Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

El cerebro humano es un órgano de alto consumo de energía que se basa principalmente en la glucosa como fuente de combustible. La glucosa se ​​cataboliza por las mitocondrias cerebrales a través de la glucólisis, las vías de ciclo y la fosforilación oxidativa de ácido tri-carboxílico (TCA) (fosforilación oxidativa) para producir la energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP). Deterioro del valor de la producción de ATP mitocondrial causa los trastornos mitocondriales, que presentan clínicamente con síntomas neurológicos y myopathic prominentes. Defectos mitocondriales también están presentes en los trastornos del neurodesarrollo (por ejemplo, trastorno del espectro autista) y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson). Por lo tanto, hay un aumento de interés en el campo para la realización de análisis en 3D de mitocondrial morfología, estructura y distribución bajo ambos estados sanos y enfermedades. La morfología mitocondrial cerebro es extremadamente diverso, con algunas mitocondrias especialmente los dela región sináptica en el intervalo de <200 nm de diámetro, que está por debajo del límite de resolución de la microscopía de luz tradicional. Expresar una proteína orientado mitocondrialmente-verde fluorescente (GFP) en el cerebro mejora significativamente la detección organellar por microscopía confocal. Sin embargo, no supera las limitaciones de la sensibilidad de detección de relativamente pequeñas mitocondrias de tamaño sin oversaturating las imágenes de gran tamaño mitocondrias. Mientras microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para caracterizar las mitocondrias en la sinapsis neuronal, esta técnica es extremadamente lento especialmente cuando se comparan múltiples muestras. La técnica de bloqueo cara microscopía electrónica de barrido de serie (SBFSEM) implica un proceso automatizado de seccionamiento, bloques de imagen de adquisición de datos y el tejido. A continuación, ofrecemos un protocolo para realizar SBFSEM de una región definida del cerebro de roedores para reconstruir y visualizar la morfología mitocondrial rápidamente. esta tecnologíanique también podría ser utilizado para proporcionar información precisa sobre el número mitocondrial, volumen, tamaño y distribución en una región del cerebro definido. Dado que la resolución de la imagen obtenida es alta (típicamente bajo 10 nm) también se pueden detectar los defectos morfológicos mitocondriales brutos.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que cambian su forma y ubicación en función de las señales y las necesidades celulares, en la interacción estrecha con el citoesqueleto celular, y en respuesta a eventos celulares tales como las corrientes de calcio en las neuronas 1. Las mitocondrias también interactúan con otros orgánulos celulares, por ejemplo, retículo endoplásmico, que a su vez regula el metabolismo de su dinámica y 2. Morfología mitocondrial muestra heterogeneidad en diferentes tipos de células, es decir. la forma de la orgánulo varía de tubular a la que consiste en hojas, sacos y óvalos 3. Se ha demostrado que la fusión y de fisión proteínas del ciclo mitocondriales pueden regular la ubicación, tamaño, forma y distribución de las mitocondrias 4. Además, cambios en la forma mitocondrial se asocian con la neurodegeneración, la plasticidad neuronal, la atrofia muscular, la señalización de calcio, la generación de especies reactivas del oxígeno, así como la vida útil y la muerte celular que implican a thala morfología mitocondrial de células T específica es crítico para el mantenimiento de la función celular normal 5-11.

Una importante función bioenergética de la mitocondria es la generación de trifosfato de adenosina (ATP) mediante la ejecución de una serie de reacciones metabólicas que implican ruptura completa de nutrientes (es decir, glucosa, grasos de ácidos o aminoácidos) a través del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa vías 12. El cerebro humano constituye sólo el 2% del peso corporal sin embargo, consume ~ 20% de la energía total producida por lo que es extremadamente demandante de energía de órganos 13. Por lo tanto, no es sorprendente que la disfunción mitocondrial en los seres humanos conduce a un gran número de manifestaciones neurológicas 14-17. Las mutaciones genéticas en los componentes de la fosforilación oxidativa que impiden la generación de ATP conduce a trastornos mitocondriales 17,18, que son clínicamente grupo heterogéneo de enfermedades con una prevalencia de 1: ~ 5.000 personas, y una de las causas más comunes de mtrastornos etabolic en niños y adultos. Déficit de ATP mitocondrias derivadas afecta a múltiples sistemas de órganos con órganos que demandan alta energía, como el cerebro, el corazón y los músculos esqueléticos están predominantemente afectados en estos pacientes 14,17,18. En los últimos años, varios estudios han proporcionado evidencia de disfunción mitocondrial en ambos trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos 15-17,19,20. Dado que las mitocondrias son esenciales y fundamentales para el desarrollo y función del cerebro, es imperativo desarrollar protocolos que pueden analizar los cambios en el cerebro mitocondrial morfología, estructura, tamaño, número y distribución previstos en ambos estados sanos y enfermos. Los modelos de ratones con la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (GFP) se han producido para visualizar los movimientos mitocondriales y localización en el cerebro 21,22. Si bien esta es una herramienta extremadamente útil para examinar la motilidad mitocondrial y la distribución general, hay algunos inconvenientes que Includresolución limitada e y la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia. Estos atributos hacen que sea difícil realizar un seguimiento de las mitocondrias relativamente pequeñas de tamaño. Del mismo modo, la microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para ver mitocondrias sináptica 23, pero este método es mucho tiempo. Morfología mitocondrial es conocido por ser altamente dinámico ya que se someten a ciclos continuos de fusión y de fisión, y en la mayoría de las células de la mitocondria mantener una red altamente conectado 24-26. Las neuronas son células con múltiples dendritas y axones extendidas, y las mitocondrias que forman una red reticular conectado en el cuerpo de la célula altamente polarizada puede tener que separar ya que hacen su camino a través de estos axones (Figura 1). Esto hace que las mitocondrias cerebrales extremadamente variadas en tamaño y forma. Por ejemplo, utilizando el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie técnica (SBFSEM), se observó previamente que la diferencia en el volumen o tamaño de mitochondr extrasynapticia a las mitocondrias presentes en los terminales de los nervios puede ser tanto como dieciséis pliegan 27.

Existen varios enfoques para la realización de los análisis del volumen 28, que incluye la sección de serie TEM 29, la cinta automatizadas para la recolección ultramicrotomo SEM 30, se centró haz de iones SEM 31 y 32 SBFSEM. El análisis SBFSEM tiene ventajas en que tiene la resolución para proporcionar datos cuantitativos sobre la forma morfológica, el tamaño, la distribución y el número de orgánulos tales como mitocondrias en áreas de hasta 1 mm del cerebro. La operación técnica es también la menos exigente, con la adquisición de datos y análisis dentro de las capacidades de muchos laboratorios biológicos que carecen de experiencia previa EM. El advenimiento de los instrumentos comerciales para la generación de la sección similar a imágenes en serie ha hecho 3D análisis ultraestructural de los tejidos de una técnica de rutina, que permite, además, un análisis volumétrico imparcial de una manera rápida y repetible 28 32, basado en una idea introducida por Leighton en 1981 33. Múltiples estudios han establecido desde entonces esta técnica como una herramienta importante en el análisis de la reconstrucción de los circuitos neuronales 34. Además, para muchos proyectos de menor escala, se proporciona un análisis para identificar la reconstrucción orgánulos celulares 27,35-39. Puesto que, las imágenes adquiridas se derivan de baja tensión electrones retrodispersión, nuevos protocolos de tinción que se combinan diferentes técnicas conocidas de tinción de metales pesados ​​fueron desarrollados para aumentar la resolución 40.

En este trabajo, ofrecemos un protocolo para la utilización de imágenes de microscopía electrónica 3D y el análisis volumétrico de las mitocondrias del cerebro sobre la base de métodos que han sido previamente utilizados por nosotros y otros 38,39,41. Los métodos de post-procesamiento de los tejidos utilizados fueron como se ha descrito anteriormente por Deerinck y col40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Virginia Tech.

Precaución: las precauciones extremas deben ser tomadas al manipular y desechar varios componentes utilizados en este protocolo. Antes de su uso, la directrices institucionales y las prácticas de salud y seguridad local debe establecer y seguir, en particular para el tetróxido de osmio, que es volátil y extremadamente venenosa, acetato de uranilo, que es a la vez un metal pesado y la fuente de radiactividad, y nitrato de plomo, que es un veneno de metales pesados. Tiocarbohidrazida (TCH) puede descomponerse para producir gases explosivos y tóxicos, por un manejo inadecuado. Muchas instituciones tendrán la facilidad de la base de EM en los que estos reactivos se utilizan de forma rutinaria y pueden proporcionar asistencia.

1. Preparación del tejido cerebral y SBFSEM Imaging

  1. Anestesiar a un joven (~ 2 - 4 meses de edad) C57 de ratón negro (C57BL / 6J) usando 4 - 5% isoflurane siguiendo las directrices institucionales. Confirmar la anestesia mediante el control de la pérdida de tono muscular, falta de movimientos voluntarios y las respuestas a los estímulos aversivos como un pellizco de la cola.
  2. Pin el ratón sobre una bandeja de disección y hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media ventral. Hacer más incisiones en la piel para exponer la caja torácica del ratón. Incisión en el diafragma, y ​​cuidadosamente diseccionar la cavidad torácica a lo largo de la periferia para exponer el corazón latiendo, y luego hacer una incisión en la aurícula derecha.
  3. El uso de una cánula de mariposa, canular el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) pH 7,2, hasta que la hemorragia es confirmado por un cambio en el color del hígado.
    Nota: Un cambio en el color de hígado se utiliza como una guía para determinar el grado de desangrado. Confirman que los cambios de color de hígado de color marrón rojizo a rosa pálido.
  4. Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de 2% glutaraldehído y 4% de paraformaldehído hizo en tampón 0,10 M de cacodilato (pH 7,2), para fijar el tejido cerebral rápidamente desde dentro. La fijación se controla mediante la observación de la rigidez de la cola.
    Nota: Preparar 0,10 M tampón de cacodilato (pH 7,2) disolviendo 2,14 g de cacodilato de sodio en 80 ml de agua, añadir ácido clorhídrico para ajustar el pH, y completar el volumen a 100 ml con agua.
  5. Tras la perfusión, decapitar el ratón, diseccionar el cerebro, seguido por fijación en tampón 0,10 M de cacodilato de sodio (pH 7,2) que contiene 2% de glutaraldehído y paraformaldehído al 4% durante 48 horas a 4 ° C
  6. Después de 48 hr hacer 400 micras secciones coronales utilizando un vibratome y luego diseccionar cuidadosamente la región de interés en el cerebro (por ejemplo, el hipocampo) bajo el microscopio de disección 42. Recortar con precisión el tejido y tomar una foto para la conservación de la orientación.
    Nota: Enviar métodos de procesamiento de tinción de tejidos en SBFSEM combina una variedad de métodos de tinción de metales pesados ​​encon el fin de mejorar la resolución y se basan en el método desarrollado previamente por Deerinck et al 40.
  7. Lavar los tejidos fijados con glutaraldehído 3 veces, 5 minutos cada uno en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,2).
  8. Preparar la solución de ácido tánico 0,1% por disolución de ácido tánico en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2). Agitar hasta que se disuelva y filtrar a través de 0,45 micras filtro, si es necesario.
  9. Postfix los tejidos con cacodilato tamponada 0,1% de ácido tánico por incubación en 1 ml de reactivo durante 30 - 60 min a TA.
    Nota: El tiempo de incubación depende del tamaño del tejido, pero 30 min funciona mejor para la mayoría de los tejidos.
  10. Lavar tejidos 3 veces, 5 min cada uno en tampón de cacodilato (pH 7,2).
  11. Disolver 0,3 g de ferrocianuro de potasio y 0,86 g cacodilato de sodio en 10 ml de H2O destilada (dH2O). Mantener la solución de ferrocianuro de potasio en hielo. Justo antes de su uso, añadir 10 ml de 4% tetróxido de osmio (OsO4).
  12. Teñir los tejidos con 2% de SGsolución de ferrocianuro-prima durante 90 minutos, en hielo. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O
  13. Preparar 1% tiocarbohidrazida solución (TCH) disolviendo 0,1 g de TCH en 10 ml de dH2O Disolver en 60 ° C por agitación cada 10 min hasta que esté completamente disuelto. Observar las precauciones de seguridad durante la manipulación de TCH, sobre todo tener cuidado de evitar el uso de los metales, el calentamiento a alta temperatura, o permitiendo que la solución se seque.
  14. Se tratan las muestras con 1% recién preparada TCH durante 20 min a RT. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O
  15. Diluir 4% OsO4 al 2% con dH 2 O, tejidos de manchas con 2% de tetróxido de osmio acuoso por incubación durante 1 hr. Lavar tejidos 3 veces, 5 minutos cada uno con dH2O
  16. Se incuban las muestras S / N en acetato de uranilo al 1% en H2O destilada a 4 ° C.
  17. Preparar la solución de aspartato ventaja de Walton (como se describe por Deerinck et al 40).
    1. Disolver 0,998 g L-aspartato en 250 ml de H2O destiladay luego añadir 10 N de hidróxido de potasio (KOH) de una manera gota a gota hasta que el pH alcanza 5,5. Después de ajuste del pH, añadir 0,066 g de nitrato de plomo en 10 ml aspártico Stock ácido y calor a 60 ° C durante 30 min.
  18. Enjuague tejidos en dH2O y se incuba con tinción aspartato ventaja de Walton durante 30 minutos en un horno a 60 ° C. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O
  19. Deshidratar muestras a través de una serie graduada de alcohol utilizando soluciones refrigerados de 20%, 50%, 75%, 85% y 95% de etanol durante 5 min cada uno, seguido de 100% de etanol 3 veces, 10 min cada uno.
    Nota: Utilizar el 100% de etanol de la botella recién abierta, como el etanol abierto absorbe el agua del aire y causar la incrustación a fallar. incubaciones más largas serán necesarias con muestras de tejido más grandes.
  20. muestras de lavado 2 veces, 15 minutos cada uno en óxido de propileno.
  21. Hacer resina plástica incrustación utilizando 25 ml de resina, 10,5 ml DDSA (dodecenilo anhídrido succínico), 15,5 ml NMA (anhídrido metil nádico) y 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Mezclar la resina por agitación. Giro y permitir que la resina reposar hasta que las burbujas de determinación.
    Nota: Esta es la receta estándar de dureza media. Otros tipos de microscopía de resina plástica electrónica (EM) se pueden utilizar, pero deben ser probados con una muestra de control no esenciales de antemano ya que no todas las resinas trabajan para SBFSEM.
  22. Incubar los tejidos O / N en un 50: Mezcla de 50 de óxido de propileno resina y la incorporación, en un vial que tiene un tope inicialmente, a continuación, sin tapar después de 2 hr de modo que el óxido de propileno se evapora durante el período de aproximadamente 8-10 horas.
  23. La transferencia de los tejidos a la resina de incrustación fresco 100% en viales limpios para 2 hr.
  24. Insertar en muestras de resina fresca, incrustación en moldes planos que contienen las etiquetas de papel impresos, y los cura en un horno a 60 ° C durante 48 horas. Después de aproximadamente 1 hora, revisar la colocación del tejido y la alineación de nuevo, y ajustar si es necesario.
  25. Recorte muestras para el área de interés y montar en un pin de aluminio utilizando Gelling pegamento de cianoacrilato o una resina epoxi conductora, a continuación, la capa con plata coloidal pasta alrededor de los lados del bloque para proporcionar un camino conductor a la clavija de aluminio.
  26. Examinar muestras de tejido utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa ultramicrotomo en la cámara y un detector de electrones retrodispersados ​​baja kV 32.
    Nota: Obtener la formación in situ instrumento- y en la microscopía electrónica de barrido (SEM) utilizar y convertirse en un usuario autorizado. Como alternativa, la colaboración con un centro investigador o núcleo de pequeños proyectos puede ser posible. la formación de radiación también puede ser necesaria como SEM generan rayos x.
  27. A la imagen de las muestras, utilice los siguientes valores: 2,25 kV, en el de 5 - 10 nm / píxeles de resolución, con tamaños de campo entre 80 - 250 micras en x, y (los tamaños posibles de otro campo), y un grosor de corte de 50 - 100 nm, con un total de 250 - 600 rebanadas en un 16 - período de tiempo de 20 horas.
    Nota: Los ajustes varían sustancialmente entre los diferentes microscopios, indimuestras indivi- y resolución deseada. Estos ajustes deben producir imágenes que son fácilmente interpretables para muchas muestras.

2. Analizar el conjunto de datos de imágenes

Nota: El software Image J / Fiji se utiliza para analizar el conjunto de datos y se basa en el plugin TrakEM2. pasos de preprocesamiento se pueden realizar usando una variedad de software, y pueden estar amplia o menor dependiendo del nivel de experiencia y las pilas obtenidas. Las principales transformaciones usando el software de código abierto (ver ImageJ 1.50b, FIJI Descargar 1 Oct, 2015) se describen aquí.

  1. Convertir imágenes en formato TIFF de 8 bits de las imágenes de 16 bits de propiedad originales mediante la apertura en el software y seleccionar elementos del menú Imagen → Tipo → 8 bits.
    1. Si la conversión automática de contraste / brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits, y la prensa de imagen → → Ajuste de brillo / contraste. Seleccionar un rango que funciona para todas las imágenes y pulse Aplicar. A continuación, realice cCONVERSIÓN. Nota: En algunos SEM, este paso puede requerir software del fabricante del microscopio.
    2. Si es necesario, debido al movimiento de la imagen inaceptable entre rebanadas (por ejemplo. La deriva debido a la carga), regístrese / alinear las pilas de imágenes (elementos de menú Plugins → → El registro lineal StackAlignmentWithSIFT). En la mayoría de software de registro, creado para el modo de "sólo la traducción" en lugar de "cuerpo rígido".
      Nota: Muchos enfoques y software pueden trabajar: el plug-in de registro de obras SIFT para muchas aplicaciones y existe una versión de pila virtual.
      1. Si es necesario, ampliar el tamaño del lienzo antes de la inscripción (Imagen → Ajustar → tamañolienzo) o reducirla a un área de interés (Imagen → Recortar).
        Nota: Puede producirse cierta deriva o ensanchamiento, y tratando otros plugins o software puede producir mejores resultados. Opciones manuales también están disponibles (por ejemplo. ImageJ / FIJI, Plugins → Registro → ManualLandmarkSelection).
    3. Si desired, imágenes en escala a un tamaño más pequeño, más manejable (por ejemplo. el 25%) utilizando ImageJ (Imagen → Escala).
  2. Iniciar el software, seleccione Archivo → Importar → secuencia de imágenes y luego seleccionar los archivos TIFF.
  3. Poner en marcha el plugin seleccionando Archivo → Nuevo → TrakEM2 (espacio en blanco). Dos ventanas se abrirán; uno maneja el proyecto y area_lists y el otro maneja el rastreo, y se conoce como el 'lienzo'.
  4. Cargar la pila de imagen en el plugin haciendo un clic derecho sobre la importación de lona. Seleccione importación y haga clic en la pila de importación. En las opciones de pop-up, marca la casilla de pilas virtuales.
    Nota: Aunque las pilas de imágenes ya están abiertas en el software, sino que también se deben abrir en el complemento. El equipo puede funcionar sin problemas si la caja de pilas virtuales está marcada.
  5. Después de los mipmaps se crean y se carga la pila, haga clic derecho de nombrar el proyecto bajo la ventana del plugin. Haga clic derecho sobre "nuevo proyecto» en la col plantillaUMN, y seleccione "añadir nuevo niño 'para ese proyecto. Haga clic derecho de nuevo para seleccionar 'area_list'.
  6. Establecer la escala del eje Z del proyecto de acuerdo con la configuración original micrografía electrónica haciendo clic derecho sobre el lienzo, a continuación, haga clic en la pantalla y seleccione la calibración. Además, ponga la Z escala mediante la selección de todas las capas en la ventana de plug-in, haga clic derecho para seleccionar la escala Z y grosor.
  7. Haga clic y arrastre el "proyecto" y los "niños" en el proyecto de sección para crear las «listas de la zona 'en la pestaña' espacio Z 'en la ventana de tela Objetos.
  8. Seleccione la 'lista de áreas' y haga clic derecho de seleccionar y establecer un color. Ahora, utilice la herramienta de pincel para trazar objetos tales como las mitocondrias, en las imágenes de micrografía electrónica. Uso 'Shift + clic' que rellenar un círculo cerrado, 'Ctrl + scroll' para acercar y alejar y, 'Alt + clic para hacer volver la pintura cursor del pincel en una goma de borrar.
  9. Seleccionar dos áreas de ~ 10 - 15 micrasUnos 10 - 15 micras en la esquina superior izquierda y la esquina inferior derecha de la imagen e identificar todas las mitocondrias dentro de estas áreas para permitir el muestreo no sesgado de las mitocondrias en cada conjunto de datos.
  10. En el 'lienzo', observar y rastrear las mitocondrias a través de las secciones. Nota: Las mitocondrias son orgánulos muy oscuros / densos que aparecen, de tamaño similar de diámetro y sin apretar cilíndricos. El crestas único formado por la membrana interna se distinguen fácilmente dentro de este orgánulo.
  11. Cuando haya terminado con el rastreo, haga clic derecho en el area_list bajo la etiqueta de espacio Z, seleccione 'Show en 3D'. Esto abrirá el plug-in visor 3D para ver una reconstrucción en 3D de la imagen trazada.
    1. Para realizar las mediciones de volumen mitocondrial, elija objeto en el visor 3D, haga clic en la pestaña 'Editar' y seleccione 'Propiedades de objeto'. La estimación del volumen mitocondrial aparece junto con varias otras mediciones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se demuestra que la morfología mitocondrial del cerebro y el tamaño es heterogénea en las diferentes sub-compartimentos neuronales. La microscopía confocal en cultivos neuronales de baja densidad transducidas con lentivirus que expresan la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente mostró que las mitocondrias que residen en el soma neuronal forman una red reticular, mientras que los que residen en las neuritas distales exhiben una morfología alargada discreta (Figura 1 AB). Utilizando la técnica de SBFSEM, la morfología mitocondrial, tamaño, volumen y distribución se analizaron en el cerebro del ratón. Tres (3D) imágenes tridimensionales de las mitocondrias fueron reconstruidos a partir de los dos neuritas y sinapsis en el hipocampo del cerebro del ratón. Se identificaron las mitocondrias presinápticos y el número de boutons presináptica que albergan las mitocondrias residentes cuantificados. La heterogeneidad en el tamaño de las mitocondrias se observó en el dendríticas frente compartimentos axonales (Figura 1 CD). Por otra parte, muchos pequeños compartimentos presináptica en el hipocampo del cerebro de ratones carecían de mitocondrias (Figura 2 AC). Las mediciones volumétricas de ambos mitocondrias presinápticos y extrasinápticos revelaron que el volumen o tamaño de las mitocondrias que residen dentro de los presynapses neuronal fue significativamente más pequeños que los que residen en la región extrasynaptic (Figura 2 DF). Curiosamente, los dos dimensiones (2D) la distribución del tamaño de las mitocondrias medidos a partir de un muestreo no sesgado de 200 mitocondrias no somáticos mostró que ~ 11% de la fracción mitocondrial se encuentra por debajo del límite de resolución del microscopio de luz (Figura 2G). Además, las imágenes 2D adquiridos por análisis SBFSEM proporcionan una mayor resolución para visualizar las características ultraestructurales de las mitocondrias individuales (Figura 3 AB). Debido a la topografía claramente visible del tejido, es posible además clasificar el borrador celularartamento de las mitocondrias mediante la determinación de su proximidad a estructuras fácilmente identificables como núcleo (somática) y las vesículas sinápticas (presináptico) (Figura 3) AB. Con el fin de identificar las mitocondrias presentes en los procesos neuronales, reconstruir el proceso individual como axón o la dendrita en base a la presencia o ausencia de boutons presináptica respectivamente 42. Basándose en estos resultados, proponemos que SBFSEM es una técnica analítica extremadamente valiosa para identificar la forma mitocondrial, tamaño, número y distribución en el tejido cerebral y que cualquier defecto brutos en la estructura y la distribución mitocondrial también se pueden determinar usando este método. Dado que las características ultraestructurales de diferentes tipos de células en el cerebro son distintos, por ejemplo. presencia de gránulos de glucógeno en los astrocitos, también es posible analizar las diferencias de células de tipo específico en las mitocondrias cerebrales.

Figura 1 Figura 1:. La heterogeneidad en Neuronal mitocondrial morfología y distribución de cultivos corticales postnatal día 1 crías de ratón fueron transducidas con lentivirus que expresan la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (mito-GFP). (A) muestra soma neuronal que expresa Mito-GFP, tenga en cuenta la red reticulada de la morfología mitocondrial; Nu = núcleo; barra de escala = 5 micras. (B) muestra la morfología mitocondrial alargado en neuritas distal; barra de escala = 5 micras. Representante imagen 2D a partir del conjunto de datos SBFSEM generado a partir del tejido cerebral del ratón (C), las mitocondrias son teñidas en verde, las dendritas se tiñen de azul y varices axonal se tiñen de marrón; barra de escala = 1 m. (D) reconstrucciones en 3D de las mitocondrias en las neuritas de tejido cerebral del ratón, tenga en cuenta la diferencia de tamaño entre dendríticas y indicat mitocondria axonalcado por grandes y pequeños de punta de flecha, respectivamente; barra de escala = 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Bloque cara Serial Microscopía Electrónica de Barrido (SBFSEM) análisis reveló baja abundancia de mitocondrias en los terminales presinápticos (A) ultramicrograph Representante 2D a partir del análisis conjunto de datos SBFSEM obtenido del hipocampo de ratones de tipo salvaje P15;. barra de escala = 1 m. (B) Muestra la reconstrucción 3D de 10 terminales nerviosas presinápticas. Tenga en cuenta que sólo 4 de cada 10 terminales presinápticos mostraron mitocondrias perceptible; barra de escala = 1 m. (C) Gráfico de barras que muestra la cuantificación de 173 reconstruye los terminales nerviosos presinápticos de la SBEl análisis conjunto de datos FSEM. Representante imagen 2D del conjunto de datos que muestra la mitocondria SBFSEM extrasináptico en las mitocondrias de color azul y verde en presináptica (D); barra de escala = 1 m. (E) reconstrucciones en 3D de las mitocondrias presináptica y extrasináptico del conjunto de datos SBFSEM el uso del software; barra de escala = 1 m. Gráfico (F) de barras que muestra el volumen de las mitocondrias y extrasinápticos presináptica. Los datos se representan como media ± SEM; n = 3 conjuntos de datos diferentes (incluye 62 mitocondrias presináptica y 80 mitocondrias extrasinápticos en total); * Representa el valor de p = 0,0405. (G) Un área de 15 por 15 micras en las cuatro esquinas de las imágenes fueron marcados y se identificaron todas las mitocondrias no somáticas para permitir un muestreo aleatorio. Se midió la dimensión mínima de ~ 200 mitocondrias. Pie gráfico muestra que ~ 11% de las mitocondrias no somáticos fueron <200 nm de dimensión que está por debajo del límite de resolución del microscopio óptico. Esta figura tiene been una adaptación de Chavan et al 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: 2D SBFSEM Las imágenes de la geniculado lateral Núcleos de cerebro de ratón (A) imagen bidimensional SBFSEM representante de los núcleo geniculado lateral (8/8 micras) que demuestran una topografía detallada de la región.. Soma y el núcleo se indican; barra de escala = 2 micras. (B) Una ampliación del área indicada por el cuadrado rojo en el panel A. Tenga en cuenta que las membranas externa e interna de las mitocondrias, así como la formación de crestas son claramente visibles. También se observa la topografía y las relaciones con otros orgánulos y estructura celular. PS indica ejemplo de las mitocondrias presinápticay NS indica ejemplo de no-sináptica (NS) mitocondrias somática; barra de escala = 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La complejidad del sistema nervioso plantea un reto importante en la reconstrucción de volúmenes de tejido grandes y el análisis de la morfología y distribución de los orgánulos tales como mitocondrias con una resolución adecuada. Varias células, incluyendo neuronas, oligodendrocitos y astrocitos con numerosos procesos extendidos en tres dimensiones interactúan dentro del tejido cerebral 43. Dado que las mitocondrias reside tanto en el soma de las células y los procesos distantes, la morfología mitocondrial es extremadamente pleomórfico en el sistema nervioso (Figura 1). Información estructural 3D adecuado, con suficiente resolución, por tanto, no puede ser adquirido mediante técnicas de microscopía de luz convencionales, tales como confocal o microscopía de dos fotones 44,45. La microscopía electrónica es la técnica sólo actualmente disponible que permite la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido neural con una resolución suficientemente alta. Tradicionalmente, la reconstrucción 3D de tejido neural que se haya logradod por microscopía de transmisión serie de la sección de electrones (sstem) de 29 cortes ultrafinos. Sin embargo, los recientes avances tecnológicos han mejorado la calidad de adquisición de datos de microscopía electrónica de volumen y la automatización.

SBFSEM es una técnica de imagen de bloque cara automatizado que combina seccionamiento en serie dentro de la cámara de un microscopio electrónico de barrido, con el fin de reconstruir la estructura del tejido 3D a través de cientos de micrómetros, con una resolución que es suficiente para seguir los procesos celulares más delgados e identificar pequeños orgánulos . Esta técnica se ha abierto la posibilidad de reconstruir los sistemas de forma rutinaria tanto nervioso de vertebrados e invertebrados. Se trata de múltiples etapas que incluyen la preparación de muestras, la operación microscopio electrónico de barrido, la adquisición de datos, la imagen post-procesamiento y análisis de imágenes. Estos procedimientos requieren una formación práctica y certificación para la operación microscopio electrónico de barrido especializados. Hay tres factores que son críticoAl decir. disección de la región anatómica correcta del cerebro, la obtención de imágenes de alta resolución, y la realización de análisis de imagen adecuada. Después de la disección de la región anatómica de interés de la rebanada vibratome del tejido cerebral fijo, es crucial para tomar la fotografía para preservar la orientación adecuada. De otro modo, puede ser difícil determinar el sitio correcto para la imagen. La obtención de imágenes de alta resolución depende de una adecuada fijación y los procedimientos adecuados de tinción posterior a la fijación. El cerebro tiende a sufrir un rápido deterioro en su ultraestructura después de la muerte. Por lo tanto, es crítico para fijar el cerebro en una solución de glutaraldehído utilizando el método de perfusión transcardial adecuada. Esto debe ser seguido por más de fijación del cerebro en solución de glutaraldehído durante al menos 24 h. Dado que la resolución de la imagen es completamente dependiente de la combinación de una variedad de métodos de tinción de metales pesados, es fundamental para seguir el método de post-fijación como se detalla en el protocolo para adquirir quantifiable imágenes. Las soluciones deben ser hechas como se describe en los métodos. Por último, para el análisis de la imagen exacta del orgánulo / s para ser analizados se debe identificar de forma inequívoca (por ejemplo. Mediante la visualización de las características ultraestructurales) antes de la localización, y las directrices de software debe respetarse escrupulosamente. La resolución de las imágenes adquiridas debe ser conocido para la conversión de píxeles de nanómetros para mediciones volumétricas.

Además del software que se describe en el protocolo para la realización de análisis de imágenes, también se puede utilizar de otro software disponible como Reconstruir y Cnosos. Aunque el énfasis del protocolo descrito es sobre la visualización de las mitocondrias en el sistema nervioso, puede ser modificado para generar información de alta resolución 3D en varias otras estructuras subcelulares (retículo endoplásmico por ejemplo., Lisosomas etc.) En una variedad de tejidos.

Mientras que una guía de solución de problemas detallada de microscopio electrónico de barrido operación está más allá del alcance de este artículo (véase el manual de usuario del instrumento de formación e información), algunos problemas habitualmente se producen durante los experimentos de imagen y la comprensión de cómo solucionar ellos pueden ayudar a los nuevos usuarios o los que la obtención de imágenes a través de fuentes comerciales de colaboración /. Un problema común está cargando de la muestra que se encuentra principalmente en las regiones de resinas que contienen poco o ningún material teñido. En una "positiva" de la imagen (es decir. Citosol muestra en blanco), los núcleos, los vasos sanguíneos y las extensiones de resina vacías pueden aparecer "ennegrecido". Además, la carga también promueve la deriva haz locales que resulta en la deformación aparente imagen. Las posibles soluciones varían entre los instrumentos y muestras. La reducción de la configuración kV reduce el artefacto "ennegrecimiento", pero puede promover más la deriva del haz. Utilizando un modo de vacío inferior, e incluyendo nitrógeno (N 2) de gas, vapor de agua, etc. en la cámara que también reduce la carga, pero a un costo sustancial de la resolución y signarelación de l-ruido. Un segundo problema común es la omisión de cuchillo. De exploración más lenta puede causar daño inducido haz a la superficie del bloque, que corta de manera desigual o no en absoluto por alguna de formación de imágenes / ciclos de corte (es decir. Imágenes sucesivas aparece el mismo). Varias soluciones existir incluyendo el aumento del grosor de la profundidad de corte / rebanada con una menor resolución Z, aumentando la velocidad de exploración y aceptar consecuentemente imágenes ruidosas, la reducción de tamaño de píxel y la aceptación más baja x / y resolución, y la elección de las muestras o áreas con tinción más intensa (como mal áreas teñidas cobran más, el daño más fácilmente, y requieren la exposición de haz más tiempo para obtener imágenes con aceptable señal -ruido proporciones). redeposición escombros en el bloque de cara es una fuente ocasional de artefacto en las imágenes, y si esto ocurre con frecuencia que puede requerir una pausa de la adquisición, y limpiando cuidadosamente el (aire soplado) cuchillo, o retrimming la muestra a un tamaño más pequeño. Bloque cara de carga también promueve la re-deposición, y los pasos anteriores puedeayuda. La corrección de enfoque y stigmation también puede ser necesaria ya que las muestras imágenes de microscopio de forma continua durante muchas horas a la semana, tiempo durante el cual la profundidad de vacío se incrementa en la cámara, que requieren stigmation correcciones. Cada microscopio electrónico de barrido difiere según la edad y características, y la experiencia es la mejor guía. dramáticos cambios repentinos en stigmation o el enfoque pueden ocurrir cuando el material seccionado se adhiere a los componentes de imagen de microscopio. La cámara debe ser abierta y material cuidadosamente desalojado a través del vacío o nitrógeno comprimido. Esto requiere absolutamente la formación especializada.

Hay algunas desventajas de la tecnología SBFSEM con respecto a su utilidad en el análisis de las mitocondrias cerebrales. Una desventaja importante, común a todos microscopía de tejidos fijados, es que proporciona imágenes estáticas de un orgánulo extremadamente dinámico. Las mitocondrias se someten a ciclos de fisión y fusión continuas 26, son móviles y tráfico a lo largo de la neurite procesos 21. Los defectos en el tráfico mitocondrial y dinámicas que no son puramente numérica o estructural puede ser fácilmente perdido por este enfoque, aunque, mirando el número de mitocondrias en un espacio anatómico definido como presinapsis se puede interpretar si el transporte de las mitocondrias puede ser modificada 39 . Una segunda desventaja es que se lleva a cabo sólo en una pequeña parte del cerebro, por lo tanto, la circuitería defectos específicos en la distribución mitocondrial puede perder. Correlativa aproxima 28,46 permitirse la oportunidad de combinar la imagen confocal multifotónica y con la tecnología SBFSEM para generar tanto los datos moleculares y ultraestructurales. Para el análisis mitocondrial, por lo tanto, puede ser útil para realizar la SBFSEM después de un examen microscópico de luz de las secciones del cerebro ya sea usando el anticuerpo específico de antígeno mitocondrial o mediante el uso de un transgén que expresa orientado mitocondrialmente-proteína fluorescente. este combinatioestrategia final puede proporcionar una metodología sólida para identificar defectos mitocondriales en modelos de ratón de trastornos neurológicos y mitocondrial.

También hay limitaciones técnicas comunes a muchas formas de microscopía electrónica debido al uso de fijadores duras, tinción de metales pesados ​​y la penetración desigual de los productos químicos. Otras limitaciones pueden provenir de la incrustación de plástico de muestras de tejido. Regiones vacías de resina y estructuras escasamente teñidas retienen los electrones durante la formación de imágenes, haciendo que de deflexión de haz y la deriva (warping imagen) así como las señales de carga de artefactos (por ejemplo. Los núcleos oscuros y los vasos sanguíneos de lumen), que tanto inciden en resolución. Beam daños a la resina también promueve corte desigual, y por esta razón, las imágenes requiere típicamente rebanadas de 50 - 100 nm a cortar desde el bloque de cara, produciendo voxels no isotrophic en los conjuntos de datos. Otras limitaciones para algunas aplicaciones incluyen que las secciones son destruidos y no pueden ser reexaminadas posteriormente,que pueden obligar a los usuarios para recoger imágenes de alta resolución de zonas que podrían no contener datos útiles.

Una ventaja importante de SBFSEM es que automatiza el proceso de seccionamiento y la formación de imágenes bloques de tejido mediante la incorporación de un microtomo personalizado en un vacío bajo cámara de SEM 32,33. Dado que las imágenes se obtienen directamente desde el bloque de cara antes de cada corte, se evitan sustancialmente los problemas de la sección de formación de arrugas, la compresión y la pérdida durante el manejo, aunque la deposición de los residuos y la deformación de carga debido a bloquear cara no contribuir a una cierta pérdida de imagen y la distorsión . Además, las imágenes obtenidas en los conjuntos de datos primas ya están alineados y sólo requieren registro micrómetro escala para acomodar la deriva de haz con el fin de ser susceptibles de más análisis. Debido al proceso de corte automatizado, una vez que el vacío del sistema se ha estabilizado, grandes volúmenes de tejido se pueden obtener imágenes sin la participación por parte del operador. Existen múltiples ventajas de utilizar estela tecnología en la realización de estudios morfológicos y cuantitativos sobre los orgánulos y las estructuras intracelulares. Una de las ventajas es conseguir la información sobre la estructura 3D de las mitocondrias dentro de un período razonable de tiempo. La disponibilidad de paquetes de software de reconstrucción de código abierto como Reconstruir 47, 48 y TrakEM Knossos 49-51 han hecho que esta tecnología una poderosa herramienta analítica donde ultraestructura detallada 3D de la red neuronal en modelos animales experimentales se pueden comparar directamente. El análisis de imágenes semiautomático y completamente automatizado se acerca 52 son susceptibles de producir datos altamente mecanicistas en animales donde se espera que la morfología mitocondrial, la función y / o la biogénesis de ser afectados. SBFSEM análisis anterior se vio obstaculizado en gran medida debido a una resolución más baja, sin embargo las técnicas de preparación de muestras más recientes que implican métodos de tinción mejoradas 40 han mejorado considerablemente la resolución hasta el punto de que incluso una sola v sinápticaesicle se puede resolver fácilmente. En este resolución defectos ultraestructurales en las mitocondrias tales como vacuolización, disrupción de la membrana, y la pérdida de crestas se pueden observar fácilmente, y la distribución de las mitocondrias defectuosas dentro de las células se pueden determinar 38,39. La alta resolución de esta técnica proporciona una gran ventaja sobre la microscopía de luz donde la resolución se limita a ~ 200 nm en el eje XY y ~ 500 nm en el eje Z. Las mitocondrias son, por tanto, justo en el límite de resolución de la microscopía de luz 53. Aunque las mitocondrias tienen dimensiones por debajo del límite de resolución todavía pueden ser visualizadas por microscopía de luz, sus dimensiones no pueden ser medidos de forma fiable. Es importante destacar que las mitocondrias que están separados por una distancia menor que el límite de resolución de un microscopio de luz no pueden ser resueltos por microscopía de luz. Otra ventaja es que el análisis estructural mitocondrial puede realizarse en el contexto de los tejidos, sin aislamiento del orgánulo. Esta lata albaja para las comparaciones apropiadas dentro del tejido en base a la localización mitocondrial, por ejemplo axonal vs. somática y / o mitocondrias dendríticas. Una ventaja adicional es que por lo general es posible determinar si las mitocondrias son neuronal o neuroglial en la localización siguiendo los procesos a un orgánulo definir, tales como filamentos gliales y glucógeno para astrocitos o mielina de oligodendrocitos. Los procesos de las neuronas y las células neurogliales son a menudo en estrecha proximidad, y con 2D se acerca como TEM puede ser difícil asignar con confianza el que los procesos son neuronal y que son neuroglial.

En conclusión, la tecnología SBFSEM ofrece pilas de imágenes en serie que cubren zonas de tejido 20 - 1000 micras de tamaño con la resolución ultraestructural de 5 a 10 nm o superior, lo que permite que las células enteras del sistema nervioso central y orgánulos tales como mitocondrias en ser fotografiado, medido y reconstruido . En el presente trabajo, hemos proprovisto algunos enfoques prácticos para hacer uso de esta tecnología. Las futuras aplicaciones incluyen el análisis de la estructura mitocondrial y distribución en una variedad de modelos animales de enfermedades neurológicas tales como modelos de la enfermedad del desarrollo neurológico y neurodegenerativas, así como el análisis de los diversos ultraestructuras subcelulares tales como retículo endoplasmático, el núcleo y / o los lisosomas en las células enteras o tejidos bajo sano y estados de enfermedad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Neurociencia No. 113 SBFSEM las mitocondrias la fosforilación oxidativa cerebro sinapsis la reconstrucción 3D
Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter