Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214

Abstract

인간의 두뇌는 주로 연료 공급원으로서 포도당에 의존하는 고 에너지 소비 기관이다. 글루코스는 아데노신 삼인산 (ATP)의 형태로 세포 에너지를 생산 당분, 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 및 산화 적 인산화 (OXPHOS) 경로를 통해 뇌 미토콘드리아 이화된다. 미토콘드리아 ATP 생산의 손상은 저명한 신경과 myopathic 증상이 임상 적으로 제시 미토콘드리아 질환을 발생합니다. 미토콘드리아 결함도 신경 발달 장애 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애) 및 신경 퇴행성 질환에 존재한다 (예 : 근 위축성 측삭 경화증, 알츠하이머와 파킨슨 질환). 따라서, 건강 상태 및 질환 모두하에 미토콘드리아 형태, 구조 및 분포의 3 차원 분석을 수행하기위한 필드에 증가 된 관심이있다. 뇌 미토콘드리아 형태는 특히 일부 미토콘드리아와 함께,에서와 매우 다양하다시냅스 영역 전통적인 광학 현미경의 해상도 한계 이하의 <200 nm의 지름의 범위에있는. 뇌의 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 것은 상당히 공 초점 현미경에 의한 organellar 검출을 향상시킨다. 그러나, 대형 미토콘드리아의 이미지 oversaturating없이 비교적 작은 크기의 미토콘드리아의 검출 감도에 대한 제약을 극복하지 않는다. 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 신경 세포에서 미토콘드리아를 특성화하기 위해 사용되었지만,이 방법은 매우 시간 소모적 여러 샘플을 비교할 때 특히이다. 시리얼 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBFSEM) 기술은 조직 및 데이터 취득 촬상 블록 절편의 자동화 된 프로세스를 포함한다. 여기서 우리는 신속하게 재구성과 미토콘드리아 형태를 시각화하기 위해 쥐의 뇌에서 정의 된 영역의 SBFSEM을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 이 기술nique 또한 정의 뇌 영역 미토콘드리아 번호, 볼륨, 크기 및 분포에 대한 정확한 정보를 제공하기 위해 사용될 수있다. 얻어진 이미지 해상도 (일반적으로는 10 nm 이하) 높기 때문에 어떤 형태 총 미토콘드리아 결함은 검출 될 수있다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

미토콘드리아는 세포의 세포 골격과의 긴밀한 상호 작용, 자신의 모양과 휴대 단서 및 필요에 따라 위치를 변경 동적 소기관이며, 이러한 뉴런 1 칼슘 전류와 같은 셀룰러 이벤트에 대한 응답이다. 다른 세포 소기관이 차례로 자신의 역학과 신진 대사 2를 조절 소포체를, 예와 미토콘드리아는 또한 상호 작용합니다. 미토콘드리아 형태, 즉 서로 다른 세포 유형의 이질성을 보여줍니다. 세포 기관의 모양은 시트, 자루 및 타원 3 구성된으로 관에 따라 다릅니다. 미토콘드리아 융합과 분열주기 단백질 위치, 크기, 형상 및 미토콘드리아 (4)의 분포를 조절할 수 있음을 보여왔다. 또한, 미토콘드리아 형상의 변화는 신경 퇴화, 신경 세포의 가소성, 근육 위축, 칼슘 신호, 반응성 산소 종의 생성뿐만 아니라, 수명 및 세포사 연루 그쪽와 연관된T 세포 특이 미토콘드리아 형태는 정상적인 세포 기능 5-11의 유지에 중요하다.

미토콘드리아의 주요한 생체 에너지 함수는 TCA 사이클을 통해 완전한 영양소 파괴 (즉, 글루코스, 지방산 류 또는 아미노산)를 포함하고 OXPHOS 12 경로 대사 된 일련의 반응을 실행함으로써, 아데노신 삼인산 (ATP)를 생성한다. 인간의 뇌는 체중의 2 %에 불과하지만 그것이 ~ 그것을 기관 (13)을 요구하는 매우 에너지 생산을 전체 에너지의 20 %를 소비 구성한다. 인간의 미토콘드리아 기능 장애는 신경 학적 증상 14-17의 큰 숫자에 이르게 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 유전 ~ 1의 유병률과 임상 질환의 이종 집단이다 미토콘드리아 장애 17,18에 ATP 생성 오퍼 손상 OXPHOS 성분 돌연변이 : 5000 개인, 및 m의 가장 흔한 원인 중 하나어린이와 성인 etabolic 장애. 미토콘드리아 유래 ATP의 결핍은 뇌, 심장과 골격 근육은 주로 환자 14,17,18에 영향을받지 높은 에너지를 요구하는 기관으로 여러 기관의 시스템에 영향을줍니다. 최근 몇 년 동안, 여러 연구는 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환 15-17,19,20 모두 미토콘드리아의 기능 장애에 대한 증거를 제공했다. 미토콘드리아 필수적인 뇌 발달과 기능에 중요하기 때문에, 모두 건강하고 질병 상태하에 미토콘드리아 뇌 형태, 구조, 크기, 수 및 분포의 변화를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하는 것이 필수적이다. 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)과 마우스 모델은 뇌 (21, 22)에서 미토콘드리아의 움직임과 현지화를 시각화하기 위해 제작되었습니다. 이것은 미토콘드리아 운동성 일반적인 분포를 조사하기 위해 매우 유용한 도구이지만 포함하여 몇 가지 단점이있다전자 제한된 해상도와 형광 현미경의 감도. 이러한 특성은 어려운 비교적 소형 미토콘드리아를 추적 할 수 있습니다. 마찬가지로, 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 미토콘드리아 23를보기 위해 사용하지만, 이러한 방법은 매우 시간이 걸리고있다. 미토콘드리아 형태들은 연속 분열 및 융합 사이클을 겪는다으로 매우 동적으로 알려져 있고 대부분의 세포에서 미토콘드리아 고도로 연결된 네트워크 24-26을 유지한다. 뉴런은 매우 그들이이 신경 돌기를 통해 그들의 방법 (그림 1) 확인으로 분리 할 수있는 다수의 수상 돌기 및 확장 축삭과 세포체에 연결된 망상 네트워크를 형성 미토콘드리아와 세포를 편광된다. 이 크기와 모양이 매우 다양 뇌 미토콘드리아를 만든다. 예를 들어, 일련의 블록 표면을 주사 전자 현미경 법을 사용하여 (SBFSEM) 기술, 우리는 이전에 관찰 extrasynaptic mitochondr의 양 또는 크기의 차이16 개의 27 배로 신경 말단에 존재하는 미토콘드리아에 아이오와만큼 할 수있다.

볼륨을 수행하기위한 여러 가지 방법이 있습니다을 Ultramicrotome SEM (30) 수집 시리얼 섹션 TEM (29), 자동화 된 테이프를 포함, 28 분석은, 이온 빔 SEM (31), 및 SBFSEM (32)을 집중했다. SBFSEM 분석은 뇌의 1mm까지의 영역에서 미토콘드리아는 형태 학적 형태, 크기, 분포 및 세포 소기관의 수 정량에 데이터를 제공하는 해상도를 가지고 있다는 장점을 갖는다. 기술적 동작 이전 EM 경험 부족 많은 생물학 실험실의 능력 내에서 데이터 수집 및 분석, 또한 상기 요구하고있다. 직렬 섹션 같은 이미지를 생성하기위한 상용 장비의 출현은 조직의 3 차원 미세 구조 분석을했다 더 신속하고 반복 가능한 방식 (28)의 편견 부피 분석을 허용하는 일상적인 기술, (34)의 재구성 분석에 중요한 수단으로이 기술을 확립 한 이후 1981 33. 여러 연구에서 레이튼 도입 아이디어에 기초하여 2004 년 32 신경 생물학의 분야에 기술 하였다. 또한, 많은 작은 규모의 프로젝트를 위해, 그것은 세포 소기관 27,35-39를 식별하기 위해 재구성 분석을 제공합니다. 이후, 획득 된 이미지가 저전압 다시 산란 전자로부터 유도되며, 다른 공지 된 중금속 염색 기법을 결합하여 새로운 염색 프로토콜 해상도 40 높이기 위해 개발되었다.

본 논문에서는 3 차원 전자 현미경 이미징 및 이전에 우리와 다른 사람 38,39,41에 의해 사용 된 방법에 따라 뇌 미토콘드리아의 부피 분석을 활용하기위한 프로토콜을 제공합니다. 티슈 후 처리 방법 바와 Deerinck 등에 의해 설명 된 사용40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 버지니아 공대에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

주의 :이 프로토콜에 사용되는 여러 구성 요소를 처리하고 폐기 할 때 극단적 인 예방 조치가 취해 져야한다. 사용하기 전에, 제도적 지침 및 건강과 안전 사례 지역은 특히 인 중금속과 방사능 소스, 납, 질산 모두이다 휘발성 매우 유독 산화 오스뮴, 우라 닐 아세테이트, 대한, 설립 따라야합니다 중금속 독. Thiocarbohydrazide (TCH)을 잘못 취급하면, 폭발과 유독 가스를 생산하기 위해 분해 할 수 있습니다. 많은 기관이 시약은 일상적으로 사용하고 도움을 제공 할 수있는에 EM의 핵심 시설을 제공합니다.

뇌 조직과 SBFSEM 이미징 1. 준비

  1. 5 % isoflura - 4를 사용 - (4 개월 ~ 2) C57 블랙 마우스 (C57BL / 6J 변형) 젊은 마취네브라스카 제도적 지침에 따라. 근육, 자발적인 움직임과 꼬리 핀치 같은 혐오 자극에 대한 반응의 부족의 손실을 모니터링하여 마취를 확인합니다.
  2. 해부 트레이에 마우스를 고정하고 복부 중간 선을 따라 피부에 절개를합니다. 마우스의 갈비뼈를 노출 피부에 더 절개를합니다. 다이어프램을 절개 조심스럽게 뛰는 심장을 노출하기 위해 주변을 따라 흉강을 절개 한 후 우심방에 절개를합니다.
  3. 나비 캐 뉼러를 사용하여 좌심실을 cannulate. 방혈은 간장의 색의 변화에​​ 의해 확인 될 때​​까지, 인산 완충 식염수 (PBS) pH를 7.2 ml의 20 - 10로 transcardially를 사용하여 마우스를 관류.
    참고 간의 색의 변화는 방혈의 범위를 결정하는 기준으로 사용된다. 적갈색의 간 색상 변경 핑크 창백 할 수 있는지 확인합니다.
  4. 2 % glutar 20ml를 -로 transcardially 10을 이용하여 마우스를 관류알데히드와 4 % 파라 포름 알데히드는 내에서 신속하게 뇌 조직을 고정, 0.10 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)에했다. 고정은 꼬리 보강을 관찰 모니터링합니다.
    pH를 조정하고, 물 100ml로 볼륨을 만드는 염산, 80 ㎖의 물에 cacodylate 나트륨 2.14 g을 용해하여 0.10 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)를 준비 참고.
  5. 관류를 따르면, 마우스 참살 O 4 ℃에서 48 시간 동안 0.10 M 소듐 cacodylate 완충액 (pH 7.2)를 함유하는 2 % 글루 타르 알데히드 및 4 % 파라 포름 알데히드로 고정 하였다 뇌를 절개
  6. 48 시간 후, vibratome를 사용하여 400 ㎛의 코로나 부분을 확인하고 조심스럽게 해부 현미경 (42)에서 (예를 들면, 해마) 뇌의 관심 영역을 해부. 조심스럽게 조직을 잘라와 방향을 유지하기위한 사진 촬영을합니다.
    참고 SBFSEM에서 조직 염색 후 처리 방법은 중금속 염색 방법의 다양한 결합순서는 해상도를 개선하고 Deerinck (40)에 의해 이전에 개발 된 방법에 기초한다.
  7. 글루 타르 알데하이드 고정 조직 3 회, 5 분 0.1 M cacodylate 완충액 (pH 7.2)의 각을 씻으십시오.
  8. 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.2)에 탄닌산을 용해시켜 0.1 % 탄닌산 용액을 제조 하였다. 용해 될 때까지 소용돌이 필요한 경우, 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
  9. 실온에서 60 분 - 접미사는 cacodylate와 조직은 30 일 ml의 시약에 배양하여 탄닌산 0.1 % 버퍼링.
    참고 : 배양 시간은 조직의 크기에 의존하지만, 30 분은 대부분의 조직에 가장 적합합니다.
  10. 조직 3 회, 5 분 cacodylate 버퍼의 각 (산도 7.2)를 씻으십시오.
  11. H 2 O 증류수 10 ㎖ (DH 2 O) 0.3 g 칼륨 페로와 0.86 g 나트륨 cacodylate을 녹인다. 얼음에 페로 시안화 칼륨 용액을 유지합니다. 그냥 사용하기 전에, 4 %의 산화 오스뮴의 10 ㎖ (OSO 4)를 추가합니다.
  12. 2 %의 운영 체제와 조직을 얼룩얼음에 90 분 동안 중요한 어 - 페로 솔루션. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오
  13. 10 ml의 DH 2 O 0.1 g TCH를 용해하여 1 % thiocarbohydrazide (TCH) 솔루션을 준비 완전히 용해 될 때까지 매 10 분 소용돌이에 의해 60 ℃에서 녹인다. TCH를 처리하는 동안 밖으로 건조, 고온, 또는 허용하는 용액에 금속의 사용, 난방을 방지하기 위해주의를 기울여야 특히, 안전주의 사항을 준수하십시오.
  14. 실온에서 20 분 동안 새로 제조 1 % TCH와 샘플을 취급합니다. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오
  15. DH 2 O로 2 % 4 % 4 OSO 희석, 1 시간 동안 배양하여 2 % 수용액 산화 오스뮴으로 염색 조직. DH 2 O.과 조직 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오
  16. 4 ° C에서 DH 2 O의 1 % 우라 닐 아세테이트 샘플 O / N을 품어.
  17. (Deerinck (40)에 의해 설명 된 바와 같이) 월튼의 리드 아스 파르 테이트 솔루션을 준비합니다.
    1. 250 ml의 DH 2 O에서 0.998 g L-아스 파르 테이트를 녹여pH가 5.5에 도달 할 때까지 다음 적하 방식으로 10 N 수산화 칼륨 (KOH)을 추가한다. pH 조정 후, 30 분간 60 ° C로 가열 산 스톡 아스파르트 10 ㎖ 리드 질산 0.066 g을 추가한다.
  18. DH 2 O에 조직을 씻어 60 ° C 오븐에서 30 분 동안 월튼의 리드 아스 파르 테이트 얼룩 품어. DH 2 O 3 회, 5 분 각각을 씻으십시오
  19. 100 % 에탄올,이어서 5 분마다 20 %, 50 %, 75 %, 85 % 및 95 % 에탄올 용액을 냉각하여 알콜 등급 일련의 3 회, 10 분마다 시료를 탈수.
    참고 : 열 에탄올 공기에서 물을 흡수로, 갓 열린 병에서 100 % 에탄올을 사용하여 실패를 포함 원인이된다. 긴 배양 큰 조직 샘플 필요합니다.
  20. 워시 샘플 2 회, 15 분 프로필렌 옥사이드의 각.
  21. (도데 세닐 숙신산 무수물) 25 ml의 수지 10.5 mL로 DDSA를 사용하여 플라스틱 매립 수지 15.5 mL로 NMA (메틸 나 딕산 무수물) 1 mL로DMP-30 (2,4,6- 트리스 디메틸 아미노 메틸 페놀). 진탕하여 수지를 혼합한다. 스핀과 수지가 거품 해결 될 때까지 방치한다.
    참고 :이 표준 매체 경도 조리법이다. 전자 현미경 (EM)의 플라스틱 수지의 다른 종류를 사용할 수 있지만, 모든 수지 SBFSEM 작동하지 사전에 필수적이지 않은 대조군 샘플에서 테스트되어야한다.
  22. 10 시간 - 산화 프로필렌은 약 8 시간에 걸쳐 증발되도록 2 시간 후, 초기 다음 캡핑 캡핑 바이알에, 매립 수지 및 프로필렌 옥사이드 50 믹스 : 50에 조직 O / N을 인큐베이션.
  23. 2 시간 동안 깨끗한 유리 병에 100 % 신선한 매립 수지에 조직을 전송합니다.
  24. 플랫 형 신선한 매립 수지에 포함 된 샘플은 종이 라벨을 인쇄하고, 48 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 경화을 함유. 약 1 시간 후에, 다시 조직 배치와 정렬을 확인하고 필요하다면 조정한다.
  25. 관심 영역 샘플을 잘라 내고 gellin를 이용한 알루미늄 핀 마운트g 시아 노 아크릴 레이트의 순간 접착제 또는 도전 에폭시 수지는 다음 콜로이드 실버 코팅 알루미늄 핀에 도전로를 제공하는 블록의 측면 주위에 붙여.
  26. 인 - 실을 Ultramicrotome 단계 낮은 kV의 후방 산란 전자 검출기 (32)를 구비 한 주 사형 전자 현미경 시스템을 이용하여 조직 시료를 조사한다.
    참고 : 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용에서의 악기와 현장 교육을 구하여 승인 된 사용자가됩니다. 또한, 작은 프로젝트를위한 연구원 또는 핵심 시설과의 협력이 가능할 수있다. 엔진 마케팅 업체는 X 선을 발생으로 방사선 훈련도 필요할 수 있습니다.
  27. 샘플 이미지, 다음 설정을 사용 : 2.25 kV로, 5시 - 10 nm의 / 픽셀 해상도, 80 사이의 필드 크기 - X 250 μm의, y를 (다른 필드가 가능한 크기), 50의 슬라이스 두께 - 100 nm의, 20 시간의 시간 - 16의 600 조각 - 250의 총.
    참고 : 설정은 다른 현미경 사이에 크게 변화, INDI개 별 샘플, 원하는 해상도입니다. 이러한 설정은 많은 샘플 쉽게 해석 할 수있는 이미지를 생성한다.

2. 이미징 데이터 세트를 분석

참고 : 이미지 J / 피지 소프트웨어는 데이터 세트를 분석하는 데 사용하고 TrakEM2 플러그인에 의존한다. 전처리 단계는 다양한 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수 있고, 광범위한이나 숙련도에 따라 보조 할 수 있으며, 스택 얻는다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 주요 변형 여기에 설명되어 있습니다 (1.50b 버전 ImageJ에는 피지 시월 (1), 2015 다운로드).

  1. 소프트웨어에서 열고 메뉴 항목을 이미지 → 형 → 8 비트를 선택하여 원래의 고유의 16 비트 이미지에서 8 비트 TIFF 형식으로 이미지를 변환합니다.
    1. 이 단계에서 자동 명암 / 밝기 변환 이미지에 적합하지 않은 경우, 16 비트 이미지를 다시 누릅니다 이미지 밝기 / 대비 → 조정 →. 모든 이미지 작동 범위를 선택하고 Enter를 누르 적용합니다. 그런 다음 C를 수행onversion. 참고 : 일부 엔진 마케팅 업체에서이 단계는 현미경 제조 업체의 소프트웨어가 필요할 수 있습니다.
    2. 때문에 조각 사이에 받아 들일 수없는 이미지 움직임에, 필요한 경우 (예. 때문에 충전에 드리프트) / 등록 이미지 스택 (메뉴 항목 플러그인 선형 StackAlignmentWithSIFT → → 등록)을 맞 춥니 다. 대부분의 등록 소프트웨어에서 "번역 전용"모드가 아닌 "강체"을 설정합니다.
      많은 접근 방법 및 소프트웨어가 작동 할 수 있습니다 참고 : 많은 응용 프로그램에 대한 SIFT 등록 플러그인 작품과 가상 스택 버전이있다.
      1. 필요한 경우, 사전 등록에 (이미지 →이 CanvasSize → 조정) 또는 (자르기 → 이미지) 관심의 영역으로 감소 캔버스 크기를 확대.
        일부 드리프트 또는 플레잉이 발생할 수 있으며, 다른 플러그인이나 소프트웨어를 시도하는 것이 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 수동 옵션도 (예를 들면. ImageJ에 / 피지, 플러그인 → 등록 →의 ManualLandmarkSelection)을 사용할 수 있습니다.
    3. desir 경우에드, 더 작고 관리 크기로 스케일 이미지 (예. 25 %) ImageJ에 (이미지 → 규모)를 사용.
  2. 소프트웨어 선택 파일 → 가져 오기 → 이미지 시퀀스를 실행 한 후 TIFF 파일을 선택합니다.
  3. (빈) 새 → TrakEM2 → 파일을 선택하여 플러그인을 시작합니다. 두 개의 창이 열립니다; 하나는 프로젝트 area_lists를 관리하고 다른 트레이스를 관리하고, '캔버스'로 지칭된다.
  4. 캔버스 가져 오기에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 플러그인으로 이미지 스택을로드합니다. 가져 오기를 선택하고 가져 오기 스택을 클릭합니다. 팝업 옵션에서 가상 스택에 대한 확인란을 선택합니다.
    참고 : 이미지 스택은 이미 소프트웨어에 오픈되어 있지만, 그들은 또한 플러그인에서 열려 있어야합니다. 가상 스택의 상자를 선택하면 컴퓨터가 원활하게 실행할 수 있습니다.
  5. 밉맵이 생성되고, 스택이로드 된 후, 바로 플러그인 창에서 프로젝트 이름을 클릭합니다. 오른쪽 템플릿 COL에 '새 프로젝트'를 클릭UMN, 그 프로젝트에 대한 '새로운 아이를 추가'를 선택합니다. 오른쪽 'area_list'를 선택하기 위해 다시 클릭합니다.
  6. 캔버스에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 원래의 전자 현미경 설정에 동의하는 프로젝트의 Z 축 스케일을 설정 한 다음 표시를 클릭하고 교정을 선택합니다. 또한, 플러그인 창에서 모든 레이어를 선택하여 Z 스케일을 설정, 오른쪽 규모의 Z와 두께를 선택합니다.
  7. 클릭하고 '프로젝트'프로젝트는 캔버스 창에서 'Z 공간'탭에서 '지역 목록'을 작성하는 섹션 개체에 모든 '아이들'을 끕니다.
  8. '영역 목록'을 선택하고 마우스 오른쪽 선택하고 색상을 설정합니다. 이제, 전자 현미경 이미지에서, 이러한 미토콘드리아와 같은 객체를 추적하기 위해 페인트 브러시 도구를 사용합니다. 사용 'Shift + 클릭'밀폐 원 채우기 위해, 'Ctrl 키 + 스크롤'확대 및 축소, 그리고 지우개로 페인트 브러시 커서를 설정하는 'Alt + 클릭'.
  9. 15 μm의 - ~ (10)의 두 영역을 선택(10) - 이미지의 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 모서리에 15 μm의 각 데이터 세트에서 미토콘드리아의 편견 샘플링을 할 수 있도록이 지역 내의 모든 미토콘드리아를 식별합니다.
  10. '캔버스'에서 관찰하고 섹션을 통해 미토콘드리아를 추적. 참고 : 미토콘드리아 비슷한 크기의 아주 어두운 / 고밀도 나타나는 세포 소기관, 직경 느슨하게 원통형이다. 내부 막에 의해 형성된 고유의 cristae이 세포 기관 내부에 쉽게 구별 할 수 있습니다.
  11. 추적이 완료되면, 오른쪽 Z 공간 탭에서 area_list 클릭 '3D로 표시'를 선택합니다. 이 추적 이미지의 3 차원 재구성을 볼 수있는 3D 뷰어 플러그인을 시작합니다.
    1. 미토콘드리아의 부피 측정, 3D 뷰어에서 개체 선택을 수행하려면 '편집'탭을 클릭하고 '개체 속성'을 선택합니다. 미토콘드리아 볼륨 추정치는 여러 가지 다른 측정과 함께 표시됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

우리는 뇌 미토콘드리아 형태와 크기가 다른 신경 하위 구획의 유형이 있음을 보여줍니다. 렌티 바이러스는 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질 도입 저밀도의 연결을 문화에 공 초점 현미경은 말초 신경 돌기에 거주하는 사람들은 개별 연장 된 형태 (그림 1 AB)를 나타내는 반면, 신경 소마에 거주하는 미토콘드리아가하는 망상 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다. SBFSEM 기술을 사용하여 미토콘드리아의 형태, 크기, 부피 분포는 마우스 뇌에서 분석 하였다. 미토콘드리아의 3 차원 (3D) 이미지는 마우스 뇌의 해마 신경 돌기 모두와 시냅스로부터 재구성되었다. 시냅스 미토콘드리아는 확인 및 주민 미토콘드리아을 품고 시냅스 부 튼스의 수를 정량화 하였다. 미토콘드리아의 크기 이질성은 인터넷 (축삭 구획 대 수지상에서 관찰gure 1 CD). 또한, 마우스 뇌의 해마에 많은 작은 시냅스 구획 (그림 2 AC) 미토콘드리아없는했다. 모두 시냅스와 extrasynaptic 미토콘드리아의 부피 측정은 볼륨이나 신경 presynapses 내에 존재하는 미토콘드리아의 크기가 extrasynaptic 영역 (그림 2 DF)에 거주하는 사람들보다 훨씬 작았 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 200이 아닌 체세포 미토콘드리아의 편견 샘플에서 측정 미토콘드리아의 두 차원 (2D) 크기 분포는 미토콘드리아 분획의 11 %가 광학 현미경의 해상도 한계 (그림 2G) 아래에 자리 잡고 있습니다 ~ 것으로 나타났다. 또한 SBFSEM 분석에 의해 취득 된 2 차원 화상은 개별 미토콘드리아 (도 3 AB)의 미세 구조 특성을 시각적으로 해상도를 증가 제공한다. 인해 조직의 명확하게 보이는 지형, 세포 샘플 콘텐츠를 분류하기 위해 상기 수있다그것의 근접을 결정함으로써 미토콘드리아의 artment에 쉽게 핵 (체세포)와 같은 식별 구조와 시냅스 소포 (시냅스) (그림 3 AB). 신경 프로세스 내에 존재하는 미토콘드리아를 식별하기 위해, 각각 연접 튼스 (42)의 유무에 기초하여 엑손 또는 수지상과 같은 개별 공정을 재구성. 이러한 결과를 바탕으로 SBFSEM는 뇌 조직 및 미토콘드리아 구조 및 분포의 모든 총 결함은 또한이 방법을 사용하여 결정될 수 미토콘드리아의 형상, 크기, 수 및 분포를 파악하기 위해 매우 중요한 분석 기술이라고 제안한다. 뇌에서 다른 세포 유형의 미세 구조 특성 때문에 예를 들어, 구별된다. 아스트로 글리코겐 과립의 존재는 그 뇌 미토콘드리아의 세포 형 특이 적 차이를 분석하는 것도 가능하다.

그림 1 그림 1 :. 출생 후의 일 1 마우스 새끼에서 신경 세포의 미토콘드리아 형태와 분포의 이질성 두피 문화 렌티 바이러스는 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (미토-GFP)를 발현하는 형질 도입 하였다. (A)는 미토-GFP를 발현하는 신경 소마를 표시, 미토콘드리아 형태의 그물 네트워크를 참고; 뉴은 핵을 =; 스케일 바 = 5 μm의. (B)는 말초 신경 돌기의 연장 미토콘드리아 형태를 보여줍니다; 스케일 바 = 5 μm의. (C) 마우스 뇌 조직에서 생성 된 SBFSEM 데이터 세트에서 대표적인 2D 이미지는 미토콘드리아는 수상 돌기가 갈색으로 염색 파란색과 축삭 정맥류에 염색, 녹색으로 염색; 스케일 바 = 1 ㎛. (D) 마우스 뇌 조직의 신경 돌기의 미토콘드리아의 3D 재구성 수지상 및 축삭 미토콘드리아 indicat 크기 사이의 차이에 유의각각 크고 작은 화살표로 에드; 스케일 바 = 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 (SBFSEM) 분석은 시냅스 터미널에서 미토콘드리아의 낮은 풍요를 공개합니다 (A) P15 야생형 생쥐의 해마에서 얻은 SBFSEM 데이터 세트의 분석에서 대표 2 차원 ultramicrograph;. 스케일 바 = 1 ㎛. (B)는 10 시냅스 전 신경 말단의 3 차원 복원을 표시합니다. 단지 4 10 명 중 시냅스 단말기 식별 미토콘드리아를 보였다 있습니다; 스케일 바 = 1 ㎛. (173)의 정량 분석을 나타내는 (C) 막대 그래프는 SB에서 시냅스 전 신경 말단 재구성FSEM 데이터 세트의 분석. (D) 녹색에서 파란색과 연접 미토콘드리아에서 extrasynaptic 미토콘드리아를 보여주는 SBFSEM 데이터 세트에서 대표적인 2D 이미지; 스케일 바 = 1 ㎛. 소프트웨어를 이용하여 SBFSEM 데이터 세트에서 시냅스와 extrasynaptic 미토콘드리아 (E)의 3D 재구성; 스케일 바 = 1 ㎛. (F) 막대 그래프 extrasynaptic와 연접 미토콘드리아의 부피를 나타내는. 데이터는 SEM ± 평균으로 그려; n은 3 개의 다른 데이터 세트 (62 시냅스 미토콘드리아 총 80 extrasynaptic 미토콘드리아를 포함); * p 값을 나타낸다 = 0.0405. (G) 이미지의 네 모서리에 15 (15)에 의해 μm의 영역을 표시하고, 이외의 모든 체세포 미토콘드리아는 무작위 표본 추출을 할 수 있도록 확인되었다. ~ 200 미토콘드리아의 최소 치수를 측정 하였다. 파이 그래프가 아닌 체세포 미토콘드리아의 11 %가 광학 현미경의 해상도 한계 이하 치수 <200 nm의 있었다 ~ 보여준다. 이 그림은 B가EEN은 Chavan 27에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 마우스 뇌의 측면 Geniculate 핵에서 2D SBFSEM 이미지 (A) 측면 geniculate 핵 (8/8 μm의)에서 두 차원 대표 SBFSEM 이미지 영역의 상세한 지형을 보여주는.. 소마와 핵 표시됩니다; 스케일 바 = 2 μm의. (B) 미토콘드리아의 외부 및 내부 세포막과의 cristae 형성이 명확하게 볼 수 있도록 패널 A. 주에서 빨간색 사각형으로 표시된 영역의 확대. 토포 그래피 및 기타 세포 소기관 및 셀룰러 구조 관계가 관찰된다. PS는 시냅스 미토콘드리아의 예를 나타냅니다및 NS 비 시냅스 (NS) 체세포 미토콘드리아의 예를 나타냅니다; 스케일 바 = 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

신경 시스템의 복잡성은 적절한 해상도와 미토콘드리아로 큰 조직의 볼륨을 재구성하고, 형태 및 세포 소기관의 분포를 분석에 상당한 도전을 포즈. 뉴런, 올리고 덴드로 사이트와 입체적으로 확장 된 다수의 프로세스와 성상 세포를 포함한 여러 세포는 뇌 조직 (43) 내에서 상호 작용한다. 미토콘드리아는 세포와 먼 프로세스의 소마에 모두 존재하기 때문에, 미토콘드리아 형태는 신경계 (그림 1)에서 매우 다형성이다. 충분한 해상도 적절한 3 차원 구조 정보 그러므로 이러한 촛점 또는 이광자 현미경 (44,45)과 같은 종래의 광학 현미경 기술에 의해 얻어 질 수 없다. 전자 현미경은, 충분히 높은 해상도로 신경 조직에 대량의 재구성을 허용하는 경우에만 현재 이용 가능한 기술이다. 전통적으로, 신경 조직의 3 차원 복원 달성했다얇은 부분 (29)의 직렬 단면 투과 전자 현미경 (SSTEM)에 의해 D. 그러나, 최근의 기술 발전은 볼륨 전자 현미경 데이터 수집 및 자동화의 품질을 개선하고있다.

SBFSEM는 얇은 세포 과정을 수행하고 작은 세포 기관을 식별하기에 충분한 해상도, 수백 마이크로 미터 이상의 차원 조직 구조를 재구성하기 위해, 주 사형 전자 현미경의 챔버 내부 직렬 절편을 결합한 자동 블록 얼​​굴 영상 기법 . 이 기술은 정기적으로 무척추 동물과 척추 동물의 신경 두 시스템을 재구성의 가능성을 열었다. 이 시료 전처리, 주 사형 전자 현미경 작업, 데이터 수집, 이미지 포스트 - 프로세싱 및 이미지 분석을 포함하여 다수의 단계를 포함한다. 이러한 절차는 전문 손에 주사 전자 현미경 작업에 대한 교육 및 인증을 필요로합니다. 세 가지 요소는 비판이다알 즉. 정확한 해부학 뇌 영역 해부 고해상도 이미지를 획득하고, 적당한 이미지 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 고정 된 뇌 조직의 vibratome 슬라이스 관심의 해부학 적 영역을 해부 한 결과, 올바른 방향을 유지하기위한 사진을 촬영하기 위해 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 이미지에 맞는 사이트를 확인하기 어려울 수 있습니다. 고해상도 이미지를 얻는 것은 적절한 고정하고 적절한 사후 고정 염색 절차에 따라 달라집니다. 뇌는 죽음 이후의 미세 구조에 급격한 악화를 겪는 경향이있다. 따라서, 적절한 transcardial 관류 방법을 사용하여 글루 타르 알데히드 용액에 뇌를 해결하기 위해 중요하다. 이는 최소 24 시간 동안 글루 타르 알데히드 용액 뇌의 추가 고정으로 따라야한다. 이미지 해상도가 중금속 오염 다양한 방법의 조합에 완전히 의존하기 때문에 quantifiabl를 취득하는 프로토콜에 설명 된대로,이 포스트 고정 방법을 수행하는 것이 중요전자 이미지. 방법에 기재된 바와 같이 용액되어야한다. 마지막으로, 정확한 이미지 해석에 대해 분석 할 소기관 / s를 추적하기 전에 (미세 구조 특성을 시각화하여 예). 명백하게 식별되어야하고, 소프트웨어 지침은 엄격하게 지켜야한다. 획득 된 이미지의 해상도는 부피 측정을위한 나노 미터 픽셀에서 변환에 알려 져야한다.

이미지 분석을 수행하기위한 프로토콜에서 설명한 소프트웨어 이외에 재구성 크노소스와 같은 다른 가능한 소프트웨어의도 사용될 수있다. 기술 된 프로토콜의 강조 신경계 미토콘드리아보기에 있지만, 다양한 조직의 다양한 세포 내 구조물 고해상도 3D 정보 (예. 소포체, 리소좀 등.)을 생성하기 위해 수정 될 수있다.

동안 주사 전자 현미경 오에 대한 자세한 문제 해결 가이드: 조작이 문서 (기기의 사용자 매뉴얼 및 교육 정보 참조)의 범위를 벗어, 몇 가지 문제가 일상적으로 영상 실험하고 새로운 사용자 또는 협력 / 상업 소스를 통해 이미지를 얻는 사람들을 도울 수 있습니다 문제를 해결하는 방법을 이해하는 동안 발생합니다. 일반적인 문제는 거의 또는 전혀 염색 물질을 함유 수지 지역에서 주로 발생하는 샘플의 충전된다. 에 "긍정적 인"이미지, 핵, 혈관, 빈 수지 넓은 구역이 "검게"나타날 수 있습니다 (예. 세포질은 흰색 나타납니다). 또한, 충전이 또한 명백한 이미지 왜곡을 초래 지역 빔 드리프트를 촉진한다. 가능한 솔루션은 장비 및 샘플에 따라 다릅니다. kV의 설정을 줄이면 "흑화"이슈를 감소하지만, 더 빔 드리프트를 촉진 할 수있다. 하부 진공 모드를 사용하고, 기타 질소 (N 2) 가스, 수증기를 포함. 챔버 내에도 충전을 감소 시키지만, 해상도 시그나 상당한 비용L 잡음비. 두 번째 일반적인 문제는 칼 스킵입니다. 느린 스캔주기를 절단 / 어떤 이미지에 대한 모든 불균일 여부를 절단 블록 표면에 광선에 의한 손상을 줄 수 있습니다 (예. 연속적인 이미지는 동일하게 나타납니다). 몇 가지 솔루션 저조한 (감소 된 Z-해상도 절삭 깊이 / 슬라이스 두께를 증가 스캔 속도가 증가되어 결과적 잡음이 이미지를 받아들이고, 픽셀 크기를 줄이고 낮은 X / Y 해상도를 접수하고, 더 강한 염색 샘플 또는 지역을 선택 포함 존재 -stained 영역은 더 쉽게 더 많은 손상을 충전 등) 비율을 -noise하는 신호 수용와 이미지를 얻기 위해 더 이상 광선 노출을 필요로한다. 블록의 얼굴에 파편의 재 침착 이미지에서 유물의 가끔 소스이며,이 자주 발생하는 경우이 인수를 일시 중지, 조심스럽게 칼 (불고 공기)를 청소하거나 더 작은 크기로 샘플을 retrimming 필요할 수 있습니다. 블록 얼굴 충전도 재 부착을 촉진하고, 5 월 위의 단계도움. 초점 stigmation 정사도 주에 몇 시간 동안 계속해서 현미경 이미지 샘플로 요구 될 수있는 시간 stigmation 수정을 필요로하는 챔버 내의 진공 깊이 증가를하는 동안. 각각의 주사 전자 현미경은 연령 및 특성에 따라 다르다 경험 최고의 가이드이다. 단면 물질이 현미경 이미징 구성 요소에 부착 할 때 stigmation 또는 초점이 갑자기 극적인 변화가 발생할 수 있습니다. 챔버는 열려 있어야합니다 및 재료는 조심스럽게 진공 또는 압축 된 질소를 통해 빠질. 이것은 절대적으로 전문 교육을 필요로한다.

뇌 미토콘드리아 분석에서의 유틸리티에 관해서 SBFSEM 기술의 몇 가지 단점이 있습니다. 고정 된 조직의 현미경 모두 공통의 주요 단점은 그것이 매우 동적 소기관의 정적 인 이미지를 제공한다는 것이다. 미토콘드리아는 지속적인 핵분열과 융합 사이클 (26)를 거쳐 모바일 및 n 함께 인신 매매입니다eurite (21)을 처리합니다. 쉽게 접근 방식에 의해 놓칠 수 있습니다 순수하게 숫자 또는 구조없는 미토콘드리아 인신 매매의 결함 및 역학, 같은 사람이 해석 할 수 presynapse 같은 해부학 적으로 정의 된 공간에서 미토콘드리아의 수를보고 미토콘드리아의 수송이 39 변경할 수있는 경우는 있지만, . 두 번째 단점은 그러므로 놓칠 수있다 미토콘드리아 분포 특정 결함 회로 만 뇌의 작은 부분에서 수행된다는 점이다. 상관은 28,46은 분자와 미세 데이터 모두를 생성 SBFSEM 기술 공 초점 및 다 광자 영상을 결합 할 수있는 기회를 수득 접근한다. 미토콘드리아 분석을 위해,이 때문에, 뇌 부분 중 미토콘드리아의 항원 특이 적 항체를 사용하여 또는 형광 단백질을 미토콘드리아 타겟팅 발현하는 유전자를 사용하여 광 현미경 검사 후 SBFSEM을 수행하는 것이 유용 할 수있다. 이 combinatioNAL 전략은 신경 및 미토콘드리아 질환의 마우스 모델에서 미토콘드리아 결함을 식별 할 수있는 강력한 방법을 제공 할 수있다.

인해 열악한 고정 제, 중금속 및 화학 염색의 얼룩 침투 용도에 전자 현미경의 다양한 형태에 공통되는 기술적 한계가있다. 다른 제한은 조직 샘플의 플라스틱 매립 유래된다. 수지와 드문 드문 스테인드 구조의 빈 영역은 빔 편향 및 드리프트 (뒤틀림 이미지)뿐만 아니라 모두가 해상도에 충돌 인공적인 충전 신호 (예. 어두운 핵 및 혈관 내강)를 일으키는 영상 중에 전자를 유지합니다. 수지에 광 손상은 요철 가공을 촉진하고,이 이유로, 화상은 일반적으로 (50)의 슬라이스가 필요 - 데이터 세트에서 비 - 등방 복셀 제조 100 nm의, 블록 표면으로부터 절단한다. 일부 애플리케이션에 대한 다른 제한은 부분이 파괴되고이어서 재검토 할 수 없다는 것을 포함어떤 유용한 데이터를 포함하지 않을 수도 부분의 고해상도 영상을 수집하는 사용자를 강제 할 수있다.

SBFSEM의 주요 장점은 절편 및 저 진공 SEM 챔버 (32, 33)는 커스텀 마이크로톰을 통합하여 조직 블록을 묘화하는 프로세스를 자동화하는 것이있다. 이미지가 각 절단하기 전에 블록면에서 직접 얻을 수 있기 때문에, 섹션 주름, 압축 및 취급시 손실의 문제는 실질적으로 파편 증착 있지만, 피할 일부 이미지 손실 및 왜곡에 기여 않습니다 인해 차단 얼굴 충전을 휘게된다 . 또한, 원시 데이터 세트에서 얻어진 이미지는 이미 정렬되어 가장 분석 의무가되기 위해서는 광 편차를 수용하기 만 마이크로 미터 규모의 등록을 필요로한다. 진공 시스템이 안정되면 때문에 자동화 단면 공정, 조직 대량은 상당한 조작자의 개입없이 묘화 할 수있다. 이것을 이용하여 다수의 이점이있다세포 기관 및 세포 내 구조에 형태 학적 및 정량적 연구를 수행하는 기술입니다. 하나의 장점은 적절한 시간 내 미토콘드리아의 3 차원 구조에 대한 정보를 얻고있다. 재구성 47, TrakEM 48 크노소스 49-51와 같은 오픈 소스 재구성 소프트웨어 패키지의 가용성은이 기술을 실험 동물 모델에서 신경 네트워크의 상세한 3D의 미세 구조를 직접 비교 될 수있는 강력한 분석 도구를 만들었습니다. 반자동 완전히 자동화 된 이미지 분석 (52)은 미토콘드리아의 형태, 기능 및 / 또는 생합성이 영향을받을 것으로 예상된다 동물에서 높은 기계적 데이터를 생성 할 가능성이 접근한다. 이전 SBFSEM 분석이 매우 낮은 해상도로 인해 방해하고, 향상된 염색 방법 (40)을 포함하지만 새로운 샘플 제조 기술은 상당히 정도의 해상도를 향상 심지어 단일 시냅스 Vesicle 쉽게 해결할 수 있습니다. 이 해상도 같은 공포가 생김 멤브레인 파괴 및 소실 등의 cristae 미토콘드리아 미세 결함이 쉽게 관찰 될 수 있고, 세포 내 미토콘드리아 결함의 분포 (38, 39)을 결정할 수있다. 이 기술의 높은 해상도는 해상도 Z 축의 XY 축 ~ 200 nm에서 ~ 500 nm의 제한 광학 현미경에 비해 큰 장점을 제공한다. 미토콘드리아는 광학 현미경 (53)의 분해능 한계에 따라서한다. 해상도 한계 이하 치수를 갖는 미토콘드리아 여전히 광학 현미경에 의해 가시화 할 수 있지만, 그 크기는 신뢰성있게 측정 할 수 없다. 중요한 것은, 광학 현미경의 해상도 한계보다 작은 거리에 의해 분리되어 미토콘드리아는 광학 현미경에 의해 해결 될 수 없다. 또 다른 장점은 미토콘드리아의 구조 분석은 세포 소기관의 단리없이 조직의 컨텍스트 내에서 수행 될 수 있다는 것이다. 이 캔 등미토콘드리아 현지화를 기반으로 조직 내에서 적절한 비교를 위해 낮은, 예를 들어 축삭 대 체세포 및 / 또는 수지상 미토콘드리아합니다. 추가적인 장점은 미토콘드리아는 희 돌기 교세포 또는 대한 미엘린 대한 폐해 필라멘트 글리코겐으로서 정의 소기관로 처리를 수행하여 신경 세포 나 위치 파악에 neuroglial 여부를 확인하는 것이 가능하다는 것이다. 신경과 neuroglial 세포의 과정은 가까이에 종종 있으며, 2D는 TEM 등의 접근으로는 프로세스의 연결하며 neuroglial있는 자신감을 부여하기 어려울 수 있습니다.

이미지화 측정 재구성 될 그러한 미토콘드리아 전체 중추 신경계 세포 소기관 수는 10 nm 이상, - (5)의 미세 해상도 크기 1000 ㎛의 - 결론적 SBFSEM 기술은 조직 영역 (20)를 덮는 일련의 이미지의 스택을 제공한다 . 본 논문에서는, 우리는 프로가이 기술의 활용에 대한 몇 가지 구체적인 방법을 vided. 미래의 애플리케이션은 신경 발달 및 신경 변성 질환 모델 신경계 질환의 동물 모델의 다양한 미토콘드리아 구조 및 분포를 분석뿐만 아니라 소포체, 핵 및 / 또는 건강하에 전체 세포 또는 조직 내의 리소좀 등 다양한 세포 내 미세 구조를 분석 포함 질병 상태.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25, (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter