Abstract
Il cervello umano è un alto organo consumare energia che si basa principalmente su glucosio come fonte di combustibile. Il glucosio è catabolizzata dai mitocondri cerebrali tramite percorsi glicolisi, acido tri-carbossilico (TCA) ciclo e fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). Perdite di valore di produzione di ATP mitocondriale provoca disturbi mitocondriali, che presentano clinicamente con sintomi neurologici e miopatici prominenti. Difetti mitocondriali sono presenti in disturbi dello sviluppo neurologico (ad esempio disturbo dello spettro autistico) e disturbi neurodegenerativi anche (ad esempio, sclerosi laterale amiotrofica, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson). Quindi, vi è un crescente interesse nel campo per l'esecuzione di analisi 3D mitocondriale morfologia, struttura e distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malattia. La morfologia mitocondriale cervello è estremamente variegato, con alcuni mitocondri specialmente quelliregione sinaptica essendo nell'intervallo <200 nm di diametro, che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica tradizionale. Esprimendo una proteina mitocondrialmente mirati verde fluorescente (GFP) nel cervello migliora in modo significativo la rilevazione organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, non supera i vincoli sulla sensibilità di rilevazione dei mitocondri relativamente piccole dimensioni senza sovra- saturazione delle immagini di grandi dimensioni mitocondri. Mentre microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per caratterizzare i mitocondri alla sinapsi neuronali, questa tecnica è notevole spreco di tempo soprattutto quando si confrontano campioni multipli. La tecnica di blocco faccia microscopia elettronica a scansione seriale (SBFSEM) comporta un processo automatizzato di sezionamento, blocchi di imaging di acquisizione dei tessuti e dei dati. Qui, forniamo un protocollo per eseguire SBFSEM di una regione definita da roditore cervello per ricostruire rapidamente e visualizzare la morfologia mitocondriale. questa tecnologianique potrebbe anche essere utilizzato per fornire informazioni accurate sul numero mitocondriale, volume, dimensione e distribuzione in una regione del cervello definito. Dal momento che la risoluzione dell'immagine ottenuta è elevata (in genere sotto i 10 nm) possono essere rilevati anche gli eventuali difetti morfologici mitocondriali lordi.
Introduction
I mitocondri sono organelli dinamici che cambiano la loro forma e la posizione a seconda delle esigenze spunti e cellulari, in stretta interazione con citoscheletro cellulare, e in risposta ad eventi cellulari come correnti di calcio nei neuroni 1. I mitocondri interagiscono anche con altri organelli cellulari ad esempio reticolo endoplasmatico, che a sua volta regola la loro dinamica e metabolismo 2. Morfologia mitocondriale mostra eterogeneità in diversi tipi di cellule ad esempio. la forma del organello varia da tubolare costituita dai fogli, sacchi e ovali 3. E 'stato dimostrato che mitocondriali fusione e fissione proteine del ciclo possono regolare la posizione, dimensione, forma e distribuzione dei mitocondri 4. Inoltre, cambiamenti di forma mitocondriale sono associati a neurodegenerazione, plasticità neuronale, atrofia muscolare, la segnalazione di calcio, specie reattive dell'ossigeno generazione così come la durata della vita e la morte cellulare implicando thacellule T specifiche per la morfologia mitocondriale è fondamentale per il mantenimento della normale funzione cellulare 5-11.
Una delle principali funzioni bioenergetico dei mitocondri è generare adenosina trifosfato (ATP) eseguendo una serie di reazioni metaboliche che coinvolgono ripartizione completa dei nutrienti (cioè glucosio, acidi grassi o amminoacidi) tramite il ciclo TCA e OXPHOS percorsi 12. Il cervello umano costituisce solo il 2% del peso corporeo tuttavia consuma ~ 20% del totale dell'energia prodotta che lo rende estremamente energia esigente organo 13. È quindi sorprendente che la disfunzione mitocondriale nell'uomo conduce a un gran numero di manifestazioni neurologiche 14-17. Le mutazioni genetiche nei componenti OXPHOS che compromettono porta ATP generazione di disturbi mitocondriali 17,18, che sono gruppo clinicamente eterogeneo di disordini con una prevalenza di ~ 1: 5.000 individui, e una delle cause più comune di mdisturbi etabolic nei bambini e negli adulti. Deficit di ATP mitocondriale di derivazione colpisce di più sistemi di organo con gli organi che richiedono alta energia, come cervello, cuore e muscoli scheletrici essendo prevalentemente colpite in questi pazienti 14,17,18. Negli ultimi anni, diversi studi hanno fornito evidenza di disfunzione mitocondriale in entrambi i disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerative 15-17,19,20. Dal momento che i mitocondri sono essenziali e fondamentali per lo sviluppo e la funzione del cervello, è imperativo sviluppare protocolli in grado di analizzare i cambiamenti nel cervello mitocondriale morfologia, la struttura, le dimensioni, il numero e la distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malati. Modelli murini con mitocondri mirati proteina fluorescente verde (GFP) sono stati prodotti di visualizzare i movimenti mitocondriali e la localizzazione nel cervello 21,22. Anche se questo è uno strumento estremamente utile per esaminare la motilità mitocondriale e distribuzione generale, ci sono alcuni inconvenienti che INCLUDe risoluzione limitata e sensibilità della microscopia a fluorescenza. Questi attributi rendono difficile rintracciare le relativamente piccole dimensioni mitocondri. Allo stesso modo, microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per visualizzare mitocondri sinaptica 23, ma questo metodo è molto tempo. La morfologia mitocondriale è noto per essere altamente dinamico come subiscono cicli di fissione e fusione continui, e nella maggior parte delle cellule mitocondri mantenere una rete altamente connessa 24-26. I neuroni sono altamente cellule con più dendriti e assoni estese, e mitocondri che formano una rete reticolare collegato nel corpo cellulare polarizzato può avere per separare come si fanno strada attraverso questi neuriti (Figura 1). Questo rende i mitocondri cerebrali estremamente vari per forma e dimensioni. Ad esempio, utilizzando la microscopia elettronica a scansione blocco faccia seriale (SBFSEM) tecnica, abbiamo precedentemente osservato che la differenza di volume o dimensioni mitochondr extrasinapticaia ai mitocondri presenti nei terminali nervosi può essere fino a sedici piega 27.
Ci sono diversi approcci per l'esecuzione di analisi del volume 28, che comprende una sezione di serie TEM 29, nastro automatizzata raccolta ultramicrotomo SEM 30, concentrati Ion Beam SEM 31, e SBFSEM 32. L'analisi SBFSEM presenta vantaggi in quanto ha la risoluzione di fornire dati quantitativi sulla morfologica forma, dimensioni, distribuzione e numero di organelli come mitocondri nelle zone fino a 1 mm dal cervello. L'operazione tecnica è anche il meno impegnativo, con l'acquisizione dei dati e l'analisi alla portata di molti laboratori biologici che non hanno precedenti esperienze EM. L'avvento degli strumenti commerciali per la generazione di immagini di sezione simile seriali ha reso 3D analisi ultrastrutturale dei tessuti una tecnica di routine, che consente inoltre un'analisi volumetrica imparziale in modo rapido e ripetibile 28 32, basato su un'idea introdotta da Leighton nel 1981 33. Diversi studi da allora hanno stabilito questa tecnica come strumento di analisi ricostruzione dei circuiti neuronali 34. Inoltre, per molti progetti di dimensioni ridotte, che fornisce analisi di ricostruzione per identificare organelli cellulari 27,35-39. Poiché, le immagini acquisite vengono derivati da bassa tensione elettroni retrodiffusione, nuovi protocolli di colorazione che combinano diverse tecniche note colorazione metalli pesanti sono stati sviluppati per aumentare la risoluzione 40.
In questo lavoro, mettiamo a disposizione un protocollo per l'utilizzo di immagini di microscopia elettronica 3D e l'analisi volumetrica dei mitocondri cerebrali in base a metodi che sono stati usati in precedenza da noi e altri 38,39,41. I metodi di tessuti post-processing utilizzati erano come precedentemente descritto da Deerinck et al40.
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Protocol
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) al Virginia Tech.
Attenzione: le precauzioni estreme devono essere prese nel maneggiare e smaltire diversi componenti utilizzati in questo protocollo. Prima dell'uso, la linee guida istituzionali e le pratiche di salute e sicurezza locale devono essere stabilite e seguite, in particolare per tetrossido di osmio, che è volatile ed estremamente velenoso, acetato di uranile, che è sia un metallo pesante e la fonte di radioattività, e nitrato di piombo, che è un veleno di metalli pesanti. Thiocarbohydrazide (TCH) può scomporre per la produzione di gas esplosivi e velenosi, se non correttamente gestito. Molte istituzioni avranno una funzione di base EM in cui questi reagenti sono regolarmente utilizzate e in grado di fornire assistenza.
1. Preparazione del tessuto cerebrale e SBFSEM Imaging
- Anestetizzare un giovane (~ 2 - 4 mesi di età) C57 topo nero (C57BL / 6J ceppo) con 4-5% isoflurane seguendo le linee guida istituzionali. Confermare anestesia monitorando la perdita di tono muscolare, la mancanza di movimenti volontari e le risposte agli stimoli avversi come un pizzico di coda.
- Pin il mouse su un vassoio dissezione e fare un'incisione sulla pelle lungo la linea mediana ventrale. Fare ulteriori incisioni nella pelle per esporre la gabbia toracica del mouse. Incidere la membrana, e con attenzione sezionare cavità toracica lungo la periferia per esporre il cuore pulsante e quindi fare un'incisione sul atrio destro.
- Utilizzando una cannula farfalla, cannulate il ventricolo sinistro. Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,2, fino dissanguamento è confermato da un cambiamento di colore del fegato.
Nota: Una modifica del colore del fegato è utilizzato come guida per determinare il grado di dissanguamento. Verificare che i cambiamenti di colore del fegato dal bruno rossastro al rosa pallido. - Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di 2% glutaraldeidi e il 4% paraformaldeide fatto in 0,10 M tampone cacodilato (pH 7,2), per risolvere rapidamente il tessuto cerebrale dall'interno. Fixation viene monitorato osservando l'irrigidimento coda.
Nota: Preparare 0.10 M cacodilato tampone (pH 7,2) sciogliendo 2,14 g di cacodilato di sodio in 80 ml di acqua, aggiungere acido cloridrico per regolare il pH, e rendere il volume a 100 ml con acqua. - Dopo perfusione, decapitare il mouse, sezionare il cervello, seguito da fissaggio in 0,10 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2) contenente 2% di glutaraldeide e 4% paraformaldeide per 48 ore a 4 ° C.
- Dopo 48 hr rendere 400 micron sezioni coronali utilizzando un vibratome e poi sezionare accuratamente la regione di interesse nel cervello (per esempio, l'ippocampo) al microscopio di dissezione 42. Rifilare con cura il tessuto e scattare una foto per preservare l'orientamento.
Nota: post metodi di lavorazione di colorazione dei tessuti in SBFSEM combina una varietà di metodi di colorazione di metalli pesanti inPer migliorare la risoluzione e sono basati sul metodo sviluppato in precedenza dal Deerinck et al 40. - Lavare i tessuti glutaraldeide-fisso per 3 volte, 5 minuti ciascuno in 0.1 M tampone cacodilato (pH 7,2).
- Preparare la soluzione di acido tannico 0,1% sciogliendo acido tannico in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2). Agitare fino a scioglimento e filtrare 0,45 micron filtro se necessario.
- Postfix i tessuti con cacodilato tamponata 0,1% di acido tannico incubando in 1 ml di reagente per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
Nota: Il tempo di incubazione dipende dalla dimensione dei tessuti, ma 30 minuti funziona meglio per la maggior parte dei tessuti. - Lavare i tessuti 3 volte, 5 minuti ciascuno a tampone cacodilato (pH 7,2).
- Sciogliere 0,3 g ferrocianuro di potassio e 0,86 g di sodio cacodilato in 10 ml di acqua distillata H 2 O (DH 2 O). Conservare la soluzione ferrocianuro di potassio sul ghiaccio. Appena prima dell'uso, aggiungere 10 ml di 4% tetrossido di osmio (OSO 4).
- Macchiare i tessuti con il 2% ossoluzione MIUM-ferrocianuro per 90 min, sul ghiaccio. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O.
- Preparare la soluzione (TCH) 1% thiocarbohydrazide sciogliendo 0,1 g TCH in 10 ml dH 2 O. Sciogliere a 60 ° C agitando ogni 10 minuti fino a completo scioglimento. Osservare le precauzioni di sicurezza durante la manipolazione TCH, in particolare fare attenzione ad evitare l'uso di metalli, riscaldamento ad alta temperatura, o una soluzione che permette di asciugare.
- Trattare i campioni con preparati al 1% TCH per 20 minuti a RT. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O.
- Diluire 4% OsO 4-2% con dH 2 O, tessuti macchia con 2% acquosa tetrossido di osmio incubando per 1 ora. Lavare i tessuti per 3 volte, 5 minuti ciascuno con dH 2 O.
- Incubare i campioni O / N in 1% acetato di uranile in DH 2 O a 4 ° C.
- Preparare la soluzione aspartato vantaggio di Walton (come descritto da Deerinck et al 40).
- Sciogliere 0,998 g L-aspartato in 250 ml di dH 2 Oe quindi aggiungere 10 N di idrossido di potassio (KOH) in modo goccia a goccia fino a pH 5,5. Dopo la regolazione del pH, aggiungere 0,066 g di nitrato di piombo in 10 ml di acido aspartico magazzino e si riscalda a 60 ° C per 30 min.
- Lavare i tessuti in DH 2 O e incubare con macchia aspartato vantaggio di Walton per 30 minuti in un forno a 60 ° C. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O.
- Disidratare campioni attraverso una serie graduata di alcol utilizzando soluzioni refrigerate di 20%, 50%, 75%, 85% e 95% di etanolo per 5 minuti ciascuno, seguito da 100% di etanolo per 3 volte, 10 minuti ciascuno.
Nota: utilizzare 100% di etanolo dalla bottiglia appena aperta, come l'etanolo aperto assorbe l'acqua dall'aria e causare l'incorporamento di fallire. incubazioni più lunghe saranno necessari con campioni di tessuto di grandi dimensioni. - Lavare i campioni 2 volte, 15 min ciascuno in ossido di propilene.
- Fai la resina plastica embedding utilizzando 25 ml di resina, 10,5 ml DDSA (Dodecenyl succinica), 15,5 ml NMA (Nadic metile anidride) e 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilamminometil fenolo). Mescolare la resina agitando. Spin e consentire alla resina di riposare fino a quando bolle determinazione.
Nota: Questa è la ricetta durezza media standard. Altri tipi di microscopia elettronica (EM) resina plastica possono essere utilizzati, ma devono essere testati con un campione di controllo non essenziale in anticipo come non tutte le resine lavorano per SBFSEM. - Incubare i tessuti O / N a 50: 50 mix di incorporamento resina e propilene ossido, in una fiala che è ricoperto inizialmente, poi livellata dopo 2 ore in modo che l'ossido di propilene evapora nel periodo di circa 8 - 10 ore.
- Trasferire i tessuti al 100% di resina embedding fresco in fiale pulite per 2 ore.
- campioni Incorpora in resina embedding fresca, in stampi piatti contenenti stampate etichette di carta, e li cura in forno a 60 ° C per 48 ore. Dopo circa 1 ora, controllare il posizionamento dei tessuti e l'allineamento di nuovo, e regolare se necessario.
- Tagliare i campioni per l'area di interesse e montare su un perno in alluminio utilizzando Gelling cianoacrilato colla o una resina epossidica conduttiva, poi cappotto con argento colloidale pasta intorno ai lati del blocco per fornire un percorso conduttivo al perno di alluminio.
- Esaminate campioni di tessuto utilizzando un sistema microscopio elettronico dotato di uno stadio ultramicrotomo in-camera e basso kV rivelatore retrodiffusi elettroni 32.
Nota: Ottenere strumento- e il sito-formazione in microscopia elettronica a scansione (SEM) utilizzare e diventare un utente autorizzato. In alternativa, la collaborazione con una struttura di ricercatore o di base per piccoli progetti può essere possibile. formazione radiazioni può anche essere richiesto come SEM generano raggi x. - Per l'immagine dei campioni, utilizzare le seguenti impostazioni: 2,25 kV, a 5 - 10 nm / pixel di risoluzione, con dimensioni del campo tra 80-250 micron in x, y (dimensioni possibile altro campo), e lo spessore fetta di 50 - 100 nm, con un totale di 250 - 600 fette in un 16 - periodo 20 hr.
Nota: Le impostazioni variano notevolmente tra i diversi microscopi, indicampioni individuali, e risoluzione desiderata. Queste impostazioni dovrebbero produrre immagini che sono prontamente interpretabili per molti campioni.
2. Analizzando il set di dati di imaging
Nota: l'immagine del software J / Fiji viene utilizzato per analizzare l'insieme di dati e si basa su il plugin TrakEM2. passi di preelaborazione possono essere eseguiti utilizzando una varietà di software, e può essere estesa o minore a seconda del livello di esperienza e le pile ottenuti. I principali trasformazioni che utilizzano il software open-source (ImageJ ver 1.50b, FIJI scaricare 1 ottobre 2015) sono descritte qui.
- Convertire le immagini in formato TIFF a 8 bit dalle immagini a 16 bit proprietarie originali aprendo nel software e selezionare le voci di menu Immagine → Tipo → 8 bit.
- Se la conversione automatica di contrasto / luminosità in questa fase non è l'ideale per le immagini, può riaprire il immagini a 16 bit, e premere il tasto Immagine → Regola → Luminosità / Contrasto. Selezionare un intervallo che funziona per tutte le immagini, e premere Apply. Quindi eseguire cLA CONVERSIONE. Nota: Su alcuni SEM, questo passaggio potrebbe richiedere software produttore microscopio.
- Se necessario, a causa di movimenti immagine inaccettabile tra fette (ad es. Alla deriva a causa di carica), registrazione / allineare le pile di immagini (voci di menu Plugin → Registrazione → lineare StackAlignmentWithSIFT). Nella maggior parte dei software di registrazione, impostare per la modalità "traduzione-only", piuttosto che "corpo rigido".
Nota: Molti approcci e software possono lavorare: la registrazione SIFT plug-in di lavori per molte applicazioni e non vi è una versione stack virtuale.- Se necessario, allargare le dimensioni della tela prima della registrazione (Immagine → Regola → dimensionesfondo) o ridurlo ad una zona di interesse (Immagine → Ritaglia).
Nota: possono verificarsi un trascinamento o divaricazione, e cercando altri plugin o software può produrre risultati migliori. Opzioni manuali sono disponibili anche (ad es. ImageJ / FIJI, Plugin → Registrazione → ManualLandmarkSelection).
- Se necessario, allargare le dimensioni della tela prima della registrazione (Immagine → Regola → dimensionesfondo) o ridurlo ad una zona di interesse (Immagine → Ritaglia).
- Se desirEd, immagini in scala ai più piccoli, dimensione più gestibile (ad es. 25%) utilizzando ImageJ (Immagine → Scala).
- Avviare il software, selezionare File → Importa → sequenza di immagini e quindi selezionare i file TIFF.
- Lanciare il plugin selezionando File → Nuovo → TrakEM2 (vuoto). Due finestre si apriranno; uno gestisce il progetto e area_lists e l'altro gestisce tracciato, e si riferisce a come la 'tela'.
- Caricare la risma immagine nel plug-in facendo un clic destro sul importazione tela. Selezionare l'importazione e fare clic sulla pila di importazione. Nelle opzioni pop-up, selezionare la casella per gli stack virtuali.
Nota: Anche se le pile di immagini sono già aperti nel software, devono essere aperti anche nel plugin. Il computer può eseguire più agevolmente se la casella di stack virtuale sia selezionata. - Dopo le mipmap vengono creati e lo stack è stato caricato, fare clic destro per denominare il progetto sotto la finestra del plugin. Fare clic destro su 'nuovo progetto' nel modello column, e selezionare 'aggiungi nuovo bambino' per quel progetto. clicca di nuovo a destra per selezionare 'area_list'.
- Impostare la scala asse Z del progetto d'accordo con le impostazioni originali microscopio elettronico facendo clic destro su tela, quindi fare clic su Visualizza e selezionare la calibrazione. Inoltre, impostare la Z-scala selezionando tutti i livelli nella finestra del plugin, fare clic destro per selezionare scala Z e spessore.
- Fare clic e trascinare il 'progetto' e tutti i "bambini" nel progetto oggetti sezione per creare le "liste di zona 'nella scheda' spazio Z 'nell'area di disegno.
- Selezionare la 'lista zona' e fare clic destro per selezionare e impostare un colore. Ora, utilizzare lo strumento pennello per tracciare oggetti come i mitocondri, nelle immagini al microscopio elettronico. Usare 'Shift + click' di compilare un cerchio chiuso, 'Ctrl + scorrimento' di zoom avanti e indietro, e 'Alt + click' per trasformare il cursore pennello in una gomma da cancellare.
- Selezionare due aree di ~ 10 - 15 micronda 10-15 micron in alto a sinistra e in basso a destra dell'immagine e identificare tutti i mitocondri all'interno di queste aree per consentire il campionamento imparziale dei mitocondri in ogni set di dati.
- Sul 'tele', osservare e tracciare i mitocondri in tutte le sezioni. Nota: I mitocondri sono piuttosto buio / densi organelli che appaiono, di dimensioni simili di diametro e vagamente cilindrica. Il creste unica formata dalla membrana interna sono facilmente distinguibili all'interno di questo organello.
- Una volta terminato con l'analisi, fare clic destro sul area_list nella scheda spazio Z, selezionare 'Mostra in 3D'. Questo lancerà il plugin visualizzatore 3D per visualizzare una ricostruzione 3D dell'immagine tracciata.
- Per eseguire misurazioni del volume mitocondriale, selezionare oggetto in visualizzatore 3D, fare clic sulla scheda 'Modifica' e selezionare 'Proprietà oggetto'. La stima del volume mitocondriale è elencata insieme a diverse altre misure.
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Representative Results
Abbiamo dimostrato che il cervello morfologia e le dimensioni dei mitocondri è eterogeneo in diversi sotto-comparti neuronali. Microscopia confocale a bassa densità colture neuronali trasdotte con lentivirus che esprimono la proteina fluorescente verde mitocondri mirati ha dimostrato che i mitocondri che risiedono nel soma neuronale formano una rete reticolare, mentre quelli che risiedono in neuriti distali esibiscono una discreta morfologia allungata (Figura 1 AB). Utilizzando la tecnica SBFSEM, la morfologia mitocondriale, dimensione, volume e distribuzione sono stati analizzati nel cervello di topo. Tre (3D) immagini tridimensionali dei mitocondri sono stati ricostruiti da entrambi i neuriti e sinapsi nell'ippocampo cervello di topo. I mitocondri presinaptiche sono stati identificati e il numero di boutons presinaptico ospitano mitocondri residenti quantificati. Eterogeneità delle dimensioni dei mitocondri è stato osservato nel dendritiche rispetto compartimenti assonali (Figura 1 CD). Inoltre, molti piccoli scomparti presinaptici nell'ippocampo del cervello di topo erano privi di mitocondri (Figura 2 AC). Le misurazioni volumetriche di entrambi i mitocondri presinaptici e extrasinaptica rivelato che il volume o le dimensioni dei mitocondri che risiedono entro i presynapses neuronali era significativamente più piccoli di quelli che risiedono nella regione extrasinaptica (Figura 2 DF). È interessante notare, bidimensionale (2D) distribuzione delle dimensioni dei mitocondri misurati da un campionamento imparziale di 200 mitocondri non somatiche mostrato che ~ 11% di frazione mitocondriale trova sotto il limite di risoluzione della microscopia ottica (figura 2G). Inoltre, le immagini 2D acquisite mediante analisi SBFSEM forniscono maggiore risoluzione per visualizzare le caratteristiche ultrastrutturali dei mitocondri individuale (Figura 3 AB). A causa della topografia chiaramente visibile del tessuto, è inoltre possibile classificare comp cellulareartment dei mitocondri determinando la sua vicinanza al prontamente strutture identificabili come nucleo (somatica) e vescicole sinaptiche (presinaptica) (Figura 3 AB). Per identificare mitocondri presenti nei processi neuronali, ricostruire il processo individuale come assone o dendrite in base alla presenza o assenza di boutons presinaptico rispettivamente 42. Sulla base di questi risultati, proponiamo che SBFSEM è una tecnica analitica estremamente prezioso per identificare la forma dei mitocondri, le dimensioni, il numero e la distribuzione nel tessuto cerebrale e che eventuali difetti grossolani nella struttura e nella distribuzione dei mitocondri possono anche essere determinati con questo metodo. Poiché le caratteristiche ultrastrutturali dei diversi tipi di cellule del cervello sono distinti, per es. presenza di granuli di glicogeno in astrociti, è anche possibile analizzare le differenze specifiche di tipo a cella di mitocondri cerebrali.
Figura 1:. L'eterogeneità in neuronale mitocondriale morfologia e distribuzione culture corticali da postnatali giorno 1 cuccioli di topo sono state trasdotte con lentivirus che esprimono mitocondri mirati proteina fluorescente verde (GFP-mito). (A) mostra soma neuronale che esprimono GFP-mito, si noti la rete reticolato della morfologia mitocondriale; Nu = nucleo; barra della scala = 5 micron. (B) mostra allungata morfologia mitocondriale in neuriti distali; barra della scala = 5 micron. Immagine rappresentativa 2D dal set di dati SBFSEM generato dal tessuto cerebrale del mouse (C), i mitocondri sono macchiati di verde, dendriti sono macchiati in varicosità blu e assonale sono macchiati in marrone; barra della scala = 1 micron. (D) ricostruzioni 3D di mitocondri nelle neuriti di tessuto cervello di topo, notare la differenza di dimensioni tra dendritica e assonale indicat mitocondricati da grandi e piccoli Arrowhead, rispettivamente; scala bar = 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Serial Block-faccia microscopia elettronica a scansione (SBFSEM) analisi ha rivelato scarsa abbondanza dei mitocondri ai terminali presinaptici (A) Rappresentante 2D ultramicrograph dall'analisi di dati SBFSEM ottenuto dalla ippocampi di topi wild-type P15;. barra della scala = 1 micron. (B) Visualizza la ricostruzione 3D di 10 terminali nervosi presinaptici. Si noti che solo il 4 su 10 terminali presinaptici mostrato mitocondri distinguibile; barra della scala = 1 micron. (C) grafico a barre che mostra la quantificazione di 173 ricostruito terminazioni nervose presinaptiche dalla SBFSEM analisi di dati. (D) immagine Rappresentante 2D da SBFSEM set di dati che mostra i mitocondri extrasinaptica nei mitocondri blu e presinaptico in verde; barra della scala = 1 micron. (E) ricostruzioni 3D dei mitocondri presinaptica e extrasinaptica dal set di dati SBFSEM utilizzando il software; barra della scala = 1 micron. Grafico (F) Bar che mostra il volume dei mitocondri extrasinaptica e presinaptico. I dati sono riportati come media ± SEM; n = 3 diversi set di dati (include 62 mitocondri presinaptiche e 80 mitocondri extrasinaptica in totale); * Raffigura valore p = 0,0405. (G) Area 15 da 15 micron di tutti e quattro gli angoli della immagini sono stati caratterizzati e tutti i mitocondri non somatici sono stati identificati per consentire il campionamento casuale. Il minimo dimensione ~ 200 mitocondri è stata misurata. grafico a torta mostra che ~ 11% dei mitocondri non somatiche erano <200 nm in dimensione che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica. Questa figura ha been adattato da Chavan et al 27. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: 2D SBFSEM Immagini dal genicolato laterale Nuclei di cervello di topo (A) Due immagine SBFSEM rappresentante dimensionale dalle corpo genicolato laterale (8/8 micron) che dimostrano una topografia dettagliata della regione.. Soma e il nucleo sono indicati; barra della scala = 2 micron. (B) Un ingrandimento della zona indicata dalla piazza rossa di pannello A. Si noti che le membrane esterne ed interne dei mitocondri e creste formazione sono chiaramente visibili. si osserva anche la topografia e le relazioni con altri organelli e struttura cellulare. PS indica esempio di mitocondri presinapticoe NS indica esempio di non-sinaptica (NS) mitocondri somatica; scala bar = 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La complessità del sistema nervoso rappresenta una sfida significativa per ricostruire grandi volumi di tessuto e l'analisi della morfologia e distribuzione di organelli come mitocondri con adeguata risoluzione. Più celle tra neuroni, oligodendrociti e astrociti con numerosi processi estesi in tre dimensioni interagiscono all'interno del tessuto cerebrale 43. Poiché i mitocondri risiede sia nel soma di cellule e processi lontane, morfologia mitocondriale è estremamente pleomorfica nel sistema nervoso (Figura 1). Un'adeguata informazione strutturale 3D con una risoluzione sufficiente, pertanto, non può essere acquisita da convenzionali tecniche di microscopia ottica, come confocale o microscopia a due fotoni 44,45. La microscopia elettronica è la tecnica attualmente disponibile che permette la ricostruzione di grandi volumi di tessuto neurale con sufficientemente alta risoluzione. Tradizionalmente, la ricostruzione 3D del tessuto neurale è stato realizzared al microscopio di serie di trasmissione sezione di elettroni (sstem) delle sezioni ultrasottili 29. Tuttavia, recenti progressi tecnologici hanno migliorato la qualità di acquisizione dati microscopia elettronica volume e automazione.
SBFSEM è una tecnica di imaging blocco faccia automatizzato che combina sezionamento seriale all'interno della camera di un microscopio elettronico a scansione, in modo da ricostruire la struttura del tessuto 3D centinaia di micrometri, con una risoluzione che è sufficiente seguire le più sottili processi cellulari e identificare piccoli organelli . Questa tecnica ha aperto la prospettiva di routine ricostruire sistemi sia invertebrati e vertebrati nervoso. Si tratta di più passaggi, tra cui la preparazione del campione, operazione di scansione microscopio elettronico, l'acquisizione dei dati, immagini post-elaborazione, e l'analisi delle immagini. Queste procedure richiedono hands-on di formazione e certificazione per operazioni di scansione microscopio elettronico specializzati. Tre fattori sono criticoal cioè. sezionare la regione anatomica corretta del cervello, ottenendo immagini ad alta risoluzione, e l'esecuzione di una corretta analisi delle immagini. Dopo la dissezione della regione anatomica di interesse da parte della fetta vibratome del tessuto cerebrale fisso, è fondamentale per scattare la foto per preservare il corretto orientamento. Può tuttavia essere difficile accertare il sito corretto per l'imaging. Ottenere immagini ad alta risoluzione dipende da un adeguato fissaggio e procedure di colorazione post-fissaggio corretto. Il cervello tende a subire un rapido deterioramento nella sua ultrastruttura dopo la morte. Pertanto, è fondamentale per risolvere il cervello in una soluzione di glutaraldeide utilizzando il corretto metodo di perfusione transcardial. Questo dovrebbe essere seguito da un ulteriore fissaggio del cervello in soluzione di glutaraldeide per almeno 24 ore. Poiché la risoluzione dell'immagine è completamente dipendente dalla combinazione di una varietà di metodi di colorazione di metalli pesanti, è fondamentale per seguire il metodo post-fissaggio come descritto nel protocollo per acquisire quantifiable immagini. Le soluzioni devono essere effettuati come descritto nei metodi. Infine, per l'analisi delle immagini accurata la organello / s da analizzare dovrebbe essere identificato in modo inequivocabile (ad es. Per visualizzare le caratteristiche ultrastrutturali) prima rintracciamento, e le linee guida del software deve essere rigorosamente rispettato. La risoluzione delle immagini acquisite dovrebbe essere noto per la conversione da pixel a nanometri per misurazioni volumetriche.
Oltre al software descritto nel protocollo per l'esecuzione di analisi delle immagini, può essere utilizzato anche di altri software disponibili come ricostruire e Cnosso. Sebbene l'enfasi del protocollo descritto è sulla visualizzazione mitocondri nel sistema nervoso, può essere modificato per generare alta risoluzione 3D informazioni su varie altre strutture subcellulari (es. Reticolo endoplasmatico, lisosomi, ecc.) In una varietà di tessuti.
Mentre una guida alla risoluzione dettagliata per la scansione microscopio elettronico operation è oltre la portata di questo articolo (vedi manuali d'uso dello strumento e informazioni di formazione), alcuni problemi si verificano normalmente durante gli esperimenti di imaging e di capire come risolvere i loro possono aiutare i nuovi utenti o quelli di ottenere immagini attraverso fonti commerciali di collaborazione /. Un problema comune è in carica del campione che si verifica principalmente nelle regioni in resina che contengono poco o nessun materiale macchiato. In un "positivo" l'immagine (cioè. Citosol visualizzato in bianco), possono apparire i nuclei, vasi sanguigni, e distese resina vuote "annerito". Inoltre, la carica promuove anche la deriva del fascio locale con conseguente apparente deformazione dell'immagine. Possibili soluzioni variano tra gli strumenti e campioni. Ridurre le impostazioni kV riduce l'artefatto "annerimento", ma può promuovere una maggiore deriva fascio. Utilizzando una modalità di vuoto inferiore, compreso l'azoto (N 2) gas, vapor d'acqua, ecc. nella camera riduce anche ricarica, ma ad un costo sostanziale di risoluzione e signal-a-rumore. Un secondo problema comune è il coltello salto. Scansione più bassa può causare fascio danno indotto alla superficie del blocco, che taglia in modo non uniforme o non del tutto per un po 'di immagini / cicli di taglio (es. Immagini successive appare lo stesso). Diverse soluzioni esistono tra cui l'aumento della / spessore della fetta profondità di taglio con ridotta z-risoluzione, aumentando la velocità di scansione e accettando di conseguenza le immagini più rumorose, riducendo le dimensioni dei pixel e accettando inferiore x / y-risoluzione, e la scelta di campioni o aree con più intensa colorazione (come mal aree -stained pagare di più, i danni più facilmente, e richiedono l'esposizione del fascio più tempo per ottenere immagini con accettabile segnale silenziata LS rapporti). Detriti rideposizione sul blocco-faccia è una fonte occasionale di artefatti nelle immagini, e se questo si verifica spesso può richiedere una pausa l'acquisizione, e con attenzione la pulizia (soffiaggio) coltello, o retrimming il campione a una dimensione inferiore. Block-faccia ricarica promuove anche rideposizione, e passi sopra maggioAiuto. Correzione di messa a fuoco e stigmation può anche essere richiesto come le immagini al microscopio campioni in modo continuo per molte ore per settimane, durante il quale i vuoto profondità aumenta nella camera, richiedono stigmation correzioni. Ogni microscopio elettronico a scansione differisce a seconda dell'età e delle caratteristiche, e l'esperienza è la migliore guida. Improvvisi cambiamenti drammatici nel stigmation o messa a fuoco possono verificarsi quando il materiale sezionato aderisce ai componenti di imaging microscopio. La camera deve essere aperto e materiale accuratamente staccato mediante vuoto o azoto compresso. Ciò richiede assolutamente una formazione specializzata.
Ci sono alcuni svantaggi della tecnologia SBFSEM per quanto riguarda la sua utilità nell'analisi mitocondri cerebrali. Uno svantaggio importante, comune a tutti microscopia tessuti fissati, è che fornisce immagini statiche di un organello estremamente dinamico. I mitocondri sono sottoposti a fissione e fusione continui cicli di 26, sono mobili e trafficate lungo il nEurite processi 21. Difetti di traffico mitocondriale e dinamiche che non sono puramente numerica o strutturale può essere facilmente perdere da questo approccio, anche se, guardando il numero di mitocondri in uno spazio anatomicamente definiti quali presynapse si può interpretare se il trasporto dei mitocondri può essere modificata 39 . Un secondo svantaggio è che è eseguita solo in una piccola parte del cervello, quindi circuitale specifici difetti nella distribuzione mitocondriale può perdere. Correlativo avvicina 28,46 permettersi l'opportunità di combinare la confocale e multiphoton con la tecnologia SBFSEM per generare sia i dati molecolari e ultrastrutturali. Per l'analisi mitocondriale, quindi, può essere utile per eseguire l'SBFSEM dopo esame microscopico luce delle sezioni cerebrali sia utilizzando l'anticorpo specifico dell'antigene mitocondriale o utilizzando un transgene che esprime mitocondrialmente mirati proteina fluorescente. Questo combinatiostrategia finale può fornire una solida metodologia per identificare i difetti mitocondriali in modelli murini di patologie neurologiche e mitocondriali.
Ci sono anche limitazioni tecniche comuni a molte forme di microscopia elettronica a causa di uso di fissativi dure, colorazione di metalli pesanti e la penetrazione irregolare di prodotti chimici. Altre limitazioni possono derivare da l'incorporamento di plastica di campioni di tessuto. Regioni vuote di resina e strutture scarsamente colorate mantengono gli elettroni durante l'imaging, causando deflessione del fascio e la deriva (immagine orditura), così come i segnali di carica artefatti (ad es. Nuclei scuri e dei vasi sanguigni lumen), che sia incidono sulla risoluzione. danni fascio alla resina promuove anche taglio irregolare, e per questo motivo, l'imaging richiede tipicamente fette di 50 - 100 nm da tagliare dal blocco faccia, producendo voxel non isotrophic negli insiemi di dati. Altre limitazioni per alcune applicazioni comprendono che le sezioni vengono distrutti e non possono essere riesaminati successivamente,che può obbligare gli utenti a raccogliere immagini ad alta risoluzione delle aree che potrebbero non contenere dati utili.
Un vantaggio importante di SBFSEM è che automatizza il processo di sezionamento e di imaging blocchi di tessuto incorporando un microtomo personalizzato in un basso vuoto camera SEM 32,33. Poiché le immagini sono ottenute direttamente dal blocco faccia prima di ogni taglio, i problemi della sezione rughe, la compressione e la perdita durante la manipolazione vengono sostanzialmente evitati, anche se deposizione detriti e deformazioni carica a causa di bloccare faccia non contribuiscono a qualche perdita di immagine e la distorsione . Inoltre, le immagini ottenute in set di dati grezzi sono già allineati e richiedono solo registrazione micrometrica scala per accogliere drift fascio in modo da essere suscettibili di più analisi. A causa del processo di sezionamento automatico, una volta che il vuoto del sistema si è stabilizzato, grandi volumi di tessuto possono essere esposte senza significative intervento dell'operatore. Ci sono molteplici vantaggi di utilizzare questoLa tecnologia nello svolgimento di studi morfologici e quantitativi su organelli e strutture intracellulari. Un vantaggio sta ottenendo le informazioni sulla struttura 3D dei mitocondri entro un ragionevole lasso di tempo. La disponibilità di open source software di ricostruzione come Ricostruire 47, TrakEM 48 e Knossos 49-51 hanno reso questa tecnologia un potente strumento di analisi in cui dettagliata ultrastruttura 3D della rete neuronale da modelli animali sperimentali possono essere confrontati direttamente. L'analisi delle immagini semiautomatico e completamente automatizzato si avvicina 52 sono in grado di produrre dati altamente meccanicistici in animali in cui si prevede la morfologia mitocondriale, la funzione e / o biogenesi di essere colpiti. In precedenza l'analisi SBFSEM è stato notevolmente ostacolato a causa di risoluzione più bassa, tuttavia più recenti tecniche di preparazione dei campioni che coinvolgono metodi di colorazione avanzate 40 hanno migliorato notevolmente la risoluzione in una misura che anche una sola v sinapticaesicle può essere facilmente risolto. A questa risoluzione difetti ultrastrutturali mitocondri come vacuolizzazione, rottura della membrana, e la perdita di creste possono essere facilmente osservati, e la distribuzione dei mitocondri difettosi all'interno delle cellule possono essere determinati 38,39. L'alta risoluzione di questa tecnica fornisce un grande vantaggio rispetto microscopio ottico in cui la risoluzione è limitata a ~ 200 nm in assi XY e ~ 500 nm in Z-asse. I mitocondri sono quindi proprio al limite di risoluzione della microscopia ottica 53. Sebbene mitocondri aventi dimensioni inferiori al limite di risoluzione possono ancora essere visualizzati mediante microscopia ottica, le loro dimensioni non possono essere misurati attendibilmente. Importante, mitocondri che sono separate da una distanza inferiore al limite di risoluzione di un microscopio ottico non possono essere risolti mediante microscopia ottica. Un altro vantaggio è che l'analisi strutturale mitocondriale può essere eseguita nel contesto del tessuto, senza isolamento del organello. Questo può albassa per i confronti appropriate all'interno del tessuto basate sulla localizzazione mitocondriale, per esempio assonale vs somatica e / o mitocondri dendritiche. Un ulteriore vantaggio è che è generalmente possibile determinare se i mitocondri sono neuronale o neurogliali nella localizzazione seguendo i processi ad un organello definire, come filamenti gliali e glicogeno per astrociti o mielina per oligodendrociti. I processi di neuroni e cellule neurogliali sono spesso in stretta prossimità e 2D quali, ad esempio TEM può essere difficile assegnare con sicurezza che i processi sono neuronale e che sono neurogliali.
In conclusione, la tecnologia SBFSEM fornisce pile di immagini seriali coprono aree di tessuto 20 - 1,000 micron dimensioni con risoluzione ultrastrutturale 5 - 10 nm o superiore, che permette intere cellule del sistema nervoso centrale e organelli come mitocondri da acquisire, misurato e ricostruito . In questo lavoro, abbiamo pro'apposita alcuni approcci pratici per fare uso di questa tecnologia. Le applicazioni future includono l'analisi della struttura dei mitocondri e la distribuzione in una varietà di modelli animali di malattie neurologiche come modelli di malattia dello sviluppo neurologico e neurodegenerative, nonché analizzando i vari ultrastrutture subcellulari, come reticolo endoplasmatico, nucleo e / o lisosomi in cellule intere o tessuti sotto sano e stati di malattia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
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