den β-laktamase reporter-systemet er å benytte den adenylat-cyclase reporter system. I likhet med rapportørsystemet som er beskrevet her, blir genet av interesse fusjonert til en kalmodulin-avhengig adenylatsyklase-genet (cyaA Bordetella pertussis. Effektor translokasjon kan måles ved kvantifisering av intracellulær cyklisk AMP (cAMP) ved anvendelse av en immunoanalyse ELISA kit. Siden aktiviteten av CyaA er helt avhengig av vertscellen kalmodulin, som bare er til stede i vertens cytosol blir effektor trans bekreftes av en økning i cAMP-nivåer. Selv om denne metoden har også blitt brukt med hell for å måle effektoren trans for en rekke bakterier 45-47, kvantifisering av intracellulært cAMP avhengig av lysering av vertsceller for å trekke ut cAMP, en prosess som er mer tidskrevende sammenlignet med fremgangsmåten beskrevet i. Måling av effektor translokasjon ved å bruke FRET-baserte β-laktamase reporter system er mer effektiv fordi den BLAM substratet kan bli tilsatt direkte til cellene og fluorescensen kan måles i løpet av timer. I tillegg kan fremgangsmåten som er beskrevet her være lettere tilpasset til å generere høy-throughput resultater, spesielt i en 96-brønners skjemapå.

Mange bakterielle patogener avhenge protein trans systemer for å innføre effektor proteiner i vertsceller slik at modulering av vertscellefunksjoner til fordel for patogen. Type IV sekresjon systemer brukes av intracellulære bakterier som legionella, Coxiella og Brucella og type III sekresjons-system benyttes ved en rekke patogener, inkludert Chlamydia, påsetting og utslettende E. coli og Salmonella. Ved å sammenligne effekten av å stanse ekspresjon av spesifikke verts proteiner på effektoren translokasjon av en rekke patogener, kan en forståelse av vertsfaktorer som er nødvendige for effektor translokasjon av bestemte typer sekresjon systemer eller spesifikk til et individ patogen belyses. Dette gir en unik tilnærming til å studere detaljene i verts-patogen interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Target konsentrasjon
1 um 5 mikrometer 10 uM 20 uM
starter Moles
1 nmol 1 ml 200 ul 100 pl 50 pl
2 nmol 2 ml 400 mL 200 ul 100 pl
5 nmol 5 ml 1 ml 500 mL 250 fil
10 nmol 10 ml 2 ml 1 ml 500 mL
20 nmol 20 ml 4 ml 2 ml 1 ml
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5x siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175 cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Tags

Infeksjon Host-patogen interaksjoner bakterielle sekresjon systemer β-laktamase transanalyse Blam substrat fluorescens mikrobiologi intracellulære bakterielle patogener, Gene silencing siRNA molekylærbiologi
Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA lyddemping
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newton, P., Latomanski, E. A.,… More

Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter