Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse af Brain mitokondrier Brug Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

Menneskelige hjerne er en høj energiforbrugende organ, der hovedsagelig er afhængig af glucose som en brændstofkilde. Glucose kataboliseres af hjernen mitokondrier via glycolyse, tri-carboxylsyre (TCA) cyklussen og oxidativ phosphorylering (OXPHOS) baner til at producere cellulær energi i form af adenosintriphosphat (ATP). Nedskrivning af mitokondrie ATP produktion forårsager mitochondriale lidelser, der udgør klinisk med prominente neurologiske og myopatiske symptomer. Mitokondriske defekter er også til stede i neurologiske forstyrrelser (f.eks autisme spektrum forstyrrelse) og neurodegenerative lidelser (f.eks amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers og Parkinsons sygdomme). Således er der en øget interesse inden for udførelse af 3D-analyse af mitokondrie morfologi, struktur og fordeling under både raske og sygdomstilstande. Hjernen mitokondrie morfologi er meget forskelligartet, med nogle mitokondrier især dem iden synaptiske region er i området på <200 nm diameter, hvilket er under opløsning grænse på traditionel lysmikroskopi. Udtrykker et mod mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) i hjernen forbedrer signifikant den organellar detektion ved konfokal mikroskopi. Det gør dog ikke overvinde begrænsninger på følsomheden af ​​påvisning af relativt lille størrelse mitokondrier uden oversaturating billeder af store mellemstore mitokondrier. Mens seriel transmission elektronmikroskopi er blevet anvendt til at karakterisere mitokondrier ved neuronal synapse er denne teknik meget tidskrævende, især når man sammenligner flere prøver. Det serielle blok-face scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknik indebærer en automatiseret proces med sektionering, imaging blokke af væv og data erhvervelse. Her giver vi en protokol til at udføre SBFSEM af et defineret område fra gnavere hjernen til hurtigt rekonstruere og visualisere mitokondrie morfologi. Denne technique kunne også bruges til at give nøjagtige oplysninger om mitokondrie nummer, volumen, størrelse og fordeling i et afgrænset område af hjernen. Da det opnåede billedopløsning er høj (typisk under 10 nm) kan også påvist grove mitokondriske morfologiske defekter.

Introduction

Mitokondrier er dynamiske organeller, som ændrer deres form og placering afhængig af de cellulære signaler og behov, i tæt interaktion med cellecytoskelettet, og som svar på cellulære begivenheder såsom calcium- strømme i neuroner 1. Mitokondrier også interagere med andre cellulære organeller fx endoplasmatisk reticulum, hvilket igen regulerer deres dynamik og stofskifte 2. Mitokondrie morfologi viser heterogenitet i forskellige celletyper ie. formen af organel varierer fra rørformet til, at der består af plader, sække og ovaler 3. Det er blevet vist, at mitokondrielle fusion og fission cyklus proteiner kan regulere placeringen, størrelsen, formen og fordelingen af mitokondrier 4. Endvidere er ændringer i mitokondrie formen er forbundet med neurodegeneration, neuronal plasticitet, muskelatrofi, calcium signalering, reaktive oxygenspecies generation samt levetid og celledød implicerer thaT-celle-specifik mitokondrie morfologi er kritisk for opretholdelse af normal cellulær funktion 5-11.

En væsentlig bioenergetic funktion af mitokondrier er at generere adenosintriphosphat (ATP) ved at udføre en serie metaboliske reaktioner, der involverer fuldstændig nedbrydning af næringsstoffer (dvs. glucose, fedt-syrer eller aminosyrer) via TCA-cyklus og OXPHOS Pathways 12. Den menneskelige hjerne udgør kun 2% af kropsvægten men det forbruger ~ 20% af den samlede energi, der produceres gør det til en yderst energikrævende organ 13. Det er derfor ikke overraskende, at mitokondriel dysfunktion hos mennesker fører til et stort antal neurologiske manifestationer 14-17. Genetiske mutationer i OXPHOS komponenter, der forringer ATP generation fører til mitochondriale lidelser 17,18, som er klinisk heterogen gruppe af sygdomme med en prævalens på ~ 1: 5.000 individer, og en af de mest almindelige årsag til metabolic lidelser hos børn og voksne. Underskud af mitokondrier-afledt ATP påvirker flere organsystemer med høj energi krævende organer såsom hjerne, hjerte og skeletmuskulatur bliver overvejende påvirket i disse patienter 14,17,18. I de senere år har flere undersøgelser fremlagt beviser for mitokondriel dysfunktion i både neurologiske og neurodegenerative sygdomme 15-17,19,20. Da mitokondrier er afgørende og kritisk for hjernens udvikling og funktion, er det bydende nødvendigt at udvikle protokoller, der kan analysere ændringer i hjernens mitokondrie morfologi, struktur, størrelse, antal og fordeling under både raske og syge tilstande. Musemodeller med mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) er fremstillet til at visualisere mitokondrie bevægelser og lokalisering i hjernen 21,22. Mens dette er et yderst nyttigt værktøj til at undersøge mitokondrie motilitet og generel fordeling, der er nogle ulemper, som omfatter en indee begrænset opløsning og følsomhed fluorescensmikroskopi. Disse egenskaber gør det vanskeligt at spore de relativt lille størrelse mitokondrier. Tilsvarende har seriel transmission elektronmikroskopi med held blevet anvendt til at se synaptisk mitokondrier 23, men denne metode er meget tidskrævende. Mitokondrie morfologi er kendt for at være meget dynamisk som de undergår kontinuerlig fission og fusion cyklusser, og i de fleste celler mitokondrier opretholde et højt tilsluttet netværk 24-26. Neuroner er stærkt polariserede celler med flere dendritter og udvidede axoner, og mitokondrier, der danner et tilsluttet retikulære netværk i cellen organ kan nødt til at adskille som de gør deres vej gennem disse neuritter (figur 1). Dette gør hjernen mitokondrier yderst varierede i størrelse og form. For eksempel ved anvendelse seriel blok-face scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknik, vi tidligere observeret, at forskellen i volumen eller størrelsen af ​​ekstrasynaptiske mitochondrIA til mitokondrier til stede i nerveender kan være så meget som seksten fold 27.

Der er flere muligheder for at udføre volumen analyser 28, som omfatter seriel sektion TEM 29, automatiseret tape indsamling ultramikrotom SEM 30, fokuseret ionstråle SEM 31, og SBFSEM 32. Den SBFSEM analysen har fordele i, at det har opløsningen til at give kvantitative oplysninger om den morfologiske form, størrelse, fordelingen og antallet af organeller såsom mitokondrier i områder op til 1 mm i hjernen. Den tekniske drift er også den mindst krævende, med dataopsamling og analyse inden for kapaciteter af mange biologiske laboratorier, der mangler tidligere EM oplevelse. Fremkomsten af kommercielle instrumenter til frembringelse serielle sektion-lignende billeder har gjort 3D ultrastrukturelle analyse af væv en rutinemæssig teknik, hvilket yderligere tillader en unbiased volumetrisk analyse på en hurtig og reproducerbar måde 28 32, baseret på en idé introduceret af Leighton i 1981 33. Flere undersøgelser har siden etableret denne teknik som et vigtigt redskab i genopbygningen analyse af neuronal kredsløb 34. Desuden er der for mange mindre projekter, det giver genopbygning analyse for at identificere cellulære organeller 27,35-39. Da er de erhvervede billeder stammer fra lav spænding tilbage scatter elektroner blev nye farvningsprotokoller som kombinerer forskellige kendte heavy metal farvningsteknikker udviklet til at øge opløsningen 40.

I dette papir, giver vi en protokol for at udnytte 3D-elektronmikroskopi billeddannelse og volumetrisk analyse af hjernens mitokondrier baseret på metoder, der tidligere har været anvendt af os og andre 38,39,41. De væv efterbehandling metoder blev som tidligere beskrevet af Deerinck et al40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Virginia Tech.

Advarsel: Der skal træffes ekstreme forholdsregler ved håndtering og bortskaffelse flere komponenter, der anvendes i denne protokol. Før brug, skal den lokale institutionelle retningslinier samt sundhed og sikkerhed praksis etableres og følges, især for osmiumtetroxid, som er flygtige og ekstremt giftige, uranylacetat, som både er et tungmetal og kilde til radioaktivitet, og bly nitrat, som er et tungmetal gift. Thiocarbohydrazide (TCH) kan nedbrydes til at producere eksplosive og giftige gasser, hvis forkert håndteres. Mange institutioner vil have en EM core facilitet, hvor disse reagenser rutinemæssigt udnyttet, og kan yde bistand.

1. Forberedelse af hjernevæv og SBFSEM Imaging

  1. Bedøver en ung (~ 2 - 4 måneder gammel) C57 sort mus (C57BL / 6J-stammen) anvendelse af 4 - 5% isoflurane efter de institutionelle retningslinjer. Bekræft bedøvelse ved at overvåge tab af muskeltonus, mangel på frivillige bevægelser og reaktioner på uvilje stimuli som en hale knivspids.
  2. Pin musen på en dissektion bakke og lave et snit på huden langs ventrale midterlinjen. Foretage yderligere indsnit i huden for at blotlægge brystkassen af ​​musen. Incise mellemgulvet, og forsigtigt dissekere ud brysthulen langs periferien for at eksponere det bankende hjerte, og derefter foretage et snit i højre atrium.
  3. Ved hjælp af en sommerfugl kanyle, kanyle i venstre ventrikel. Perfundere musen transkardialt anvendelse af 10 - 20 ml phosphatbuffer saltvand (PBS) pH 7,2, indtil forblødning bekræftes af en ændring i farven af ​​leveren.
    Bemærk: En ændring i farven på leveren bruges som en guide til at bestemme omfanget af forblødning. Kontroller, at leveren farveændringer fra rødbrun til svagt rosa.
  4. Perfundere musen transkardialt anvendelse af 10 - 20 ml 2% glutaraldehyd og 4% paraformaldehyd lavet i 0,10 M cacodylatbuffer (pH 7,2), at fastsætte hjernevævet hurtigt indefra. Fiksering overvåges ved at observere halen afstivende.
    Bemærk: Der fremstilles 0,10 M cacodylatbuffer (pH 7,2) ved opløsning 2,14 g natriumcacodylat i 80 ml vand, tilsæt saltsyre til indstilling af pH, og et rumfang til 100 ml med vand.
  5. Efter perfusion, halshugge musen, dissekere hjernen, efterfulgt af fiksering i 0,10 M natriumcacodylat-buffer (pH 7,2) indeholdende 2% glutaraldehyd og 4% paraformaldehyd i 48 timer ved 4 ° C.
  6. Efter 48 timers gøre 400 um kranssektioner bruger vibratome og derefter forsigtigt dissekere området af interesse i hjernen (f.eks hippocampus) under dissektion mikroskop 42. trim forsigtigt vævet og tage et billede for at bevare orientering.
    Bemærk: Indlæg forarbejdningsmetoder væv farvning i SBFSEM kombinerer en række heavy metal farvning metoderFor at forbedre opløsning og er baseret på den metode, der tidligere er udviklet af Deerinck et al 40.
  7. Vask glutaraldehyd-fikserede væv 3 gange, 5 minutter hver i 0,1 M cacodylatbuffer (pH 7,2).
  8. Forbered 0,1% garvesyre opløsning ved opløsning garvesyre i 0,1 M natriumcacodylat-buffer (pH 7,2). Swirl indtil opløsning og filtreres gennem 0,45 um filter, hvis det er nødvendigt.
  9. Postfix vævene med cacodylat pufret 0,1% garvesyre ved inkubation i 1 ml reagens i 30 - 60 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: Inkubationstiden er afhængig af væv størrelse, men 30 min fungerer bedst for de fleste væv.
  10. Vask væv 3 gange, 5 minutter hver i cacodylatbuffer (pH 7,2).
  11. Opløs 0,3 g kaliumferrocyanid og 0,86 g natriumcacodylat i 10 ml destilleret H2O (DH 2 O). Hold kaliumferrocyanid løsning på is. Lige før anvendelse, tilsættes 10 ml 4% osmiumtetroxid (OsO4).
  12. Farv væv med 2% osmium-ferrocyanid løsning i 90 minutter på is. Vask 3 gange, 5 min hver i dH 2 O.
  13. Forbered 1% thiocarbohydrazide (TCH) løsning ved at opløse 0,1 g TCH i 10 ml dH 2 O. Opløses ved 60 ° C ved omrystning hver 10 min, indtil fuldt opløst. Overhold sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering TCH, især sørge for at undgå brug af metaller, opvarmning til høj temperatur, eller tillade løsning til at tørre ud.
  14. Behandl prøverne med frisk fremstillet 1% TCH i 20 minutter ved stuetemperatur. Vask 3 gange, 5 min hver i dH 2 O.
  15. Fortynd 4% Oso 4 til 2% med dH 2 O, bejdse væv med 2% vandig osmiumtetroxid ved inkubation i 1 time. Vask væv 3 gange, 5 min hver med dH 2 O.
  16. Inkuber prøverne O / N i 1% uranylacetat i dH 2 O ved 4 ° C.
  17. Forbered Walton føring aspartat opløsning (som beskrevet af Deerinck et al 40).
    1. Opløs 0,998 g L-aspartat i 250 ml dH2Oog derefter tilsættes 10 N kaliumhydroxid (KOH) dråbevis, indtil pH når 5,5. Efter justering af pH tilsættes 0,066 g bly nitrat i 10 ml asparaginsyre lager og opvarm til 60 ° C i 30 minutter.
  18. Skyl væv i dH2O og inkuberes med Walton føring aspartat plet i 30 minutter i en 60 ° C varm ovn. Vask 3 gange, 5 min hver i dH 2 O.
  19. Dehydrere prøver gennem en gradueret række af alkohol ved anvendelse kølede opløsninger af 20%, 50%, 75%, 85% og 95% ethanol i 5 minutter hver, efterfulgt af 100% ethanol 3 gange, 10 minutter hver.
    Bemærk: Brug 100% ethanol fra frisk åbnet flaske, som åbnede ethanol absorberer vand fra luften og forårsage indlejring til at mislykkes. Længere inkubationer vil være nødvendigt med større vævsprøver.
  20. Vask prøver 2 gange, 15 min hver i propylenoxid.
  21. Gøre plastik indlejring harpiks ved anvendelse af 25 ml harpiks, 10,5 ml DDSA (dodecenyl ravsyreanhydrid), 15,5 ml NMA (nadic methyl anhydrid) og 1 mlDMP-30 (2,4,6-tris dimethylaminomethyl phenol). Bland harpiksen ved rystning. Spin og tillade harpiksen at stå indtil bobler beslutsomhed.
    Bemærk: Dette er standard medium hårdhed opskrift. Der kan anvendes andre typer af elektronmikroskopi (EM) plast harpiks, men bør testes med en ikke-essentiel kontrolprøve i forvejen som ikke alle harpiks arbejde for SBFSEM.
  22. Inkuber vævene O / N i en 50: 50 blanding af indlejring harpiks og propylenoxid, i et hætteglas, der er udjævnet, dernæst ikke-reducerede efter 2 timer, således at propylenoxid fordamper i perioden på ca. 8 - 10 timer.
  23. Overfør vævene til 100% frisk indlejring harpiks i rene hætteglas i 2 timer.
  24. Integrer prøver i frisk indlejring harpiks, i flade forme indeholder trykte papiretiketter, og helbrede dem i en ovn ved 60 ° C i 48 timer. Efter ca. 1 time, tjek vævet placering og tilpasning igen, og om nødvendigt justere.
  25. Trim prøver til området af interesse og montere på en aluminium pin hjælp gelling cyanoacrylat superlim eller en ledende epoxyharpiks, smøre med kolloidt sølv indsæt omkring siderne af blokken for at tilvejebringe en ledende vej til aluminium pin.
  26. Undersøge vævsprøver under anvendelse af et scanningselektronmikroskop, der er udstyret med en in-kammer ultramikrotom fase og lav kV tilbagekastet elektron detektor 32.
    Bemærk: Få instrumentspecifikke og site-uddannelse i scanning elektronmikroskopi (SEM) anvende og blive en autoriseret bruger. Alternativt kan samarbejde med en forsker eller core facilitet for små projekter være muligt. Stråling uddannelse kan også være påkrævet som SEMs genererer røntgenstråler.
  27. Til billedet prøverne, skal du bruge følgende indstillinger: 2,25 kV, 5 - 10 nm / pixel opløsning, med markstørrelser mellem 80-250 um i x, y (andet felt størrelser muligt) og skive tykkelse på 50 - 100 nm, med i alt 250 - 600 skiver i en 16 - 20 timer tidsperiode.
    Bemærk: Indstillinger varierer betydeligt mellem forskellige mikroskoper, indiduelle prøver, og ønskede opløsning. Disse indstillinger skal producere billeder, der er let tolkes i mange prøver.

2. Analysere Imaging Datasæt

Bemærk: Image J / Fiji software bruges til at analysere datasæt og er afhængig af TrakEM2 plugin. kan udføres forbehandlingstrin anvendelse af en række af software, og kan være omfattende eller mindre afhængig af erfaring niveau og stablerne opnået. De vigtigste forandringer ved hjælp af open source-software (ImageJ ver 1.50b, FIJI hente 1 oktober 2015) er beskrevet her.

  1. Konverter billeder til 8 bit tiff-format fra de originale proprietære 16-bit billeder ved at åbne i softwaren og valg af menupunkter billede → Type → 8 bit.
    1. Hvis automatisk kontrast / lysstyrke konvertering under dette trin er ikke ideel til billeder, genåbne 16-bit-billeder, og tryk på billede → Juster → Lysstyrke / Kontrast. Vælg et område, der virker for alle billeder, og tryk på Anvend. Udfør derefter conversion. Bemærk: På nogle SEMs kan dette trin kræver mikroskop producent software.
    2. Hvis det er nødvendigt, på grund af billedet uacceptabel bevægelse mellem skiver (f.eks. Afdrift på grund af opladning), registrere / justere billedet stakke (menupunkter Plugins → Registrering → ​​Linear StackAlignmentWithSIFT). I de fleste registrering software, indstillet til "oversættelse kun" mode snarere end "stift legeme".
      Bemærk: Mange tilgange og software kan arbejde: de SIFT registrering plug-in-værker for mange applikationer, og der er en virtuel stak version.
      1. Hvis det er nødvendigt, forstørre lærredet størrelse før registrering (Billede → Juster → canvassize) eller reducere den til et område af interesse (Billede → Beskær).
        Bemærk: Der kan forekomme nogle afdrift eller splaying, og forsøger andre plugins eller software kan give bedre resultater. Manuelle indstillinger er også tilgængelige (f.eks. ImageJ / FIJI, Plugins → Registrering → ​​ManualLandmarkSelection).
    3. Hvis desired, skala billeder til mindre, mere håndterbar størrelse (f.eks. 25%) ved hjælp af ImageJ (Billede → Scale).
  2. Start softwaren, skal du vælge Filer → import → billedsekvens og derefter vælge de TIFF-filer.
  3. Start plugin ved at vælge Filer → ny → TrakEM2 (Blank). To vinduer vil åbne; man styrer projektet og area_lists og den anden styrer sporing, og omtales som "lærred".
  4. Læg stakken billedet i plugin ved at lave et højreklik på lærredet import. Vælg import og klik på import stakken. I pop-up muligheder, markere feltet for virtuelle stakke.
    Bemærk: Selvom billedstakke allerede åbnet i softwaren, skal de også åbnes i plugin. Computeren kan køre mere jævnt, hvis virtuelle stakke er markeret.
  5. Efter mipmaps skabes og stakken er indlæst, højreklik for at navngive projekt under plugin vinduet. Højreklik på "nyt projekt" i skabelonen colUMN, og vælg 'tilføje nye barn "til dette projekt. Højreklik igen for at vælge "area_list«.
  6. Indstil Z-aksen omfanget af projektet at være enig med de oprindelige elektronmikrografibillede indstillinger ved at højreklikke på lærredet, og klik derefter på skærmen og vælge kalibrering. Også indstillet, Z-skalaen ved at vælge alle lag i plugin vinduet, højreklik for at vælge skala Z og tykkelse.
  7. Klik og træk "projekt" og alle "børn" i objekter sektion til at skabe de lister området 'under fanen' Z plads 'i lærredet vinduet projektet.
  8. Vælg "område liste«, og højreklik for at vælge og indstille en farve. Nu bruge pensel værktøj til at spore genstande såsom mitokondrier, i elektronmikroskop billeder. Brug 'Shift + klik på' at udfylde en lukket kreds, "Ctrl + rulle" for at zoome ind og ud, og "Alt + klik på 'for at slå børste cursor maling ind et viskelæder.
  9. Vælg to områder af ~ 10 - 15 umved 10 - 15 um i øverste venstre hjørne og nederste højre hjørne af billedet og identificere alle mitokondrier inden for disse områder at tillade uvildig prøvetagning af mitokondrier i hvert datasæt.
  10. På den "lærred", observere og spore mitokondrier i hele sektioner. Bemærk: Mitokondrier er ret mørkt / tætte vises organeller, af lignende størrelse i diameter og løst cylindriske. Den unikke cristae dannes af den indre membran er lette at skelne inde i dette organel.
  11. Når du er færdig med opsporing, højreklikke på area_list under fanen Z plads, vælge 'Vis i 3D'. Dette vil lancere 3D-fremviser plugin for at se en 3D-rekonstruktion af spores billede.
    1. For at udføre mitokondrie volumen målinger, skal du vælge objekt i 3D-fremviseren, skal du klikke på fanen "Rediger" og vælg "Object Egenskaber '. Estimatet mitokondrie volumen er opført sammen med flere andre målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser, at hjernen mitokondrie morfologi og størrelse er heterogen i forskellige neuronale undersektioner. Konfokal mikroskopi på lave densitet neuronale kulturer transduceret med lentivirus udtrykker mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein viste, at mitokondrier bosiddende i neuronal soma danne et retikulære netværk, mens dem, der bor i distale neuritter udviser en diskret langstrakt morfologi (Figur 1 AB). Brug af SBFSEM teknikken, blev det mitokondrielle morfologi, størrelse, volumen og distribution analyseret i musehjerne. Tredimensionelle (3D) billeder af mitokondrier blev rekonstrueret fra begge neuritter og synapser i musehjerne hippocampus. De præsynaptiske mitokondrier blev identificeret, og antallet af præsynaptiske boutons huser residente mitokondrier kvantificeret. Forskelligartethed i størrelsen af mitochondrier blev observeret i dendritiske versus axonale rum (Figur 1 CD). Desuden har mange små præsynaptiske rum i musen hjernen hippocampus var blottet for mitokondrier (figur 2 AC). De volumetriske målinger af både præsynaptiske og ekstrasynaptiske mitokondrier viste, at mængden eller størrelsen af mitokondrier bosiddende inden for de neuronale presynapses var betydeligt mindre end dem, der bor i ekstrasynaptiske region (Figur 2 DF). Interessant nok todimensionelle (2D) størrelsesfordelingen af mitokondrier målt fra en objektiv prøvetagning af 200 ikke-somatiske mitokondrier viste, at ~ 11% af mitochondriefraktionen ligger under opløsning grænse på lysmikroskopi (Figur 2G). Desuden giver de 2D-billeder erhvervet af SBFSEM analyse øget beslutning til visualisere ultrastrukturelle karakteristika individuelle mitokondrier (Figur 3 AB). På grund af den klart synlig topografi af vævet, er det endvidere muligt at klassificere det cellulære compartment af mitokondrier ved at bestemme dets nærhed til let identificerbare strukturer som kerne (somatisk) og synaptiske vesikler (præsynaptiske) (figur 3 AB). For at identificere mitokondrier til stede i de neuronale processer, rekonstruere den individuelle proces som axon eller dendritceller baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af præsynaptiske boutons henholdsvis 42. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at SBFSEM er en yderst værdifuld analyseteknik til at identificere mitokondrisk form, størrelse, antal og fordeling i hjernevæv og at eventuelle grove defekter i mitokondriestruktur og distribution kan også bestemmes ved hjælp af denne metode. Da de ultrastrukturelle egenskaber ved forskellige celletyper i hjernen er forskellige, for eksempel. Tilstedeværelsen af ​​glykogen granulat i astrocytter, er det også muligt at analysere de celle-typespecifikke forskelle i hjernen mitokondrier.

figur 1 Figur 1:. Heterogenitet Neuronal mitokondrie morfologi og distribution Kortikale kulturer fra postnatal dag 1 museunger blev transduceret med lentivirus udtrykker mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein (mito-GFP). (A) Viser neuronal soma udtrykker mito-GFP, bemærk netformet netværk af mitokondrie morfologi; Nu = kerne; skala bar = 5 um. (B) Viser langstrakt mitokondrie morfologi i distale neuritter; skala bar = 5 um. (C) repræsentant 2D billede fra SBFSEM datasæt genereres fra muse hjernevæv, er mitokondrierne farves grønt, dendritter farves i blå og axonale varicosities farves i brun; skala bar = 1 um. (D) 3D rekonstruktioner af mitokondrier i neuritter af mus hjernevæv, bemærk forskellen i størrelse mellem dendritiske og axonal mitokondrier indicated af store og små pilespids henholdsvis; skala bar = 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Serial Block-face scanningselektronmikroskopi (SBFSEM) analyse afslørede lav tæthed af mitokondrier på den præsynaptiske terminaler (A) repræsentative 2D ultramicrograph fra SBFSEM datasæt analyse opnået fra hippocampi af P15 vildtypemus;. skala bar = 1 um. (B) Viser 3D rekonstruktion af 10 præsynaptiske nerveterminaler. Bemærk, at kun 4 ud af 10 præsynaptiske terminaler viste mærkbar mitokondrier; skala bar = 1 um. (C) Søjlediagram der viser kvantificering af 173 rekonstruerede præsynaptiske nerveterminaler fra SBFSEM datasæt analyse. (D) Repræsentant 2D-billede fra SBFSEM datasæt viser ekstrasynaptiske mitokondrier i blå og præsynaptiske mitokondrier i grøn; skala bar = 1 um. (E) 3D rekonstruktioner af den præsynaptiske og ekstrasynaptiske mitokondrier fra SBFSEM datasæt ved hjælp af software; skala bar = 1 um. (F) Søjlediagram der viser mængden af ekstrasynaptiske og præsynaptiske mitokondrier. Data er plottet som middeltal ± SEM; n = 3 forskellige datasæt (inkluderer 62 præsynaptiske mitokondrier og 80 ekstrasynaptiske mitokondrier i alt); * Viser p-værdi = 0,0405. (G) En 15 med 15 um område i alle fire hjørner af billeder blev mærket og alle ikke-somatiske mitokondrier blev identificeret til at tillade stikprøvekontrol. Den mindste dimension på ~ 200 mitochondrier blev målt. Pie diagram viser, at ~ 11% af ikke-somatiske mitokondrier var <200 nm i dimension hvilket er under opløsning grænse på lysmikroskopi. Dette tal har been tilpasset fra Chavan et al 27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: 2D SBFSEM billeder fra Lateral geniculate Kerner af Mouse Brain (A) To dimensionelle repræsentativ SBFSEM billede fra de laterale geniculate kerner (8/8 um) fremviser en detaljeret topografi i regionen.. Soma og kernen er angivet; skala bar = 2 um. (B) En forstørrelse af området angivet med en rød firkant i panel A. Bemærk, at de ydre og indre membraner af mitokondrier samt cristae dannelse er klart synlige. Topografien og relationer til andre organeller og cellestruktur er også observeret. PS indikerer eksempel på præsynaptisk mitokondrierog NS indikerer eksempel på ikke-synaptisk (NS) somatisk mitokondrier; skala bar = 1 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kompleksiteten af ​​nervesystemet udgør en betydelig udfordring i at rekonstruere store væv mængder og analysere morfologi og distribution af organeller såsom mitochondrier med tilstrækkelig opløsning. Flere celler, herunder neuroner, oligodendrocytter og astrocytter med mange forskellige processer forlænget i tre dimensioner interagere i hjernevævet 43. Eftersom mitokondrier bor både i soma af celler og fjerne processer, mitokondrie morfologi er yderst pleomorfe i nervesystemet (figur 1). Tilstrækkelig 3D strukturel information med tilstrækkelig opløsning kan derfor ikke erhverves af konventionelle lys mikroskopi teknikker såsom konfokal eller to-foton mikroskopi 44,45. Elektronmikroskopi er den eneste for tiden tilgængelige teknik, der giver rekonstruktion af store volumener af neuralt væv med tilstrækkelig høj opløsning. Traditionelt har 3D rekonstruktion af neuralt væv været opnåd ved seriel sektion transmission elektronmikroskopi (SSTEM) af ultratynde sektioner 29. Imidlertid har de seneste teknologiske fremskridt forbedret kvaliteten af ​​volumen elektronmikroskopi dataindsamlings- og automatisering.

SBFSEM er en automatiseret blok-face imaging teknik, der kombinerer seriel sektionering inde i kammeret af en scanning elektron mikroskop, for at rekonstruere 3D væv struktur over hundreder af mikrometer, med en opløsning, der er tilstrækkelig til at følge de tyndeste cellulære processer og identificere små organeller . Denne teknik har åbnet op for udsigten til rutinemæssigt at rekonstruere både hvirvelløse og hvirveldyr nervesystem. Det indebærer flere trin, herunder prøveforberedelse, scanning elektron mikroskop drift, dataopsamling, billede efterbehandling, og billedanalyse. Disse procedurer kræver specialiserede hands-on uddannelse og certificering til scanning elektronmikroskop operation. Tre faktorer er kritikeral ie. dissekere den rigtige hjerne anatomiske region, opnåelse billeder i høj opløsning, og udføre korrekt billedanalyse. Efter dissekere den anatomiske region af interesse fra vibratome skive fast hjernevæv, er det afgørende at tage billedet for at bevare en ordentlig orientering. Det kan ellers være svært at fastslå det korrekte sted for billedbehandling. Indhentning billeder i høj opløsning, afhænger af tilstrækkelig fiksering og ordentlig post-fastsættelse farvningsprocedurer. Hjernen har en tendens til at undergå hurtig forværring i sin ultrastruktur efter døden. Derfor er det vigtigt at fastsætte hjernen i en glutaraldehydopløsning med korrekt transcardial perfusion metode. Dette bør følges op af yderligere fiksering af hjernen i glutaraldehyd opløsning i mindst 24 timer. Da billedopløsningen er fuldstændig afhængig af en kombination af en række af tungmetal farvningsmetoder, er det kritisk at følge post-fiksering fremgangsmåde som beskrevet i protokollen til at erhverve quantifiable billeder. Opløsninger skal fremstilles som beskrevet i fremgangsmåderne. Endelig til nøjagtig billedanalyse den organel / s, der skal analyseres, bør identificeres entydigt (f.eks. Ved at visualisere ultrastrukturelle karakteristika), før opsporing, og retningslinjerne for software skal følges nøje. Løsningen af ​​de erhvervede billederne skal være kendt for konvertering fra pixel til nanometer til volumetriske målinger.

Udover software, der beskrives i protokollen for at udføre billedanalyse, kan også anvendes til andet tilgængelig software er ligesom Genskab og Knossos. Selv om vægten af den beskrevne protokol er om visning mitokondrier i nervesystemet, kan det modificeres til at generere høj opløsning 3D information om forskellige andre subcellulære strukturer (f.eks. Endoplasmatisk reticulum, lysosomer osv.) I en række væv.

Mens en detaljeret vejledning fejlfinding til scanning elektronmikroskop oBetjening er uden for rammerne af denne artikel (se instrument brugermanualer og uddannelse information), et par problemer rutinemæssigt forekomme under billedbehandling eksperimenter og forstå, hvordan de kan løses, kan hjælpe nye brugere eller dem at opnå billeder gennem samarbejde / kommercielle kilder. Et fælles problem oplades af prøven, som optræder hovedsageligt i harpiks regioner, der indeholder lidt eller intet farvet materiale. I en "positiv" billede (dvs.. Cytosol er hvid), kernerne, blodkar og tomme harpiks vidder kan forekomme "blackened". Desuden opladning fremmer også lokal stråle drift resulterer i tilsyneladende billede vridning. Mulige løsninger varierer mellem instrumenter og prøver. Reduktion kV indstillinger reducerer "sværtning" artefakt, men kan fremme mere stråle afdrift. Ved hjælp af en lavere vakuum-tilstand, og inklusive kvælstof (N 2) gas, vanddamp osv. i kammeret reducerer også opladning, men med en betydelig omkostning for opløsning og signal-til-støj-forhold. Et andet fælles problem er kniv skipping. Langsommere scanning kan forårsage stråle induceret skade til blokken overflade, som skærer ujævnt eller slet ikke for nogle billedbehandling / skære cyklusser (dvs.. Hinanden følgende billeder vises samme). Flere løsninger findes herunder øget skæredybde / skive tykkelse med reduceret z-opløsning, stigende scanningshastighed og som følge heraf acceptere støjende billeder, reducerer pixelstørrelse og acceptere lavere x / y-opløsning, og vælge prøver eller områder med mere intens farvning (som dårligt -stained områder opkræve mere, skader lettere, og kræver længere stråle eksponering for at opnå billeder med acceptabel signal -støj nøgletal). Debris genaflejring på blokken-ansigt er en lejlighedsvis kilde til artefakt i billeder, og hvis dette sker ofte det kan kræve pause erhvervelse, og omhyggeligt at rense kniven (blæse luft), eller retrimming prøven til en mindre størrelse. Block-face opladning fremmer også genaflejring, og ovenstående trin majhjælp. Korrektion af fokus og stigmation kan også være nødvendigt, da mikroskop billeder prøver uafbrudt i mange timer til uger, i hvilket tidsrum vakuum dybden stigninger i kammeret, der kræver stigmation korrektioner. Hver scanning elektron mikroskop varierer efter alder og egenskaber, og erfaring er den bedste vejledning. Pludselige dramatiske ændringer i stigmation eller fokus kan opstå, når sektioneret materiale klæber til mikroskop billedbehandling komponenter. Kammeret skal åbnes og materiale omhyggeligt løsnes gennem vakuum eller komprimeret kvælstof. Det kræver absolut specialiseret uddannelse.

Der er et par ulemper ved SBFSEM teknologi med hensyn til dens anvendelighed i at analysere hjernen mitokondrier. En væsentlig ulempe, der er fælles for alle mikroskopi af fikserede væv, er, at det giver statiske billeder af en ekstremt dynamisk organel. Mitokondrier undergår kontinuerlig fission og fusion cykler 26, er mobile og smugles langs neurite processer 21. Defekter i mitokondrie handel og dynamik som ikke er rent numerisk eller strukturel kan let savnet af denne fremgangsmåde, selv om, ved at se på antallet af mitokondrier i en anatomisk definerede rum såsom presynapse man kan fortolke, hvis transporten af mitokondrier kan ændres 39 . En anden ulempe er, at den udføres kun i en lille del af hjernen, derfor kredsløbet specifikke defekter i mitokondrie fordeling kan gå glip af. Korrelative nærmer 28,46 råd mulighed for at kombinere den konfokal og multifoton billeddannelse med SBFSEM teknologi til at generere både molekylære og ultrastrukturelle data. For mitokondrie analyse, derfor kan det være nyttigt at udføre SBFSEM efter lysmikroskopisk undersøgelse af hjernesektioner enten ved at anvende den mitokondriske antigen-specifikt antistof eller ved anvendelse af et transgen, som udtrykker mitokondrier målrettet fluorescerende protein. Denne combinational strategi kan give en robust metode til at identificere mitokondrie defekter i musemodeller af neurologiske og mitokondrie sygdomme.

Der er også tekniske begrænsninger er fælles for mange former for elektronmikroskopi skyldes brugen af ​​barske fiksativer, heavy metal-farvning og ujævn gennemtrængning af kemikalier. Andre begrænsninger kan stamme fra plastik indlejring af vævsprøver. Tomme områder af harpiks og tyndt farvede strukturer bevarer elektroner under billedbehandling, forårsager stråle deformation og afdrift (billede warping) samt artefakt opladning signaler (f.eks. Mørke kerner og blodkar lumen), som både har indvirkning på opløsning. Beam beskadigelse af harpiksen fremmer også ujævn skæring, og af denne grund, imaging typisk kræver skiver på 50 - 100 nm, der skal skæres fra blokken ansigt, producerer ikke-isotrophic voxels i datasættene. Andre begrænsninger for nogle applikationer omfatter, at sektionerne er ødelagt og ikke kan efterfølgende op til fornyet overvejelse,som kan tvinge brugerne til at indsamle høj opløsning billeder af områder, som måske ikke indeholder nyttige data.

En stor fordel ved SBFSEM er, at det automatiserer processen med sektionering og billedbehandling blokke af væv ved at inkorporere en brugerdefineret mikrotom til et lavt vakuum SEM kammer 32,33. Da billederne er opnået direkte fra blokken ansigt før hvert snit, er problemerne i § rynker, komprimering og tab under håndtering væsentligt undgået, selv om vragrester deposition og vridning grund til at blokere-face opladning bidrager til nogle billede tab og forvrængning . Desuden er billederne opnået i rå datasæt allerede er tilpasset og kræver kun registrering mikrometer-skala til at rumme stråle drift for at være modtagelig for de fleste analyser. På grund af den automatiserede skæreproces, når systemet tomrum har stabiliseret sig, store mængder af væv kan afbildes uden væsentlig operatør engagement. Der er flere fordele ved at anvende denneteknologi i at udføre morfologiske og kvantitative undersøgelser af organeller og intracellulære strukturer. En fordel er at få oplysninger om 3D-struktur af mitokondrier inden for et rimeligt tidsrum. Tilgængeligheden af open source genopbygning softwarepakker som Genskab 47, TrakEM 48 og Knossos 49-51 har gjort denne teknologi et stærkt analytisk værktøj, hvor detaljeret 3D ultrastruktur af neuronal netværk fra eksperimentelle dyremodeller kan sammenlignes direkte. Den semiautomatiseret og fuldt automatiseret billedanalyse nærmer 52 sandsynligvis vil producere meget mekanistiske data i dyr, hvor mitokondrie morfologi, funktion og / eller biogenese forventes at blive påvirket. Tidligere SBFSEM analyse blev stærkt hæmmet på grund af lavere opløsning, har dog nyere prøveforberedelse teknikker, der involverer forbedrede farvningsmetoder 40 væsentligt forbedret opløsningen til et omfang, at selv en enkelt synaptisk vesicle kan nemt løses. Ved denne opløsning ultrastrukturelle defekter i mitokondrierne såsom vakuolisering, membransprængning, og tab af cristae let kan observeres, og fordelingen af defekte mitokondrier i cellerne kan bestemmes 38,39. Den høje opløsning af denne teknik giver en stor fordel i forhold lysmikroskopi hvor opløsningen er begrænset til ~ 200 nm i XY akse og ~ 500 nm i Z-aksen. Mitokondrier er derfor lige ved opløsning grænse for lysmikroskopi 53. Selvom mitokondrier med dimensioner under grænsen opløsning stadig kan visualiseres ved lysmikroskopi, deres dimensioner ikke kan måles pålideligt. Vigtigt er det, kan mitokondrier der er adskilt af en afstand lavere end den opløsning grænse på et lysmikroskop ikke løses ved lysmikroskopi. En anden fordel er, at den mitokondriske strukturanalyse kan udføres inden for rammerne af vævet, uden isolering af organel. Dette kan allav til passende sammenligninger i vævet baseret på mitokondrie lokalisering, til f.eks axonal vs. somatiske og / eller dendritiske mitokondrier. En yderligere fordel er, at det normalt er muligt at afgøre, om mitokondrier er neuronal eller neuroglial i lokalisering ved at følge de processer til et definerende organel, såsom glia filamenter og glykogen til astrocytter eller myelin til oligodendrocytter. Fremgangsmåderne ifølge neuroner og neuroglial celler er ofte i tæt nærhed, og med 2D tilgange såsom TEM kan det være vanskeligt at tildele med tillid, som processer er neuronal og som er neuroglial.

Som konklusion SBFSEM teknologi giver stakke af serielle billeder dækker vævsområder 20 - 1000 um i størrelse med ultrastrukturel opløsning af 5 - 10 nm eller højere, hvilket giver hele centralnervesystemet celler og organeller, såsom mitokondrier, der skal afbildes, målt og rekonstrueret . I dette papir, vi har proforudsat nogle praktiske tilgange til at gøre brug af denne teknologi. Fremtidige anvendelser omfatter analysere mitokondriestruktur og distribution i forskellige dyremodeller for neurologiske sygdomme såsom neurologiske og neurodegenerative sygdomsmodeller samt at analysere de forskellige subcellulære ultrastructures såsom endoplasmatisk reticulum, kerne og / eller lysosomer i hele celler eller væv under sunde og sygdomstilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Neuroscience SBFSEM mitokondrier OXPHOS hjerne synapse genopbygning 3D
Analyse af Brain mitokondrier Brug Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter