Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analys av Brain Mitokondrier Använda Serial Block-Face Svepelektronmikroskopi

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

Mänskliga hjärnan är en energikrävande organ som huvudsakligen bygger på glukos som en energikälla. Glukos kataboliseras av hjärn mitokondrier via glykolysen tri-karboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering (OXPHOS) vägar för att producera cellulär energi i form av adenosintrifosfat (ATP). Nedskrivning av mitokondriella ATP produktionen orsakar mitokondriella sjukdomar, som uppvisar kliniskt med framstående neurologiska och myopatiska symptom. Mitokondriella defekter är också närvarande i nervsystemets sjukdomar (t.ex. autism) och neurodegenerativa sjukdomar (t.ex. amyotrofisk lateralskleros, Alzheimers och Parkinsons sjukdomar). Det finns således ett ökat intresse inom området för att utföra 3D analys av mitokondrie-morfologi, struktur och distribution under både friska och sjukdomstillstånd. Hjärnan mitokondriella morfologi är oerhört varierande, med några mitokondrier särskilt iden synaptiska området ligger i området av <200 nm i diameter, vilket är lägre än upplösningsgränsen av traditionell Ijusmikroskopi. Uttrycker en mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein (GFP) i hjärnan avsevärt förbättrar organeller upptäckt av konfokalmikroskopi. Men det inte övervinna de begränsningar på känsligheten för detektering av relativt liten storlek mitokondrier utan oversaturating bilder av stora och medelstora mitokondrier. Medan seriell transmissionselektronmikroskopi har med framgång använts för att karakterisera mitokondrier vid neuronala synapsen, är extremt tidskrävande, särskilt när man jämför flera prover denna teknik. Serieblock ansikte svepelektronmikroskop (SBFSEM) teknik innebär en automatiserad process för sektionering, bildbehandling block av vävnad och datainsamling. Här ger vi ett protokoll för att utföra SBFSEM av ett definierat område från gnagare hjärnan att snabbt rekonstruera och visualisera mitokondriella morfologi. denna technique kan också användas för att ge korrekt information om mitokondriell nummer, volym, storlek och fördelning i ett definierat område i hjärnan. Eftersom den erhållna bildupplösningen är hög (typiskt under 10 nm) eventuella grova mitokondriella morfologiska defekter kan också upptäckas.

Introduction

Mitokondrier är dynamiska organ som ändrar sin form och placering beroende på de cellulära signaler och behov, i tät samverkan med cell cytoskelettet, och som svar på cellulära händelser såsom kalciumströmmar i nervceller 1. Mitokondrier också interagera med andra cellulära organeller t.ex. endoplasmatiska retiklet, vilket i sin tur reglerar deras dynamik och metabolism 2. Mitokondriell morfologi visar heterogenitet i olika celltyper dvs. formen av organell varierar från rund som består av lakan, säckar och ovaler 3. Det har visat sig att mitokondriella fusion och fission cykelproteiner kan reglera läge, storlek, form och fördelning av mitokondrier 4. Dessutom är förändringar i mitokondriell form i samband med neurodegeneration, neuronal plasticitet, muskelatrofi, kalciumsignalering, reaktiva syreradikaler generation samt livslängd och celldöd blandar thaT-cellspecifika mitokondriell morfologi är avgörande för att upprätthålla normal cellfunktion 5-11.

En stor bioenergetisk funktion av mitokondrier är att generera adenosintrifosfat (ATP) genom att exekvera en serie av metaboliska reaktioner som involverar fullständig nedbrytning av näringsämnen (dvs. glukos, fett-syror eller aminosyror) via TCA-cykeln och OXPHOS Pathways 12. Den mänskliga hjärnan utgör endast 2% av kroppsvikten men det förbrukar ~ 20% av den totala energi som produceras vilket gör det extremt energikrävande organ 13. Det är därför inte förvånande att mitokondriell dysfunktion hos människor leder till ett stort antal neurologiska manifestationer 14-17. Genetiska mutationer i OXPHOS komponenter som försämrar ATP generation leder till mitokondriella sjukdomar 17,18, som är kliniskt heterogen grupp av sjukdomar med en prevalens på ~ 1: 5000 personer, och en av de vanligaste orsaken till metabolic störningar hos barn och vuxna. Underskott på mitokondrierna härrörande ATP påverkar flera organsystem med hög energikrävande organ såsom hjärna, hjärta och skelettmuskler som främst berörs i dessa patienter 14,17,18. Under de senaste åren har flera studier visade för mitokondriell dysfunktion hos både nervsystemets och neurodegenerativa sjukdomar 15-17,19,20. Eftersom mitokondrierna är viktigt och avgörande för hjärnans utveckling och funktion, är det absolut nödvändigt att utveckla protokoll som kan analysera förändringar i hjärnans mitokondriell morfologi, struktur, storlek, antal och fördelning under både friska och sjuka tillstånd. Musmodeller med mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein (GFP) har tagits fram för att visualisera mitokondriella rörelser och lokalisering i hjärnan 21,22. Även om detta är ett mycket användbart verktyg för att undersöka mitokondriell rörlighet och allmän spridning, det finns vissa nackdelar som inkludee begränsad upplösning och känslighet fluorescensmikroskopi. Dessa attribut gör det svårt att spåra de relativt liten storlek mitokondrier. På liknande sätt har seriell transmissionselektronmikroskopi med framgång använts för att visa synaptisk mitokondrier 23, men denna metod är mycket tidskrävande. Mitochondrial morfologi är känd för att vara mycket dynamisk som de genomgår kontinuerliga klyvnings och fusionscykler, och i de flesta celler mitokondrier upprätthålla ett starkt sammanhängande nätverk 24-26. Nervceller är mycket polariserade celler med flera dendriter och utökade axoner, och mitokondrier som bildar en ansluten retikulära nätverket i cellkroppen kan behöva separera när de gör sig igenom dessa neuriter (Figur 1). Detta gör hjärnmitokondrier extremt varierande i storlek och form. Exempelvis med användning av serieblock-face svepelektronmikroskopi (SBFSEM) teknik, som tidigare observerade vi att skillnaden i volymen eller storleken av extrasynaptic mitochondrIA till mitokondrierna som finns i nervändarna kan vara så mycket som sexton vika 27.

Det finns flera metoder för att utföra volym analyser 28, som innefattar serie avsnitt TEM 29, automatiserad tejp samla ultramicrotome SEM 30, fokuserad jonstråle SEM 31 och SBFSEM 32. Den SBFSEM analys har fördelar i att den har upplösningen för att ge kvantitativa uppgifter om den morfologiska form, storlek, fördelning och antal organeller såsom mitokondrier i områden upp till 1 mm i hjärnan. Den tekniska driften är också minst krävande, med datainsamling och analys inom kapacitet många biologiska laboratorier som saknar tidigare EM erfarenhet. Tillkomsten av kommersiella instrument för att generera seriesektionsliknande bilder har gjort 3D ultra analys av vävnader en rutinteknik, vilket ytterligare tillåter en opartisk volymetriska analyser på ett snabbt och repeterbart sätt 28 32, baserat på en idé som infördes genom Leighton i 1981 33. Flera studier har sedan dess etablerat denna teknik som ett viktigt verktyg i återuppbyggnaden analys av neuronala kretsar 34. Dessutom för många mindre projekt, ger det återuppbyggnads analys för att identifiera cellulära organeller 27,35-39. Eftersom de förvärvade bilderna härrör från lågspänning tillbaka scatter elektroner har nya färgningsprotokoll som kombinerar olika kända tungmetallfärgningstekniker utvecklats för att öka upplösningen 40.

I detta dokument ger vi ett protokoll för att utnyttja 3D-elektronmikroskopi avbildning och volymetriska analys av hjärn mitokondrier baserat på metoder som tidigare har använts av oss och andra 38,39,41. De vävnads post-bearbetningsmetoder som användes var såsom beskrivits tidigare av Deerinck et al40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Virginia Tech.

Varning: Extrema försiktighetsåtgärder måste vidtas vid hantering och bortskaffande flera komponenter som används i detta protokoll. Före användning, den lokala institutionella riktlinjer och rutiner för hälsa och säkerhet måste fastställas och följas, särskilt när det gäller osmiumtetroxid, som är flyktig och mycket giftig, uranylacetat, som är både en tungmetall och källa till radioaktivitet, och bly nitrat, som är en tungmetall gift. Thiocarbohydrazide (TCH) kan sönderdelas för att producera explosiva och giftiga gaser, vid felaktig hantering. Många institutioner kommer att ha en EM kärna anläggning där dessa reagens rutinmässigt används och kan ge stöd.

1. Beredning av hjärnvävnad och SBFSEM Imaging

  1. Söva en ung (~ 2 - 4 månader gamla) C57 svart mus (C57BL / 6J-stam) med användning av 4 - 5% isoflurane efter institutionens riktlinjer. Bekräfta anesthetization genom att övervaka förlust av muskeltonus, brist på frivilliga rörelser och reaktioner på aversiva stimuli som en svans nypa.
  2. Stift med musen på en dissektion fack och göra ett snitt på huden längs ventrala mittlinjen. Gör ytterligare snitt i huden för att exponera bröstkorgen av musen. Incise membranet, och noggrant dissekera ut brösthålan längs periferin för att exponera hjärtrytm, och sedan göra ett snitt på höger förmak.
  3. Med användning av en fjärilskanyl, kanylera vänster kammare. BEGJUTA musen transkardiellt med användning av 10 - 20 ml av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,2, till dess exsanguination bekräftas av en förändring i färgen på levern.
    Obs: En förändring i färgen på levern används som en guide för att fastställa omfattningen av blodtappning. Kontrollera att de lever ändrar färg från rödbrun till svagt rosa.
  4. BEGJUTA musen transcardially användning av 10 - 20 ml av 2% glutaraldehyd och 4% paraformaldehyd gjordes i 0,10 M kakodylatbuffert (pH 7,2), för att fixera hjärnvävnad snabbt inifrån. Fixering övervakas genom att observera svansen hårdnande.
    Notera: Förbered 0,10 M kakodylatbuffert (pH 7,2) genom att lösa upp 2,14 g natrium kakodylat i 80 ml vatten, tillsätt saltsyra för att justera pH-värdet, och gör volymen till 100 ml med vatten.
  5. Efter perfusion, decapitate musen, dissekera hjärnan, följt av fixering i 0,10 M natrium-kakodylatbuffert (pH 7,2) innehållande 2% glutaraldehyd och 4% paraformaldehyd under 48 h vid 4 ° C
  6. Efter 48 timmar göra 400 pm koronala sektioner med hjälp av en vibratome och sedan försiktigt dissekera regionen av intresse i hjärnan (t.ex. hippocampus) under dissektion mikroskop 42. trimma noggrant vävnaden och ta en bild för att bevara orientering.
    Obs: Inlägg bearbetningsmetoder för vävnadsfärgning i SBFSEM kombinerar en mängd olika tungmetallfärgningsmetoderFör att förbättra upplösningen och baseras på den metod som utvecklats tidigare av Deerinck et al 40.
  7. Tvätta glutaraldehydfixerade vävnader 3 gånger, 5 min vardera i 0,1 M kakodylatbuffert (pH 7,2).
  8. Förbereda 0,1% garvsyra lösning genom upplösning av garvsyra i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,2). Virvla tills det är upplöst och filtrera genom 0,45 ^ m filter, om så är nödvändigt.
  9. Postfix vävnaderna med kakodylat-buffrad 0,1% garvsyra genom inkubering i 1 ml reagens för 30-60 min vid RT.
    Obs: Inkubationstiden beror på vävnads storlek, men 30 min fungerar bäst för de flesta vävnader.
  10. Tvätta vävnader 3 gånger, 5 min vardera i kakodylatbuffert (pH 7,2).
  11. Lös 0,3 g kaliumferrocyanid och 0,86 g natriumcacodylat i 10 ml destillerat H2O (dH 2 O). Hålla kaliumferrocyanid lösningen på is. Strax före användning, tillsätt 10 ml 4% osmiumtetroxid (OSO4).
  12. Färga vävnader med 2% osmie-ferrocyanid lösning under 90 min, på is. Tvätta 3 gånger, 5 min vardera i dH2O
  13. Förbereda en% thiocarbohydrazide (TCH) lösning genom upplösning av 0,1 g TCH i 10 ml dH2O Upplösas vid 60 ° C genom att snurra varje 10 min tills den är helt upplöst. Beakta säkerhetsföreskrifterna vid hantering TCH, särskilt noga med att undvika användningen av metaller, uppvärmning till hög temperatur, eller låta lösningen torka ut.
  14. Behandla proven med nyframställd 1% TCH under 20 min vid RT. Tvätta 3 gånger, 5 min vardera i dH2O
  15. Späd 4% OSO4 till 2% med dH 2 O, fläck vävnader med 2% vattenhaltig osmiumtetroxid genom inkubering under 1 timme. Tvätta vävnader 3 gånger, 5 min vardera med dH 2 O.
  16. Inkubera proverna O / N i 1% uranylacetat i dH 2 O vid 4 ° C.
  17. Förbered Walton ledningen aspartat lösning (som beskrivs av Deerinck et al 40).
    1. Lös upp 0,998 g L-aspartat i 250 ml dH 2 Ooch sedan lägga till 10 N kaliumhydroxid (KOH) droppvis tills pH når 5,5. Efter pH-justering, tillsätt 0,066 g blynitrat i 10 ml asparaginsyra lager och värm till 60 ° C under 30 min.
  18. Skölj vävnader i dH 2 O och inkubera med Walton ledning aspartat fläck för 30 minuter i en ugn vid 60 °. Tvätta 3 gånger, 5 min vardera i dH2O
  19. Dehydrera prover genom en graderad serie av alkohol med användning kylda lösningar av 20%, 50%, 75%, 85% och 95% etanol under 5 min vardera, följt av 100% etanol 3 gånger, 10 min vardera.
    Obs: Använd 100% etanol från nyöppnad flaska, som öppnade etanol absorberar vatten från luften och orsaka inbäddning att misslyckas. Längre inkubationer kommer att bli nödvändigt med större vävnadsprover.
  20. Tvätta prover 2 ggr, 15 minuter vardera i propylenoxid.
  21. Gör plast inbäddning harts med användning av 25 ml harts, 10,5 ml DDSA (dodecenyl bärnstenssyraanhydrid), 15,5 ml NMA (Nadic Methyl-hydrid) och 1 mlDMP-30 (2,4,6-tris dimetylaminometyl fenol). Blanda hartset genom skakning. Spin och låta hartset stå tills bubblor lösa.
    Obs! Detta är standardreceptet medelhårt. Andra typer av elektronmikroskopi (EM) plastharts kan användas, men bör testas med en icke-essentiell kontrollprovet i förväg eftersom inte alla hartser fungerar för SBFSEM.
  22. Inkubera vävnaderna O / N i en 50: 50 blandning av inbäddning harts och propylenoxid, i en injektionsflaska som är maximerad initialt, då icke-begränsade efter 2 h så att propylenoxid avdunstar under en period av ca 8-10 h.
  23. Överför vävnaden till 100% frisk inbäddning harts i rena flaskor under 2 timmar.
  24. Bädda in prover i färskt inbäddning harts, i plana formar innehållande tryckta pappersetiketter, och bota dem i en ugn vid 60 ° C under 48 h. Efter ca en timme, ta vävnads placering och inriktning igen, och justera vid behov.
  25. Trimma prover till området av intresse och montera på en aluminium stift använder Gelling cyanoakrylat superlim eller ett ledande epoxiharts, och bestryk med kolloidalt silver klistra runt sidorna av blocket för att tillhandahålla en ledande bana till aluminium pin.
  26. Undersök vävnadsprover med hjälp av ett svepelektronmikroskop utrustat med ett in-kammare ultramicrotome scenen och låg kV bakåtspridda elektrondetektor 32.
    Obs: Skaffa instrument- och plats utbildning i svepelektronmikroskop (SEM) använda och bli en behörig användare. Alternativt kan samarbete med en forskare eller kärn anläggning för små projekt vara möjlig. utbildning strålning kan också krävas som SEM genererar röntgenstrålar.
  27. Till bilden av proverna, använd följande inställningar: 2,25 kV, vid 5-10 nm / pixel upplösning, med fältstorlekar mellan 80-250 um i x, y (annat område storlekar möjligt), och skiva tjocklek på 50-100 nm, med totalt 250 - 600 skivor i en 16 - 20 h tidsperioden.
    Obs: Inställningar varierar kraftigt mellan olika mikroskop, indiskilda prover och önskad upplösning. Dessa inställningar bör producera bilder som är lätt tolkningsbara för många prover.

2. Analysera Imaging Dataset

Obs: Bild J / Fiji programvara används för att analysera dataset och förlitar sig på TrakEM2 plugin. Förbehandlingssteg kan utföras med hjälp av olika program, och kan vara omfattande eller mindre beroende på erfarenhetsnivå och travar erhållits. De viktigaste omvandlingar med hjälp av programvara med öppen källkod (ImageJ ver 1.50b, Fiji hämta okt 1, 2015) beskrivs här.

  1. Konvertera bilder till 8-bitars TIFF-format från de ursprungliga egna 16-bitarsbilder genom att öppna i programmet och välja menyalternativ Bild → Typ → 8 bitar.
    1. Om automatisk kontrast / ljusstyrka omvandling under detta steg är inte idealiskt för bilder, öppna 16-bitarsbilder, och tryck på Bild → Justera → Ljusstyrka / Kontrast. Markera ett område som fungerar för alla bilder, och tryck på Verkställ. utför sedan conversion. Obs: På vissa SEM, kan detta steg kräver mikroskop tillverkare programvara.
    2. Om det behövs, på grund av oacceptabel bild rörelse mellan skivorna (eg. Glida på grund av laddning), registrera / justera bildstaplar (menyalternativen Insticksprogram → Registrering → ​​Linear StackAlignmentWithSIFT). I de flesta registrering programvara, inställd på "översättning-only" läget snarare än "stel kropp".
      Obs: Många metoder och programvara kan fungera: de sålla registrerings plug-in fungerar för många tillämpningar och det finns en virtuell stack version.
      1. Om det behövs, förstora storleken på arbetsytan före registrering (Bild → Justera → canvassize) eller minska den till ett område av intresse (Bild → Beskär).
        Obs! Vissa drift eller splaying kan förekomma, och försöker andra insticksprogram eller programvara kan ge bättre resultat. Manuella alternativ finns också (eg. ImageJ / FIJI, Plugins → Registrering → ​​ManualLandmarkSelection).
    3. Om Desired, skala bilder till mindre, mer hanterbar storlek (t.ex.. 25%) med hjälp av ImageJ (Bild → Scale).
  2. Starta programmet, välj Arkiv → import → bildsekvensen och välj sedan TIFF-filer.
  3. Starta plugin genom att välja Arkiv → Ny → TrakEM2 (Blank). Två fönster öppnas; en sköter projektet och area_lists och den andra hanterar spårning, och kallas "duk".
  4. Ladda bildstapel i plugin genom att göra ett högerklick på duken import. Välj import och klicka på import stacken. I pop-up alternativ, markera rutan för virtuella stackar.
    Notera: Även om bildstaplar är redan öppnat i programvaran, måste de också öppnas i plugin. Datorn kan fungera smidigare om lådan virtuella stackar är markerad.
  5. Efter mipmaps skapas och stapeln är laddad, högerklicka för att namnge projektet under plugin fönstret. Högerklicka på "nya projekt" i mallen colUMN och välj "lägg till ny barn" för detta projekt. Högerklicka igen för att välja "area_list".
  6. Ställ Z-axeln projektets omfattning att komma överens med de ursprungliga elektronmikroskopinställningar genom att högerklicka på duken, klicka sedan på displayen och väljer kalibreringen. Ställ också in Z-skala genom att markera alla lager i plugin fönstret, högerklicka för att välja skala Z och tjocklek.
  7. Klicka och dra "projekt" och alla "barn" i projektet objects avsnittet för att skapa "område listor" under "Z utrymme fliken i duken fönstret.
  8. Välj "område listan" och högerklicka för att välja och ställa in en färg. Nu använder pensel verktyg för att spåra föremål såsom mitokondrier, i elektronmikroskopbilder. Använd 'Shift + klicka för att fylla i en sluten cirkel, "Ctrl + bläddra" för att zooma in och ut, och "Alt + klicka för att stänga pensel markören till ett suddgummi.
  9. Välja två områden av ~ 10-15 | j, mmed 10 - 15 um i det övre vänstra hörnet och nedre högra hörnet av bilden och identifiera alla mitokondrier inom dessa områden för att möjliggöra opartisk provtagning av mitokondrier i varje dataset.
  10. På "duk", observera och spår mitokondrier genom sektionerna. Obs: Mitokondrierna är ganska mörk / täta förekommer organeller, av liknande storlek i diameter och löst cylindriska. Den unika crista som bildas av det inre membranet är lätt urskiljbara i denna organell.
  11. När du är klar med att spåra, högerklicka på area_list under fliken Z utrymme, välj "Visa i 3D". Detta kommer att lansera 3D-visningen plugin för att se en 3D-rekonstruktion av den spårade bilden.
    1. För att utföra mitokondriella volymmätningar väljer objekt i 3D-visningen, klicka på fliken "Redigera" och välj "Object Properties". Mitokondrie uppskattade volymen listas tillsammans med flera andra mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi visar att hjärnan mitokondriell morfologi och storlek är heterogen i olika neuronala underavdelningarna. Konfokalmikroskopi på låg densitet neuronala kulturer omvandlade med lentivirus uttrycker mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein visade att mitokondrierna är bosatta i neuronala soma bildar en reticular nätverk, medan de som bor i distala neuriter uppvisar en diskret långsträckt morfologi (Figur 1 AB). Använda SBFSEM tekniken var den mitokondriella morfologi, storlek, volym och distribution analyseras i mushjärna. Tredimensionella (3D) bilder av mitokondrier rekonstruerades från både neuriter och synapser i mushjärna hippocampus. De presynaptiska mitokondrier identifierades och antalet presynaptiska boutons härbärge bosatta mitokondrier kvantifieras. Heterogenitet i storlek mitokondrier observerades i dendritiska kontra axonala fack (Figur 1 CD). Dessutom har många små presynaptiska fack i mushjärna hippocampus saknade mitokondrier (Figur 2 AC). Det volymetriska mätningar av både presynaptiska och extrasynaptic mitokondrier visade att volymen eller storleken av mitokondrier är bosatta inom de neuronala presynapses var betydligt mindre än de som bor i extrasynaptic regionen (Figur 2 DF). Intressant, tvådimensionell (2D) storleksfördelning av mitokondrier mätt från en opartisk provtagning av 200 icke-somatiska mitokondrier visade att ~ 11% av mitokondriella fraktionen ligger under upplösningsgränsen av ljusmikroskop (Figur 2G). Dessutom ger de 2D-bilder som förvärvats av SBFSEM analys ökad upplösning för att visualisera ultra egenskaperna hos enskilda mitokondrier (Figur 3 AB). På grund av den väl synliga topografi av vävnaden, är det vidare möjligt att klassificera den cellulära kompartment av mitokondrier genom att bestämma dess närhet till lätt identifierbara strukturer som kärnan (somatisk) och synaptiska vesiklar (presynaptiska) (Figur 3 AB). För att identifiera mitokondrierna som finns i de neuronala processerna, rekonstruera den individuella processen som axon eller dendrit baserat på närvaron eller frånvaron av presynaptiska boutons respektive 42. Baserat på dessa resultat, föreslår vi att SBFSEM är en mycket värdefull analytisk teknik för att identifiera mitokondriell form, storlek, antal och fördelning i hjärnvävnaden och att eventuella grova defekter i mitokondriell struktur och fördelning kan också bestämmas med hjälp av denna metod. Eftersom ultra egenskaperna hos olika celltyper i hjärnan är distinkta, för t ex. Närvaron av glykogen granuler i astrocyter, är det också möjligt att analysera cell typspecifika skillnader i hjärn mitokondrier.

