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Neuroscience

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

O cérebro humano é um órgão alta consumindo energia que depende principalmente da glicose como fonte de combustível. A glicose é catabolizada pela mitocôndria do cérebro através de vias de glicólise, ácido tri-carboxílico (TCA) ciclo e fosforilação oxidativa (FOX) para produzir a energia celular na forma de trifosfato de adenosina (ATP). Comprometimento da produção de ATP mitocondrial provoca doenças mitocondriais, que apresentam clinicamente com sintomas neurológicos e miopáticos proeminentes. Defeitos mitocondriais também estão presentes em desordens do desenvolvimento neurológico (por exemplo, transtorno do espectro do autismo) e doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e Parkinson). Assim, há um aumento do interesse na área para a realização de análise 3D da mitocondrial morfologia, estrutura e distribuição em ambos os estados saudáveis ​​e doentes. A morfologia mitocondrial cérebro é extremamente diverso, com algumas mitocôndrias especialmente aqueles ema região sináptica estar na gama de <200 nm de diâmetro, que é inferior ao limite de resolução de microscopia óptica tradicional. Expressando uma proteína mitocondrial-alvo verde fluorescente (GFP) no cérebro aumenta significativamente a detecção organelar por microscopia confocal. No entanto, ele não superar os constrangimentos sobre a sensibilidade de detecção de pequenas relativamente mitocôndrias porte sem supersaturação as imagens de grande porte mitocôndrias. Enquanto microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para caracterizar mitocôndrias na sinapse neuronal, esta técnica é extremamente demorada, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A técnica de microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) envolve um processo automatizado de corte, blocos de imagem de tecido e aquisição de dados. Aqui, nós fornecemos um protocolo para realizar SBFSEM de uma região definida a partir de cérebro de roedores para reconstruir rapidamente e visualizar a morfologia mitocondrial. esta tecnologianique também poderia ser utilizado para fornecer informação precisa sobre o número de mitocôndrias, de volume, de tamanho e distribuição na região do cérebro definido. Desde a resolução da imagem obtida é alta (tipicamente abaixo de 10 nm) quaisquer defeitos morfológicos mitocondriais brutas também pode ser detectado.

Introduction

As mitocôndrias são organelos dinâmicos que alteram a sua forma e localização de acordo com as pistas e necessidades celulares, em interacção com apertado citoesqueleto celular, e em resposta a eventos celulares, tais como correntes de cálcio em neurónios 1. Mitocôndrias também interagir com outros organelos celulares, por exemplo, retículo endoplasmático, que por sua vez regula a sua dinâmica e metabolismo 2. Morfologia mitocondrial mostra heterogeneidade em diferentes tipos de células ou seja. a forma do organelo varia de tubulares para que consiste em folhas, sacos e ovais 3. Tem sido demonstrado que a fusão e fissão proteínas do ciclo mitocondriais pode regular a localização, tamanho, forma e distribuição das mitocôndrias 4. Além disso, alterações na forma mitocondrial estão associadas com a neurodegeneração, a plasticidade neuronal, atrofia muscular, a sinalização de cálcio, a geração de espécies de oxigénio reactivo, bem como tempo de vida e a morte celular implicando THAmorfologia mitocondrial especifica para a célula T é crítica para a manutenção da função celular normal de 5-11.

Uma das principais funções bioenergética da mitocôndria é a geração de trifosfato de adenosina (ATP) através da execução de uma série de reacções metabólicas que envolvem degradação completa de nutrientes (ou seja glucose, ácidos gordos ou aminoácidos) através do ciclo do TCA e OXPHOS vias 12. O cérebro humano constitui apenas 2% do peso corporal no entanto, consome cerca de 20% da energia total produzida tornando-se extremamente energia exigindo órgão 13. É, por conseguinte, não é surpreendente que a disfunção mitocondrial em seres humanos conduz a um grande número de manifestações neurológicas 14-17. As mutações genéticas em componentes OXPHOS que prejudicam leads geração de ATP para doenças mitocondriais 17,18, que são clinicamente grupo heterogêneo de doenças com uma prevalência de ~ 1: 5.000 indivíduos, e uma das causas mais comum de mdistúrbios etabolic em crianças e adultos. Déficit de ATP derivado de mitocôndrias afeta vários sistemas do órgão com os órgãos que exigem alta energia, como o cérebro, coração e músculos esqueléticos sendo influenciados principalmente nesses pacientes 14,17,18. Nos últimos anos, vários estudos têm fornecido evidências para disfunção mitocondrial em ambas as desordens do desenvolvimento neurológico e neurodegenerativas 15-17,19,20. Desde mitocôndrias é essencial e crítico para o desenvolvimento e funcionamento do cérebro, é imperativo desenvolver protocolos que podem analisar as mudanças no cérebro mitocondrial morfologia, estrutura, tamanho, número e distribuição sob ambos os estados saudáveis ​​e doentes. Modelos de rato com mitocôndrias-alvo a proteína fluorescente verde (GFP) foram produzidos para visualizar movimentos mitocondriais e localização no cérebro 21,22. Embora esta seja uma ferramenta extremamente útil para analisar a motilidade mitocondrial e distribuição geral, existem algumas desvantagens que inclue limitada resolução e sensibilidade da microscopia de fluorescência. Estes atributos tornam difícil acompanhar os relativamente pequenos mitocôndrias porte. Da mesma forma, microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para visualizar mitocôndrias sináptica 23, mas este método é muito demorado. Morfologia mitocondrial é conhecida por ser altamente dinâmicos uma vez que passam por ciclos contínuos de fissão e de fusão, e na maioria das células mitocôndrias manter uma rede altamente ligado 24-26. Os neurônios são altamente células com vários dendritos e axônios estendidos, e as mitocôndrias que formam uma rede reticular conectado no corpo da célula polarizada pode ter que separar como eles fazem seu caminho através destes neurites (Figura 1). Isso faz com que as mitocôndrias do cérebro extremamente variadas em tamanho e forma. Por exemplo, usando microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) técnica, observamos anteriormente que a diferença no volume ou tamanho do mitochondr extrasynapticIA para mitocôndrias presentes nos terminais do nervo pode ser tanto quanto 27 dezasseis vezes.

Existem várias abordagens para a realização de volume analisa 28, que inclui de série seção TEM 29, fita automatizada coleta ultramicrotome SEM 30, com foco Ion Beam SEM 31 e SBFSEM 32. A análise SBFSEM tem vantagens na medida em que tem a resolução de fornecer dados quantitativos sobre os morfológica forma, tamanho, número e distribuição dos organelos tais como a mitocôndria em áreas de até 1 mm do cérebro. A operação técnica é também o menos exigente, com aquisição de dados e análise dentro das capacidades de muitos laboratórios biológicos que não têm experiência EM anterior. O advento de instrumentos comerciais para gerar imagens de seção do tipo de série tem feito exame ultra-estrutural em 3D de tecidos de uma técnica de rotina, o que permite ainda uma análise volumétrica imparcial de uma forma rápida e repetível 28 32, baseado em uma idéia introduzida por Leighton em 1981 33. Vários estudos desde então estabeleceram esta técnica como uma ferramenta importante na análise de reconstrução do circuito neuronal 34. Além disso, para muitos projectos de menor escala, ele fornece uma análise de reconstrução para identificar organelas celulares 27,35-39. Uma vez que, as imagens obtidas são derivados de baixa tensão elétrons volta de dispersão, novos protocolos de coloração que combinam diferentes técnicas conhecidas de coloração de metais pesados ​​foram desenvolvidos para aumentar a resolução 40.

Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para a utilização de 3D ​​imagens de microscopia eletrônica e análise volumétrica das mitocôndrias do cérebro com base em métodos que foram usados ​​previamente por nós e outros 38,39,41. Os métodos de tecido pós-processamento utilizadas foram como anteriormente descrito por Deerinck et al40.

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Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) na Virginia Tech.

Cuidado: precauções extremas devem ser tomados no manuseio e descarte vários componentes utilizados neste protocolo. Antes do uso, o diretrizes institucionais e práticas de saúde e segurança local deve ser estabelecido e seguido, particularmente para tetróxido de ósmio, que é volátil e extremamente venenoso, acetato de uranilo, que é tanto um metal pesado e uma fonte de radioatividade, e nitrato de chumbo, que é um veneno heavy metal. Thiocarbohydrazide (TCH) pode decompor-se para produzir gases explosivos e tóxicos, se manuseados incorretamente. Muitas instituições irá ter uma opção de núcleo EM em que esses reagentes são rotineiramente utilizados e podem fornecer assistência.

1. Preparação do Tecido Cerebral e SBFSEM Imagiologia

  1. Anestesiar um jovem (~ 2 - 4 meses de idade) C57 rato preto (C57BL / estirpe 6J) usando 4-5% isoflurane seguindo as diretrizes institucionais. Confirmar anesthetization monitorando a perda do tônus ​​muscular, falta de movimentos voluntários e respostas a estímulos aversivos, como uma pitada cauda.
  2. Pin o mouse sobre uma bandeja de dissecação e fazer uma incisão na pele ao longo da linha média ventral. Adicione mais incisões na pele para expor a caixa torácica do rato. Inciso o diafragma, e cuidadosamente dissecar a cavidade torácica longo da periferia para expor o coração batendo, em seguida, fazer uma incisão no átrio direito.
  3. Utilizando uma cânula borboleta, canular o ventrículo esquerdo. Perfundir o rato transcardialmente usando 10 - 20 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS) pH 7,2, até exsanguinação é confirmada por uma alteração na cor do fígado.
    Nota: Uma mudança na cor do fígado é utilizado como um guia para determinar a extensão da exsanguinação. Confirmar que a cor fígado muda de marrom avermelhado a rosa pálido.
  4. Perfundir o rato transcardialmente usando 10 - 20 ml de 2% de glutaraldeído e paraformaldeído a 4% feita em tampão de cacodilato 0,10 M (pH 7,2), para fixar o tecido do cérebro rapidamente a partir de dentro. A fixação é monitorizado através da observação da rigidez da cauda.
    Nota: Preparar tampão de cacodilato 0,10 M (pH 7,2) por dissolução de 2,14 g de cacodilato de sódio em 80 ml de água, adiciona-se ácido clorídrico para ajustar o pH, e perfazer o volume a 100 ml com água.
  5. Após perfusão, decapitar o rato, dissecar o cérebro, seguido por fixação em tampão de cacodilato de sódio 0,10 M (pH 7,2) contendo 2% de glutaraldeído e paraformaldeído a 4% durante 48 horas a 4 o C.
  6. Após 48 h a 400 uM fazer cortes coronais utilizando um vibratomo e, em seguida, cuidadosamente dissecar a região de interesse no cérebro (por exemplo, no hipocampo) sob o microscópio de dissecação 42. Cuidadosamente cortar o tecido e tirar uma fotografia para a preservação de orientação.
    Nota: Os métodos de pós-processamento de coloração de tecidos em SBFSEM combina uma variedade de métodos de coloração de metais pesados ​​ema fim de melhorar a resolução e baseiam-se no método anteriormente desenvolvido pelo Deerinck 40 et al.
  7. Lavar os tecidos fixados com glutaraldeído, 3 vezes 5 minutos cada em tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,2).
  8. Preparar uma solução de ácido tânico 0,1% por dissolução do ácido tânico em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2). Agitar até à dissolução e filtra-se através de 0,45 um filtro se necessário.
  9. Sufixo os tecidos com cacodilato tamponada com 0,1% de ácido tânico, por incubação em 1 ml de reagente de 30 - 60 min à temperatura ambiente.
    Nota: O tempo de incubação é dependente do tamanho do tecido, mas 30 min funciona melhor para a maioria dos tecidos.
  10. Lavar os tecidos 3 vezes, 5 minutos cada em tampão de cacodilato (pH 7.2).
  11. Dissolve-se 0,3 g de ferrocianeto de potássio e 0,86 g de cacodilato de sódio em 10 ml de H2O destilada (dH2O). Manter a solução ferrocianeto de potássio em gelo. Imediatamente antes da utilização, adicionar 10 ml de 4% tetróxido de ósmio (OsO 4).
  12. Manchar os tecidos com 2% OSsolução mio-ferrocianeto durante 90 min, em gelo. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O.
  13. Prepare 1% solução (TCH) thiocarbohydrazide por dissolução de 0,1 g TCH em 10 ml dH2O Dissolve-se a 60 ° C por agitação cada 10 minutos até ficar completamente dissolvida. Observar as precauções de segurança durante o manuseio TCH, especialmente tomar cuidado para evitar o uso de metais, aquecimento a altas temperaturas, ou permitir que solução para secar.
  14. Tratar as amostras recém-preparado com um TCH% durante 20 min à TA. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O.
  15. Diluir 4% OsO4 a 2% com dH2O, tecidos mancha com 2% de tetróxido de ósmio aquoso por incubação durante 1 h. Lavar tecidos 3 vezes, 5 min cada um com dH 2 O.
  16. Incubar as amostras S / N em 1% de acetato de uranilo em dH 2 O a 4 ° C.
  17. Preparar a solução de aspartato a vantagem da Walton (como descrito por Deerinck et al 40).
    1. Dissolve-se 0,998 g de L-aspartato em 250 ml de dH2Oe, em seguida, adicionam-se 10 N de hidróxido de potássio (KOH) de uma forma gota a gota até o pH atingir 5,5. Após ajuste do pH, adicionar 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 mL de ácido aspártico estoque e aquecer a 60 ° C durante 30 min.
  18. Lavar tecidos em dH 2 O e incubar com mancha aspartato vantagem de Walton durante 30 min numa estufa a 60 ° C. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O.
  19. Desidratar as amostras através de uma série graduada de soluções de álcool usando refrigerada de 20%, 50%, 75%, 85% e 95% de etanol durante 5 min cada, seguido de 100% de etanol 3 vezes, 10 min cada.
    Nota: Use 100% de etanol a partir de garrafa recém-aberta, como o etanol abriu absorve a água do ar e causar a incorporação falhar. incubações mais longas são necessárias com amostras de tecido maiores.
  20. Lavar as amostras 2 vezes, 15 min cada em óxido de propileno.
  21. Adicione resina plástica incorporação usando 25 ml de resina, 10,5 ml DDSA (dodecenilo anidrido succínico), 15,5 ml NMA (anidrido nádico de metilo) e 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Misturar a resina por agitação. Rotação e permitir que a resina em repouso até bolhas determinação.
    Nota: Esta é a receita de dureza média padrão. Podem ser utilizados outros tipos de microscopia de resina plástica de electrões (EM), mas deve ser testado com uma amostra de controlo não-essencial antecedência como todas as resinas não funcionar para SBFSEM.
  22. Incubar os tecidos o / n em um 50: 50 mistura de óxido de propileno e resina de incorporação, num frasco que é tapado inicialmente, em seguida, destapado após 2 horas de modo a que o óxido de propileno evapora durante o período de cerca de 8-10 h.
  23. Transferir os tecidos a resina fresca de incorporação de 100% em frascos limpos durante 2 h.
  24. amostras incorporadas em resina incorporação fresco, em moldes plano que contém as etiquetas de papel impresso, e curá-las num forno a 60 ° C durante 48 h. Após cerca de 1 hora, verifique a colocação do tecido e alinhamento novamente, e ajustar, se necessário.
  25. Apare amostras para a área de interesse e montar sobre um pino de alumínio usando Gelling supercola cianoacrilato ou uma resina epóxi condutora, em seguida, revestir com prata coloidal colar em torno dos lados do bloco para proporcionar um trajecto condutor para o pino de alumínio.
  26. Analisar amostras de tecido usando um sistema de microscópio eletrônico de varredura equipado com um estágio ultramicrotome na câmara e baixa kV detector de elétrons retroespalhados 32.
    Nota: Obtenha-local que treina instrument- e em microscopia eletrônica de varredura (SEM) usar e se tornar um usuário autorizado. Alternativamente, a colaboração com uma facilidade pesquisador ou do núcleo para pequenos projectos pode ser possível. formação de radiação também pode ser necessária como SEMs gerar raios-x.
  27. À imagem das amostras, use as seguintes configurações: 2.25 kV, em 5-10 nm / pixels de resolução, com tamanhos de campo entre 80-250 mm em x, y (tamanhos possíveis outro campo), e espessura fatia de 50 - 100 nm, com um total de 250 - 600 um em fatias 16 - período de tempo de 20 h.
    Observação: As configurações variam consideravelmente entre diferentes microscópios, indiamostras indivi- e resolução desejada. Estas definições devem produzir imagens que são facilmente interpretável para muitas amostras.

2. Analisando o conjunto de dados de imagem

Nota: O software Image J / Fiji é usado para analisar o conjunto de dados e depende do plugin TrakEM2. etapas de pré-processamento podem ser realizados utilizando uma variedade de software, e pode ser grande ou pequena, dependendo do nível de experiência e as pilhas obtidas. As principais transformações que usam o software de código aberto (ImageJ ver 1.50b, FIJI baixar 01 de outubro de 2015) são descritos aqui.

  1. Converter imagens para o formato TIFF de 8 bits a partir das imagens de 16 bits proprietárias originais abrindo no software e selecionar itens do menu Imagem → Tipo → 8 bit.
    1. Se a conversão automática de contraste / luminosidade durante este passo não é ideal para imagens, reabrir as imagens de 16 bits, e prima Imagem → Ajuste → Brilho / Contraste. Selecione um intervalo que funciona para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, execute cONVERSÃO. Nota: Em alguns SEMs, este passo pode exigir software fabricante de microscópio.
    2. Se necessário, devido ao movimento de imagem inaceitável entre fatias (eg. Deriva devido à cobrança), cadastre-se / alinhar as pilhas de imagens (itens de menu Plugins → Registro → Linear StackAlignmentWithSIFT). Na maioria dos softwares de registro, definido para o modo de "tradução-only" em vez de "corpo rígido".
      Nota: Muitas abordagens e software pode funcionar: as obras de plug-in de registro SIFT para muitas aplicações e há uma versão pilha virtual.
      1. Se necessário, ampliar o tamanho da tela antes do registro (Imagem → Ajuste → canvassize) ou reduzi-la a uma área de interesse (Imagem → Cultura).
        Nota: Alguns deriva ou splaying pode ocorrer, e tentar outros plugins ou softwares pode produzir melhores resultados. Opções manuais também estão disponíveis (por exemplo. ImageJ / FIJI, Plugins → Registro → ManualLandmarkSelection).
    3. Se desired, imagens em escala de tamanho menor, mais manejável (ex. 25%) usando ImageJ (Imagem → Scale).
  2. O lançamento do software, selecione Arquivo → importação → sequência de imagens e selecione os arquivos de tiff.
  3. Inicie o plug-in selecionando Arquivo → nova → TrakEM2 (em branco). Duas janelas abrirá; um gerencia o projeto e area_lists eo outro administra o rastreamento, e é referida como a "tela".
  4. Carregue a pilha de imagem para o plug-in, fazendo um clique com o botão direito sobre a importação de lona. Escolha de importação e clique na pilha de importação. Nas opções de pop-up, marque a caixa de pilhas virtuais.
    Nota: Embora as pilhas de imagens já estão abertas no software, eles também devem ser abertas no plugin. O computador pode correr mais suavemente se a caixa de pilhas virtuais está marcada.
  5. Após os mipmaps são criadas e a pilha é carregado, clique direito de nomear o projeto sob a janela do plugin. clique direito em 'novo projeto' no colo templateUMN, e selecione "adicionar novo filho 'para esse projeto. Botão direito do mouse novamente para selecionar 'area_list'.
  6. Defina a escala do eixo Z do projeto de acordo com as configurações originais micrografia eletrônica com o botão direito na tela, clique em tela e selecione a calibragem. Além disso, definir a escala Z, selecionando todas as camadas na janela do plug-in, clique direito para selecionar Z escala e espessura.
  7. Clique e arraste o «projecto» e todas as 'crianças' seção para criar as "listas da área 'no separador' espaço Z 'na janela de lona no projeto objetos.
  8. Selecione a opção "lista de área" e clique direito para selecionar e definir uma cor. Agora, use a ferramenta pincel para rastrear objetos, tais como mitocôndrias, nas imagens micrografia eletrônica. Use 'Shift + clique' para preencher um círculo fechado, "Ctrl + rolar 'para zoom in e out, e' Alt + clique para converter pintura cursor do pincel em uma borracha.
  9. Escolha duas áreas de ~ 10 - 15 uMpor 10 - 15 mm no canto superior esquerdo e canto inferior direito da imagem e identificar todas as mitocôndrias dentro dessas áreas para permitir a amostragem imparcial das mitocôndrias em cada conjunto de dados.
  10. Na "tela", observar e rastrear mitocôndrias em todas as seções. Nota: As mitocôndrias são bastante escuro / organelas densas que aparecem, de tamanho similar de diâmetro e vagamente cilíndricas. O cristas única formada pela membrana interna são facilmente distinguíveis dentro dessa organela.
  11. Quando terminar com o rastreamento, clique direito sobre o area_list na guia espaço Z, selecione "Mostrar em 3D '. Isto irá lançar o plugin visualizador 3D para visualizar uma reconstrução 3D da imagem traçada.
    1. Para realizar medições de volume mitocondrial, selecione objeto no visualizador 3D, clique na guia "Editar" e selecione "Propriedades do objeto '. A estimativa do volume mitocondrial é listado juntamente com várias outras medições.

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Representative Results

Nós demonstramos que a morfologia mitocondrial cérebro e tamanho é heterogênea em diferentes sub-compartimentos neuronais. A microscopia confocal na densidade culturas neuronais baixos transduzidas com lentivírus expressando a proteína fluorescente verde mitocôndrias-alvo mostraram que as mitocôndrias que residem na soma neuronal formar uma rede reticular, ao passo que aqueles que residem em neurites distais apresentam uma morfologia alongada discreto (Figura 1 AB). Usando a técnica SBFSEM, a morfologia mitocondrial, o tamanho, o volume de distribuição e foram analisadas no cérebro do rato. Imagens em três dimensões (3D) de mitocôndrias foram reconstruídos a partir de ambas as neurites e sinapses no hipocampo do cérebro do rato. As mitocôndrias pré-sinápticos foram identificadas eo número de boutons pré-sinápticos que abrigam mitocôndrias residentes quantificados. A heterogeneidade no tamanho das mitocôndrias foi observada no dendrítica contra compartimentos axonais (Figura 1 CD). Além disso, muitos pequenos compartimentos pré-sinápticas no hipocampo do cérebro de ratinho eram desprovidas de mitocôndrias (Figura 2 CA). As medições volumétricas de ambas as mitocôndrias pré-sinápticos e extrasynaptic revelou que o volume ou tamanho das mitocôndrias que residem dentro dos presynapses neuronais foi significativamente menor do que aqueles que residem na região extrasynaptic (Figura 2 DF). Curiosamente, o dimensões (2D) de distribuição de dois tamanho das mitocôndrias medidos a partir de uma amostragem imparcial de 200 mitocôndrias não-somáticas mostrou que ~ 11% da fração mitocondrial encontra-se abaixo do limite de resolução de microscopia de luz (Figura 2G). Além disso, as imagens 2D adquiridos por análise SBFSEM proporcionam uma maior resolução para visualizar as características ultra-estruturais das mitocôndrias individuais (Figura 3 B). Devido à topografia claramente visível do tecido, é ainda possível classificar a amostra celularartment de mitocôndrias por determinação da sua proximidade com estruturas prontamente identificáveis ​​como núcleo (somática) e vesículas sinápticas (pré-sinápticos) (figura 3-B). A fim de identificar as mitocôndrias presentes nos processos neuronais, reconstruir o processo individual como axónio ou dendrito com base na presença ou ausência de pré-sinápticos boutons 42 respectivamente. Com base nestes resultados, nós propomos que SBFSEM é uma técnica analítica para identificar extremamente valiosa forma mitocondrial, tamanho, número e distribuição no tecido cerebral e de que quaisquer defeitos na estrutura brutas e distribuição mitocondrial também pode ser determinada usando este método. Uma vez que as características ultra-estruturais de diferentes tipos de células no cérebro são distintos, por exemplo. presença de grânulos de glicogênio em astrócitos, também é possível analisar as diferenças específicas de células-Type-In mitocôndrias do cérebro.

figura 1 Figura 1:. Heterogeneidade em Neuronal mitocondrial morfologia e distribuição culturas corticais de filhotes de rato pós-natal dia 1 foram transduzidas com lentivírus expressando mitocôndrias-alvo a proteína fluorescente verde (mito-GFP). (A) Mostra soma neuronal expressando mito-GFP, observe a rede reticulada da morfologia mitocondrial; Nu = núcleo; barra de escala = 5 mm. (B) mostra a morfologia mitocondrial alongado em neurites distais; barra de escala = 5 mm. Imagem representativa 2D a partir do conjunto de dados SBFSEM gerado a partir do tecido cerebral do rato (C), as mitocôndrias estão manchadas de verde, dendrites estão manchadas em varicosidades azuis e axonal estão manchadas de marrom; barra de escala = 1 m. (D) reconstruções 3D de mitocôndrias nas neurites de tecido cerebral do rato, observe a diferença de tamanho entre dendrítica e indicad mitocôndrias axonaled por grandes e pequenas seta, respectivamente; barra de escala = 1 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy (SBFSEM) análise revelou baixa abundância de mitocôndrias em terminais pré-sinápticos (A) ultramicrograph Representante 2D a partir da análise do conjunto de dados SBFSEM obtido a partir do hipocampo de camundongos selvagens P15;. barra de escala = 1 m. (B) Mostra a reconstrução 3D de 10 terminais nervosos pré-sinápticos. Note-se que apenas 4 dos 10 terminais pré-sinápticos mostrou mitocôndrias perceptível; barra de escala = 1 m. (C) Gráfico de barras que mostra a quantificação de 173 reconstruída terminais nervosos pré-sinápticos da SBanálise de dataset FSEM. (D) Imagem representativa 2D a partir do conjunto de dados SBFSEM mostrando a mitocôndria extrasynaptic na mitocôndria azuis e pré-sinápticos em verde; barra de escala = 1 m. (E) reconstruções 3D da mitocôndria pré-sináptico e extrasynaptic do conjunto de dados SBFSEM usando o software; barra de escala = 1 m. Gráfico (F) da barra que mostra o volume de mitocôndrias extrasynaptic e pré-sinápticos. Os dados são representados como média ± SEM; n = 3 conjuntos de dados diferentes (inclui 62 mitocôndrias pré-sinápticos e 80 mitocôndrias extrasynaptic no total); * Representa o valor de p = 0,0405. (G) Uma área de 15 por 15 mm em todos os quatro cantos de imagens foram marcadas e foram identificadas todas as mitocôndrias não-somáticas para permitir amostragem aleatória. A dimensão de menos de 200 ~ mitocôndria foi medida. Gráfico da torta mostra que ~ 11% de mitocôndrias não-somáticos foram <200 nm em dimensão que é inferior ao limite de resolução de microscopia de luz. Esta figura tem been adaptado de Chavan et al 27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: 2D SBFSEM Imagens da lateral Geniculado Núcleos de rato Cérebro (A) imagem Dois SBFSEM representante dimensional dos núcleos geniculado lateral (08/08 mm), demonstrando uma topografia detalhada da região.. Soma e núcleo são indicados; barra de escala = 2 mm. (B) Uma ampliação da área indicada por quadrado vermelho no painel A. Note-se que as membranas exterior e interior das mitocôndrias, bem como a formação de cristas são claramente visíveis. A topografia e relações com outras organelas e estrutura celular também é observado. PS indica exemplo de mitocôndrias pré-sinápticae NS indica exemplo de não-sináptica (NS) mitocôndrias somática; barra de escala = 1 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A complexidade do sistema nervoso apresenta um desafio significativo na reconstrução de grandes volumes de tecido e análise da morfologia e distribuição dos organelos tais como as mitocôndrias com resolução adequada. Várias células, incluindo neurônios, oligodendrócitos e astrócitos com numerosos processos estendidos em três dimensões interagem dentro do tecido cerebral 43. Desde mitocôndrias reside tanto na soma das células e dos processos distantes, morfologia mitocondrial é extremamente pleomorfo no sistema nervoso (Figura 1). Informação estrutural 3D adequado com resolução suficiente, portanto, não pode ser adquirido por meio de técnicas de microscopia de luz convencionais, tais como confocal ou de dois fótons de microscopia 44,45. A microscopia electrónica, é a única técnica disponível que permita a reconstrução de grandes volumes de tecido neural com suficientemente alta resolução. Tradicionalmente, a reconstrução 3D do tecido neural tem sido conseguird por microscopia de série de transmissão seção elétron (Haste) de cortes ultrafinos 29. No entanto, recentes avanços tecnológicos têm melhorado a qualidade de aquisição de dados de microscopia eletrônica de volume e automação.

SBFSEM é uma técnica de imagem de bloco-face automatizado que combina cortes seriados no interior da câmara de um microscópio eletrônico de varredura, a fim de reconstruir a estrutura do tecido 3D ao longo de centenas de micrômetros, com uma resolução que é suficiente para acompanhar os processos celulares mais finos e identificar pequenas organelas . Esta técnica abriu a perspectiva de reconstruir rotineiramente sistemas, tanto invertebrados e vertebrados nervosos. Ela envolve várias etapas, incluindo a preparação da amostra, a operação microscópio eletrônico de varredura, aquisição de dados, pós-processamento e análise de imagem. Esses procedimentos requerem hands-on formação e certificação para operação Microscópio Electrónico de Varrimento especializados. Três fatores são críticoisto é, ai. dissecando o cérebro correta região anatômica, a obtenção de imagens de alta resolução, e realizar análise de imagem adequada. Depois de dissecar a região anatômica de interesse a partir da fatia vibratome de tecido cerebral fixo, é crucial para tirar a fotografia para a preservação de orientação adequada. É outra forma pode ser difícil determinar o local correto para a imagem latente. Obtenção de imagens de alta resolução depende a fixação adequada e procedimentos adequados de coloração pós-fixação. O cérebro tende a sofrer uma rápida deterioração na sua ultra-estrutura após a morte. Portanto, é essencial para fixar o cérebro em solução de glutaraldeído utilizando o método de perfusão transcardial adequada. Isto deve ser seguido por uma maior fixação do cérebro em solução de glutaraldeído durante pelo menos 24 h. Uma vez que a resolução da imagem é completamente dependente da combinação de uma variedade de métodos de coloração de metal pesado, é crítica a seguir o método de pós-fixação conforme descrito no protocolo de aquisição quantifiable imagens. As soluções devem ser feitas conforme descrito nos métodos. Finalmente, para a análise de imagens precisas a organela / s a ser analisado deve ser identificado de forma inequívoca (por exemplo., Visualizando características ultra-estruturais) antes de rastreamento, bem como as orientações de software devem ser rigorosamente respeitados. A resolução das imagens adquiridas deve ser conhecida para a conversão de pixels para nanómetros para medições volumétricas.

Além disso o programa informático descrito no protocolo para a realização de análise de imagem, também pode ser utilizado de outro software disponível como reconstruir e Cnossos. Embora a ênfase do protocolo descrito na visualização é mitocôndrias no sistema nervoso, pode ser modificado para gerar alta resolução informação 3D em várias outras estruturas subcelulares (por ex. Retículo endoplasmático, lisossomas, etc.) Numa variedade de tecidos.

Enquanto um guia de solução detalhada para microscópio eletrônico de varredura operação está além do escopo deste artigo (ver manual instrumento de usuário e informações de treinamento), alguns problemas rotineiramente ocorrer durante experimentos com imagens e entender como resolvê-los pode ajudar novos usuários ou aqueles obtenção de imagens por meio de fontes comerciais de colaboração /. Um problema comum é o carregamento da amostra, que ocorre principalmente em regiões de resina que contêm pouco ou nenhum material de coradas. Em um "positivo" da imagem (ie. Citosol apresentado a branco), os núcleos, vasos sanguíneos, e extensões de resina vazios podem aparecer "enegrecido". Além disso, o carregamento também promove tração feixe local, resultando em aparente deformação da imagem. Possíveis soluções variam entre os instrumentos e amostras. Reduzir configurações kV reduz o artefato "escurecimento", mas pode promover mais feixe de drift. Utilizando um modo de vácuo inferior, e incluindo o gás de azoto (N 2), o vapor de água, etc. na câmara de carregamento também reduz, mas a um custo substancial de resolução e Signarelação L-para-ruído. Um segundo problema comum é faca de pular. Digitalização mais lenta pode causar feixe danos induzidos a superfície do bloco, que corta de forma irregular ou não por alguma imagem / ciclos de corte (ie. Imagens sucessivas parece o mesmo). Várias soluções existem, incluindo o aumento da espessura da profundidade de corte / fatia com reduzida z-resolução, aumentando a velocidade de digitalização e, consequentemente aceitando imagens mais ruidosos, reduzindo o tamanho do pixel e aceitando inferior x / y-resolução, e escolher amostras ou áreas com coloração mais intensa (como mal áreas -stained cobrar mais, os danos mais facilmente, e requerem exposição mais longa feixe para obter imagens com aceitável signal-to -noise proporções). Detritos redeposição no bloco-face é uma fonte ocasional de artefato em imagens, e se isso ocorrer com freqüência pode exigir parando a aquisição, e limpar cuidadosamente o (ar soprando) faca, ou retrimming a amostra para um tamanho menor. Bloquear-face carregamento também promove redeposição, e os passos acima podeSocorro. Correção de foco e stigmation também pode ser necessário que as amostras de imagens de microscópio continuamente durante muitas horas a semanas, tempo durante o qual a profundidade de vácuo aumenta na câmara, exigindo stigmation correções. Cada microscópio eletrônico de varredura varia de acordo com idade e características, e a experiência é o melhor guia. mudanças dramáticas bruscas de stigmation ou o foco pode ocorrer quando o material seccionado adere aos componentes de imagem de microscópio. A câmara deve ser aberto e material com cuidado desalojado através de vácuo ou nitrogênio comprimido. Este absolutamente requer treinamento especializado.

Existem algumas desvantagens da tecnologia SBFSEM no que diz respeito à sua utilidade na análise de mitocôndrias do cérebro. Uma grande desvantagem, comum a todos microscopia de tecidos fixos, é que ele fornece imagens estáticas de uma organela extremamente dinâmico. Mitocôndrias sofrer fissão e fusão ciclos contínuos 26, são móveis e traficadas ao longo do neurite processa 21. Defeitos no tráfico mitocondrial e dinâmicas que não são puramente numérica ou estrutural pode ser facilmente perdida por esta abordagem, embora, ao olhar para o número de mitocôndrias em um espaço anatomicamente definido como pré-sinapse pode-se interpretar se o transporte das mitocôndrias podem ser alterados 39 . Uma segunda desvantagem é que ela é realizada apenas numa pequena porção do cérebro, portanto, sistema de circuitos de distribuição de defeitos específicos nos mitocondrial podem ser perdidas. Correlativa aproxima 28,46 dar a oportunidade de combinar a imagem confocal e multiphoton com tecnologia SBFSEM para gerar ambos os dados moleculares e ultra-estruturais. Para a análise mitocondrial, portanto, pode ser útil para realizar a SBFSEM após exame ao microscópio óptico de cortes cerebrais, quer usando o anticorpo específico de antigénio mitocondrial ou usando um transgene que expressa as mitocôndrias-alvo proteína fluorescente. este combinaçãestratégia nal pode fornecer uma metodologia sólida para identificar defeitos mitocondriais em modelos de ratos com distúrbios neurológicos e mitocondriais.

Também existem limitações técnicas comuns a muitas formas de microscopia eletrônica, devido à utilização de fixadores duras, coloração de metais pesados ​​e de penetração desigual de produtos químicos. Outras limitações podem resultar da incorporação de plástico de amostras de tecido. Regiões vazias de resina e estruturas pouco manchadas reter elétrons durante o exame, fazendo com que a deflexão do feixe e deriva (imagem empenamento), bem como sinais de carregamento de artefatos (ex. Núcleos escuros e vasos sanguíneos lúmen), que tanto afetam a resolução. Feixe danos à resina também promove corte desigual e, por este motivo, a imagem latente tipicamente requer fatias de 50 - 100 nm a ser cortadas a partir do bloco de cara, produzindo voxels não isotrophic nos conjuntos de dados. Outras limitações para algumas aplicações incluem as secções que são destruídos e não pode ser reexaminada subsequentemente,o que pode forçar os usuários a recolher imagens de alta resolução de áreas que podem não contêm dados úteis.

Uma grande vantagem do SBFSEM é que automatiza o processo de corte e imagiologia de blocos de tecido, incorporando um micrótomo personalizada para um baixo vácuo SEM câmara 32,33. Uma vez que as imagens são obtidas diretamente do bloco-face antes de cada corte, os problemas da seção de rugas, compressão e perda durante o manuseio são substancialmente evitados, embora a deposição de detritos e deformação devido a bloquear-face carregamento contribuem para alguma perda de imagem e distorção . Além disso, as imagens obtidas em conjuntos de dados brutos já estão alinhados e requerem apenas um registo escala micrométrica para acomodar desvio de feixe, de modo a ser passível de mais análise. Devido ao processo de corte automatizado, uma vez que o vácuo do sistema tenha se estabilizado, grandes volumes de tecido podem ser visualizados sem a participação por parte do condutor. Existem várias vantagens da utilização destetecnologia na realização de estudos morfológicos e quantitativos sobre organelos e estruturas intracelulares. Uma vantagem é a obtenção de informação sobre a estrutura 3D da mitocôndria dentro de um período razoável de tempo. A disponibilidade de pacotes de software de reconstrução de código aberto como Reconstruct 47, TrakEM 48 e Knossos 49-51 fizeram esta tecnologia uma poderosa ferramenta analítica, onde ultra-estrutura 3D detalhada de rede neuronal de modelos animais experimentais podem ser comparadas diretamente. A análise de imagem semi-automático e totalmente automatizado aproxima 52 são susceptíveis de produzir dados altamente mecanicistas em animais, onde a morfologia mitocondrial, função e / ou biogênese se espera que sejam afetados. Análise anterior SBFSEM foi grandemente prejudicado devido à menor resolução, técnicas de preparação de amostras no entanto mais recentes envolvendo métodos de coloração melhoradas 40 melhoraram consideravelmente a resolução de tal forma que mesmo um único v sinápticaesicle pode ser facilmente resolvido. Neste resolução defeitos ultra-estruturais em mitocôndrias como vacuolização, ruptura da membrana, e a perda de cristas pode ser facilmente observado, e a distribuição de mitocôndrias defeituosas dentro das células pode ser determinado 38,39. A alta resolução de esta técnica fornece uma grande vantagem sobre a microscopia de luz, onde a resolução é limitada a ~ 200 nm no eixo XY e ~ 500 nm de eixo-Z. As mitocôndrias são, portanto, apenas no limite de resolução da microscopia de luz 53. Embora mitocôndrias com dimensões inferiores ao limite de resolução ainda pode ser visualizado por microscopia de luz, suas dimensões não pode ser mensurado com segurança. Importante, as mitocôndrias que são separadas por uma distância menor do que o limite de resolução de um microscópio de luz não pode ser resolvido por microscopia de luz. Outra vantagem é que a análise estrutural mitocondrial pode ser realizada no contexto do tecido, sem isolamento do organelo. Isto pode, albaixa para comparações adequadas dentro do tecido com base na localização mitocondrial, por exemplo axonal somática vs. e / ou mitocôndrias dendríticas. Uma vantagem adicional é que, geralmente, é possível determinar se as mitocôndrias são neuronal ou neuroglial em localização, seguindo os processos para uma organela definição, tais como filamentos gliais e glicogênio para astrócitos ou mielina para oligodendrócitos. Os processos de neurônios e células neurológicas são muitas vezes em grande proximidade, e com 2D abordagens como TEM pode ser difícil atribuir com confiança que os processos são neuronal e que são neuroglial.

Em conclusão, a tecnologia SBFSEM fornece pilhas de imagens seriadas cobrindo áreas de tecido de 20 - 1.000 fiM no tamanho com uma resolução ultra-estrutural de 5 - 10 nm ou mais, o que permite que as células inteiras do sistema nervoso central e organelos tais como as mitocôndrias a ser trabalhada, medido e reconstruída . Neste trabalho, nós temos proDESDE algumas abordagens práticas para fazer uso desta tecnologia. As aplicações futuras incluem a análise da estrutura mitocondrial e distribuição em grande variedade de modelos animais de doenças neurológicas, tais como modelos de doenças do neurodesenvolvimento e neurodegenerativas, bem como analisando as várias ultraestruturas subcelulares tais como retículo endoplasmático, o núcleo e / ou lisossomas em células completas ou tecidos sob saudável e estados de doença.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

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Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

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