Abstract
人間の脳は、主燃料源として、グルコースに依存している臓器を消費する高エネルギーです。グルコースは、アデノシン三リン酸（ATP）の形態の細胞エネルギーを産生するために、解糖、トリカルボン酸（TCA）サイクル及び酸化的リン酸化（OXPHOS）経路を介して脳ミトコンドリアによって異化されます。ミトコンドリアのATP産生の障害は、顕著な神経学的および筋疾患の症状を臨床的に提示するミトコンドリア障害を引き起こします。ミトコンドリアの欠陥はまた、神経発達障害（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害）および神経変性疾患に存在している（ 例えば 、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病）。このように、健康と病気の両方の状態の下でミトコンドリアの形態、構造と分布の3次元解析を行うためのフィールドへの関心の高まりがあります。脳ミトコンドリアの形態は、特にいくつかのミトコンドリアで、中のものは極めて多様ですシナプス領域は、従来の光学顕微鏡の解像限界以下である<200 nmの直径の範囲にあります。脳内のミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現することは著しく、共焦点顕微鏡によるオルガネラの検出を強化します。しかし、大型ミトコンドリアの画像を過飽和することなく、比較的小サイズのミトコンドリアの検出感度の制約を克服していません。シリアル透過電子顕微鏡が正常神経シナプスにおいてミトコンドリアを特徴付けるために使用されてきたが、この技術は非常に時間のかかる複数のサンプルを比較する場合は特にです。シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBFSEM）技術、組織、およびデータ収集の撮像ブロックを切片の自動化プロセスを含みます。ここでは、急速にミトコンドリアの形態を再構築し、視覚化するげっ歯類の脳から定義された領域のSBFSEMを実行するためのプロトコルを提供します。このハイテクniqueはまた、定義された脳領域におけるミトコンドリアの数、量、サイズおよび分布に関する正確な情報を提供するために使用することができます。得られた画像の解像度は、（典型的には10nm未満）高いため、任意の総ミトコンドリアの形態学的欠陥も検出することができます。
Introduction
ミトコンドリアは細胞骨格との緊密な相互作用において、そのようなニューロン1におけるカルシウム電流などの細胞事象に応答して、携帯手がかりやニーズに応じて、その形状と位置を変更する動的な細胞小器官です。ミトコンドリアはまた、他の細胞小器官と相互作用順番に彼らのダイナミクスと代謝2を調節する小胞体を、 例えば 。ミトコンドリアの形態、 すなわち異なる細胞型における不均一性を示しています。細胞小器官の形状は、筒状のシート、袋や楕円3からなるものに変化します。ミトコンドリアの融合および分裂周期タンパク質は、ミトコンドリア4の位置、大きさ、形状及び分布を調節することができることが示されています。また、ミトコンドリアの形状の変化は、神経変性、神経可塑性、筋萎縮、カルシウムシグナル伝達、活性酸素種の生成だけでなく、寿命及び細胞死関与股関節に関連していますT細胞特異的なミトコンドリアの形態は、正常な細胞機能5-11の維持に重要です。
ミトコンドリアの主要な生体エネルギー機能は、TCAサイクルを介して、完全な栄養素の破壊（ すなわち 、グルコース、脂肪酸、酸またはアミノ酸）を含んでおり、OXPHOSが12を経路代謝反応のシリーズを実行することにより、アデノシン三リン酸（ATP）を生成することです。人間の脳は、体重のわずか2％しかし、それは〜それを器官13を要求する非常にエネルギーを作る製造全エネルギーの20％を消費する構成します。ヒトにおけるミトコンドリア機能障害は、神経学的症状14-17の多くをもたらすことは驚くべきことではありません。 5000個人、およびmの最も一般的な原因の1：ATP生成を損なうOXPHOSコンポーネントの遺伝的変異は、臨床的に不均質な〜1の有病率と疾患群であるミトコンドリア病17,18につながり、子供と大人でetabolic障害。ミトコンドリア由来のATPの赤字は、脳、心臓および骨格筋は、主にこれらの患者14,17,18に影響されるような高エネルギー厳しい臓器で複数の器官系に影響を与えます。近年では、複数の研究では、神経発達と神経変性疾患15-17,19,20両方におけるミトコンドリア機能障害のための証拠を提供しました。ミトコンドリアが不可欠と脳の発達と機能に重要であるので、健康と病気の両方の状態の下で脳ミトコンドリアの形態、構造、大きさ、数および分布の変化を分析することができるプロトコルを開発することが不可欠です。ミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するマウスモデルは、脳21,22ミトコンドリア運動および局在化を可視化するために製造されています。これはミトコンドリアの運動性と一般的な分布を調べるために非常に便利なツールですが、INCLUDいくつかの欠点があります電子限られた解像度および蛍光顕微鏡の感度。これらの属性は、それが困難な比較的小さなサイズのミトコンドリアを追跡することを可能にします。同様に、シリアル伝送電子顕微鏡が正常シナプスミトコンドリア23を表示するために使用されてきたが、この方法は非常に時間がかかります。ミトコンドリアの形態は、それらが連続的な分裂および融合サイクルを受けるように非常に動的であることが知られており、大部分の細胞においてミトコンドリアは非常に接続されたネットワーク24〜26に維持されます。ニューロンは、複数の樹状突起と拡張軸索と高度に極性細胞であり、細胞体で接続された網状ネットワークを形成するミトコンドリアは、彼らがこれらの神経突起を介して自分の道（ 図1）を作るように分離する必要があります。これは、大きさや形状が極めて多様な脳ミトコンドリアを作ります。例えば、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡を用いて（SBFSEM）技術は、我々が以前に観察されたシナプスmitochondrの体積またはサイズの違いとりわけ神経終末に存在するミトコンドリアに限り16として倍の27とすることができます。
ボリュームを実施するためのいくつかのアプローチがありますウルトラSEM 30収集シリアルセクションのTEM 29、自動化されたテープを含む、28の分析は、イオンビームSEM 31、およびSBFSEM 32を集中しました。 SBFSEM分析は、脳、1ミリメートルまでの領域におけるミトコンドリアのように、それは形態学的形状、大きさ、分布、および細胞小器官の数の定量的データを提供するために解像度を有するという利点を有します。技術的な操作は、以前のEMの経験が不足している多くの生物学的研究室の能力の範囲内のデータ収集と分析しても、少なくとも厳しいです。連続切片のような画像を生成するための市販の装置の出現は、組織の3次元超微細構造解析を行っている、さらに迅速かつ繰り返し可能な方法28で公平な容積測定分析を可能にするルーチン技術、 33でレイトンによって導入されたアイデアをもとに、2004年32に記載されており、神経生物学の分野で使用された。それ以来、複数の研究は、神経回路34の再建分析の主要なツールとして、この技術を確立しました。また、多くの小規模なプロジェクトのために、それは、細胞小器官27,35-39を識別するために、再構成分析を提供します。以降、取得された画像は、低電圧後方散乱電子から誘導され、別の既知の重金属染色技術を組み合わせた新たな染色プロトコルは、解像度40を増加させるために開発されました。
本稿では、3次元電子顕微鏡イメージング、以前に私たちと他の人38,39,41によって使用されている方法に基づいて脳ミトコンドリアの容量分析を利用するためのプロトコルを提供します。組織後処理方法として以前Deerinck らによって記載された使用40。
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Protocol
倫理文：動物を対象とする手順は、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
注意：このプロトコルで使用されるいくつかのコンポーネントを処理し、廃棄する際エクストリーム予防措置を講じなければなりません。使用前に、地元の施設の指針と健康と安全慣行を確立し、従わなければならない、特に揮発性および非常に有毒である四酸化オスミウム、ため、重金属やソース放射能の、および硝酸鉛の両方である酢酸ウラニル、あります重金属毒。チオカルボ（TCH）は、取扱いを誤ると、爆発や有毒ガスを生成するために分解することができます。多くの機関は、これらの試薬は、日常的に利用され、支援を提供することができるでEMの中核施設を持っています。
脳組織とSBFSEMイメージングの作製
- 5％のisoflura - 4を使用して、C57黒色マウス（C57BL / 6J株） - 若い（4カ月齢〜2）麻酔機関のガイドライン以下のね。筋緊張、随意運動と尾のピンチのような嫌悪刺激に対する応答の欠如の損失を監視することによって麻酔を確認してください。
- 解剖トレイの上でマウスをピンと腹側正中線に沿って皮膚に切開を行います。マウスの胸郭を公開するために、皮膚のさらなる切開を行います。横隔膜を切開し、慎重に拍動する心臓を露出するように外周に沿って胸腔を解剖してから、右心房に切開を行います。
- 蝶のカニューレを使用して、左心室にカニューレを挿入。失血は、肝臓の色の変化によって確認されるまで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2の20mlの - 10を使用して経マウスを灌流。
注：肝臓の色の変化は、失血の程度を決定するためのガイドとして使用されます。赤褐色から肝臓の色の変化はピンクの淡いすることを確認してください。 - 2％のグルタルの20ミリリットル - 経10を用いてマウスを灌流アルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドが内から急速に脳組織を固定するために、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）で行われました。固定テール硬化を観察することによって監視されます。
注：pHを調整し、水で100mlにボリュームを作るために塩酸を追加し、80ミリリットルの水にカコジル酸ナトリウムの2.14グラムを溶解することにより、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）を準備します。 - 4 O℃で48時間、2％グルタルアルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドを含有する0.10 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）に固定することにより、その後、灌流に続いて、マウスの首を切る、脳を解剖
- 48時間後ビブラトームを用いて400μmの冠状切片を作成した後、慎重に解剖顕微鏡42の下（例えば、海馬）脳内の関心領域を分析。慎重に組織をトリミングして、向きを保存するための写真を撮ります。
注：処理方法SBFSEMで組織染色のポストは中の重金属染色の様々な方法を組み合わせて順序は、分解能を向上させるとDeerinck ら 40によって以前に開発された方法に基づいています。 - 0.1 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）にグルタルアルデヒド固定組織を3回、各5分洗浄します。
- 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）でタンニン酸を溶解することにより、0.1％タンニン酸溶液を調製します。溶解するまで旋回し、必要に応じて、0.45μmのフィルターでろ過します。
- RTで60分 - カコジルとPostfixの組織は、30のための1ミリリットルの試薬でインキュベートすることにより、0.1％タンニン酸緩衝しました。
注：インキュベーション時間は、組織のサイズに依存するが、30分には、ほとんどの組織に最適です。 - ウォッシュは、カコジル酸緩衝液（pH 7.2）で、5分ごとに3回を組織します。
- 0.3グラムのフェロシアン化カリウムおよびH 2 O（ の dH 2 O）10mlの蒸留で0.86グラムのカコジル酸ナトリウムを溶解させます。氷上のフェロシアン化カリウム溶液を保管してください。使用直前に、4％の四酸化オスミウム（OsO 4）の10ミリリットルを追加します。
- 2％のOSで組織を染色氷上で90分間mium-フェロシアンソリューション、。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄
- 1％チオカルボヒドラジド（TCH）溶液を10mlのdH 2 O中の0.1 gでTCHを溶解することによって調製します完全に溶解するまで10分ごとに旋回することにより、60℃で溶解します。 TCHの処理中に安全上の注意事項を守って、特に金属の使用を避けるように注意してください、高温に加熱、または溶液を乾燥させること。
- RTで20分間、新たに調製した1％TCHのサンプルを扱います。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄
- dH 2 Oで2％ま でのOsO 4 4％を希釈し、1時間インキュベートすることにより2％水性四酸化オスミウムで染色組織。 dH 2 Oで洗浄組織3回、各5分
- 4℃での dH 2 O中の1％酢酸ウラニルでサンプルO / Nインキュベートします。
- （Deerinck ら 40によって記載されるように）ウォルトンのリードアスパラギン酸溶液を調製します。
- 250ミリリットルのdH 2 O中に0.998グラムのL-アスパラギン酸を溶かしpHが5.5に達するまで、次に滴下様式で、10Nの水酸化カリウム（KOH）を加えます。 pH調整した後、30分間60℃に10ミリリットルにアスパラギン酸ストックと熱を硝酸鉛の0.066グラムを追加します。
- dH 2 Oで組織をすすぎ、60℃のオーブンで30分間ウォルトンのリードアスパラギン酸染色でインキュベートします。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄
- 100％エタノール、続いて、5分ごとに20％、50％、75％、85％および95％エタノールの冷蔵溶液を用いてアルコールを段階的な一連の3回、10分毎にサンプルを脱水します。
注：開かれたエタノールは、空気中から水分を吸収するように、新たにオープンした瓶から100％エタノールを使用すると失敗する埋め込む引き起こします。インキュベーション時間が長いほど、より大きな組織サンプルでは必要になります。 - プロピレンオキシドで洗浄サンプル2回、15分ずつ。
- NMA（ナジックメチル無水物）と1ミリリットルmlで10.5、25ミリリットルの樹脂を用いたプラスチック包埋樹脂を作るDDSA（ドデセニル無水コハク酸）、15.5DMP-30（2,4,6-トリスジメチルアミノメチルフェノール）。振盪することにより、樹脂を混ぜます。スピンとは、樹脂が泡決意するまで放置します。
注：これは、標準培地硬度のレシピです。電子顕微鏡の他のタイプ（EM）プラスチック樹脂を用いてもよいが、必ずしもすべての樹脂はSBFSEMのために働くように、事前に非必須の対照試料を用いて試験されるべきです。 - 10時間 - プロピレンオキシドは、約8の期間にわたって蒸発するように、2時間後に、最初はその後、非キャップキャップされているバイアルに、包埋樹脂とプロピレンオキシドの50ミックス：50で組織O / Nインキュベートします。
- 2時間きれいなバイアルに100％の新鮮な埋め込み樹脂に組織を転送します。
- 平坦な金型中で新鮮な埋込樹脂で埋め込んだサンプルは、紙ラベルを印刷し、そして48時間60℃のオーブンでそれらを硬化含有します。約1時間後、再び組織の配置および整列をチェックし、必要に応じて調整します。
- 関心のある領域にサンプルをトリミングしてgellinを使用したアルミニウムピンにマウントその後グラムシアノアクリレート瞬間接着剤または導電性エポキシ樹脂、アルミ端子に導電性経路を提供するために、ブロックの側面の周りのコロイド銀ペーストでコート。
- チャンバ内ウルトラミクロトームステージと低kVの反射電子検出器32を備えた走査型電子顕微鏡システムを使用して組織標本を調べます。
注：走査型電子顕微鏡（SEM）を使用中の楽器とサイトトレーニングを取得し、許可されたユーザになります。また、小規模なプロジェクトのための研究者や中核施設との連携が可能です。 SEM写真は、X線を発生させるように放射訓練も必要とされ得ます。 - サンプル画像には、次の設定を使用します。2.25 kVで、5時 - 10ナノメートル/ピクセルの解像度、80の間のフィールドサイズの - xの250μmであり、Y（他のフィールドが可能なサイズ）、および50のスライス厚 - 100 nmで、 20時間の期間 - 16で600スライス - 250の合計。
注意：設定が異なる顕微鏡の間で実質的に変化し、INDIvidualサンプル、および所望の解像度。これらの設定は、多くのサンプルのために容易に解釈されている画像を生成する必要があります。
2.イメージングデータセットを分析
注：画像J /フィジーのソフトウェアは、データセットを分析するために使用され、TrakEM2プラグインに依存します。前処理ステップは、ソフトウェアのさまざまな方法を使って行ってもよいし、豊富なまたは経験レベルに応じて軽微であってもよいし、スタックが得られました。オープンソースソフトウェア（1.50b版ImageJの、フィジーは2015年10月1日のダウンロード）を使用して、メインの変換は、ここで説明されています。
- ソフトウェアで開き、→8ビットのメニュー項目画像→タイプを選択することで、元の独自の16ビット画像から8ビットTIFF形式に画像を変換します。
- このステップの間、自動コントラスト/明るさ変換は画像のための理想的でない場合は、16ビット画像を再度開き、プレスイメージ→→明るさ/コントラストを調整します。すべての画像のために働く範囲を選択し、[Apply]を押します。その後、Cを実行しますonversion。注：一部のSEMでは、このステップは、顕微鏡メーカーのソフトウェアが必要な場合があります。
- スライス間の許容できない画像の動きに、必要な場合（ 例えばによる充電にドリフト）、登録/画像スタック（メニュー項目のプラグイン→登録→リニアStackAlignmentWithSIFT）を合わせます。ほとんどの登録ソフトウェアでは、「翻訳のみ」モードではなく、「剛体」に設定されました。
SIFT登録プラグインの多くのアプリケーションのための作品や仮想スタックのバージョンがあります：多くのアプローチとソフトウェアが動作する可能性があります注意してください。- 必要な場合は、登録前にキャンバスサイズを拡大する（画像→→CanvasSizeを調整）または利息（画像→クロップ）の領域にそれを減らします。
いくつかのドリフトや扇形に開くが発生する可能性があり、および他のプラグインやソフトウェアをしようとすると、より良い結果を生む可能性があります注意してください。マニュアルオプションも（ 例えば ImageJを/ FIJI、プラグイン→登録→のManualLandmarkSelection）ご利用いただけます。
- 必要な場合は、登録前にキャンバスサイズを拡大する（画像→→CanvasSizeを調整）または利息（画像→クロップ）の領域にそれを減らします。
- デザイアーズ場合編、より小さく、より管理しやすいサイズにスケール画像（ 例えば 25％）のImageJ（画像→スケール）を使用。
- ソフトウェアを起動し、[ファイル]→[インポート]→[画像シーケンス、その後、TIFFファイルを選択します。
- （空白）新→TrakEM2→ファイルを選択して、プラグインを起動します。 2つのウィンドウが開きます。一つのプロジェクトとarea_listsを管理し、他のトレース管理し、「キャンバス」と呼ばれます。
- キャンバス、インポート時に右クリックを行うことで、プラグインに画像スタックをロードします。インポートを選択して、インポート・スタックをクリックしてください。ポップアップオプションでは、仮想スタックのためのチェックボックスをオンにします。
注：画像スタックが既にソフトウェアで開かれているが、彼らはまた、プラグインでオープンする必要があります。仮想スタックボックスがチェックされている場合は、コンピュータをより円滑に実行することができます。 - ミップマップが作成され、スタックがロードされた後、右側のプラグインウィンドウの下にプロジェクトの名前をクリックします。テンプレートCOLの「新しいプロジェクト」を右クリックしますUMN、およびそのプロジェクトのための「新しい子を追加」を選択します。右の「area_list 'を選択するには、もう一度クリックします。
- キャンバス上で右クリックし、元の電子顕微鏡写真の設定に同意するプロジェクトのZ軸スケールを設定し、表示をクリックして、キャリブレーションを選択します。また、右側のスケールZと厚さを選択する]をクリックし、プラグインウィンドウ内のすべてのレイヤを選択することにより、Z-スケールを設定。
- クリックして、「プロジェクト」とプロジェクトがキャンバスウィンドウ内の「Zスペース]タブの[地域のリスト」を作成するセクションオブジェクトにすべての「子供」をドラッグします。
- 色を選択し、設定する「領域リスト」を選択し、右クリックし。さて、電子顕微鏡写真の画像では、このようなミトコンドリアなどのオブジェクトを追跡するためにペイントブラシツールを使用します。使用「Shiftキー+クリック」でズームイン、ズームアウト、および消しゴムにペイントブラシカーソルをオンにする「Altキー+クリック」するには、「Ctrlキー+スクロール」、囲まれた円形に記入します。
- 15ミクロン - 〜10の二つの領域を選択します10で - 画像の左上隅と右下隅の15ミクロンとすると、各データセット内のミトコンドリアの公平なサンプリングを可能にするために、これらの領域内のすべてのミトコンドリアを識別します。
- 「キャンバス」で、セクション全体のミトコンドリアを観察し、トレースします。注：ミトコンドリアは同様のサイズの非常に暗い/稠密に現れる細胞小器官、直径が緩く円筒形です。内膜によって形成されたユニークなクリステはこの細胞小器官の内部に容易に区別可能です。
- トレースが終了したら、右、Zスペース]タブの下のarea_listをクリックして「3Dで表示」を選択します。これは、トレースされた画像の3D再構成を表示するには、3Dビューアプラグインを起動します。
- ミトコンドリアの体積測定、3Dビューアで選択したオブジェクトを実行するには、「編集」タブをクリックし、[オブジェクトのプロパティ]を選択します。ミトコンドリアの体積推定値は、いくつかの他の測定値と一緒に表示されています。
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Representative Results
我々は、脳ミトコンドリアの形態と大きさが異なるニューロンのサブコンパートメントにおいて不均一であることを示しています。ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスで形質導入された低密度の神経細胞培養上の共焦点顕微鏡は、遠位神経突起に存在するものは個別の細長い形態（ 図1 AB）を示すのに対し、神経細胞の細胞体に存在するミトコンドリアは、網状ネットワークを形成することを示しました。 SBFSEM技術を用いて、ミトコンドリアの形態、大きさ、量及び分布は、マウスの脳で分析しました。ミトコンドリアの三つ（3D）立体画像は、マウス脳の海馬において神経突起およびシナプスの両方から再構成しました。シナプス前ミトコンドリアを同定し、常駐のミトコンドリアを保有するシナプス前終末の数を定量しました。ミトコンドリアの大きさの不均一性は、（軸索コンパートメント対樹状Fiの中で観察されましたグレ1 CD）。また、マウス脳の海馬における多くの小さなシナプス前コンパートメントは、ミトコンドリア（ 図2 AC）を欠いていました。両方のシナプス前とシナプスミトコンドリアの体積測定は、ボリュームまたはニューロンpresynapses内に存在するミトコンドリアの大きさはシナプス外領域（ 図2 DF）に存在するものよりも有意に小さかったことを明らかにしました。興味深いことに、200非体性ミトコンドリアの公平なサンプリングから測定されたミトコンドリアの二次元（2D）のサイズ分布は、ミトコンドリア分画の11％が、光学顕微鏡の解像限界（ 図2G）を下回る〜たことを示しました。また、SBFSEM分析によって取得された2D画像は、個々のミトコンドリア（ 図3 AB）の超微細構造特性を可視化するための高解像度を提供します。組織のはっきりと目に見える地形に、細胞COMPを分類することが可能です核（体細胞）とシナプス小胞（シナプス前）（ 図3 AB）などの近さに容易に識別可能な構造を決定することにより、ミトコンドリアのartment。神経突起に存在するミトコンドリアを識別するためには、シナプス前終末それぞれ42の有無に基づいて軸索や樹状突起のような個々のプロセスを再構築します。これらの結果に基づき、我々はSBFSEMが脳組織においてミトコンドリアの形状、大きさ、数および分布を識別するための非常に貴重な分析技術であり、ミトコンドリアの構造および分布における任意の総欠陥はまた、この方法を用いて決定することができることを提案します。脳内の異なる細胞型の超微細構造特性は、例えばため、異なっています。星状細胞におけるグリコーゲン顆粒の存在は、脳ミトコンドリアにおける細胞型特異的な違いを分析することも可能です。
図1：生後1日目仔マウスから神経細胞ミトコンドリアの形態と分布における不均一皮質培養物は、レンチウイルスは、ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質（水戸-GFP）を発現する形質導入しました。 （A）は、水戸-GFPを発現する神経細胞の細胞体を示し、ミトコンドリアの形態の網状ネットワークを注意してください。ニュー=核;スケールバー=5μmです。 （B）は 、遠位神経突起内の細長いミトコンドリアの形態を示しています。スケールバー=5μmです。 （C）マウスの脳組織から生成SBFSEMデータセットからの代表的な2D画像は、ミトコンドリアは樹状突起が茶色に染色され、青と軸索静脈瘤に染色され、緑色に染色されます。スケールバー=1μmです。 （D）マウスの脳組織の神経突起におけるミトコンドリアの3D再構成は、樹状突起と軸索のミトコンドリアindicat間の大きさの違いに注意してください。それぞれ大小の矢印でエド。スケールバー=1μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBFSEM）分析は、シナプス前終末におけるミトコンドリアの低存在を明らかにした （A）P15野生型マウスの海馬から得たSBFSEMデータセットの分析からの代表的な2次元ultramicrograph;。スケールバー=1μmです。 （B）は 10シナプス前神経終末の3D再構成を表示します。のみ4 10シナプス前終末のうちは、識別可能なミトコンドリアを示したことに注意してください。スケールバー=1μmです。 SBから173復元されたシナプス前神経末端の定量化を示す（C）バーグラフFSEMデータセットの分析。 （D）緑で青とシナプス前ミトコンドリア内のシナプスミトコンドリアを示すSBFSEMデータセットからの代表的な2D画像。スケールバー=1μmです。ソフトウェアを使用してSBFSEMデータセットから、シナプス前とシナプスミトコンドリアの（E）の3D再構成。スケールバー=1μmです。 （F）バーグラフは、シナプスとシナプス前ミトコンドリアの量を示します。データは、平均±SEMとしてプロットされています。 n = 3の異なるデータセット（62シナプス前ミトコンドリアと合計で80シナプスミトコンドリアが含まれます）。 * p値= 0.0405を示しています。 （G）画像の四隅で15 15によるμmの領域がマークされ、すべての非体細胞のミトコンドリアは、ランダムサンプリングを可能にするために同定されました。 〜200ミトコンドリアの少なくとも寸法を測定しました。円グラフは、〜非体細胞のミトコンドリアの11％は、光学顕微鏡の分解能限界未満であるディメンション内の<200 nmであったことを示しています。この図は、Bを持っていますチャバンら 27から適応EEN。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： マウス脳の外側膝状核からの2D SBFSEM画像 （A）外側膝状核（8/8ミクロン）からの2つの次元の代表SBFSEM画像領域の詳細な地形を実証します。相馬と核が示されています。スケールバー=2μmです。 （B）パネルAの注に赤い四角で示される領域の拡大ミトコンドリアの外膜と内膜だけでなく、クリステ形成が明瞭に見えること。地形や他の細胞小器官や細胞構造との関係も観察されます。 PSは、シナプス前ミトコンドリアの例を示していますそして、NSは非シナプス（NS）体細胞のミトコンドリアの例を示します。スケールバー=1μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
神経系の複雑さは、大きな組織のボリュームを再構築し、そのような十分な解像度を持つミトコンドリアなどの細胞小器官の形態や分布の分析に重要な課題を提起します。 3次元に拡張する多数のプロセスとニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを含む複数の細胞が脳組織43内で相互作用します。ミトコンドリアは細胞や遠くの過程の細胞体の両方に存在するので、ミトコンドリアの形態は、神経系（ 図1）で非常に多形性です。十分な解像度を有する適切な立体構造情報は、したがって、そのような共焦点または二光子顕微鏡44,45のような従来の光学顕微鏡法により取得することができません。電子顕微鏡法は、十分に高い分解能で神経組織の大量の再構築を可能にするだけで、現在利用可能な技術です。伝統的に、神経組織の3次元再構成が実現されています超薄切片29の連続切片の透過型電子顕微鏡（SSTEM）により、D。しかし、最近の技術の進歩は、ボリューム電子顕微鏡データの取得と自動化の品質が改善されています。
SBFSEMは最も薄い細胞プロセスに従うと、小器官を同定するのに十分な解像度で、数百マイクロメートルを超える3次元組織構造を再構成するために、走査型電子顕微鏡のチャンバ内の連続切片を組み合わせた自動化されたブロックの顔画像化技術であります。この技術は、日常的に、両方の無脊椎動物と脊椎動物の神経系を再構築するの見通しを開きました。これは、サンプル調製、走査型電子顕微鏡の操作、データ収集、画像後処理、および画像解析を含む複数の工程を含みます。これらの手順は、特殊なハンズオン走査型電子顕微鏡操作のためのトレーニングと認定が必要です。 3つの要因が評論家ですアルすなわち 。正しい脳の解剖学的領域を解剖高解像度の画像を取得し、適切な画像解析を行います。固定脳組織のビブラトーム切片からの関心の解剖学的領域を解剖した後、適切な向きを維持するために写真を撮ることが重要です。それ以外の場合はイメージングのための正しいサイトを確認することは困難です。高解像度の画像を得ることは、十分な固定および適切な定着後の染色手順に依存します。脳は死後、その超微細構造の急激な悪化を受けやすくなります。したがって、適切なtranscardial灌流法を使用してグルタルアルデヒド溶液中で脳を固定することが重要です。これは、少なくとも24時間、グルタルアルデヒド溶液中の脳のさらなる固定によって従わなければなりません。画像の解像度は、重金属染色の様々な方法の組み合わせに完全に依存しているのでquantifiablを取得するためのプロトコルで説明するように、後の固定方法に従うことが重要です電子画像。方法に記載のように解決策がなされるべきです。最後に、正確な画像分析のために分析されるべき細胞小器官/ sがトレースの前に（超微細構造特性を可視化することにより、 例えば 。）明確に識別されるべきであり、ソフトウェアのガイドラインを厳守しなければなりません。取得した画像の解像度は、画素から体積測定のためのナノメートルへの変換のために知られている必要があります。
画像解析を行うためのプロトコルに記載されているソフトウェアに加えて、他の利用可能なソフトウェアの再構築とクノッソス等も用いることができます。記述されたプロトコルの重点は、神経系におけるミトコンドリアの表示のですが、様々な組織における様々な他の細胞内構造上の高解像度の3D情報（ 例えば 、小胞体、リソソームなど 。）を生成するように変更することができます。
一方、走査型電子顕微鏡Oのための詳細なトラブルシューティングガイドperationは、この記事の範囲を超えている（楽器のユーザーマニュアルやトレーニングに関する情報を参照してください）、いくつかの問題が日常の実験を画像化し、それらをトラブルシューティングする方法を理解する時に発生する新しいユーザーまたはコラボレーション/商業的供給源を介して画像を得るそれらを助けることができます。一般的な問題は、ほとんど、あるいは全く染色された材料を含有樹脂領域で主に発生した試料の帯電されています。 「正」のイメージで（ すなわち 。細胞質ゾルは白色に見える）、核、血管、および空の樹脂広がりは「黒くなった」表示されることがあります。また、充電も見かけ画像ワーピングの結果ローカルビームドリフトを促進します。考えられる解決策は、楽器やサンプル間で変動します。 kVの設定を小さくすると、「黒化」アーティファクトを減少させるが、より多くのビームドリフトを促進することができます。下部真空モードを使用して、 等窒素（N 2）ガス、水蒸気を含みます。室内でも充電を減少しますが、解像度とシグナの実質的なコストでL対雑音比。第2の共通の問題は、ナイフスキップです。遅いスキャンは、いくつかのイメージング/切断サイクルのために、まったく不均一かカットブロック表面にビーム誘起損傷、原因となります（ すなわち 。連続した画像を同じように表示されます）。いくつかの解決策として不十分（縮小Z分解能を有する切削深度/スライス厚を増加させる走査速度を増加させ、結果的にノイズの多い画像を受け入れ、画素サイズを小さくし、下側のx / yの解像度を受け入れ、より強い染色を有する試料または領域を選択することを含む、存在します-stained領域）が損傷より簡単に、より多くを充電し、許容可能な信号対する比率を-noiseで画像を取得するために、より長いビーム露光を必要とします。ブロック面上のデブリの再付着は、画像内のアーティファクトの時折の源であり、これが頻繁に発生する場合には、取得を一時停止し、慎重にナイフ（送風）を清掃、または小さいサイズのサンプルをretrimmingが必要な場合があります。ブロック面充電も再付着を促進してもよく、上記の手順助けて。焦点とstigmationの補正は、真空深さがstigmation補正を必要とする、チャンバ内で増加する時間の間に連続的に数週間に多くの時間顕微鏡画像サンプルとして必要とされ得ます。各走査型電子顕微鏡は、年齢や特性に応じて異なり、経験は最高のガイドです。切片材料は、顕微鏡イメージング部品に付着した場合stigmationやフォーカスの突然の劇的な変化が発生することがあります。チャンバーが開かれ、材料慎重に真空または圧縮窒素を介して追い出されなければなりません。これは絶対に専門的なトレーニングを必要とします。
脳ミトコンドリアを分析する上で、その有用性に関してでSBFSEM技術のいくつかの欠点があります。固定組織のすべての顕微鏡に共通する主な欠点は、それは非常にダイナミックなオルガネラの静止画像を提供することです。ミトコンドリアは、連続的な核分裂と核融合サイクル26を受けるモバイルおよびnに沿って人身売買されていますeuriteは21を処理します 。ミトコンドリアの輸送は39を変更することができるならば、このようなプレシナプスのような解剖学的に定義された空間内のミトコンドリアの数を見て、1が解釈できる、が、純粋に数値的または構造的ではありませんミトコンドリア人身売買とダイナミクスにおける欠陥は簡単に、このアプローチでは見逃さすることができます。第2の欠点は、それがミトコンドリアの分布における特定の欠陥の回路従って、唯一の脳の小部分で行われることである見落とされてもよいです。相関は28,46は 、分子や超微細構造データの両方を生成するSBFSEM技術と共焦点および多光子イメージングを組み合わせる機会を与える近づきます。ミトコンドリアの分析のために、したがって、ミトコンドリアの抗原に特異的な抗体を使用することによって、またはミトコンドリア標的化蛍光タンパク質を発現する導入遺伝子を用いて、いずれかの脳切片の光学顕微鏡検査後SBFSEMを実行するために有用であり得ます。このcombinatio最終的な戦略は、神経およびミトコンドリア疾患のマウスモデルにおけるミトコンドリアの欠陥を識別するための堅牢な方法を提供することができます。
過酷な固定剤の使用、重金属染色や化学物質の不均一な浸透に電子顕微鏡の多くの形態に共通する技術的な制限もあります。他の制限は、組織サンプルのプラスチック埋め込みに由来することができます。樹脂の空き領域とまばらに染色された構造は、ビーム偏向とドリフト（画像はワープ）だけでなく、人為充電信号（ 例えば 。暗い核と血管内腔）の両方が、解像度に衝突、原因、撮像中に電子を保持しています。樹脂の光損傷はまた、不均一な切断を促進し、このため、イメージングは、典型的には、50のスライスを必要とする - データセット内の非isotrophicボクセルを生成する、100nmのブロック面から切断します。いくつかのアプリケーションのための他の制限は、セクションが破壊され、その後再検査することができないことを含みますこれは有用なデータが含まれていない可能性がある領域の高解像度の画像を収集するためにユーザーを強制することができます。
SBFSEMの主な利点は、切片と低真空SEMチャンバ32,33内にカスタムミクロトームを組み込むことによって、組織のブロックを画像化するプロセスを自動化することです。画像が前カットごとにブロック面から直接得られるので、デブリの堆積とによりブロック-顔充電に反りがいくつかの画像の損失や歪みに寄与しないものの、セクションのしわの問題は、取り扱い時に圧縮および損失は、実質的に回避されます。さらに、生のデータセットで得られた画像は既に整列最も解析に従順であるために、ビームドリフトを収容するためにのみマイクロメートルスケールの登録を必要としています。システムの真空が安定した後ために自動化された切片処理について、組織の大容量は、かなりのオペレータの関与なしに撮像することができます。これを使用して複数の利点があります細胞小器官や細胞内構造上の形態学的および定量的な研究を行う上での技術。一つの利点は、妥当な時間内のミトコンドリアの3次元構造に関する情報を得ています。再構築47、TrakEM 48クノッソス49-51のようなオープンソース再構築ソフトウェア・パッケージの可用性は、この技術実験動物モデルからの神経回路網の詳細な3Dの超微細構造を直接比較することができる強力な分析ツール行きました。半自動、完全自動化画像分析52は 、ミトコンドリアの形態、機能および/ または生合成に影響することが予想される動物での高い機械的データを生成する可能性がある近づきます。以前SBFSEM分析は大きく低解像度のために妨げられた、強化された染色法40を含むが、より新しい試料調製技術はかなりの程度の解像度が向上していることも、単一のシナプスVesicleは容易に解決することができます。この解像度で、このような空胞形成、膜破壊、およびクリステの損失としてミトコンドリアにおける超微細欠陥を容易に観察することができ、細胞内の欠陥ミトコンドリアの分布38,39を決定することができます。この技術の高解像度は解像度がZ軸にXY軸で〜200 nmおよび〜500nmのに限定されている光学顕微鏡の上に大きな利点を提供します。ミトコンドリアは、単に光学顕微鏡53の解像限界でそのためです。解像限界以下の寸法を有するミトコンドリアは依然として光学顕微鏡によって可視化することができるが、それらの寸法を確実に測定することができません。重要なことは、光学顕微鏡の解像度限界以下の間隔で分離されているミトコンドリアは、光学顕微鏡によって解決することはできません。別の利点は、ミトコンドリアの構造解析は、細胞小器官を単離することなく、組織のコンテキスト内で実行することができることです。この缶アル例えば軸索対体細胞および/ または樹状ミトコンドリアのためのミトコンドリア局在に基づいて、組織内の適切な比較のために低いです。追加の利点は、ミトコンドリアが、そのようなオリゴデンドロサイトのためのアストロサイトまたはミエリンのためのグリアフィラメントおよびグリコーゲンとして、定義オルガネラへのプロセスに従うことによってローカライズにおけるニューロンまたは神経膠であるかどうかを判断することが通常可能であるということです。ニューロンおよび神経膠細胞のプロセスは、近接であることが多い、と2DはTEMなどに近づくと、プロセスがニューロンであり、神経膠である自信をもって割り当てることが困難な場合があります。
、撮像された測定され、再構築されるためにこのようなミトコンドリアなどの全体の中枢神経系細胞や細胞小器官を可能にするが10nm以上、 - 5の超微細解像度とサイズが1,000μmで - 結論として、SBFSEM技術は、組織領域20をカバーする連続画像のスタックを提供します。本稿では、プロ持っていますこの技術を利用するにはいくつかの実用的なアプローチをvided。将来のアプリケーションは、このような神経発達と神経変性疾患モデルなどの神経疾患の動物モデルの様々なミトコンドリアの構造と分布を解析するだけでなく、健康の下で全細胞または組織中で、このような小胞体、核および/またはリソソームなどの様々な細胞内微細構造を分析し、含ま疾患状態。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
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