Figur 1 Figur 1:. Heterogen i Neuronal Mitokondriell Morfologi och Distribution kortikala kulturer från postnatal dag 1 musungar transducerades med lentivirus uttrycker mitokondriellt inriktade grönt fluorescerande protein (mito-GFP). (A) visar neuronala soma uttrycker Mito-GFP, observera det nätformiga nätverk av mitokondriell morfologi; Nu = kärna; skala bar = 5 um. (B) visar avlånga mitokondriell morfologi i distala neuriter; skala bar = 5 um. (C) representant 2D-bild från SBFSEM dataset som genereras från musen hjärnvävnad, är mitokondrierna färgas i grönt, dendriter färgas i blått och axonal varicosities färgas i brunt; skala bar = 1 pm. (D) 3D rekonstruktioner av mitokondrier i neuriter från mus hjärnvävnad, notera skillnaden i storlek mellan dendritiska och axonal mitokondrier indicated av stora och små pilspetsen respektive; skala bar = 1 pm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Serial Block-face svepelektronmikroskopi (SBFSEM) analys visade Låg Överflöd av Mitokondrier vid den presynaptiska terminaler (A) Representativa 2D ultramicrograph från SBFSEM dataset analys erhållen från hippocampi av P15 vildtyp möss,. skala bar = 1 pm. (B) Visar 3D-rekonstruktion av 10 presynaptiska nervterminaler. Observera att endast 4 av 10 presynaptiska terminaler visade urskiljbara mitokondrier; skala bar = 1 pm. (C) Stapeldiagram som visar kvantifieringen av 173 rekonstruerade presynaptiska nervterminaler från SBFSEM dataset analys. (D) Representant 2D-bild från SBFSEM dataset visar extrasynaptic mitokondrier i blått och presynaptiska mitokondrier i grönt; skala bar = 1 pm. (E) 3D rekonstruktioner av presynaptiska och extrasynaptic mitokondrier från SBFSEM dataset med hjälp av programvara; skala bar = 1 pm. (F) Stapeldiagram som visar volymen av extrasynaptic och presynaptiska mitokondrier. Data är inprickade som medelvärdet ± SEM; n = 3 olika dataset (inkluderar 62 presynaptiska mitokondrier och 80 extrasynaptic mitokondrier totalt); * Skildrar p-värde = 0,0405. (G) En 15 av 15 um område i alla fyra hörnen av bilder markerades och alla icke-somatiska mitokondrier identifieras för att möjliggöra stickprov. Den minst dimensionen av ~ 200 mitokondrier mättes. Cirkeldiagram visar att ~ 11% av icke-somatiska mitokondrier var <200 nm i dimension som ligger under upplösningsgränsen för Ijusmikroskopi. Denna siffra har been anpassat från Chavan et al 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: 2D SBFSEM Bilder från Lateral geniculate Kärnor av Mouse Brain (A) Tvådimensionell representativ SBFSEM bild från laterala knäkroppen (8/8 pm) som visar en detaljerad topografi i regionen.. Soma och kärnan är indikerade; skala bar = 2 ^ m. (B) En förstoring av området indikeras med röd fyrkant i panel A. Notera att de yttre och inre membran av mitokondrier liksom cristae bildning är klart synliga. Topografin och relationer till andra organeller och cellstruktur är också observerats. PS anger exempel på presynaptiska mitokondrieroch NS visar exempel på icke-synaptiska (NS) somatisk mitokondrier; skala bar = 1 pm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Komplexiteten av nervsystemet utgör en betydande utmaning i att rekonstruera stora vävnadsvolymer och analysera morfologin och distribution av organeller, såsom mitokondrier med tillräcklig upplösning. Flera celler inklusive neuroner, oligodendrocyter och astrocyter med många processer utökade i tre dimensioner samverkar inom hjärnvävnaden 43. Eftersom mitokondrierna ligger både i soma av celler och avlägsna processer, är mitokondriell morfologi extremt pleomorfa i nervsystemet (Figur 1). Tillräcklig 3D strukturinformation med tillräcklig upplösning kan därför inte förvärvas av konventionella ljusmikroskopiska tekniker såsom konfokal eller två foton mikroskopi 44,45. Elektronmikroskopi är den enda för närvarande tillgängliga teknik som möjliggör rekonstruktion av stora volymer av neural vävnad med tillräckligt hög upplösning. Traditionellt har 3D-rekonstruktion av nervvävnad varit uppnåd genom seriell avsnitt transmissionselektronmikroskopi (SSTEM) av ultratunna sektioner 29. Dock har de senaste tekniska framsteg förbättrat kvaliteten på volym elektronmikroskopi datainsamling och automatisering.

SBFSEM är en automatiserad block ansikte bildteknik som kombinerar seriesnitt i kammaren av ett svepelektronmikroskop, i syfte att rekonstruera 3D vävnadsstruktur under hundratals mikrometer, med en upplösning som är tillräcklig för att följa de tunnaste cellulära processer och identifiera små organeller . Denna teknik har öppnat upp möjligheten att rutinmässigt rekonstruera både ryggradslösa och ryggradsdjur nervsystemet. Det handlar om flera steg, inklusive provpreparering, svepelektronmikroskop drift, datainsamling, bild efterbearbetning och bildanalys. Dessa procedurer kräver specialiserade praktisk utbildning och certifiering för svepelektronmikroskop operation. Tre faktorer är kritikeral ie. dissekera rätt hjärnan anatomiskt område, få högupplösta bilder och utföra ordentlig bildanalys. Efter att dissekera den anatomiska regionen av intresse från vibratome skiva fast hjärnvävnad, är det viktigt att ta bilden för att bevara rätt orientering. Det kan annars vara svårt att fastställa den korrekta platsen för avbildning. Erhålla högupplösta bilder beror på adekvat fixering och korrekt efter fästfärgningsprocedurer. Hjärnan tenderar att genomgå en snabb försämring av sin ultra efter döden. Därför är det viktigt att fastställa hjärnan i en glutaraldehydlösning använder rätt transcardial perfusion metod. Detta bör följas av ytterligare fixering av hjärnan i glutaraldehyd-lösning under minst 24 h. Eftersom bildupplösningen är helt beroende av en kombination av en mängd olika tungmetallfärgningsmetoder, är det viktigt att följa post-fixeringsmetod som beskrivs i protokollet för att förvärva quantifiable bilder. Lösningar bör göras såsom beskrivits i metoderna. Slutligen, för noggrann bildanalys organell / s som skall analyseras bör fastställas entydigt (eg. Genom att visualisera ultra egenskaper) före spårning och riktlinjerna programvara måste följas strikt. Upplösningen av de förvärvade bilderna ska vara kända för konvertering från pixlar till nanometer för volymmätningar.

Förutom den programvara som beskrivs i protokollet för att utföra bildanalys, kan andra tillgängliga program är som återuppbygga och Knossos även användas. Även om tyngdpunkten i den beskrivna protokollet är på visning mitokondrier i nervsystemet, kan det modifieras för att generera hög upplösning 3D-information om olika andra subcellulära strukturer (t.ex.. Endoplasmatiska retiklet, lysosomer etc.) I en mängd olika vävnader.

Medan en detaljerad felsökningsguide för svepelektronmikroskop oFunktioner är utanför ramen för denna artikel (se instrumentanvändarhandböcker och träningsinformation), några problem uppstår rutinmässigt under avbildning experiment och förstå hur man felsöker dem kan hjälpa nya användare eller de som bilder genom samarbete / kommersiella källor. Ett vanligt problem är laddning av provet som förekommer främst i harts regioner som innehåller lite eller inget färgade material. I en "positiv" bild (dvs. Cytosolen visas i vitt), kärnor, blodkärl, och tomma plast vidder kan visas "svärtade". Dessutom laddning främjar också lokal balk drift resulterar i skenbild skevhet. Möjliga lösningar varierar mellan instrument och prover. Minska kV inställningar minskar "svärtning" artefakt men kan främja mer balk drift. Användning av en lägre vakuumläget, och innefattande kväve (N 2) gas, vattenånga, osv. i kammaren minskar också laddning, men vid en betydande kostnad för upplösning och signal-till-brus-förhållande. Ett andra vanligt problem är kniv hoppa. Långsammare scanning kan orsaka strålen inducerad skada på blocket yta, som skär ojämnt eller inte alls för någon avbildning / skärcykler (dvs. Successiva bilder visas samma). Flera lösningar finns bland annat öka skärdjup / snittjocklek med reducerad z-upplösning, ökar skanningshastighet och följdriktigt att acceptera bullrigare bilder, minska pixelstorlek och acceptera lägre x / y-upplösning, och välja prover eller områden med mer intensiv färgning (som dåligt -stained områden ut mer, skador lättare och kräver längre balk exponering för att få bilder med acceptabel signal -buller förhållanden). Skräp återavsättning på blocket ansikte är en tillfällig källa till artefakt i bilder, och om detta inträffar ofta det kan kräva att pausa förvärvet och noggrant rengöra kniven (blåsa luft), eller retrimming provet till en mindre storlek. Block ansikte laddning främjar också återdeponering, och steg ovanhjälp. Korrigering av fokus och stigmation kan också krävas som mikroskopbilder prover kontinuerligt under många timmar till veckor, under vilken tid de vakuumdjupet ökar i kammaren, vilket kräver stigmation korrigeringar. Varje svepelektronmikroskop varierar beroende på ålder och egenskaper, och erfarenhet är den bästa guiden. Plötsliga dramatiska förändringar i stigmation eller fokus kan uppstå när sektione material följer de mikroskop imaging komponenter. Kammaren måste öppnas och materialet rubbas noga igenom vakuum eller komprimerad kväve. Detta kräver helt specialiserad utbildning.

Det finns några nackdelar med SBFSEM teknik med avseende på dess användbarhet i att analysera hjärn mitokondrier. En stor nackdel, som är gemensam för alla mikroskopi fasta vävnader, är att det ger statiska bilder av en extremt dynamisk organell. Mitokondrier undergår kontinuerliga klyvnings och fusionscykler 26, är rörliga och trafikerade längs neurite bearbetar 21. Defekter i mitokondriell handel och dynamik som inte är rent numerisk eller strukturell lätt kan missas av detta tillvägagångssätt, även om genom att titta på antalet mitokondrier i en anatomiskt definierat utrymme som presynapsen kan man tolka om transport av mitokondrier kan ändras 39 . En andra nackdel är att den utförs endast i en liten del av hjärnan, därför kretsar specifika defekter i mitokondriell fördelning kan missas. Korrelat närmar 28,46 ge möjlighet att kombinera konfokala och multifoton avbildning med SBFSEM teknik för att generera både molekylära och ultra data. För mitokondriell analys därför kan det vara användbart att utföra SBFSEM efter lätt mikroskopisk undersökning av hjärnsektioner antingen genom att använda den mitokondriella antigenspecifika antikroppen eller genom användning av en transgen som uttrycker mitokondriellt inriktade fluorescerande protein. denna combinational strategi kan ge en robust metod för att identifiera mitokondriella defekter i musmodeller av neurologiska och mitokondriella sjukdomar.

Det finns också tekniska begränsningar som är gemensamma för många former av elektronmikroskopi orsakade av hårda fixativ, heavy metal färgning och ojämn penetrering av kemikalier. Andra begränsningar kan härröra från plast inbäddning av vävnadsprover. Tomma områden av harts och glest färgade strukturer behålla elektroner under avbildning, vilket strålavböjning och drift (bild skevhet) samt artefaktuella laddningssignaler (t.ex.. Mörka kärnor och blodkärls lumen), som båda inkräktar på upplösning. Beam skada hartset främjar också ojämn skärning, och av denna anledning kräver avbildning typiskt skivor av 50-100 nm skäras från blocket ansikte, som producerar icke-isotrophic voxlar i datamängder. Andra begränsningar för vissa tillämpningar är att sektionerna förstörs och inte kan omprövas senare,som kan tvinga användare att samla högupplösta bilder av områden som kanske inte innehåller användbara data.

En stor fördel med SBFSEM är att det automatiserar processen med sektionering och avbildning block av vävnad genom att införliva en anpassad mikrotomen i en lågvakuum SEM kammare 32,33. Eftersom bilderna erhålls direkt från blocket ansikte före varje snitt är problemen i avsnitt rynkor, kompression och förlust under hanteringen väsentligen undviks, även om skräp nedfall och skevhet på grund av att blockera ansikte laddning bidrar till en viss bildförlust och distorsion . Dessutom är bilderna som erhållits i rådatamängder redan har anpassats och kräver bara mikrometerskala registrering för att rymma balk drift för att vara mottagliga för de flesta analyser. På grund av den automatiserade snittn, när systemet vakuum har stabiliserats, stora volymer av vävnad kan avbildas utan betydande aktör inblandning. Det finns flera fördelar med att använda dennateknik i att utföra morfologiska och kvantitativa studier på organeller och intracellulära strukturer. En fördel är att få information om 3D-strukturen för mitokondrier inom en rimlig tid. Tillgången till öppen källkod rekonstruktion programvarupaket som Rekonstruera 47, TrakEM 48 och Knossos 49-51 har gjort den här tekniken ett kraftfullt analysverktyg där detaljerad 3D ultra av neuronala nätverk från experimentella djurmodeller kan jämföras direkt. Den halvautomatiserad och helt automatiserad bildanalys närmar 52 kommer sannolikt att producera mycket mekanistiska data i djur där mitokondrie morfologi, funktion och / eller biogenes förväntas påverkas. Tidigare SBFSEM analys var mycket hindras på grund av lägre upplösning, har dock nyare provberedningstekniker som omfattar förbättrade färgningsmetoder 40 avsevärt förbättrade upplösningen i en omfattning som en enda synaptiska vesicle kan enkelt lösas. Vid denna resolution lätt kan observeras ultra defekter i mitokondrierna som vakuolisering, membran störningar och förlust av cristae, och fördelningen av defekta mitokondrier i celler kan bestämmas 38,39. Den höga upplösningen av denna teknik ger en stor fördel jämfört med ljusmikroskop där upplösningen är begränsad till ~ 200 nm i XY axel och ~ 500 nm i Z-axeln. Mitokondrier är därför bara på upplösningsgränsen av ljusmikroskop 53. Även mitokondrier med dimensioner under upplösningsgränsen fortfarande kan visualiseras genom ljusmikroskop, deras dimensioner kan inte mätas på ett tillförlitligt. Viktigt kan mitokondrier som skiljs åt av en lägre än upplösningen gränsen för ett ljusmikroskop avstånd inte lösas genom ljusmikroskop. En annan fördel är att det mitokondriella strukturella analysen kan utföras inom ramen för vävnaden, utan isolering av organellen. Detta kan allåg för lämpliga jämförelser inom vävnaden baserat på mitokondriell lokalisering, för t ex axonal mot somatisk och / eller dendritiska mitokondrier. En ytterligare fördel är att det är oftast möjligt att avgöra om mitokondrierna är neuronal eller neuroglial i lokalisering genom att följa processerna till en avgörande organell, såsom gliaceller filament och glykogen för astrocyter eller myelin för oligodendrocyter. Processerna av nervceller och neuroglial celler är ofta i närheten, och med 2D metoder såsom TEM kan det vara svårt att tilldela med tillförsikt som processer neuronala och som är neuroglial.

Sammanfattningsvis ger SBFSEM teknik högar av seriebilder som täcker vävnadsområden 20 - 1000 nm i storlek med ultra resolution av den 5 - 10 nm eller högre, vilket gör att hela centrala nervsystemets celler och organeller såsom mitokondrier som ska avbildas, mätas och rekonstrueras . I detta dokument har vi provided några praktiska metoder för att använda sig av denna teknik. Framtida tillämpningar inkluderar analysera mitokondrie struktur och fördelning i olika djurmodeller av neurologiska sjukdomar såsom nervsystemets och neurodegenerativa sjukdomsmodeller samt analysera de olika subcellulära ultrastructures såsom endoplasmatiska retiklet, kärnan och / eller lysosomer i hela celler eller vävnader under frisk och sjukdomstillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Neurovetenskap SBFSEM mitokondrier OXPHOS hjärna synapse 3D-rekonstruktion
Analys av Brain Mitokondrier Använda Serial Block-Face Svepelektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter