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Neuroscience

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

Das menschliche Gehirn ist ein hochenergieverbrauchende Organ, das in erster Linie auf Glucose als Energiequelle angewiesen ist. Glukose wird durch Gehirn Mitochondrien über Glykolyse, Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus und oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Wege zu erzeugen zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) abgebaut. Beeinträchtigung der mitochondrialen ATP-Produktion verursacht mitochondrialen Erkrankungen, die klinisch mit prominenten neurologischen und myopathischen Symptome präsentieren. Mitochondriale Defekte sind auch in der Entwicklung des Nervenstörungen (zB Autismus - Spektrum - Störung) und neurodegenerative Erkrankungen (zB Amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer und Parkinson-Erkrankungen). Somit besteht auf dem Gebiet ein erhöhtes Interesse für die Durchführung von 3D-Analyse von Mitochondrien-Morphologie, Struktur und Verteilung unter gesunden und Krankheitszuständen. Das Gehirn der mitochondrialen Morphologie ist äußerst vielfältig, mit einigen Mitochondrien vor allem inwobei die synaptische Region im Bereich von <200 nm Durchmesser, die unterhalb der Auflösungsgrenze der herkömmlichen Lichtmikroskopie ist. Exprimieren eines mitochondrial-bezogene grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Gehirn steigert signifikant die organellären Nachweis durch konfokale Mikroskopie. Allerdings ist es nicht überwinden die Einschränkungen auf die Empfindlichkeit der Detektion von relativ kleiner Größe Mitochondrien ohne die Bilder von großformatigen Mitochondrien Übersättigung. Während serielle Transmissions-Elektronenmikroskopie wurde erfolgreich auf neuronaler Synapsen zu charakterisieren Mitochondrien verwendet wurde, ist diese Technik sehr zeitaufwendig insbesondere, wenn mehrere Proben zu vergleichen. Die serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) Technik umfasst einen automatisierten Prozess der Schneiden, Bildgebungsblöcken von Gewebe und Datenerfassung. Hier stellen wir ein Protokoll SBFSEM einer definierten Region von Nagetier Gehirn durchzuführen, um schnell zu rekonstruieren und mitochondriale Morphologie visualisieren. Diese Technique könnte auch genaue Informationen zu liefern auf die mitochondriale Zahl, Volumen, Größe und Verteilung in einer definierten Region des Gehirns verwendet werden. Da die erhaltene Bildauflösung hoch ist (in der Regel unter 10 nm) jede grobe mitochondriale morphologische Defekte auch nachgewiesen werden können.

Introduction

Mitochondrien sind Organellen , die dynamisch ihre Form und Lage an die zellulären Cues und je nach Bedarf zu ändern, in enge Wechselwirkung mit Zell Zytoskeletts, und in Reaktion auf zelluläre Ereignisse , wie beispielsweise Calciumströme in Neuronen 1. Mitochondria auch Wechselwirkungen mit anderen Zellorganellen endoplasmatischen Retikulum zB die wiederum 2 ihre Dynamik und Stoffwechsel reguliert. Mitochondrial Morphologie zeigt Heterogenität in verschiedenen Zelltypen , dh. die Form des Organell variiert von rohrförmigen dieser bestehend aus Folien, Säcke und Ovalen 3. Es hat sich gezeigt , dass die mitochondriale Fusion und Spaltung Zyklusproteine ​​können die Position, Größe, Form und Verteilung der Mitochondrien 4 regulieren. Darüber hinaus Veränderungen in der mitochondrialen Form sind mit Neurodegeneration, neuronale Plastizität, Muskelatrophie, Calcium-Signalgebung, reaktive Sauerstoffspezies Generation sowie Lebensdauer und Zelltod Verwicklung tha assoziiertT - Zell-spezifische mitochondriale Morphologie ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktion 5-11.

Ein Haupt bioenergetischen Funktion der Mitochondrien ist Adenosintriphosphat (ATP) durch eine Reihe von Stoffwechselreaktionen ausführen , die umfassen vollständigen Abbau von Nährstoffen (zB Glucose,-Fettsäuren oder Aminosäuren) über den TCA - Zyklus und OXPHOS Pfade 12 zu erzeugen. Das menschliche Gehirn macht nur 2% des Körpergewichts jedoch verbraucht er ~ 20% der Gesamtenergie erzeugt es eine extrem Energie machen Organ anspruchsvolle 13. Es ist daher nicht verwunderlich , dass mitochondriale Dysfunktion beim Menschen zu einer großen Anzahl von neurologischen Auffälligkeiten führt 14-17. Genetische Mutationen in OXPHOS Komponenten , die ATP - Generation führt zu mitochondrialen Erkrankungen 17,18, beeinträchtigen die klinisch heterogene Gruppe von Erkrankungen mit einer Prävalenz von ~ 1 sind: 5000 Personen, und eine der häufigsten Ursache von metabolic Störungen bei Kindern und Erwachsenen. Defizit von Mitochondrien stamm ATP wirkt multiple Organsysteme mit hoher Energie anspruchsvollen Organen, wie Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur überwiegend in diesen Patienten 14,17,18 beeinflusst zu werden. In den letzten Jahren haben mehrere Studien gezeigt , dass 15-17,19,20 für mitochondriale Dysfunktion sowohl in der neurologischen Entwicklung und neurodegenerativen Erkrankungen zur Verfügung gestellt. Da Mitochondrien essentiell und von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung des Gehirns und Funktion sind, ist es zwingend notwendig, Protokolle zu entwickeln, die Veränderungen in der Hirn mitochondrialen Morphologie, Struktur, Größe, Anzahl und Verteilung unter den beiden gesunden und kranken Zustand zu analysieren. Mausmodelle mit mitochondrial-bezogene grün fluoreszierende Protein (GFP) wurden hergestellt , um die mitochondriale Bewegungen und Lokalisation im Gehirn 21,22 visualisieren. Dies ist zwar ein äußerst nützliches Werkzeug ist mitochondriale Motilität und allgemeine Verteilung zu untersuchen, gibt es einige Nachteile includ diee begrenzte Auflösung und Empfindlichkeit der Fluoreszenzmikroskopie. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die relativ kleine Größe Mitochondrien zu verfolgen. In ähnlicher Weise wurde serielle Transmissions - Elektronenmikroskopie erfolgreich anzuzeigen synaptic Mitochondrien 23, jedoch ist dieses Verfahren sehr zeitraubend verwendet. Die mitochondriale Morphologie ist bekannt , sehr dynamisch, da sie kontinuierlich Spaltungs- und Fusionszyklen durchlaufen, und in den meisten Zellen Mitochondrien pflegen ein sehr verbundenes Netzwerk 24-26. Neuronen sind Zellen mit mehreren Dendriten und Axone erweitert stark polarisiert, und Mitochondrien , die einen angeschlossenen retikulären Netzwerk im Zellkörper bilden können , haben zu trennen , wie sie sich ihren Weg durch diese Neuriten (Abbildung 1). Dies macht Gehirn Mitochondrien sehr unterschiedlich in Größe und Form. Zum Beispiel haben wir serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) Technik, die zuvor beobachtet, daß die Differenz im Volumen oder die Größe der extrasynaptischen mitochondria an die Mitochondrien in den Nervenenden können so viel wie sechzehn 27 falten.

Es gibt mehrere Ansätze für die Volumen Durchführung von Analysen 28, die TEM - Serien Abschnitt 30 29, automatisierte Band sammeln Ultramikrotom SEM umfasst, fokussierten Ionenstrahl SEM 31 und SBFSEM 32. Die SBFSEM Analyse hat Vorteile, dass es die Auflösung hat quantitative Daten über die morphologische Form, Größe, Verteilung und Anzahl von Organellen wie Mitochondrien in Bereichen von bis zu 1 mm des Gehirns zu ermöglichen. Der technische Betrieb ist auch die am wenigsten anspruchsvoll, mit Datenerfassung und Analyse innerhalb Fähigkeiten vieler biologischer Labors, die früheren EM Erfahrung fehlt. Das Aufkommen von kommerziellen Instrumenten für die serielle schnittartige Bilder zu erzeugen hat 3D ultrastrukturelle Analyse von Geweben aus einer Routine - Technik, die erlaubt weiterhin eine unvoreingenommene volumetrische Analyse in einer schnellen und wiederholbaren Weise 28 32, basierend auf einer Idee , eingeführt durch Leighton seitdem etabliert haben als wichtiges Instrument bei der Rekonstruktion Analyse der neuronalen Schaltkreise 34 1981 33. Mehrere Studien beschrieben und verwendet. Darüber hinaus für viele kleinere Projekte, bietet es Rekonstruktionsanalyse Zellorganellen 27,35-39 zu identifizieren. Da werden die aufgenommenen Bilder von der Niederspannung zurück gestreute Elektronen abgeleitet, neue Färbeprotokollen , die unterschiedliche bekannte Schwermetall Färbetechniken kombinieren wurden die Auflösung 40 zu erhöhen , entwickelt.

In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll für die 3D - Elektronenmikroskopie Bildgebung und volumetrische Analyse von Gehirn Mitochondrien Verwendung basierend auf Methoden, die von uns und haben andere 38,39,41 zuvor. Die Gewebenachbearbeitungsverfahren verwendet wurden , wie früher von Deerinck et al40.

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Protocol

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt.

Achtung: Extreme Vorkehrungen müssen getroffen werden, wenn der Handhabung und Entsorgung mehrerer Komponenten in diesem Protokoll verwendet. Vor Gebrauch muss der lokale institutionellen Richtlinien und die Gesundheits- und Sicherheitsmaßnahmen eingerichtet werden und anschließend, insbesondere für Osmiumtetroxid, die flüchtig und sehr giftig ist, Uranylacetat, die beide ist ein Schwermetall und die Quelle der Radioaktivität und Bleinitrat, das ist ein Schwermetall Gift. Thiocarbohydrazid (TCH) können sich zersetzen explosive und giftige Gase zu erzeugen, wenn sie falsch gehandhabt. Viele Institutionen wird eine EM-Core Facility, in dem haben diese Reagenzien routinemäßig eingesetzt werden und Unterstützung bieten kann.

1. Herstellung von Hirngewebe und SBFSEM Imaging

  1. Anesthetize eine junge (~ 2-4 Monate alt) C57 schwarze Maus (C57BL / 6J-Stamm) mit 4 - 5% isoflurane nach den Richtlinien des Instituts. Bestätigen anesthetization durch den Verlust des Muskeltonus Überwachung, Mangel an willkürlichen Bewegungen und Reaktionen auf aversiven Reizen wie ein Schwanz kneifen.
  2. Pin der Maus auf eine Dissektion Tablett und machen einen Schnitt auf der Haut entlang ventralen Mittellinie. Machen Sie weitere Einschnitte in der Haut den Brustkorb der Maus zu belichten. Inzision der Membran und vorsichtig die Brusthöhle entlang der Peripherie sezieren heraus das schlagende Herz, zu entlarven und dann auf den rechten Vorhof einen Einschnitt zu machen.
  3. Mit einer Flügelkanüle, kanülieren den linken Ventrikel. Perfundieren transkardial mit der Maus 10 - 20 ml Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), pH 7,2, bis zum Ausbluten durch eine Änderung in der Farbe der Leber bestätigt wird.
    Hinweis: Eine Änderung in der Farbe der Leber ist als Leitfaden verwendet, um das Ausmaß der Ausbluten zu bestimmen. Bestätigen Sie, dass die Leber Farbe von rötlich-braun rosa bis hellrot.
  4. Perfuse transcardial mit der Maus 10 - 20 ml 2% GlutarAldehyd und 4% Paraformaldehyd in 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) handelt, das Gehirngewebe schnell von innen zu befestigen. Die Fixierung erfolgt durch die Beobachtung der Schwanz Versteifung überwacht.
    Anmerkung: Bereiten 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) durch Auflösen von 2,14 g Natrium-Cacodylat in 80 ml Wasser, fügt Salzsäure den pH-Wert einzustellen, und das Volumen auf 100 ml mit Wasser zu machen.
  5. Im Anschluss an die Perfusion, köpfen die Maus, um das Gehirn zu sezieren, gefolgt von der Fixierung in 0,10 M Natriumkakodylat - Puffer (pH 7,2), der 2% Glutaraldehyd und 4% Paraformaldehyd für 48 Stunden bei 4 o C.
  6. Nach 48 Stunden machen 400 um Koronalschnitte ein Vibratom und anschließend vorsichtig den interessierenden Bereich im Gehirn (beispielsweise der Hippocampus) unter dem Dissektionsmikroskop 42 sezieren. Sorgfältig das Gewebe schneiden und nehmen Sie ein Bild Orientierung für die Konservierung.
    Hinweis: Die Nachbearbeitung Methoden der Gewebefärbung in SBFSEM kombiniert eine Vielzahl von Schwermetall Färbemethoden inUm die Auflösung zu verbessern und werden auf der Grundlage des Verfahrens entwickelt , die zuvor von Deerinck et al 40.
  7. Waschen Sie die Glutaraldehyd-fixierten Gewebe 3 mal, jeweils 5 min in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,2).
  8. Bereiten 0,1% Gerbsäure-Lösung durch Auflösen von Gerbsäure in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer (pH 7,2). Swirl, bis sie gelöst und filtriert durch 0,45 um Filter, falls erforderlich.
  9. Postfix die Gewebe mit Cacodylat gepufferte 0,1% Gerbsäure durch 30 in 1 ml Reagenz Inkubation - 60 min bei RT.
    Hinweis: Die Inkubationszeit hängt von Gewebegröße, aber 30 min am besten für die meisten Gewebe.
  10. Waschen Gewebe 3 mal, jeweils 5 min in Kakodylat-Puffer (pH 7,2).
  11. Man löst 0,3 g Kaliumferrocyanid und 0,86 g Natriumcacodylat in 10 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O). Halten Sie die Kaliumferrocyanidlösung auf Eis. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 10 ml 4% Osmiumtetroxid (OsO 4) hinzuzufügen.
  12. Stain das Gewebe mit 2% osmium-Ferrocyanidlösung für 90 Minuten auf Eis. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O.
  13. Vorbereitung 1% Thiocarbohydrazid (TCH) Lösung von 0,1 g TCH Auflösen in 10 ml dH 2 O. Man löst bei 60 ° C durch alle 10 min wirbelnden, bis sie vollständig gelöst. Sicherheitshinweise beachten während TCH Handhabung, vor allem darauf achten, Verwendung von Metallen, Erhitzen auf hohe Temperatur zu vermeiden, oder ermöglicht Lösung austrocknen.
  14. Behandlung der Proben mit frisch hergestellten 1% TCH für 20 min bei RT. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O.
  15. Verdünne 4% OsO 4 bis 2% mit dH 2 O, stain Gewebe mit 2% iger wäßriger Osmiumtetroxid durch 1 h Inkubation. Waschen Sie Gewebe 3 - mal, jeweils 5 min mit dH 2 O.
  16. Inkubieren der Proben O / N in 1% Uranylacetat in dH 2 O bei 4 ° C.
  17. Bereiten Sie Waltons Blei Aspartat - Lösung (wie von Deerinck et al 40).
    1. Man löst 0,998 g L-Aspartat in 250 ml dH 2 Ound fügen Sie dann 10 N Kaliumhydroxid (KOH) in tropfenweise, bis der pH-Wert 5,5 erreicht. Nach pH-Einstellung in 10 ml Asparaginsäure Lager und Wärme auf 60 ° C für 30 min 0.066 g Bleinitrat hinzu.
  18. Spülen Gewebe in dH 2 O und Inkubation mit der Walton stain Blei Aspartat für 30 min in einem 60 ° C - Ofen. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O.
  19. Dehydratisieren Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol gekühlten Lösungen von 20% unter Verwendung von 50%, 75%, 85% und 95% Ethanol jeweils 5 Minuten, gefolgt von 100% Ethanol 3 mal, jeweils 10 Minuten.
    Hinweis: Verwenden Sie 100% Ethanol aus frisch geöffneten Flasche, wie geöffnet Ethanol Wasser aus der Luft absorbiert und verursachen Einbettung zum Scheitern verurteilt. Längere Inkubationen werden bei größeren Gewebeproben erforderlich sein.
  20. Waschproben 2-mal, jeweils 15 min in Propylenoxid.
  21. Machen Kunststoff Einbettung Harz unter Verwendung von 25 ml Harz, 10,5 ml DDSA (Dodecenylbernsteinsäureanhydrid), 15,5 ml NMA (nadic Methyl Anhydrid) und 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimethylaminomethyl phenol). Mischen Sie das Harz durch Schütteln. Spin und lassen Sie das Harz bis Blasen Entschlossenheit zu stehen.
    Hinweis: Dies ist die Standard mittlerer Härte Rezept. Andere Arten der Elektronenmikroskopie (EM) Kunstharz kann verwendet werden, sollten aber mit einem nicht-essentiellen Kontrollprobe im Voraus überprüft werden, da nicht alle Harze für SBFSEM arbeiten.
  22. Inkubieren Sie das Gewebe O / N in einer 50: 50 Mischung aus Einbettungsharz und Propylenoxid in einer Phiole, die zunächst mit einer Kappe bedeckt wird, dann uncapped nach 2 h, so daß das Propylenoxid im Zeitraum von etwa 8 verdampft über - 10 hr.
  23. Übertragen Sie die Gewebe zu 100% frisch Einbettungsharz in saubere Fläschchen für 2 Std.
  24. Einbetten von Proben in frischem Einbettungsharz, in flache Formen bedruckten Papieretiketten enthalten, und heile sie in einem Ofen bei 60 ° C für 48 Stunden. Nach ca. 1 Stunde, überprüfen Sie die Gewebe Platzierung und Ausrichtung wieder, und bei Bedarf einstellen.
  25. Trim Proben auf den Bereich von Interesse und Montage auf einem Aluminiumstift Gellin mitg Cyanacrylat superglue oder ein leitfähiges Epoxydharz, dann Mantel mit kolloidalem Silber an den Seiten des Blocks Paste einen leitenden Pfad zu der Aluminiumstift bereitzustellen.
  26. Untersuchen von Gewebeproben eines Rasterelektronenmikroskops - System ausgestattet mit einer in-Kammer Ultramikrotom Bühne und niedrige kV Rückstreuelektronendetektor 32.
    Hinweis: Erhalten Instrument- und Website-Ausbildung in der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) verwenden und zu einem autorisierten Benutzer. Alternativ Zusammenarbeit mit einem Forscher oder Core Facility für kleine Projekte möglich sein. Radiation Ausbildung kann auch erforderlich sein, wie REMs Röntgenstrahlen erzeugen.
  27. Um das Bild zu den Proben, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2,25 kV, mit einem 5 - 10 nm / Pixel Auflösung, mit Feldgrößen zwischen 80 bis 250 & mgr; m in x, y (andere Feldgrößen möglich) und Schichtdicke von 50 bis 100 nm, mit insgesamt 250 bis 600 Scheiben in einer 16 bis 20 Stunden Zeit.
    Hinweis: Die Einstellungen variieren erheblich zwischen den verschiedenen Mikroskopen, indiduellen Proben und die gewünschte Auflösung. Diese Einstellungen sollten Bilder zu erzeugen, die leicht interpretierbar für viele Proben sind.

2. Die Analyse der Imaging-Dataset

Hinweis: Das Bild J / Fidschi-Software verwendet wird, den Datensatz zu analysieren und stützt sich auf die TrakEM2 Plugin. Vorverarbeitungsschritten können unter Verwendung einer Vielzahl von Software durchgeführt werden und können auch umfangreiche oder klein sein, je nach Erfahrungsgrad und die Stapel erhalten. Die wichtigsten Transformationen, die Open-Source-Software (ImageJ ver 1.50b herunterladen FIJI 1. Oktober 2015) werden hier beschrieben.

  1. Umwandeln von Bildern in 8-Bit-TIFF-Format von den ursprünglichen proprietären 16-Bit-Bilder von in der Software öffnen und Auswählen von Menüoptionen Bild → Typ → 8 Bit.
    1. Wenn die automatische Kontrast / Helligkeitsumwandlung während dieses Schrittes für Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder, und drücken Sie Bild → Anpassen → Helligkeit / Kontrast. Wählen Sie einen Bereich, der für alle Bilder funktioniert, und drücken Sie Apply. Dann c durchführenonversion. Hinweis: Bei einigen REMs kann dieser Schritt Mikroskophersteller-Software.
    2. Bei Bedarf aufgrund inakzeptablen Bildbewegung zwischen den Schichten (z. B. Drift aufgrund des Ladens), registrieren / align Bildstapel (Menüpunkte Plugins → Registrierung → Lineare StackAlignmentWithSIFT). In den meisten Registrierungssoftware, die für "Übersetzung-only" -Modus und nicht als "starrer Körper".
      Hinweis: Viele Ansätze und Software arbeiten können: die SIFT Registrierung Plugin funktioniert für viele Anwendungen und es gibt einen virtuellen Stack-Version.
      1. Bei Bedarf vergrößern die Größe der Leinwand vor der Registrierung (Bild → → Leinwandgröße anpassen) oder es von Interesse (Bild → Crop) auf einen Bereich zu reduzieren.
        Hinweis: Einige Drift oder Spreizen auftreten können, und versuchen, andere Plugins oder Software kann zu besseren Ergebnissen führen. Manuelle Optionen sind ebenfalls verfügbar (zB. ImageJ / FIDSCHI, Plugins → Registrierung → ManualLandmarkSelection).
    3. Wenn desired, Stufenbilder zu kleineren, überschaubaren Größe (z. B. 25%) mit ImageJ (Bild → Scale).
  2. Starten Sie die Software, wählen Sie Datei → Import → Bildfolge und dann die TIFF-Dateien auswählen.
  3. Starten Sie das Plugin von Datei → Neu → TrakEM2 (Blank) auswählen. Zwei Fenster wird geöffnet; ein leitet das Projekt und area_lists und die andere Verfolgung verwaltet, und ist als "Leinwand" bezeichnet.
  4. Legen Sie das Bildstapel in das Plugin, indem ein Rechtsklick auf die Leinwand importieren. Wählen Sie importieren, und klicken Sie auf Import-Stack. In der Pop-up-Optionen, markieren Sie das Kästchen für virtuelle Stacks.
    Anmerkung: Obwohl die Bildstapel bereits in der Software geöffnet werden, müssen sie auch in dem Plugin geöffnet werden. Der Computer kann mehr reibungslos laufen, wenn die virtuelle Stapel Kästchen aktiviert ist.
  5. Nachdem die mipmaps erstellt werden und der Stapel wird geladen, klicken Sie rechts das Projekt unter dem Plugin-Fenster zu nennen. Klicken Sie rechts auf "neues Projekt" in der Vorlage colUMN, und wählen Sie "Hinzufügen neuer Kind 'für das Projekt. Rechts klicken Sie erneut auf, um 'area_list'.
  6. Stellen Sie die Z-Achse Umfang des Projekts mit den ursprünglichen elektronenmikroskopische Aufnahme-Einstellungen mit der rechten Maustaste auf die Leinwand zu einigen, dann klicken Sie auf Anzeige und wählen Sie Kalibrierung. Außerdem sind die Z-Skala durch alle Ebenen im Plugin-Fenster Auswahl der rechten Maustaste auf Skala Z und Dicke wählen.
  7. Klicken Sie auf und ziehen Sie das "Projekt" und alle "Kinder" in den Projektteil Objekte, die "Bereich Listen 'unter dem' Z Raum 'Seite in der Leinwand-Fenster zu erstellen.
  8. Wählen Sie die "Bereichsliste" und der rechten Maustaste auf eine Farbe auszuwählen und einzustellen. Verwenden Sie nun den Pinsel-Werkzeug Objekte zu verfolgen, wie Mitochondrien, in der elektronenmikroskopischen Aufnahme Bilder. Verwenden Sie 'Shift + Klick "in einem geschlossenen Kreis zu füllen," Strg + blättern' zu vergrößern und aus, und "Alt + klicken Sie auf" Pinsel Cursor in einen Radiergummi zu machen.
  9. Wählen Sie zwei Bereiche von ~ 10 bis 15 & mgr; mvon 10 bis 15 & mgr; m in der oberen linken Ecke und die untere rechte Ecke des Bildes und zu identifizieren alle Mitochondrien innerhalb dieser Bereiche in jeden Datensatz unvoreingenommene Probenahme von Mitochondrien zu ermöglichen.
  10. Auf der "Leinwand", beobachten und Spuren Mitochondrien in den Sektionen. Hinweis: Die Mitochondrien sind ziemlich dunkel / dicht erscheinen, Organellen, von ähnlicher Größe im Durchmesser und locker zylindrisch. Die einzigartige cristae durch die innere Membran gebildet sind in diesem Organell leicht zu unterscheiden.
  11. Wenn mit Tracing fertig sind, klicken rechts auf dem area_list unter dem Reiter Z Raum, wählen Sie "Show in 3D '. Dadurch wird der 3D-Viewer-Plugin starten Sie eine 3D-Rekonstruktion des verfolgt Bild anzuzeigen.
    1. Um mitochondrialen Volumenmessungen, wählen Sie Objekt in 3D-Viewer ausführen, klicken Sie auf "Bearbeiten" Registerkarte und wählen Sie "Objekteigenschaften". Die mitochondriale Volumenschätzung wird zusammen mit mehreren anderen Messungen aufgeführt.

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Representative Results

Wir zeigen, dass das Gehirn der mitochondrialen Morphologie und Größe in verschiedenen neuronalen Unterfächer heterogen ist. Die konfokale Mikroskopie auf niedriger Dichte neuronalen Kulturen transduziert mit Lentiviren mitochondrial-bezogene grün fluoreszierende Protein exprimieren , zeigten , dass die Mitochondrien in neuronalen soma Wohnsitz eines retikulären Netzwerk bilden, während diejenigen , die eine diskrete längliche Morphologie in distalen Neuriten zeigen Wohnsitz (Abbildung 1 AB). Verwendung der SBFSEM Technik, die mitochondriale Morphologie, Größe, Volumen und die Verteilung wurden in Gehirn der Maus untersucht. Dreidimensionale (3D) Bilder von Mitochondrien wurden aus beiden Neuriten und Synapsen im Gehirn der Maus hippocampus rekonstruiert. Die präsynaptischen Mitochondrien wurden identifiziert und die Anzahl der präsynaptischen boutons beherbergen resident Mitochondrien quantifiziert. Heterogeneity in der Größe von Mitochondrien in der dendritischen Vergleich axonale Kompartimente beobachtet (FiAbbildung 1 CD). Viele kleine präsynaptischen Fächer im Gehirn der Maus Hippocampus waren darüber hinaus frei von Mitochondrien (Abbildung 2 AC). Die Volumenmessungen beider präsynaptischen und extrasynaptischen Mitochondrien zeigte , dass das Volumen oder die Größe der Mitochondrien innerhalb der neuronalen Präsynapsen Wohnsitz als die deutlich kleiner war in der extrasynaptischen Region (Abbildung 2 DF) wohnen. Interessanterweise zeigte die zweidimensionale (2D) Größenverteilung von Mitochondrien aus einer unvoreingenommenen Probenahme von 200 nicht-somatischen Mitochondrien gemessen , dass ~ 11% der mitochondrialen Fraktion liegt unterhalb der Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie (2G). Darüber hinaus bieten die 2D - Bilder erworben durch SBFSEM Analyse eine erhöhte Auflösung der ultrastrukturellen Eigenschaften einzelner Mitochondrien (Abbildung 3 AB) zu visualisieren. Aufgrund der deutlich sichtbaren Topographie des Gewebes ist es weiterhin möglich, die zelluläre comp zu klassifizierenartment der Mitochondrien durch seine Nähe zu leicht identifizierbaren Strukturen wie Kern (somatische) und synaptischen Vesikeln (präsynaptischen) (Abbildung 3 AB) zu bestimmen. Um die Mitochondrien , die in den neuronalen Prozesse zu identifizieren, zu rekonstruieren , die einzelnen Verfahren wie Axon oder Dendriten auf der Basis der Anwesenheit oder Abwesenheit von präsynaptischen boutons bzw. 42. Basierend auf diesen Ergebnissen, schlagen wir vor, dass SBFSEM eine äußerst wertvolle analytische Technik ist, kann mitochondriale Form, Größe, Anzahl und Verteilung im Gehirngewebe und dass alle groben Defekte in der mitochondrialen Struktur und Verteilung zu identifizieren, auch mit dieser Methode bestimmt werden. Da die ultrastrukturellen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen im Gehirn verschieden sind, für zB. Vorhandensein von Glykogen Granulat in Astrozyten, ist es auch möglich, die zelltypspezifische Unterschiede in Gehirnmitochondrien zu analysieren.

Abbildung 1 Abb . 1: Heterogene Neuronale mitochondriale Morphologie und Verteilung kortikale Kulturen von postnatalen Tag 1 Maus Welpen wurden transduziert mit Lentiviren mitochondrial-bezogene grün fluoreszierende Protein (Mito-GFP) exprimieren. (A) zeigt die neuronale soma Mito-GFP - exprimierenden, beachten Sie die reticulate Netzwerk der mitochondrialen Morphologie; Nu = Kern; Maßstab = 5 & mgr; m. (B) zeigt längliche mitochondrialen Morphologie in distalen Neuriten; Maßstab = 5 & mgr; m. (C) Repräsentative 2D - Bild aus dem SBFSEM - Datensatz aus dem Maus - Hirngewebe erzeugt wird , werden die Mitochondrien in grün gefärbt, Dendriten gefärbt sind in Blau und axonalen Varikositäten in braun gefärbt; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. (D) 3D - Rekonstruktionen der Mitochondrien in den Neuriten der Maus Hirngewebe, beachten Sie den Unterschied in der Größe zwischen dendritischen und axonalen Mitochondrien indicated durch Pfeilspitze groß und klein sind; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Serienblock Gesicht Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) Analyse ergab , Low Fülle von Mitochondrien an den präsynaptischen (A) Repräsentative 2D ultramicrograph aus der SBFSEM - Datensatz - Analyse aus dem Hippocampus von P15-Typ wilden Mäusen erhalten;. Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. (B) Zeigt die 3D - Rekonstruktion von 10 präsynaptischen Nervenendigungen. Beachten Sie, dass nur 4 von 10 präsynaptischen erkennbar Mitochondrien zeigte; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. (C) Balkendiagramm die Quantifizierung von 173 rekonstruiert präsynaptischen Nervenenden aus dem SB zeigtFSEM-Datensatz-Analyse. (D) Repräsentative 2D - Bild von SBFSEM Dataset die extrasynaptischen Mitochondrien in blau und präsynaptischen Mitochondrien in grün zeigt; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. (E) 3D - Rekonstruktionen der präsynaptischen und extrasynaptischen Mitochondrien aus dem SBFSEM - Datensatz mit Hilfe der Software; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. (F) Balkendiagramm zeigt das Volumen der extrasynaptischen und präsynaptischen Mitochondrien. Daten sind als Mittelwert ± SEM aufgetragen ist; n = 3 verschiedene Datensätze (enthält 62 präsynaptischen Mitochondrien und 80 extrasynaptischen Mitochondrien insgesamt); * Zeigt p-Wert = 0,0405. (G) A 15 von 15 & mgr; m - Bereich in allen vier Ecken der Bilder wurden markiert und alle nicht-somatischen Mitochondrien wurden identifiziert Stichproben zu ermöglichen. Die am wenigsten Dimension von ~ 200 Mitochondrien gemessen. Kreisdiagramm zeigt, dass ~ 11% der nicht-somatischen Mitochondrien waren <200 nm in die Dimension unterhalb der Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie ist. Diese Zahl hat been von Chavan et al angepasst 27. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: 2D SBFSEM Bilder aus dem corpus geniculatum laterale von Mausgehirn (A) Zweidimensionale repräsentative SBFSEM Bild von den seitlichen geniculate Kerne (8/8 & mgr; m) eine detaillierte Topographie der Region zu demonstrieren.. Soma und Kern sind angegeben; Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. (B) Eine Vergrößerung der Fläche durch rotes Quadrat in der Abdeckung A. Hinweis darauf hingewiesen , dass die äußeren und inneren Membranen von Mitochondrien sowie cristae Bildung deutlich sichtbar sind. Die Topographie und die Beziehungen zu anderen Organellen und Zellstruktur wird auch beobachtet. PS zeigt Beispiel von präsynaptischen Mitochondrienund NS zeigt Beispiel für nicht-synaptische (NS) somatische Mitochondrien; Maßstabsbalken = 1 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Komplexität des Nervensystems stellt eine erhebliche Herausforderung große Gewebevolumina in Rekonstruieren und die Morphologie und Verteilung von Organellen wie Mitochondrien mit ausreichender Auflösung zu analysieren. Mehrere Zellen , einschließlich Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten mit zahlreichen Prozessen in drei Dimensionen erweitert interagieren innerhalb des Hirngewebes 43. Da Mitochondrien sowohl im Soma von Zellen und fernen Prozesse liegt, ist mitochondrialen Morphologie extrem pleomorphen im Nervensystem (Figur 1). Eine ausreichende 3D ​​- Strukturinformationen mit ausreichender Auflösung kann daher nicht durch herkömmliche Lichtmikroskopie - Techniken wie konfokale oder Zwei-Photonen - Mikroskopie 44,45 erworben werden. Elektronenmikroskopie ist die einzige derzeit verfügbare Technik, die mit ausreichend hoher Auflösung Rekonstruktion großer Mengen von Nervengewebe ermöglicht. Traditionell wurde 3D-Rekonstruktion von Nervengewebe erreichen gewesend durch serielle Abschnitt Transmissions - Elektronenmikroskopie (sstem) von ultra - dünnen Abschnitte 29. Allerdings haben die jüngsten technologischen Fortschritte, die Qualität der Volumen Elektronenmikroskopie Datenerfassung und Automatisierung verbessert.

SBFSEM ist ein automatisiertes Block-face-Bildgebungstechnik, die im Inneren der Kammer eines Rasterelektronenmikroskops, um Serienschnitt vereint über hundert Mikrometer 3D-Gewebestruktur zu rekonstruieren, mit einer Auflösung, die die dünnste zelluläre Prozesse folgen ausreichend ist und kleine Organellen identifizieren . Diese Technik hat die Aussicht auf beide wirbellosen Tiere und wirbelNervenSystem routinemäßig Rekonstruktion eröffnet. Es umfasst mehrere Schritte, einschließlich Probenvorbereitung, Rasterelektronenmikroskops Betrieb, Datenerfassung, Bildnachbearbeitung und Bildanalyse. Diese Verfahren erfordern spezielle praktische Ausbildung und Zertifizierung für Rasterelektronenmikroskops Betrieb. Drei Faktoren sind Kritikeral dh. die richtige Gehirn anatomische Region sezieren, hochauflösende Bilder zu erhalten, und die richtige Bildanalyse durchführen. die anatomische Region von Interesse aus der Vibratom Scheibe fixiert Hirngewebe Nach sezieren, ist es entscheidend, um das Bild für die Erhaltung der richtigen Orientierung zu nehmen. Es kann sonst schwierig sein, die richtige Stelle für die Bildgebung zu ermitteln. Bilder mit hoher Auflösung Erhalt hängt von entsprechend fixiert und die richtigen post-Befestigungs Färbeverfahren. Das Gehirn neigt dazu, in ihrer Ultrastruktur nach dem Tod rapide Verschlechterung zu unterziehen. Daher ist es wichtig, das Gehirn in einer Glutaraldehyd-Lösung Verfahren unter Verwendung geeigneter transkardialer Perfusion zu beheben. Dies sollte durch eine weitere Fixierung des Gehirns in Glutaraldehyd-Lösung für mindestens 24 Stunden eingehalten werden. Da die Bildauflösung auf die Kombination einer Vielzahl von Schwermetall Färbemethoden vollständig abhängig ist, ist es wichtig, die post-Befestigungsmethode zu folgen, wie im Protokoll detailliert quantifiabl zu erwerbene Bilder. Lösungen sollten, wie in den beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Schließlich ist für eine genaue Bildanalyse der Organell / s analysiert werden sollten eindeutig identifiziert werden (z. B. durch ultrastrukturelle Merkmale Visualisierung) vor Verfolgung und die Software - Richtlinien müssen strikt eingehalten werden. Die Auflösung der aufgenommenen Bilder sollten für die Umwandlung von Pixeln zu Nanometern für die volumetrische Messungen bekannt sein.

Neben der Software in dem Protokoll zur Durchführung einer Bildanalyse, des anderen verfügbaren Software wie Reconstruct und Knossos können auch verwendet werden, beschrieben. Obwohl der Schwerpunkt des beschriebenen Protokolls auf Betrachtungs Mitochondrien im Nervensystem ist, kann es modifiziert werden hochauflösende 3D ​​- Informationen zu verschiedenen anderen subzellulären Strukturen zu erzeugen (z. Endoplasmatischen Retikulum, Lysosomen etc.) In einer Vielzahl von Geweben.

Während eine detaillierte Anleitung zur Fehlerbehebung für Rasterelektronenmikroskops operation geht über den Rahmen dieses Artikels (siehe Instrument Bedienungsanleitungen und Schulungsinformationen), ein paar Probleme routinemäßig während der Bildgebung Experimente auftreten und zu verstehen, wie sie zu beheben können neue Benutzer helfen, oder die Bilder durch die Zusammenarbeit / kommerziellen Quellen zu erhalten. Ein häufiges Problem ist Aufladen der Probe, die hauptsächlich in Harz Regionen auftritt, die wenig oder keine gefärbten Material enthalten. In einem "positiven" Bild (dh. Cytosol erscheint weiß), die Kerne, Blutgefäße, und leere Harz Weiten erscheinen "geschwärzt". Darüber hinaus Aufladung fördert auch lokale Strahldrift in der scheinbaren Imagewarping. Mögliche Lösungen variieren zwischen den Instrumenten und Proben. kV-Einstellungen Reduzierung reduziert die "Schwärzung" Artefakt kann aber mehr Strahldrift fördern. Mit einem unteren Vakuummodus und mit Stickstoff (N 2) Gas, Wasserdampf, usw. in der Kammer reduziert auch Lade-, aber zu einem erheblichen Kosten der Auflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Ein zweites gemeinsames Problem ist, Messer-Skipping. Langsamer Abtaststrahl induzierte Schäden an der Blockoberfläche verursachen kann, die für einige Bildgebung ungleichmäßig oder gar nicht schneidet / Schneidzyklen (dh. Aufeinanderfolgenden Bildern erscheint das gleiche). Es gibt mehrere Lösungen, die Schnitttiefe / Schichtdicke mit reduzierter z-Auflösung einschließlich der Erhöhung, Scan-Geschwindigkeit zu erhöhen und konsequent lautere Bilder zu akzeptieren, Pixelgröße zu reduzieren und niedrigere x / y-Auflösung zu akzeptieren, und (wie schlecht mit intensiver Färbung Proben oder Bereiche der Wahl färbten Flächen berechnen mehr, Schäden leichter und erfordern längere Belichtungs Bilder mit akzeptabler zu erhalten Verhältnisse von Signal zu -Noise). Debris erneute Ablagerung auf dem Block-face ist eine gelegentliche Quelle von Artefakten in Bildern, und wenn dies der Fall ist häufig kann die Übernahme erfordern Anhalten und sorgfältig das Messer (Blasluft) Reinigen oder etwas nachzutrimmen die Probe zu einer kleineren Größe. Block-face Ladung fördert auch erneute Ablagerung und Schritte oben MaiHilfe. Korrektur des Fokus und stigmation kann auch als die Mikroskopbilder Proben kontinuierlich für viele Stunden bis Wochen, während welcher Zeit die Vakuumtiefe erhöht sich in der Kammer erforderlich ist stigmation Korrekturen erforderlich. Jedes Rasterelektronenmikroskops unterscheidet sich je nach Alter und Eigenschaften, und Erfahrung ist der beste Führer. Plötzliche dramatische Veränderungen in stigmation oder Fokus kann auftreten, wenn geschnittene Material zu den Bildgebungskomponenten Mikroskop haftet. Die Kammer muss geöffnet und Material sorgfältig durch Vakuum oder Druck Stickstoff verdrängt werden. Dies erfordert absolut spezialisierte Ausbildung.

Es gibt einige Nachteile der SBFSEM Technologie in Bezug auf ihre Nützlichkeit Gehirnmitochondrien in analysieren. Ein großer Nachteil, die für alle Mikroskopie von festen Geweben, ist, dass sie statische Bilder von einem äußerst dynamischen Organell bietet. Mitochondrien werden kontinuierlich Spaltungs- und Fusionszyklen 26, sind mobil und entlang der n gehandelteurite verarbeitet 21. Defekte in der mitochondrialen Handel und Dynamik , die nicht rein numerische oder strukturelle sind , können leicht durch diesen Ansatz verfehlt werden, obwohl, indem man die Anzahl der Mitochondrien in einer anatomisch definierten Raum wie Präsynapse sucht man interpretieren kann , wenn der Transport von Mitochondrien 39 verändert werden kann , . Ein zweiter Nachteil ist, dass es nur in einem kleinen Teil des Gehirns durchgeführt wird, damit die Schaltungsanordnung spezifische Defekte in mitochondrial Verteilung verfehlt werden kann. Korrelative Ansätze 28,46 die Möglichkeit bieten , die konfokale und Multiphotonen - Bildgebung mit SBFSEM Technologie zu kombinieren sowohl die molekularen und Ultrastrukturdaten zu erzeugen. Für mitochondriale Analyse daher kann es nützlich sein, die SBFSEM nach lichtmikroskopischer Untersuchung von Hirnschnitten auszuführen entweder durch die mitochondriale Antigen spezifischen Antikörper oder durch ein Transgen verwendet, die fluoreszierendes Protein mitochondrial-bezogene Ausdruck bringt. Diese combinational Strategie kann eine robuste Methode zur Verfügung stellen, um die mitochondriale Defekte in Mausmodellen von neurologischen und mitochondrialen Erkrankungen zu identifizieren.

Es gibt auch technische Beschränkungen, die in vielen Formen der Elektronenmikroskopie durch den Einsatz von harten Fixierungen, Schwermetallfärbung und unebene Eindringen von Chemikalien. Weitere Einschränkungen aus der Kunststoff-Einbettung von Gewebeproben stammen können. Leere Regionen Harz und dünn gefärbten Strukturen behalten Elektronen während der Bildgebung, Strahlablenkung und Drift verursacht (Bild Warping) sowie artifactual Ladesignale (z. B. dunkle Kerne und Blutgefäßlumen), die beide auf Auflösung auftreffen. Strahl Schäden an dem Harz fördert auch die ungleichmäßige Schneiden, und aus diesem Grund Bildgebung erfordert typischerweise Scheiben von 50 bis 100 nm aus dem Block-Gesicht geschnitten werden, die Herstellung von nicht-isotrophic Voxel in den Datensätzen. Weitere Einschränkungen für einige Anwendungen beinhalten, dass die Abschnitte zerstört und kann nicht nachträglich erneut untersucht werden,die Anwender zwingen können hochauflösende Bilder von Bereichen zu sammeln, die nicht sinnvoll, Daten enthalten könnten.

Ein großer Vorteil der SBFSEM ist , dass sie den Prozess der sectioning und Bildgebungsblöcken von Gewebe automatisiert durch eine benutzerdefinierte Mikrotom in eine niedrige Vakuum SEM Kammer 32,33 enthält. Da die Bilder direkt aus dem Block-Gesicht vor jedem Schnitt erhalten werden, werden die Probleme der Abschnitt Knittern, Kompression und Verlust während der Behandlung im Wesentlichen vermieden, obwohl Schutt Ablagerung und Verwerfungen aufgrund Block-face Ladung bis zu einem gewissen Imageverlust und Verzerrung tragen . Darüber hinaus werden die Bilder im RAW-Datensätzen erhalten bereits ausgerichtet und nur Mikrometer-Maßstab eine Registrierung erforderlich ist, um Strahldrift, um die meisten Analyse zugänglich untergebracht werden. Aufgrund der automatisierten Schneidens, sobald das System Vakuum stabilisiert hat, große Mengen von Gewebe ohne wesentliche Beteiligung des Bedieners abgebildet werden. Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung dieserTechnologie in morphologische und quantitative Studien über Organellen und intrazelluläre Strukturen durchgeführt wird. Ein Vorteil ist immer die Informationen über die 3D-Struktur der Mitochondrien innerhalb einer angemessenen Höhe der Zeit. Die Verfügbarkeit von Open - Source - Rekonstruktionssoftware - Pakete wie Reconstruct 47, TrakEM 48 und Knossos 49-51 haben diese Technologie ein leistungsstarkes analytisches Werkzeug gemacht , wo detaillierte 3D Ultrastruktur von neuronalen Netzwerk aus experimentellen Tiermodellen können direkt verglichen werden. Die halbautomatische und vollautomatische Bildanalyse Ansätze 52 sind voraussichtlich betroffenen sehr mechanistische Daten in Tieren , bei denen die mitochondriale Morphologie, Funktion und / oder Biogenese werden voraussichtlich zu erzeugen. Früher wurde SBFSEM Analyse durch, aber neuere Techniken der Probenvorbereitung verbesserte Einbeziehung Färbemethoden 40 haben die Auflösung in einem Ausmaß deutlich geringere Auflösung stark behindert verbessert , dass auch nur eine einzige synaptische vesicle können leicht gelöst werden. Bei dieser Auflösung ultrastrukturelle Defekte in Mitochondrien wie Vakuolisierung, Membranzerstörung und Verlust der Cristae leicht beobachtet werden kann, und die Verteilung der defekten Mitochondrien in den Zellen kann 38,39 bestimmt werden. Die hohe Auflösung dieser Technik stellt einen großen Vorteil gegenüber der Lichtmikroskopie, wo die Auflösung auf ~ 200 nm in XY-Achse und ~ 500 nm in Z-Achse beschränkt ist. Mitochondrien sind daher nur bei der Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie 53. Obwohl Mitochondrien Abmessungen unterhalb der Auflösungsgrenze aufweist, kann immer noch durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden, deren Abmessungen nicht zuverlässig gemessen werden kann. Wichtig ist, dass die Mitochondrien, die durch einen Abstand kleiner als die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops getrennt sind, können nicht durch Lichtmikroskopie gelöst werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die mitochondriale Strukturanalyse kann im Rahmen des Gewebes durchgeführt werden, ohne Isolierung des Organell. Dies kann alniedrig für entsprechende Vergleiche innerhalb des Gewebes auf die mitochondriale Lokalisation basiert, für zB axonalen vs. somatischen und / oder dendritischen Mitochondrien. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass es in der Regel möglich ist, bei der Lokalisierung zu bestimmen, ob die Mitochondrien sind neuronal oder Neuroglia durch die Prozesse zu bestimmendes Organell folgenden, wie glial Filamente und Glykogen für Astrozyten oder Oligodendrozyten Myelin für. Die Prozesse der Neuronen und Neuroglia-Zellen sind oft in unmittelbarer Nähe und mit 2D wie TEM nähert, kann es schwierig sein, mit Zuversicht zuzuordnen, die Prozesse sind neuronale und welche neuroglialen.

Zusammenfassend stellt die SBFSEM Technologie Stapel von seriellen Bilder abdeckt Gewebebereiche 20 - 1,000 & mgr; m in der Größe mit ultra Auflösung von 5 - 10 nm oder höher, die gesamte Zentralnervensystems Zellen und Organellen wie Mitochondrien ermöglicht abgebildet werden, gemessen und rekonstruiert . In diesem Papier haben wir proeinige praktische Ansätze vided Verwendung dieser Technologie zu machen. Zukünftige Anwendungen umfassen die mitochondriale Struktur und Verteilung in verschiedenen Tiermodellen von neurologischen Erkrankungen wie neurologischen Entwicklung und neurodegenerative Krankheitsmodellen sowie die Analyse der verschiedenen subzellulären Ultrastrukturen wie endoplasmatischen Retikulum, Zellkern und / oder Lysosomen in ganzen Zellen oder Geweben unter gesunden Analyse und Krankheitszustände.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

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References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

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Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

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