Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

العقل البشري هو المستهلكة للطاقة الجهاز العالية التي تعتمد أساسا على الجلوكوز كمصدر للوقود. وcatabolized الجلوكوز من الميتوكوندريا الدماغ عن طريق تحلل، مسارات حمض ثلاثي الكربوكسيلية (TCA) دورة والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) لإنتاج الطاقة الخلوية في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). انخفاض قيمة إنتاج ATP الميتوكوندريا يسبب اضطرابات الميتوكوندريا، التي تمثل سريريا مع أعراض عصبية والعضلية بارزة. عيوب الميتوكوندريا موجودة أيضا في الاضطرابات العصبية النمائية (مثل اضطراب طيف التوحد) والاضطرابات العصبية (مثل التصلب العضلي الجانبي والزهايمر وأمراض باركنسون). وبالتالي، هناك اهتمام متزايد في الميدان لإجراء تحليل 3D من التشكل الميتوكوندريا والهيكل والتوزيع في إطار كل من الدول صحية والمرض. مورفولوجية الميتوكوندريا الدماغ متنوع للغاية، مع بعض الميتوكوندريا وبخاصة فيالمنطقة متشابك يجري في نطاق <200 نانومتر قطر، وهو أقل من الحد قرار من المجهر الضوئي التقليدي. معربا عن بروتين المستهدفة mitochondrially أخضر فلوري (GFP) في الدماغ يعزز إلى حد كبير في الكشف عن organellar بواسطة المجهر متحد البؤر. ومع ذلك، فإنه لا التغلب على القيود المفروضة على حساسية الكشف عن الميتوكوندريا صغيرة نسبيا الحجم دون oversaturating الصور الميتوكوندريا كبيرة الحجم. في حين التسلسلي المجهر الإلكتروني النافذ وقد استخدم بنجاح لتوصيف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المشبك، وهذا الأسلوب هو خصوصا عند مقارنة عينات متعددة تستغرق وقتا طويلا للغاية. وتنطوي هذه التقنية التسلسلي كتلة وجه مسح الإلكترون المجهري (SBFSEM) عملية مؤتمتة من باجتزاء، وكتل التصوير اكتساب الأنسجة والبيانات. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لأداء SBFSEM من منطقة محددة من الدماغ القوارض لإعادة بسرعة وتصور مورفولوجيا الميتوكوندريا. هذه التكنولوجياويمكن أيضا أن تستخدم يت ضمن لتوفير معلومات دقيقة عن عدد الميتوكوندريا، وحجم والحجم والتوزيع في منطقة الدماغ محددة. منذ دقة وضوح الصورة التي تم الحصول عليها مرتفع (عادة أقل من 10 نانومتر) ويمكن أيضا يتم الكشف عن أي عيوب شكلية الميتوكوندريا الإجمالية.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات الديناميكية التي تغير شكلها والمكان اعتمادا على العظة والاحتياجات الخلوية، في التفاعل مع ضيق الهيكل الخلوي الخلية، وردا على الأحداث الخلوية مثل التيارات الكالسيوم في الخلايا العصبية 1. الميتوكوندريا أيضا التفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى مثل الشبكة الإندوبلازمية، الذي ينظم بدوره ديناميتها والتمثيل الغذائي 2. يظهر التشكل الميتوكوندريا عدم التجانس في أنواع مختلفة من الخلايا مثل. شكل عضية يختلف من أنبوبي إلى أن تتكون من صفائح، أكياس والأشكال البيضاوية 3. وقد تبين أن الميتوكوندريا الانصهار والانشطار البروتينات يمكن أن تنظم دورة في الموقع والحجم والشكل وتوزيع الميتوكوندريا 4. وعلاوة على ذلك، ترتبط التغييرات في شكل الميتوكوندريا مع التنكس العصبي، اللدونة العصبية، ضمور العضلات، مما يشير الى الكالسيوم، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلي وكذلك عمر وموت الخلايا تورط ثامورفولوجيا الميتوكوندريا تي خلية محددة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الخلوية العادية 5-11.

وظيفة الطاقة البيولوجية الرئيسية للالميتوكوندريا هي لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال تنفيذ سلسلة من التفاعلات الأيضية التي تنطوي على انهيار كامل من المواد المغذية (أي الجلوكوز، والدهنية والأحماض أو الأحماض الأمينية) من خلال دورة TCA وOXPHOS مسارات 12. يشكل الدماغ البشري 2٪ فقط من وزن الجسم إلا أنه يستهلك ~ 20٪ من إجمالي الطاقة المنتجة مما يجعل من الطاقة للغاية للمطالبة الجهاز 13. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن ضعف الميتوكوندريا في البشر يؤدي إلى عدد كبير من مظاهر العصبية 14-17. الطفرات الوراثية في مكونات OXPHOS أن تنال يؤدي جيل ATP إلى اضطرابات الميتوكوندريا 17،18، وهي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات سريريا مع انتشار ~ 1: 5000 الأفراد، واحدة من أكثر الأسباب شيوعا للماضطرابات etabolic في الأطفال والبالغين. العجز للاعبي التنس المحترفين المستمدة من الميتوكوندريا يؤثر على أجهزة الجسم المتعددة ذات طاقة عالية مطالبين أجهزة مثل المخ والقلب والعضلات الهيكلية التي أثرت في الغالب في هؤلاء المرضى 14،17،18. في السنوات الأخيرة، وقد وفرت دراسات متعددة دليل على ضعف الميتوكوندريا في كل من الاضطرابات العصبية النمائية والاعصاب 15-17،19،20. منذ الميتوكوندريا ضرورية وحاسمة لنمو الدماغ ووظيفته، فإنه لا بد من وضع البروتوكولات التي يمكن تحليل التغيرات في الدماغ الميتوكوندريا التشكل، بنية، حجم وعددها وتوزيعها في إطار كل من الدول صحية والمريضة. وقد تم إنتاج نماذج الماوس مع استهداف mitochondrially البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور الحركات الميتوكوندريا والتعريب في الدماغ 21،22. في حين أن هذا هو أداة مفيدة للغاية لدراسة حركية الميتوكوندريا والتوزيع العام، هناك بعض السلبيات التي امبه محدود القرار، وحساسية المجهر مضان. هذه الصفات تجعل من الصعب تتبع الميتوكوندريا صغيرة نسبيا الحجم. وبالمثل، وقد استخدم المسلسل انتقال المجهر الإلكتروني بنجاح لعرض الميتوكوندريا متشابك 23، ولكن هذه الطريقة وقتا طويلا جدا. ومن المعروف التشكل الميتوكوندريا أن تكون ديناميكية للغاية لأنها تخضع لاستمرار الانشطار والانصهار دورات، وفي معظم خلايا الميتوكوندريا الحفاظ على شبكة متصلة غاية 24-26. الخلايا العصبية مستقطبة للغاية الخلايا مع التشعبات المتعددة ومحاور عصبية طويلة، والميتوكوندريا التي تشكل شبكة متصلة شبكي في خلايا الجسم قد تضطر إلى فصل لأنها تشق طريقها من خلال هذه neurites التي (الشكل 1). وهذا يجعل من الميتوكوندريا الدماغ متنوعة للغاية من حيث الحجم والشكل. على سبيل المثال، وذلك باستخدام التسلسلي كتلة وجه المجهر الإلكتروني (SBFSEM) تقنية، لاحظنا سابقا أن الفرق في حجم أو حجم mitochondr extrasynapticالجيش العراقي إلى الميتوكوندريا الموجودة في النهايات العصبية قد تكون بقدر أضعاف ستة عشر (27).

هناك عدة طرق لأداء حجم يحلل 28، والذي يتضمن المسلسل القسم تيم 29، الشريط الآلي جمع مشراح مستدق SEM 30، تركز أيون شعاع SEM 31، وSBFSEM 32. تحليل SBFSEM مزاياه في أن لديها القرار لتوفير البيانات الكمية على شكل صرفي، وحجم وتوزيع وعدد من العضيات مثل الميتوكوندريا في المناطق تصل إلى 1 ملم من الدماغ. العملية التقنية هي أيضا أقل تطلبا، مع الحصول على البيانات وتحليلها ضمن قدرات العديد من المعامل البيولوجية التي تفتقر إلى الخبرة EM السابقة. جعلت ظهور الأوراق التجارية لتوليد التسلسلية الصور الشبيهة قسم 3D تحليل التركيبية للأنسجة تقنية روتينية، الذي يسمح مزيد من التحليل الحجمي منحازة بطريقة سريعة ومتكررة 28 32، استنادا إلى فكرة عرضته ليتون في عام 1981 33 دراسات متعددة منذ ذلك الحين وضعت هذه التقنية كأداة رئيسية في تحليل إعادة بناء الدوائر العصبية 34. وعلاوة على ذلك، للعديد من المشاريع الأصغر حجما، فإنه يوفر التحليل إعادة الإعمار لتحديد العضيات الخلوية 27،35-39. منذ ذلك الحين، وتستمد الصور تم الحصول عليها من الجهد المنخفض الإلكترونات مبعثر الظهر، وقد وضعت بروتوكولات تلطيخ الجديدة التي تجمع بين مختلف تقنيات تلوين المعادن الثقيلة المعروفة لزيادة دقة 40.

في هذه الورقة، ونحن نقدم بروتوكول لاستخدام 3D التصوير المجهر الإلكتروني والتحليل الحجمي الميتوكوندريا الدماغ على أساس الأساليب التي سبق استخدامها من قبلنا وغيرها 38،39،41. الطرق الأنسجة مرحلة ما بعد المعالجة المستخدمة وكما هو موضح سابقا من قبل Deerinck وآخرون40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا.

تنبيه: يجب أن تؤخذ الاحتياطات الشديد عند التعامل مع والتخلص العديد من المكونات المستخدمة في هذا البروتوكول. قبل الاستخدام، والمبادئ التوجيهية المؤسسية وممارسات الصحة والسلامة المحلية ويجب وضع وتلت ذلك، ولا سيما بالنسبة للرباعي أكسيد الأوزميوم، وهي متقلبة وسامة للغاية، اليورانيل خلات، التي هي على حد سواء وهو معدن ثقيل ومصدر النشاط الإشعاعي، ونترات الرصاص، الذي هو ومن المعادن الثقيلة السامة. Thiocarbohydrazide (تك) يمكن أن تتحلل لإنتاج الغازات المتفجرة والسامة، إذا ما تم تناوله بشكل غير صحيح. ولدى الكثير من المؤسسات منشأة الأساسية EM التي تستخدم هذه المواد الكيميائية بشكل روتيني ويمكن تقديم المساعدة.

1. إعداد أنسجة المخ وSBFSEM التصوير

  1. تخدير الشباب (~ 2-4 أشهر من العمر) C57 الماوس الأسود (C57BL / 6J سلالة) باستخدام 4-5٪ isofluraشمال شرق اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية. تأكيد التخدير عن طريق رصد فقدان قوة العضلات، وعدم الحركات الطوعية والردود على محفزات مكره مثل قرصة الذيل.
  2. دبوس الماوس على علبة تشريح وإجراء شق في الجلد على طول خط الوسط بطني. تقديم مزيد من شقوق في الجلد لفضح القفص الصدري من الفأرة. شق الحجاب الحاجز، وبعناية تشريح خارج تجويف الصدر على طول محيط لفضح القلب النابض، ومن ثم إجراء شق في الأذين الأيمن.
  3. باستخدام قنية فراشة، يقني؛ يدخل القنية البطين الأيسر. يروي الماوس transcardially باستخدام 10-20 مل من المياه المالحة العازلة الفوسفات (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2، حتى يتم تأكيد استنزاف عن تغيير في لون الكبد.
    ملاحظة: يتم استخدام تغيير في لون الكبد كدليل لتحديد مدى استنزاف. تأكد من أن يتغير لون الكبد من البني المحمر إلى شاحب وردي.
  4. يروي الماوس transcardially باستخدام 10-20 مل من 2٪ glutarألدهيد و 4٪ لامتصاص العرق المحرز في 0.10 M عازلة كاكوديلات (الرقم الهيدروجيني 7.2)، لإصلاح أنسجة المخ بسرعة من الداخل. ويتم رصد التثبيت من خلال مراقبة تشنج الذيل.
    ملاحظة: إعداد 0.10 M كاكوديلات عازلة (درجة الحموضة 7.2) عن طريق إذابة 2.14 غرام من كاكوديلات الصوديوم في 80 مل من الماء، إضافة حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة، وجعل وحدة التخزين إلى 100 مل بالماء.
  5. بعد نضح، قطع رأس الماوس، تشريح الدماغ، تليها تثبيت في 0.10 M عازلة كاكوديلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) تحتوي على 2٪ غلوتارالدهيد و 4٪ لامتصاص العرق لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
  6. بعد 48 ساعة جعل 400 ميكرون أقسام الاكليلية باستخدام vibratome ثم بعناية تشريح المنطقة من اهتمام في الدماغ (على سبيل المثال، وقرن آمون) تحت المجهر تشريح 42. بعناية تقليم النسيج والتقاط صورة للحفاظ على الميول.
    ملاحظة: طرق معالجة الموضوع من تلطيخ الأنسجة في SBFSEM يجمع بين مجموعة متنوعة من أساليب تلطيخ المعادن الثقيلة فيأجل تحسين القرار، وتستند إلى طريقة تم تطويرها من قبل Deerinck وآخرون 40.
  7. غسل الأنسجة الثابتة غلوتارالدهيد 3 مرات، في كل من 0.1 M عازلة كاكوديلات (درجة الحموضة 7.2) 5 دقائق.
  8. تحضير 0.1٪ محلول حامض التانيك عن طريق تذويب حمض التانيك في 0.1 العازلة كاكوديلات M الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2). دوامة حتى يذوب وتصفية من خلال 0.45 ميكرون التصفية، إذا لزم الأمر.
  9. بوستفيكس الأنسجة مع كاكوديلات مخزنة 0.1٪ حمض التانيك التي يحتضنها في 1 كاشف مل لمدة 30 - 60 دقيقة في RT.
    ملاحظة: فترة حضانة المرض يعتمد على حجم الأنسجة، ولكن 30 دقيقة يعمل بشكل أفضل بالنسبة لمعظم الأنسجة.
  10. غسل الأنسجة 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما في المخزن كاكوديلات (درجة الحموضة 7.2).
  11. حل 0.3 غرام فيرو سيانيد البوتاسيوم و 0.86 غرام كاكوديلات الصوديوم في 10 مل المقطر H 2 O (درهم 2 O). حافظ على حل فيرو سيانيد البوتاسيوم على الجليد. فقط قبل الاستخدام، إضافة 10 مل من 4٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (أوسو 4).
  12. وصمة عار على الأنسجة مع 2٪ السراجحل mium-فيروسيانيد لمدة 90 دقيقة، على الجليد. يغسل 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما في DH 2 O.
  13. إعداد 1٪ thiocarbohydrazide (تك) حل عن طريق إذابة 0.1 غرام تك في 10 مل درهم 2 O. حل في 60 درجة مئوية بحلول يحوم كل 10 دقيقة حتى يذوب تماما. مراقبة احتياطات السلامة أثناء التعامل مع تك، ولا سيما الحرص على تجنب استخدام المعادن والتدفئة لدرجة حرارة عالية، أو حل يسمح لتجف.
  14. علاج العينات مع الطازجة 1٪ تك لمدة 20 دقيقة في RT. يغسل 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما في DH 2 O.
  15. تمييع 4٪ أوسو 4-2٪ مع DH 2 O، والأنسجة وصمة عار مع 2٪ رباعي أكسيد الأوزميوم المائي التي يحتضنها لمدة 1 ساعة. غسل الأنسجة 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما مع DH 2 O.
  16. احتضان العينات O / N في 1٪ خلات اليورانيل في DH 2 O في 4 درجات مئوية.
  17. يعد حل اسبارتاتي الرئيسي والتون (كما وصفها Deerinck وآخرون 40).
    1. حل 0.998 ز L-الأسبارتات في 250 مل O 2 درهمثم إضافة 10 N هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) بطريقة قطرة قطرة حتى تصل درجة الحموضة 5.5. بعد تعديل درجة الحموضة، إضافة 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 مل الأسبارتيك الأسهم الحمضية والحرارة إلى 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  18. شطف الأنسجة في DH 2 O، واحتضان مع وصمة عار اسبارتاتي الرصاص والتون لمدة 30 دقيقة في 60 ° C الفرن. يغسل 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما في DH 2 O.
  19. يذوى العينات من خلال سلسلة متدرجة من الكحول باستخدام حلول المبردة من 20٪، 50٪، 75٪، 85٪ و 95٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما، تليها الإيثانول بنسبة 100٪ 3 مرات، 10 دقيقة لكل منهما.
    ملاحظة: استخدام الإيثانول بنسبة 100٪ من زجاجة افتتح حديثا، كما الايثانول فتح تمتص الماء من الجو وتسبب تضمين بالفشل. وحضانات أطول يكون من الضروري مع عينات الأنسجة أكبر.
  20. غسل العينات 2 مرات، في كل من أكسيد البروبيلين 15 دقيقة.
  21. جعل البلاستيك الراتنج التضمين باستخدام 25 الراتنج مل، 10.5 مل DDSA (dodecenyl السكسينك)، و 15.5 مل NMA (نادك أنهيدريد الميثيل) و 1 ملDMP-30 (2،4،6-تريس dimethylaminomethyl الفينول). خلط الراتنج عن طريق هز. تدور والسماح للراتنج على الوقوف حتى فقاعات عزم.
    ملاحظة: هذا هو معيار المتوسطة وصفة صلابة. أنواع أخرى من المجهر الإلكتروني (EM) الراتنجات البلاستيكية يمكن استخدامها، ولكن يجب أن يتم اختبارها مع عينة السيطرة غير الضرورية مقدما وليس كل راتنجات تعمل لSBFSEM.
  22. احتضان الأنسجة O / N في 50: مزيج 50 من تضمين الراتنج وأكسيد البروبيلين، في قارورة الذي توج في البداية، ثم لم يسبق لهم اللعب بعد 2 ساعة حتى يتبخر أكسيد البروبيلين خلال الفترة من حوالي 8-10 ساعة.
  23. نقل الأنسجة إلى 100٪ راتنج التضمين جديدة في قارورة نظيفة لمدة 2 ساعة.
  24. عينات تضمين في الراتنج التضمين جديدة، في قوالب شقة تحتوي على طباعة ملصقات ورقية، وعلاج لهم في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد حوالي 1 ساعة، والتحقق من وضع الأنسجة والمحاذاة، وتعديل إذا لزم الأمر.
  25. تقليم العينات إلى مجال الاهتمام وجبل على دبوس الألومنيوم باستخدام جيلينز cyanoacrylate superglue أو راتنجات الايبوكسي موصل، ثم معطف مع الفضة الغروية لصق حول جوانب كتلة لتوفير مسار موصل للدبوس الألومنيوم.
  26. فحص عينات الأنسجة باستخدام نظام المجهر الإلكتروني الماسح مجهزة مرحلة مشراح مستدق في غرفة وانخفاض كيلو فولت كاشف الإلكترون الأشعة المرتدة 32.
    ملاحظة: الحصول instrument- وموقع التدريب في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) استخدام وتصبح المستخدم المصرح له. بدلا من ذلك، بالتعاون مع الباحث أو الأساسية منشأة للمشاريع الصغيرة قد يكون ممكنا. قد تكون هناك حاجة أيضا تدريب الإشعاع كما محترفو التسويق عبر محركات تولد الأشعة السينية.
  27. لصورة العينات، استخدام الإعدادات التالية: 2.25 كيلو فولت، في 5-10 نانومتر / بكسل القرار، مع أحجام الحقول بين 80-250 ميكرون في س، ص (ميدان آخر أحجام ممكن)، وسمك شريحة من 50-100 نانومتر، مع ما مجموعه 250-600 شرائح في 16 - الفترة الزمنية 20 ساعة.
    ملاحظة: إعدادات تختلف بشكل كبير بين المجاهر المختلفة، ومؤشراتالعينات المفردة، والدقة المطلوبة. ينبغي أن تنتج هذه الإعدادات الصور التي التأويل بسهولة لكثير من العينات.

2. تحليل مجموعة بيانات التصوير

ملاحظة: يستخدم صورة برنامج J / فيجي لتحليل بيانات ويعتمد على المساعد TrakEM2. ويمكن تنفيذ الخطوات تجهيزها باستخدام مجموعة متنوعة من البرامج، ويمكن أن تكون واسعة أو صغيرة اعتمادا على مستوى الخبرة ومداخن الحصول. التحولات الرئيسية باستخدام برمجيات المصدر المفتوح (يماغيج النسخة 1.50b، فيجي تحميل 1 أكتوبر 2015) تم وصفها هنا.

  1. تحويل الصور إلى تنسيق TIFF 8 بت من الملكية صور 16 بت الأصلية من خلال فتح في البرنامج واختيار عناصر القائمة صورة → → نوع 8 بت.
    1. إذا التلقائي تحويل النقيض / سطوع خلال هذه الخطوة ليست مثالية للصور، فتح الصور 16 بت، ثم اضغط على صورة → ضبط → السطوع / التباين. حدد النطاق الذي يعمل لجميع الصور، واضغط على تطبيق. ثم نفذ جonversion. ملاحظة: في بعض محترفو التسويق عبر محركات، هذه الخطوة قد تتطلب برامج الشركة المصنعة المجهر.
    2. إذا لزم الأمر، وذلك بسبب حركة صورة غير مقبولة بين شرائح (مثل الانجراف بسبب الشحن)، سجل / محاذاة مداخن صورة (عناصر القائمة الإضافات → التسجيل → الخطي StackAlignmentWithSIFT). في معظم برامج التسجيل، المحدد لوضع "ترجمة فقط" بدلا من "هيئة جامدة".
      ملاحظة: العديد من المناهج والبرامج قد تعمل: والمكونات في أعمال تسجيل فرزت للعديد من التطبيقات وهناك نسخة كومة الظاهري.
      1. إذا لزم الأمر، وتوسيع حجم قماش قبل التسجيل (صورة → ضبط → CanvasSize) أو تخفيضها إلى مجال الاهتمام (صورة → المحاصيل).
        ملاحظة: بعض الانجراف أو التفلطح قد تحدث، ومحاولة الإضافات أو برامج أخرى قد تعطي نتائج أفضل. خيارات اليدوية وتتوفر أيضا (على سبيل المثال. يماغيج / فيجي، والإضافات → التسجيل → ManualLandmarkSelection).
    3. إذا ديزيريهالطبعه، وحجم الصور إلى أصغر حجم أكثر قابلية للإدارة (على سبيل المثال 25٪) باستخدام يماغيج (صورة → مقياس).
  2. إطلاق البرنامج، حدد → ملف استيراد → تسلسل الصور ثم حدد ملفات TIFF.
  3. إطلاق البرنامج المساعد عن طريق تحديد ملف → → TrakEM2 جديدة (فارغة). سيتم فتح نافذتين. واحد يدير المشروع وarea_lists والآخر يدير تتبع، ويشار إليها باسم "قماش".
  4. تحميل كومة الصورة في البرنامج المساعد من خلال جعل النقر بزر الماوس الأيمن على استيراد قماش. حدد استيراد وانقر على كومة الاستيراد. في الخيارات المنبثقة، حدد المربع للمداخن الظاهري.
    ملاحظة: على الرغم من مداخن صورة يتم فتح بالفعل في البرنامج، فإنها يجب أيضا فتح في البرنامج المساعد. قد تشغيل الكمبيوتر أكثر سلاسة إذا تم تحديد خانة مداخن الظاهري.
  5. بعد أن يتم إنشاء mipmaps ويتم تحميل المكدس، انقر بزر الماوس الأيمن على اسم المشروع ضمن إطار البرنامج المساعد. انقر على الحق في "مشروع جديد" في عمود قالبUMN، واختر "إضافة طفل جديد" لهذا المشروع. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى لتحديد "area_list".
  6. تعيين نطاق المحور Z للمشروع أن نتفق مع إعدادات صورة مجهرية الإلكترون الأصلية عن طريق النقر بالزر الأيمن على قماش، ثم انقر فوق العرض واختيار المعايرة. أيضا، تعيين على نطاق وZ عن طريق اختيار جميع الطبقات في إطار البرنامج المساعد، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد Z حجم وسماكة.
  7. انقر واسحب 'المشروع' وجميع 'الأطفال' في المشروع الباب لإنشاء "قوائم منطقة" تحت علامة التبويب "Z الفضاء 'في نافذة قماش الكائنات.
  8. حدد "قائمة منطقة" وانقر على الحق في اختيار وتعيين لون. الآن، استخدام أداة فرشاة الطلاء لتتبع الأشياء مثل الميتوكوندريا، في صور مجهرية الإلكترون. استخدام "التحول + انقر فوق" لملء في دائرة مغلقة، 'السيطرة + التمرير "لتكبير والتصغير، و" البديل + انقر فوق "لتحويل الطلاء فرشاة المؤشر إلى ممحاة.
  9. تحديد مجالين من مجالات ~ 10-15 ميكرونمن 10-15 ميكرومتر في أعلى الزاوية اليسرى وأسفل الزاوية اليمنى من الصورة وتحديد جميع الميتوكوندريا في هذه المناطق للسماح أخذ العينات مشاركات الميتوكوندريا في كل مجموعة بيانات.
  10. على "قماش"، ومراقبة وتتبع الميتوكوندريا في جميع أنحاء أقسام. ملاحظة: الميتوكوندريا هي مظلمة تماما / العضيات التي تظهر كثيفة، مشابهة من حيث الحجم وقطرها أسطواني فضفاضة. وأعراف فريد من نوعه يتكون من الغشاء الداخلي يمكن تمييزها بسهولة داخل هذه العضية.
  11. عند الانتهاء من البحث عن المفقودين، انقر على الحق في area_list تحت علامة التبويب مساحة Z، اختر "عرض في 3D. سيؤدي ذلك إلى تشغيل المشاهد المساعد 3D لعرض التعمير 3D من الصورة تتبعها.
    1. لإجراء قياسات حجم الميتوكوندريا، حدد الكائن في المشاهد 3D، انقر فوق علامة التبويب "تحرير" واختر "خصائص كائن". يتم سرد تقدير حجم الميتوكوندريا جنبا إلى جنب مع العديد من القياسات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

علينا أن نبرهن على التشكل الميتوكوندريا الدماغ وحجم غير متجانس في مختلف العصبية مقصورات الفرعية. وأظهر الفحص المجهري متحد البؤر في منخفض الكثافة الثقافات العصبية transduced مع الفيروسة البطيئة معربا عن استهداف mitochondrially البروتين الفلوري الأخضر أن الميتوكوندريا المقيمين في سوما العصبية تشكل شبكة شبكي، في حين أن أولئك الذين يقيمون في neurites التي البعيدة تظهر التشكل ممدود منفصلة (الشكل 1 AB). باستخدام تقنية SBFSEM، وقد تم تحليل مورفولوجية الميتوكوندريا، وحجم وحدة التخزين والتوزيع في مخ الفأر. تم بناؤها ثلاثية الأبعاد (3D) وصور من الميتوكوندريا من كل neurites التي ونقاط الاشتباك العصبي في الحصين مخ الفأر. وقد تم التعرف على الميتوكوندريا قبل المشبكي وعدد من حبات قبل المشبكي إيواء الميتوكوندريا المقيمين كميا. وقد لوحظ عدم التجانس في حجم الميتوكوندريا في شجيري مقابل مقصورات محور عصبي (فايجوري 1 CD). وعلاوة على ذلك، كان العديد من المقصورات قبل المشبكي الصغيرة في قرن آمون في الدماغ الماوس خالية من الميتوكوندريا (الشكل 2 AC). كشفت قياسات حجم كل من الميتوكوندريا قبل المشبكي وextrasynaptic أن حجم أو حجم الميتوكوندريا المقيمين داخل presynapses العصبية كان أصغر بكثير من أولئك الذين يقيمون في المنطقة extrasynaptic (الشكل 2 DF). ومن المثير للاهتمام، وأظهر الأبعاد (2D) توزيع حجم اثنين من الميتوكوندريا يقاس من وأخذ العينات مشاركات من 200 الميتوكوندريا غير الجسدية التي ~ 11٪ من نسبة الميتوكوندريا تقع تحت الحد قرار من المجهر الضوئي (الشكل 2G). وبالإضافة إلى ذلك، فإن الصور 2D المكتسبة عن طريق تحليل SBFSEM توفر زاد قرار لتصور الخصائص التركيبية الميتوكوندريا الفردية (الشكل 3 AB). نظرا لتضاريس واضحة للعيان من الأنسجة، فمن مزيد من الممكن تصنيف شركات الخلويةartment الميتوكوندريا من خلال تحديد قربها بسهولة الهياكل التعريفية مثل النواة (جسدية) والحويصلات المشبكية (قبل المشبكي) (الشكل 3 AB). من أجل تحديد الميتوكوندريا الموجودة في العمليات العصبية، وإعادة بناء العملية الفردية ومحور عصبي أو التغصنات بناء على وجود أو عدم وجود حبات قبل المشبكي على التوالي 42. وبناء على هذه النتائج، فإننا نقترح أن SBFSEM هو تقنية تحليلية قيمة للغاية لتحديد شكل الميتوكوندريا والحجم والعدد والتوزيع في أنسجة المخ والتي يمكن أيضا أن أي عيوب جسيمة في هيكل الميتوكوندريا والتوزيع يتم تحديدها باستخدام هذا الأسلوب. منذ الخصائص التركيبية من أنواع مختلفة من الخلايا في الدماغ تختلف، على سبيل المثال ل. وجود حبيبات الجليكوجين في الخلايا النجمية، فمن الممكن أيضا أن تحليل الاختلافات خلية من نوع معين في الميتوكوندريا الدماغ.

شكل 1 تم transduced التجانس في الخلايا العصبية الميتوكوندريا الصرف والتوزيع الثقافات القشرية من بعدها يوم 1 الجراء الفأر مع الفيروسة البطيئة معربا عن استهداف mitochondrially البروتين الفلوري الأخضر (ميتو-GFP): الشكل 1. (أ) يبين سوما الخلايا العصبية معربا عن ميتو-GFP، لاحظ شبكة شبكي من التشكل الميتوكوندريا. نو = نواة. شريط مقياس = 5 ميكرون. (ب) أن التشكل الميتوكوندريا ممدود في neurites التي البعيدة. شريط مقياس = 5 ميكرون. (C) صورة الممثل 2D من مجموعة البيانات SBFSEM المتولدة من أنسجة مخ الفأر، ملطخة الميتوكوندريا باللون الأخضر، ملطخة التشعبات في دوالي الزرقاء ومحور عصبي ملطخة باللون البني. شريط مقياس = 1 ميكرون. (د) إعادة البناء 3D الميتوكوندريا في neurites التي من نسيج مخ الفأر، لاحظ الفرق في الحجم بين شجيري والمحاور indicat الميتوكوندرياإد التي كتبها السهم الكبيرة والصغيرة على التوالي؛ مقياس شريط = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: المسلسل بلوك وجه المجهر الإلكتروني (SBFSEM) تحليل وكشف وفرة منخفضة من الميتوكوندريا في محطات قبل المشبكي (A) الممثل 2D ultramicrograph من تحليل بيانات SBFSEM تم الحصول عليها من الحصين من P15 البرية من نوع الفئران،. شريط مقياس = 1 ميكرون. (ب) يعرض إعادة الإعمار 3D من 10 النهايات العصبية قبل المشبكي. لاحظ أن 4 فقط من أصل 10 محطات قبل المشبكي أظهرت الميتوكوندريا ملحوظا؛ شريط مقياس = 1 ميكرون. (C) بار رسم بياني يوضح الكميات من 173 بناؤها النهايات العصبية قبل المشبكي من بينالي الشارقةتحليل بيانات FSEM. (D) صورة الممثل 2D من SBFSEM بيانات تظهر الميتوكوندريا extrasynaptic في الميتوكوندريا الزرقاء وقبل المشبكي باللون الأخضر. شريط مقياس = 1 ميكرون. (E) اعادة البناء 3D من الميتوكوندريا قبل المشبكي وextrasynaptic من مجموعة البيانات SBFSEM باستخدام البرمجيات؛ شريط مقياس = 1 ميكرون. (F) بار الرسم البياني يظهر حجم الميتوكوندريا extrasynaptic وقبل المشبكي. يتم رسم البيانات كما يعني ± SEM. ن = 3 مجموعات البيانات المختلفة (ويشمل 62 الميتوكوندريا قبل المشبكي و 80 الميتوكوندريا extrasynaptic في المجموع). * يصور قيمة ص = 0.0405. (G) منطقة 15 من 15 ميكرون في جميع الزوايا الأربع من الصور وتميزت وتم تحديد جميع الميتوكوندريا غير جسدية للسماح أخذ العينات العشوائية. وقد تم قياس أقل بعدا من ~ 200 الميتوكوندريا. ويظهر الرسم البياني فطيرة أن ~ 11٪ من الميتوكوندريا غير جسدية كانت <200 نانومتر في البعد الذي هو أقل من الحد قرار من المجهر الضوئي. هذا الرقم له بتكييفها التابعين من شافان وآخرون (27). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): 2D SBFSEM صور من جانبي الركبي النوى من مخ الفأر (A) اثنين من الأبعاد صورة SBFSEM تمثيلية من نوى الركبية الجانبية (8/8 ميكرون) يدل على تضاريس مفصل للمنطقة. يشار إلى سوما ونواة. شريط مقياس = 2 ميكرون. (ب) والتكبير من المنطقة المشار إليها من قبل مربع أحمر في لوحة A. ملاحظة أن الأغشية الداخلية والخارجية من الميتوكوندريا وكذلك أعراف تشكيل واضحة للعيان. ويلاحظ أيضا التضاريس والعلاقات إلى العضيات الأخرى والبنية الخلوية. يشير PS سبيل المثال الميتوكوندريا قبل المشبكيويشير NS سبيل المثال من غير متشابك (NS) الميتوكوندريا الجسدية. مقياس شريط = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعقيد النظام العصبي يشكل تحديا كبيرا في إعادة كميات كبيرة الأنسجة وتحليل التشكل وتوزيع عضيات مثل الميتوكوندريا مع قرار مناسب. خلايا متعددة بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية مع العديد من العمليات الموسعة في ثلاثة أبعاد تتفاعل داخل أنسجة المخ 43. منذ الميتوكوندريا يقيم في كل من سوما الخلايا والعمليات البعيدة، مورفولوجيا الميتوكوندريا هو متعدد الأشكال للغاية في الجهاز العصبي (الشكل 1). كافية المعلومات الهيكلية 3D مع قرار كاف بالتالي لا يمكن الحصول عليها من خلال تقنيات المجهر الضوئي التقليدية مثل متحد البؤر أو اثنين الفوتون المجهري 44،45. الإلكترون المجهري هو الأسلوب الوحيدة المتاحة حاليا التي تسمح إعادة الإعمار كميات كبيرة من الأنسجة العصبية مع عال بما فيه الكفاية القرار. تقليديا، كانت 3D إعادة بناء الأنسجة العصبية تحقيقد كتبها التسلسلي قسم البث المجهر الإلكتروني (SSTEM) من أقسام سامسونج 29. ومع ذلك، تحسنت التطورات التكنولوجية الحديثة نوعية الحصول على البيانات حجم الإلكترون المجهري والأتمتة.

SBFSEM هو أسلوب التصوير كتلة وجه الآلي الذي يجمع بين باجتزاء المسلسل داخل غرفة المجهر الإلكتروني، من أجل إعادة بناء هيكل الأنسجة 3D على مدى مئات ميكرومتر، مع قرار غير كافية لمتابعة أنحف العمليات الخلوية وتحديد العضيات الصغيرة . وقد فتحت هذه التقنية آفاق إعادة بشكل روتيني كل من النظم اللافقاريات والفقاريات العصبي. أنها تنطوي على خطوات متعددة بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل المجهر الالكتروني الماسح، والحصول على البيانات، صورة مرحلة ما بعد المعالجة، وتحليل الصور. تتطلب هذه الإجراءات التدريب العملي على متخصصة التدريب ومنح الشهادات للتشغيل المجهر الالكتروني الماسح. هناك ثلاثة عوامل الناقدالله أي. تشريح المنطقة التشريحية الصحيح الدماغ، والحصول على صور عالية الدقة، وتحليل الصور السليم. بعد تشريح المنطقة التشريحية للاهتمام من شريحة vibratome من أنسجة المخ ثابتة، لا بد من أخذ صورة للحفاظ على التوجه السليم. ويمكن أن يكون الأمر خلاف ذلك من الصعب التأكد من الموقع الصحيح للتصوير. الحصول على صور عالية الدقة تعتمد على تثبيت الكافي والإجراءات المناسبة تلطيخ بعد تثبيت. الدماغ يميل إلى الخضوع لتدهور سريع في التركيب الدقيق لها بعد الموت. لذا، فمن الأهمية بمكان لإصلاح الدماغ في حل غلوتارالدهيد استخدام السليم طريقة نضح transcardial. وينبغي أن يتبع ذلك عن طريق مزيد من التثبيت من الدماغ في حل غلوتارالدهيد لا يقل عن 24 ساعة. منذ دقة وضوح الصورة هو تعتمد اعتمادا كليا على الجمع بين مجموعة متنوعة من أساليب تلطيخ المعادن الثقيلة، فمن الأهمية بمكان أن اتباع أسلوب بعد تحديد كما هو مفصل في البروتوكول للحصول على quantifiablالبريد الصور. وينبغي بذل الحلول كما هو موضح في الأساليب. وأخيرا، لتحليل صورة دقيقة ينبغي تحديد عضية / ثانية ليتم تحليلها بشكل لا لبس فيه (على سبيل المثال. من خلال وضع تصور الخصائص التركيبية) قبل البحث عن المفقودين، والمبادئ التوجيهية البرامج يجب التقيد التام بها. القرار من الصور المكتسبة ينبغي أن يكون معروفا للتحويل من بكسل نانومتر لقياسات حجم.

إلى جانب البرنامج الموضحة في بروتوكول لتحليل الصور، ويمكن أيضا أن تستخدم البرمجيات المتاحة الآخر مثل إعادة إعمار وكنوسوس. على الرغم من أن التركيز من بروتوكول صفها على عرض الميتوكوندريا في الجهاز العصبي، ويمكن تعديلها لتوليد عالية الدقة المعلومات 3D على مختلف الهياكل التحت خلوية أخرى (على سبيل المثال. الشبكة الإندوبلازمية، الجسيمات الحالة الخ.) في مجموعة متنوعة من الأنسجة.

في حين أن دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفصل لمجهر المسح الإلكتروني ستعاونكم هو خارج نطاق هذه المادة (انظر دليل المستخدم الصك والمعلومات التدريب)، بعض المشاكل تحدث بشكل روتيني خلال تجارب التصوير وفهم كيفية استكشاف لهم قد تساعد المستخدمين الجدد أو الحاصلين على الصور من خلال مصادر تجارية التعاون /. وهناك مشكلة مشتركة هو اتهام من العينة التي تحدث أساسا في المناطق الراتنج التي تحتوي على القليل أو أي مادة الملون. في "ايجابية" صورة (أي ظهور العصارة الخلوية البيضاء)، قد تظهر نواة، والأوعية الدموية، ومساحات الراتنج فارغة "اسودت". وبالإضافة إلى ذلك، يشجع الشحن أيضا الانجراف شعاع المحلي مما أدى إلى تشويه صورة واضحة. تختلف الحلول الممكنة بين الصكوك والعينات. تخفيض إعدادات كيلو فولت يقلل من "اسوداد" قطعة أثرية ولكن قد تشجع المزيد من شعاع الانجراف. عن طريق وضع فراغ أقل، وبما في ذلك النتروجين (N 2) الغاز، وبخار الماء، وغيرها. في غرفة يقلل من الشحن، ولكن بتكلفة كبيرة من القرار، والاشاراتل إلى نسبة الضوضاء. وهناك مشكلة مشتركة الثانية هي سكين الطفر. أبطأ المسح قد يسبب شعاع الناجم عن الأضرار التي لحقت سطح كتلة، الذي يقطع بشكل غير متساو أو لا على الاطلاق لبعض التصوير / قطع دورات (أي الصور المتعاقبة تظهر نفسها). العديد من الحلول موجودة بما في ذلك زيادة عمق القطع / سمك شريحة ذوي الاحتياجات ض القرار، وزيادة سرعة المسح الضوئي وقبول بالتبعية الصور ضجيج، والحد من حجم بكسل وقبول أقل س / ص القرار، واختيار عينات أو المناطق التي تلطيخ أكثر كثافة (كما سيئة المناطق -stained تهمة أكثر، كلما زاد الضرر بسهولة، وتتطلب التعرض شعاع أطول للحصول على صور مع مقبولة إشارة إلى -noise النسب). الحطام إعادة الترسب على كتلة الوجه هو مصدر عرضية من القطع الأثرية في صور، وإذا كان هذا يحدث في كثير من الأحيان قد يتطلب التوقف عملية الاستحواذ، وتنظيف بعناية (الهواء تهب) سكين، أو retrimming العينة إلى حجم أصغر. يعزز كتلة وجه الشحن أيضا إعادة الترسب، والخطوات الموضحة أعلاه قدمساعدة. قد تكون هناك حاجة أيضا تصحيح التركيز وstigmation كما العينات الصور المجهر بشكل مستمر لعدة ساعات إلى أسابيع، وهي الفترة التي يزيد عمق الفراغ في الغرفة، الأمر الذي يتطلب stigmation التصحيحات. كل المجهر الإلكتروني الماسح يختلف وفقا للسن وخصائصها، والخبرة هي أفضل دليل. قد تحدث تغييرات جذرية مفاجئة في stigmation أو التركيز عندما تلتزم المواد مقطوع لمكونات المجهر التصوير. يجب فتح الغرفة والمواد فكها بعناية من خلال فراغ أو النيتروجين المضغوط. وهذا يتطلب على الاطلاق التدريب المتخصص.

هناك عدد قليل من مساوئ التكنولوجيا SBFSEM فيما يتعلق فائدتها في تحليل الميتوكوندريا الدماغ. والعيب الرئيسي، مشتركة بين جميع المجهري للأنسجة ثابت، هو أنه يوفر صورا ثابتة من عضية ديناميكية للغاية. الميتوكوندريا الخضوع المستمر الانشطار والانصهار دورات 26، متحركة والاتجار بهن على طول نeurite العمليات 21. عيوب في الاتجار الميتوكوندريا والديناميات التي ليست عددية بحتة أو الهيكلية يمكن تفويتها بسهولة عن طريق هذا النهج، على الرغم من أنه من خلال النظر في عدد من الميتوكوندريا في مساحة محددة تشريحيا مثل presynapse يمكن لأحد أن يفسر إذا كان النقل من الميتوكوندريا يمكن تعديل 39 . والعيب الثاني هو أن يتم تنفيذ ذلك إلا في جزء صغير من الدماغ، وبالتالي الدوائر عيوب محددة في توزيع الميتوكوندريا يمكن تفويتها. نهج مترابط 28،46 تحمل فرصة الجمع بين التصوير متحد البؤر وmultiphoton مع التكنولوجيا SBFSEM لتوليد كل من البيانات الجزيئية والتركيبية. لتحليل الميتوكوندريا، وبالتالي، فإنه قد يكون من المفيد إجراء SBFSEM بعد الفحص المجهري ضوء أقسام الدماغ إما باستخدام الميتوكوندريا مستضد الضد معين أو باستخدام التحوير الذي يعبر عن mitochondrially استهداف بروتين فلوري. هذا combinatioقد توفر استراتيجية نال منهجية قوية لتحديد العيوب الميتوكوندريا في نماذج الفئران من الاضطرابات العصبية والميتوكوندريا.

وهناك أيضا قيود فنية مشتركة لأشكال عديدة من المجهر الإلكتروني بسبب استخدام مثبتات قاسية، وتلطيخ المعادن الثقيلة وانتشار غير المتكافئ للمواد الكيميائية. قد تنبع قيود أخرى من التضمين البلاستيك عينات الأنسجة. المناطق الفارغة من الراتنج والهياكل الملون قليلة تحتفظ الإلكترونات أثناء التصوير، مما تسبب في انحراف شعاع والانجراف (صورة تزييفها)، وكذلك إشارات الشحن مصطنعة (على سبيل المثال. أنوية مظلمة والأوعية الدموية التجويف)، والتي تؤثر على كل من القرار. شعاع الأضرار التي لحقت الراتنج يعزز أيضا قطع متفاوتة، ولهذا السبب، والتصوير عادة ما يتطلب شرائح من 50-100 نانومتر إلى أن تقطع من كتلة وجه، إنتاج voxels غير isotrophic في قواعد البيانات. وتشمل القيود الأخرى لبعض التطبيقات التي الأقسام دمرت ولا يمكن اعاد في وقت لاحق،مما قد يجبر المستخدمين على جمع صور عالية الدقة من المجالات التي قد لا تحتوي على بيانات مفيدة.

والميزة الرئيسية لSBFSEM هو أنه بأتمتة عملية باجتزاء والتصوير كتل من الأنسجة من خلال دمج مشراح المخصصة في فراغ منخفض SEM غرفة 32،33. منذ يتم الحصول على الصور مباشرة من كتلة وجه قبل كل قطع، وتجنب كثيرا من المشاكل من قسم التجاعيد والضغط وفقدان أثناء المناولة وعلى الرغم من ترسب الحطام وتزييفها المناسب لمنع وجه اتهام لا تسهم في فقدان بعض الصور وتشويه . وعلاوة على ذلك، فإن الصور التي تم الحصول عليها في قواعد البيانات الخام بالفعل الانحياز وتتطلب التسجيل ميكرومتر النطاق الوحيد لاستيعاب شعاع الانجراف لكي تكون قابلة لمعظم التحليل. بسبب عملية باجتزاء الآلي، ومرة ​​واحدة استقرت فراغ النظام، كميات كبيرة من الأنسجة يمكن تصويرها دون تدخل من المشغل. هناك مزايا متعددة لاستخدام هذاالتكنولوجيا في إجراء الدراسات المورفولوجية والكمية على العضيات وهياكل داخل الخلايا. ميزة واحدة هو الحصول على معلومات عن هيكل 3D من الميتوكوندريا في غضون فترة معقولة من الزمن. جعلت توافر مفتوحة المصدر حزم البرمجيات اعادة الاعمار مثل إعادة إعمار 47، TrakEM 48 و كنوسوس 49-51 هذه التكنولوجيا أداة تحليلية قوية حيث مفصل التركيب الدقيق 3D من شبكة الخلايا العصبية من النماذج الحيوانية التجريبية يمكن مقارنتها مباشرة. اقتراب تحليل الصور semiautomated ومؤتمتة بالكامل من المحتمل أن إنتاج بيانات الميكانيكية عالية في الحيوانات حيث من المتوقع أن تتأثر التشكل الميتوكوندريا، وظيفة و / أو نشوء حيوي 52. وقد أعاق تحليل SBFSEM في وقت سابق إلى حد كبير نظرا لدقة أقل، ولكن أحدث تقنيات إعداد عينة تشمل تعزيز أساليب تلطيخ 40 قد تحسنت تحسنا كبيرا القرار إلى حد أنه حتى الخامس متشابك واحدesicle يمكن حلها بسهولة. في هذا القرار العيوب التركيبية في الميتوكوندريا مثل ظهور فجوات، وتمزق الغشاء، وفقدان أعراف يمكن ملاحظتها بسهولة، وتوزيع الميتوكوندريا معيبة داخل الخلايا يمكن تحديدها 38،39. عالية الدقة من هذه التقنية توفر ميزة كبيرة على المجهر الضوئي حيث القرار يقتصر على ~ 200 نانومتر في محور XY و~ 500 نانومتر في المحور Z. لذا الميتوكوندريا هي فقط عند حد حل المجهر الضوئي 53. على الرغم من الميتوكوندريا وجود أبعاد أقل من الحد قرار لا يزال من الممكن تصور بواسطة المجهر الضوئي، أبعادها لا يمكن قياسها بشكل موثوق به. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا التي تكون مفصولة مسافة أقل من الحد قرار من مجهر الضوء لا يمكن حلها بواسطة المجهر الضوئي. ميزة أخرى هي أن التحليل البنيوي الميتوكوندريا لا يمكن أن يؤديها في إطار النسيج، دون عزل عضية. وهذا يمكن أن آلمنخفضة لمقارنات المناسبة داخل الأنسجة بناء على توطين الميتوكوندريا، على سبيل المثال محور عصبي مقابل جسدية و / أو الميتوكوندريا الجذعية. ميزة إضافية هي أنه من الممكن عادة تحديد ما إذا كانت الميتوكوندريا هي العصبية أو دبقية في توطين باتباع العمليات لعضية تعريف، مثل خيوط الدبقية والجليكوجين للالنجمية أو النخاعين للقليلة التغصن. عمليات الخلايا العصبية وخلايا دبقية في كثير من الأحيان على مقربة، ومع النهج 2D مثل تيم أنه قد يكون من الصعب تعيين مع الثقة التي هي العمليات العصبية والتي هي دبقية.

وفي الختام، والتكنولوجيا SBFSEM توفر رزمة من الصور المتسلسلة التي تغطي مجالات النسيج 20 - 1000 ميكرون في الحجم مع قرار التركيبية من 5 - 10 نانومتر أو أعلى، والتي تمكن خلايا كامل الجهاز العصبي المركزي وعضيات مثل الميتوكوندريا للتصوير وقياسها وإعادة بنائها . في هذه الورقة، لدينا محترفينالتكفل بعض الأساليب العملية للاستفادة من هذه التكنولوجيا. وتشمل التطبيقات المستقبلية تحليل بنية الميتوكوندريا والتوزيع في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية مثل نماذج الأمراض العصبية النمائية والاعصاب وكذلك تحليل مختلف ultrastructures التحت خلوية مثل الشبكة الإندوبلازمية، نواة و / أو الجسيمات الحالة في الخلايا أو الأنسجة بأكملها تحت صحية و الحالات المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 113، SBFSEM، الميتوكوندريا، OXPHOS، الدماغ، المشبك، وإعادة الإعمار 3D
تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter