Summary
非拘束脳波radiotelemetryは自由に動くげっ歯類からin vivoでの長期的な脳波を記録する貴重な方法論的アプローチです。この詳細なプロトコールは、CNSのリズムとCNS関連行動の段階の信頼性の高い記録を得るために、異なる脳領域に定位硬膜外と深い脳内電極配置を説明しています。
Abstract
植込み型脳波radiotelemetryは、神経精神医学的および神経変性疾患だけでなく、てんかんのトランスジェニックマウスモデルの神経学的特性評価において中心的な関連性があります。この強力な技術は、根底にある病態生理学的メカニズムに貴重な洞察を提供するだけでなく、すなわち 、CNS関連疾患の原因病理は、それはまた、新しい翻訳、 すなわち 、治療法の開発を容易にします。ジャケットまたは係留システムで使用される記録システムを利用する競合技術は、半拘束文字への非生理的な抑制に苦しむ一方、radiotelemetric EEG記録はこれらの欠点を克服します。技術的には、移植可能な脳波radiotelemetryは、様々な生理学的および病態生理学的条件の下で硬膜外と深い、脳内脳波の正確かつ高感度な測定を可能にします。まず、我々は、成功したまっすぐの詳細なプロトコルを提示します高品質のelectrocorticogramsその結果硬膜外（表面）EEG記録のための迅速かつ効率的な技術。第二に、我々は、海馬（electrohippocampogram）で、 例えば深い、脳内EEG電極を、移植する方法を示しています。両方のアプローチについては、コンピュータの3D定位電極注入システムが用いられます。無線周波数送信機自体が、マウスおよびラットの両方における皮下嚢に移植されます。特別な注意はまた、実験動物の周囲および術後治療を事前に支払われる必要があります。マウス、ラット、適切な麻酔の術前の準備だけでなく、術後の治療や痛みの管理は、詳細に記載されています。
Introduction
Radiotelemetryは特にEEG、ECG、EMG、血圧、体のコア温度または活性の測定1-7との関連で、様々なサイズを意識し、拘束されていない動物で、行動や生理的パラメータの多様性を測定するための最も貴重な方法論的アプローチです。理論的には、任意の種は、ネコ、イヌ、ブタおよび霊長類3.8のマウスおよびラットのような実験用げっ歯類の移植可能な脳波radiotelemetryを用いて分析することができます。でも、魚、爬虫類と両生類はradiotelemetric調査9の対象となります。過去20年間にわたって、移植可能なEEGのradiotelemetryは、てんかん、睡眠障害、神経変性および神経精神障害7,10-12などのヒト疾患の種々のトランスジェニック動物モデルの特性に有益であることが証明されました。過去には、マウスおよびラットからの生体電位を含む生理学的データを収集する多数の方法論的アプローチは、descをしていますribed。ジャケットレコーダーシステム、物理的な拘束方法、非移植radiotransmittersと係留システムで着用は過去13,14のメイン注目を集めています。今日、radiotelemetric移植のための様々なシステムが市販されています。しかし、文学の画面には、自作のradiotelemetricシステム15-40の開発を記述する29の出版物を明らかにしました。自家製のシステムは安価で、よりユーザに適合である可能性が高いのに対し、市販のシステムは、単純にインストールすることが比較的容易であり、迅速に設定することができます。
植込み型脳波radiotelemetryは、ジャケット・システムまたは係留アプローチで着用物理的な拘束方法、などの競合技術に比べて多くの利点を有します。後者は、定義によって拘束されている、すなわち 、動物は動くことができない場合、またはその正常な動作が損なわれています。それも、再取得のための動物を麻酔する必要があるかもしれません責任を負うデータ。現代の係留システムは、しかしながら、より少ない拘束である可能性が高いが、これは科学的に検証される必要があります。一方、Radiotelemetryは、動物が時空間の制約なしに行動の彼らの完全なレパートリーを発揮することができ、したがって、アプローチを抑制し、人間1,3で取得することができ、結果の複数の予測であることがより優れていると考えられています。その拘束アプローチは劇的に根本的な生理学的パラメータ、 例えば 、食物摂取、身体の深部体温、血圧と心拍数と実施例3のために身体活動を変化させることができるが、それはかなりのために知られています。係留システムは、1枚の静止広く使用されている古典的な拘束アプローチ13,14を表します。硬膜外または深いのいずれかの電極である電極は、一般的に頭蓋骨に固定されている小型のソケットに接続されています。ソケット自体は、動物の比較的自由な動きを可能にするケーブルの取り付けのために露出されています。 ALTHウワーッ、今日係留システムは非常に繊細かつ非常に柔軟になってきた、その主要な欠点の一つは、それがまだ半拘束であること、です。動物は自分の体（頭）由来の任意の外部機器を操作する傾向があるように加えて、電極移植部位での感染の危険があるかもしれません。様々な種の無線radiotelemetry技術はすでに60年代後半に記載されているので、数十年前から存在してきたが、それはごく最近になって、特にこのような小さな実験用げっ歯類では、手頃な価格で信頼性が高く、比較的使いやすい10,41,42となっていますマウスやラットなど。小さい、小型の移植可能なEEG送信機は、現在市販されており、20グラム（約10週間）よりも大きいマウスに移植することができます。このように、特にトランスジェニックマウスモデルの電気生理学的特性評価は、これらの日の移植可能な脳波radiotelemetryのアプリケーションの主な分野となっています。動物の大きさは、もはや絶対的な実験restricではありませんトランスミッタ「バッテリーの寿命一方ションは確かです。その限られた寿命にもかかわらず、移植可能な送信機システムは、システムを抑制することによって潜在的な記録に関連するストレスに関連するほとんどの欠点を最小限に抑えることが可能です。げっ歯類は安静時、運動活性（探査）と睡眠（REM、徐波睡眠）43,44を含む生理学的な行動の彼らの完全な装備一式を提示することができます。重要なのは、移植可能なradiotelemetryは強く動物使用3を減らすことができます 。現在、科学の実験動物の数を制限し、彼らの苦しみを軽減する方法について激しい議論があります。明らかに、動物実験やヒトおよび動物の疾患の動物モデルは、ボトムラインの病態と治療におけるその後の進展についての我々の理解のために不可欠です。また、動物実験は、薬物の研究開発において重要です。彼らは、実質的に、薬物のライセンスでの前臨床/毒物学的研究に寄与しませんこのように、ヒトおよび動物の両方の世話にコミットします。これは現在の選択肢がまだ誘発される他の方法では不可能であろう複雑な病態生理学的メカニズムを理解するために、動物の研究に利用できないことを、注目すべきです。同時に、EUおよび米国における3R、 すなわち 、交換、縮小と洗練戦略が強く補完代替方法の研究を奨励しています。 Radiotelemetryは、他の技術と比較して、実験動物の数およびそれらの苦痛を軽減することができるように成功した3R戦略の重要な例です。
ここでは、マウスとラットの両方における無線周波数送信機の皮下ポーチ注入を実行するための詳細かつ連続的なステップバイステップのアプローチを提供します。この最初のシーケンスは、定位硬膜外と深い脳内脳波電極の位置の説明が続いています。特別な注意は、住宅事情、麻酔、周囲および術後疼痛に支払われます管理および可能な抗感染症治療。焦点は確実に硬膜外と深い脳内構造物を対象とするコンピュータ化された3D定位アプローチです。また、術後の回復時の外傷および疼痛管理の最適化を減少させるための頻繁な実験的なEEG電極注入における落とし穴と戦略についてのコメント。最後に、表面と深部EEG記録の例を提示します。
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Protocol
倫理声明：すべての動物実験は動物ケア（ボン大学、BfArM、LANUV、ドイツ）上のローカルおよび制度理事会のガイドラインに従って行われました。また、すべての動物実験は、優れた法律、 例えばに従って行った。、1986年11月24日（609分の86 / EEC）または個々の地域または国の法律の欧州共同体理事会指令。具体的な努力が使用される動物の数およびそれらの苦痛を最小限にするために行われます。
1.実験動物
- 実験動物と種の選択
- 特定のヒト疾患7,9,45,46に関連する相同性、同型と予測可能性の要件を満たすげっ歯類、 すなわち 、マウスおよびラットでradiotelemetric研究を行います。
注：その他のマウスとラット系統利用可能厳しく基本的な生理学的および病態生理学的characteristに異なる場合がありますICS 47-49。 - 例えば 、その後の電気生理学的実験を実行する前に麻酔薬、睡眠構造および発作感受性50,51の適用投与量に対する応答を、マウス/ラット系統の生理学的および病態生理学的特性を考慮してか、評価します。
- 研究デザインにおけるジェンダー特定の特性に注意してください。発情周期は強く、中央リズム、その概日依存関係、睡眠と発作活動52-54に影響を与えることができます。したがって、性別、特定の分析を行います。
注：金融と実験の容量が限られている場合、雄マウスに制限が助言されます。
- 特定のヒト疾患7,9,45,46に関連する相同性、同型と予測可能性の要件を満たすげっ歯類、 すなわち 、マウスおよびラットでradiotelemetric研究を行います。
- 動物飼育と取り扱い
- フィルタートップケージ内またはより良い個別換気ケージの住宅マウスとラット。
- 排他的に移植した動物専用の特殊なラボの部屋に置か換気キャビネットとその次の記録に動物施設からマウスを転送する（ 図1）。
- 。相対湿度60％、および従来の12時間の明/暗サイクル-陸上輸送、標準的な条件下での換気キャビネット内の1週間のための場所の動物、 すなわち 、21±2℃の周囲温度、50後の順化のために。
- 外科的移植に先立って、3のグループに家のマウス-透明なポリカーボネートケージタイプIIの4（26.7センチメートルX 20.7センチメートルX 14.0センチメートル、領域410 cm 2）を飲料水と標準食物ペレットへの随意アクセス権を持ちます。ラットのための透明なポリカーボネートケージタイプIII（X 26.6センチメートルX 18.5センチメートル、面積800センチメートル2 42.5センチメートル）を使用します。
- アイソレーションが後に実験結果に影響を与えるストレスを引き起こす可能性がありますように/この段階で動物を隔離分離しないでください。しかし、外科手術用器具類以下、家の動物は別々の動物は、創傷stiches /縫合糸または金属クリップを（下記参照）を操作する傾向があるよう。
- 彼らは秒のさまざまな不適切と判断されると、オープン住宅事情を避けますcientific質問、 例えば 、睡眠研究。
- これは、動物への追加のストレスをもたらすようもないマウスやラットが互いの存在を感知することができるように、マウス、ラット、特定の機器を使用してください。
2. EEG Radiotelemetryシステム
注：記載されているプロトコルは、（ 図2）表面と深部脳内EEG記録のために使用される市販の遠隔計測システムに基づいています。
- 例えば 、マウスまたはラットに移植に適した無線周波数テレメトリインプラントを使用してください。、1チャンネルの送信機または2チャンネル送信機。
注：両方の送信機は、様々な生体電位を測定することが可能である、 すなわち 、脳波（EEG）、心電図（ECG）、筋電図（EMG）、だけでなく、身体活動と温度。彼らは、磁気作動オン・オフメカニズムを持っています。送信機と感知リードは、滅菌が設けられています。送信機がある場合再使用されることを再滅菌するための製造元の指示に従ってください。 - 例えば（500ヘルツまで）高周波ガンマ分析のために、より高い名目サンプリング・レート（F、最大5,000ヘルツ）と送信機の帯域幅（500ヘルツまでのB）と送信機を選択します。具体的には、ナイキスト・シャノンサンプリング限界を考えるすなわち 、EEGデータはなく越えて、F / 2の絶対最大値まで分析することができます。信頼性の高い周波数分析のために、F / 10の周波数帯域幅（B） - / 5 fが推奨されます。
注：対処すべき科学的疑問は、送信機の技術仕様を満たしている必要があります。
3.麻酔と疼痛管理
- イソフルラン吸入麻酔を使用してください。
- 5％イソフルランおよび0.8 - - 1％の酸素またはカルボゲン（5％CO 2、95％O 2）L /分の4が充填された「誘導室」で動物を置きます。フロー1.5を提供するシリコンフェイスマスク麻酔の所望の深さを維持- 3.0％イソフルランおよび0.8から1パーセントの酸素またはカーボゲンL /分（ 図3A）。
注：適切なイソフルラン濃度は体重（分布容積）、年齢、性別、および動物の遺伝的背景に応じて変化します。ガス麻酔機器が使用できない場合、 すなわち 、「誘導室」、カーボゲンまたは酸素供給、流量計、イソフルラン気化器、システムを清掃、3.2節を参照してください。吸引システム（掃気システム、 図3A）実験のイソフルラン暴露を避けるためにインストールすることによって引き出さ（チューブはデモンストレーション用のビデオドキュメントに示されていません）。
- 5％イソフルランおよび0.8 - - 1％の酸素またはカルボゲン（5％CO 2、95％O 2）L /分の4が充填された「誘導室」で動物を置きます。フロー1.5を提供するシリコンフェイスマスク麻酔の所望の深さを維持- 3.0％イソフルランおよび0.8から1パーセントの酸素またはカーボゲンL /分（ 図3A）。
- 吸入aneestheticsがオプションでない場合には、注射用麻酔薬によって麻酔を行います。 0.9％NaCl中でesketamine塩酸塩（齧歯類用量を100mg / kg）および塩酸キシラジン（齧歯類用量は10mg / kg）の組み合わせを調製し、腹腔内に、その体重に基づいて動物を注入します。
- 気をつけた動物を観察しますテールピンチ、足のピンチを使用して、麻酔の深さと（ - ;ラット70から115呼吸/分220呼吸/分マウス150）呼吸速度を監視することによって、Y。可能な喘ぎを確認してください。
注：異なるマウスおよびラットの系統は、麻酔に異なる感度を示すことができます。同じことは、トランスジェニックマウスモデルにも当てはまります。
注：気管内挿管は、げっ歯類では必須ではありません。実際には、挿管は、気管への損傷の危険性を増大させます。
4.手術機器 - 一般的な側面
- 中に補足的な暖かさを適用し、手術後の体のコア温度を維持するために温水毛布、電気温暖化プレート、加熱ランプ、強制温風ユニットまたはポケットウォーマーを再循環使用しました。 38.0°C（98.6 - - 100.4°F）36.5で、後者を維持します。
注意：小げっ歯類が原因体表面（マウス、10.5のx（グラムでの重量）2/3;ラット、10.5のxグラムで（重量）2/3）の高い比率に低体温症にかかりやすいです身体ボリュームに。 - 角膜の乾燥を避け、点滅反射が完全に回復するまでの石油系人工涙軟膏またはデクスパンテノール（ビデオドキュメントを参照してください）全体の注入プロセスの間に、早期回復と目をカバーしています。
- オートクレーブ手術器具（ 材料の表を参照）殺菌や消毒剤に配置します。
注：エレガントかつ迅速な方法は、ガラスビーズとの熱ベースの手術器具の滅菌器の使用です。 - 両眼手術用倍率顕微鏡と柔軟なまたは自己支持、可動光導波路を介して、強烈な照明のために利用可能な冷光源を有しています。
- きれいな白衣、フェイスマスク、ヘッドカバーと滅菌手袋を着用してください。
注：最適な用品や楽器は研究室から研究室に変えることができ、ラボ固有と制度の要件を満たす必要があります。
5.手術 - トランスミッタの配置
- haiの体を削除しますシェーバーを使用して、完全に麻酔したマウス/ラットの頭皮からのR。消毒剤、 例えば、70％エタノールおよびヨウ素ベースのスクラブを使って剃ったエリアを清掃してください。過度の曝露による皮膚刺激や炎症を避けます。麻酔中の体温を維持するために加熱毛布の上にうつ伏せに動物を置きます。
- （ブレグマ頭蓋ランドマークが見えるように）（台形筋肉が見えるように）メスを用いて、首に額から頭皮上正中切開を行います。項部切開部位から出発し、手術ハサミを使用して、鈍的切開によって、動物の左右脇腹に沿って皮下ポーチを開きます。
- 皮下ポーチに1ミリリットルの0.9％NaClを注入します。センシング腹側腹部に近い脇腹に皮下ポケットの内側に頭側指向つながると送信機を置きます。送信機は、縫合糸タブを持っている場合は、1つまたは複数のSTIを使用して、背側/横肌で送信機を固定しますCHES（オーバー・アンド・オーバー縫合）。
送信機の固定が必須ではないことに注意してください。手術部位と送信機のインプラントの汚染を防止することに特別な注意を払ってください。ドレープが正しく非無菌領域から滅菌を単離するために使用されるべきです。 - 術後ケアと疼痛管理については、セクション8を参照してください。
6.定位面電極の移植
- 麻酔下で定位フレームに動物を置き、慎重に頭蓋骨のブレグマとラムダcraniometricsのランドマークが同じレベル（ 図3B）になるようにバーのヘルプと鼻クランプでヘッドを位置決め。耳のバーを使用して内耳に損傷を与えないでください。必要に応じて、コットンボールと耳のバーをカバーしています。この注意事項は、定位フレーム内のヘッドのタイトな固定を可能にします。
- 時間的および後頭部の筋肉を損傷することなく、綿のヒントと骨膜をきれいにしてください。の表面薄層を事前に扱いますラットの頭蓋骨のマウス頭蓋骨および3％H 2 O 2 0.3％のH 2 O 2と頭蓋骨。この手順は、明らかに、このようなブレグマとラムダ（ 図4B、C）のような頭蓋縫合糸とcraniometricsランドマークを公開します。
- それぞれ耳のバーや鼻のクランプサイズに適合したマウスおよびラットのために、と定位フレームを含むマウスとラットのための特別な、設備の整った定位の設定を使用してください。定位フレームはイソフルラン蒸発器とイソフルランスカベンジャーモジュールへの接続を持つガス麻酔マスクが含まれていることを確認。
注：特定のマウスとラットの脳とコンピュータ化された3D定位の設定が推奨され、軸方向のコロナル及びサジタルビューを可能にする、ナビゲーションや3Dアトラスのためのユーザインタフェースを含むソフトウェアを調整します。 - 定位フレームの垂直アームの精度ドリルをマウントします。場合頭蓋骨の上に任意の座標に小さなマークを残して垂直アームに取り付けられた鉛筆やペンを使用してください何のコンピュータ化された定位システムは利用できません。
- ドリル穴を慎重にマウスとラットが厳しくneurocranial骨の厚さが異なることを考慮して。また、マウスの頭蓋骨の厚さが強く、マウスでは、例えば 、ローカライズに前頭骨を依存することに注意してください：正中セクション：320から390マイクロメートル、横セクション：300から430ミクロン; OS parietale：正中セクション：210 - 250μmで、横方向のセクション：200から210ミクロン; OSはoccipitale：正中セクション：600から730マイクロメートル、横セクション：380から420μm）を。
- ドリル穴の圧力フリーの最大速度で。
注：これは、ドリルヘッドの突然のブレークスルーと主に皮質分野での潜在的な損傷をもたらす可能性が頭蓋骨の強壮圧平を回避することができます。開頭術のために、脳神経外科の高速精密モータドリルシステムを強くお勧めします。 - 典型的なドリルヘッド径の選択の座標でドリルバーホール0.5ミリメートル - 0.3。
注：穴の直径は、電極径に応じて小さくなることがあります。一般的なルールとして、直径より小さく、よりダメージが生成されます。 - ベンド硬膜外電極として機能し、選択した座標に穴に硬膜上に直接置きトランスミッタ「センシングリードの先端。また、皮質のネジを使用し、機械的に、送信機（ 図4A）のセンシングリード線に取り付けます。
- 。頭蓋1ミリメートル、横1.5ミリメートル（左半球）：表面から記録のために、 例えば 、マウス運動皮質M1 / M2、で、例えば 、電極を配置します。ブレグマ-6ミリメートル、ブレグマ1ミリメートル（左半球）またはブレグマ-6ミリメートル、ブレグマ1ミリメートル（右半球）（ 図4D）の横の横：小脳皮質での硬膜外基準電極を配置します。
注：それは脳波上無音領域であるとして、小脳が基準となります。 Stereotaxic座標は、マウスおよびラット用の標準的な定位アトラスから誘導することができます。 - 非常に困難である、基礎となる脳頭蓋に強力な接着力を与えるグラスアイオノマー歯科用セメント（水ベース）で電極を固定してください。
注：グラスアイオノマー歯科用セメントを使用する場合、固着ねじは、電極を確保する必要はありません。 - 5分間乾燥させるためにセメントを残します。オーバーやオーバー5-0 / 6-0非吸収性縫合糸材料と縫合糸を使用して頭皮を閉じます。あるいは、皮膚接着剤を使用することができます。密接電極移植部位に基づいて、EEG記録の品質を監視します。注：ドリル穴からの骨化はそれが時間の経過とともに電極を持ち上げる能力を持つ発生する可能性があります。これは、EMGおよびECG汚染を減少さEEG品質をもたらすことができるので、最適な記録時間を制限することができます。
- 術後ケアと疼痛管理については、セクション8を参照してください。
- 検証脳波電極位置死後。
- 安楽死のための、インキュベーションチャンバーに動物（単数または複数）を配置し、100％の二酸化炭素を導入します。 10％の充填率を使用する - 二酸化炭素で毎分チャンバ容積の30％がインキュベーションチャンバー内に存在する空気に加えました。これは、動物への最小限の苦痛で迅速な無意識を達成することが適当です。
注：これは悲惨であることが示されているように> 70％の二酸化炭素濃度に対する意識のある動物の突然の露出を避けてください。 - 呼吸と色あせた目の色の不足のために各マウス/ラットを観察します。呼吸停止、次の1分間の最低CO 2流れを維持します。無意識への期待時間は2〜3分以内に通常です。
- 両方の兆候が認められた場合は、ケージからげっ歯類を削除します。それ以外の場合はCO 2にそれらをさらす続けます。無意識は2〜3分以内に発生していない場合は、室内のフィルレートを確認してください。
- 正しい電極配置を確認するために、脳は、死後を投稿根絶例えば 、CO以下
- さらなる処理まで4℃でPBSと店舗脳内の30％スクロース中で凍結保護し、続いて室温で4％PFAで4時間 - 2はPostfix頭脳。
- クライオスタット切片用に試料マトリックスを使用して、定位ブロックの上に脳を凍結し、クライオスタットを用いて60μmの冠状スライスを切ります。分岐運河と旧電極位置を視覚化するための標準的な技術を用いてガラススライド、空気乾燥、およびニッスルブルーで染色上にマウントスライス。
注：このアプローチは、表面電極は、皮質の上にマイナーな衝突を残すことによって、誤って深くに配置されているかどうかを明らかにする。
- 安楽死のための、インキュベーションチャンバーに動物（単数または複数）を配置し、100％の二酸化炭素を導入します。 10％の充填率を使用する - 二酸化炭素で毎分チャンバ容積の30％がインキュベーションチャンバー内に存在する空気に加えました。これは、動物への最小限の苦痛で迅速な無意識を達成することが適当です。
7.定位ディープ脳内EEG電極Implantatイオン
- 6.2 - セクション6.1に記載されているように、動物の頭皮と頭蓋骨を事前に扱います。 例えば 、考慮して、その材料特性を取って、慎重に深い電極の種類を選択します。、直径およびインピーダンスと送信機のセンシングリードに可能な接続。
注：パリレン被覆鋼及びタングステン電極は、一般的に使用されます。電極特性は、個々の実験のニーズに合わせて必要があります。電極は、無菌提供されない場合、それらは、使用前に70％エタノール中でインキュベートされるべきです。電極はこの実験的な目的のためにコーティングされているように、熱ベースの滅菌は適用されません。 - 定位システムを用いて、第6章で説明したように、任意の座標に穴を開けます。 、集中的に調べた脳領域となる例えばマウスCA1領域を標的とブレグマを参照する以下の座標に差動電極を配置するには：尾2ミリメートル、横1.5ミリメートル（右半球）そして、背腹（深さ）2ミリメートル。 例えば 、小脳皮質に硬膜外基準電極を配置します。、ブレグマ-6ミリメートル、ブレグマの横方向の1ミリメートル（左または右半球）（ 図4D、E）。
注：小脳電極は、小脳のサイレント領域上の擬似参照電極を提供しています。定位座標は、マウスおよびラット用の標準的な定位アトラスから誘導することができます。 - 彼らがどのように脳深部に挿入されるに応じて必要な長さに深い電極を短くしてください。間に90°の角度に両方のセクションを曲げることにより、送信機リードのステンレス鋼製のらせんへの電極の頭蓋外の部分を接続します。
- 機械的に送信機の検知リードに深い電極をクリップ。これはEEG記録に大きなノイズを誘導することができるよう、可能な限りのはんだ付けはしないでください。の先端の外側シリコーン分離の短いセクションを削除することで、送信機リードのステンレス製のらせんを公開滅菌メスの刃を使用して、送信機のリード。
- 脳深部電極への送信機のリードを配線し直します。両方のコンポーネント（ 図4F）の適切かつ安定した接続を確認してください。定位装置の垂直アームに注入し、電極を（機械的に送信器リード線に接続されている）に取り付けます。
- 非常に困難である、基礎となる脳頭蓋に強力な接着力を与える、グラスアイオノマー歯科用セメント（水ベース）で電極を固定してください。 5分間乾燥させるためにセメントを残します。オーバーやオーバー5-0 / 6-0非吸収性縫合糸材料と縫合糸を使用して頭皮を閉じます。あるいは、皮膚接着剤を使用することができます。
- 密接電極注入側に基づいて、EEG記録の品質を監視します。
注：ドリル穴からの骨化はそれが時間の経過とともに電極を持ち上げる能力を持つ発生する可能性があります。これは、EMGおよびECG汚染を減少EEG品質をもたらすことができるので、最適な録音を制限することができますオルディング時間。これは深い電極配置のための特別な関連性があります。 - 術後ケアと疼痛管理については、セクション8を参照してください。
- 検証EEG電極配置後のセクション6.13に記載されているように死後。
8.術後ケアと術後疼痛管理
- それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
- 完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
- 術後疼痛管理のために、次のグループのいずれかの薬剤を選択します。2 -アゴニスト、局所麻酔および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）をα麻薬オピオイド、オピオイドアゴニスト/アンタゴニストを、55-60起因することに注意してください。手術の重症度は、3日間の鎮痛治療が推奨されます。
- マウス：0.05ブプレノルフィンを使用している場合は、以下の用量を投与- 0.1ミリグラム/ kg、腹腔内、皮下、すべての6から12時間。ラット：0.01から0.05ミリグラム/ kg、腹腔内、皮下、すべての8から12時間。
- マウス：ブトルファノールを使用している場合は、以下の用量投与1.0から5.0ミリグラム/ kg、皮下、4時間毎に。ラット：2.0から2.5ミリグラム/ kg、皮下、4時間毎。
- トラマドールを使用している場合は、以下の用量を投与：マウス、ラット：10から30ミリグラム/ kg、腹腔内に
- マウス：フルニキシンを使用している場合は、以下の用量投与の2.5mg / kg、皮下、12時間毎に。ラット：1.1ミリグラム/ kg、皮下、12時間ごと。
- マウス：ケトプロフェンを使用している場合は、以下の用量投与は5mg / kg、皮下、すべての12から24時間を。ラット：5ミリグラム/ kg、皮下、すべての12から24時間。
- マウス、ラット：100ミリグラム/ kg、腹腔内、8時間毎メタミゾールを使用している場合は、以下の用量を投与。
- マウス、ラット：1ミリグラム/ kg皮下、24時間毎にメロキシカムを使用している場合は、以下の用量を投与。
- マウス：カルプロフェンを使用している場合は、以下の用量投与は5〜10mg / kg、皮下、すべての12から24時間を。ラット：2.5から5.0ミリグラム/ kg、皮下、すべての12から24時間。
- acetumの複数形を使用している場合マウス：minophenは、以下の用量投与300 mgの/ kg、経口、4時間毎に。ラット：100から300ミリグラム/キログラム、4時間毎。
- （補助的鎮痛剤として）リドカインを使用している場合は、以下の用量を投与：マウス、ラット：1から4ミリグラム/ kgの皮下
- 長期的な術後疼痛管理のために - （0.9％NaCl中に希釈された10mg / kgの皮下、齧歯類用量5）、最初の注射10実行 - カルプロフェンを使用する場合は外科手術器具の終了前15分間、その後の2のために繰り返します一日一回日。
- 術後、食物摂取を容易にするために、湿ったペレットを供給する。慎重に食品を観察し（~15グラム/は100g / D;約5グラム/ 24時間）および水（~15ミリリットル/は100g / D;約5ミリリットル/ 24時間）の消費。
- それらの正常な姿勢や行動の復帰のために密接に動物を監視します。
注：このようなエンロフロキサシンまたはトリメトプリム、スルホンアミドなどの抗生物質の全身投与は、多くの場合、目で髄膜炎や脳炎の炎症の徴候がない限り絶対必要を推奨していないが、注入のE部位が検出されます。 - マウスを完全にさらなる分析のためにEEG記録を開始する前に回復するために、少なくとも10から14の追加の日を与えます。
注：具体的な実験のタスクは、より長い回復期間が必要な場合があります。 - フォローアップの移植後の術後回復を体重の術後発生を評価すること。 14日間の回復期間 - 10中の体重のわずかな、しかし着実な増加が続く5手術後 - 体重の最大減少は、通常、4日目の周りに観察されます。
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Representative Results
このセクションでは、表面と深い、脳内EEG記録から得られた例を示しています。当初は、生理学的条件下でのベースラインの記録は、従来例えば 、以下の後続の記録、薬理学的な治療に必須であることを明記すべきです。このようなベースラインの記録は、異なる行動状態またはスリープ/概日リズムと脳のリズムの機能的相互依存性に関する貴重な情報を提供することができます。ここでは、proconvulsive /心霊エネルギーの薬の急性投与後に記録された発作活動の例を示しています。上記で概説したように、脳波radiotelemetryでのアプリケーションの一般的なフィールドは、てんかんの研究です。てんかんモデルは、急性および慢性の薬理学的モデルだけでなく、てんかんの遺伝的（トランスジェニック）モデルが含まれています。ここでは、R / S-バクロフェンでは20mg / kgであり、bicucullinemetの腹腔内投与によって誘発される非痙攣性欠如のような発作の急性モデルを実証します、10mg / kgでhobromide。細胞内への流入-薬力学的には、バクロフェンはClでを阻害するGABA（A）アンタゴニストビククリンであるのに対し前およびシナプス後の両方の細胞外K +の流出を増加させ、GABA（B）受容体アゴニストです。視床皮質-皮質視床回路内hyperoscillationとhypersynchronizationの開始および維持におけるGABA（A）受容体の活性化。 図5B、Cは、IP R / S-バクロフェン（20ミリグラム/キログラム）の管理とbicucullinemethobromide以下の硬膜外EEG記録を表示します（10mg / kgの）。 10mg / kgの腹腔またはペンチレンテトラゾール（PTZ）の用量で4-アミノピリジン（4-AP）の全身投与は、マウスとラットで一般化強直間代発作を誘発することができます。 4-APまたはPTZは、注射後、動物は、用量依存的重症度の運動の行動、 すなわち 、強度および持続時間の典型的な時系列を示しています。発作は通常、ミルに続く、低活動状態からスタートD、主に感覚毛けいれん、頭部および/または前肢で顔に影響を与える部分ミオクローヌス。この部分発作の状態がより直立姿勢や四肢全てを含む全身クローヌスの損失を特徴とミオクローヌスに一般化することができます。後者はジャンプ、野生の実行と後肢の最後に、強直性伸展することを特徴とします。 4-AP投与（10mg / kgの）次の一般的な硬膜外EEG記録は、図5Aに示されています。高精度で記録のこの硬膜外タイプすなわち 、発作、開発の初期段階を誘発することができる。、ミオクローヌス頭の動き、顔と前肢のジャーク）。高いEMG、 すなわち 、筋肉の活動に関連した運動の発作活動の高度があるが、EEG記録の最小限EMG汚染が観察されます。 図5（a）に明らかなほど、散発的なスパイク活動（*）は、典型的なスパイク/多棘/スペイン系アメリカ人との一般的なクローヌスが続いています連続的なスパイク活動のその後のエピソードに続いて、電子波パターン（1）。 EMG汚染がほとんど検出であることに注意してください。記録セグメントが原因で全身クローヌスに強化された筋肉の活性を特徴としているが、脳由来のスパイク活動が顕著であるとEMG汚染は極めて低いです。この例では、提案された実験的なアプローチは、EEG信号がEMGアーチファクトによってマスクされることが予想可能性がある場合、選択的であっても全身発作条件下でEEG信号を記録することが可能であることを証明します。ここで説明するように、常に注射前に、注射の下および薬理学的投与後に録音を必要とする薬物注射体制に注意してください。コントロールは、偽注入/車両を注射した動物を含める必要があります。
典型的な脳内の脳標的は、海馬、 例えば、CA1領域です。海馬発作活性はカイニン酸（KA）、又はN-メチルにより誘導することができます-Dアスパラギン酸（NMDA）。非NMDA受容体アゴニストKAは、一般的に10〜30ミリグラム/ kgの用量で腹腔内投与されます。海馬発作は、急性様々なグルタメート受容体アゴニストによって誘導することができる重要な発作のサブグループを表します。上述の深い電極移植手順を用いて、KA誘発性海馬発作は、高精度（ 図5D）を用いて記録することができます。 KAのほかに、海馬発作はまた150ミリグラム/ kgの用量でNMDAの腹腔内投与によって誘導することができます。 KA処置動物のように、NMDA処理したマウスは、時折、死を発作性スクラッチ、運動亢進および旋回、強直間代性痙攣のシーケンスにより発作を開発し、。
図6は、最も人気のある慢性海馬発作モデル、 すなわちで同時皮質（硬膜外）と海馬（深い）脳波の例を示す。、近心側頭葉エピのピロカルピンモデルをラットにおけるlepsy（mTLE）。なお、EEGアーチファクトができ、時々模倣ictiform放電（ 図7）。このように特別な注意がECG、EMGを低減するために支払われる必要があり、外部からのEEG信号の乱れを誘発しました。ここに記載の注入手順は、EEG信号の汚染で最大の減少を可能にすることに留意すべきです。例えば、によって遮蔽することができる外部電気機器からのアーティファクトのいずれかの結果、ファラデーケージや脳の外に電極を持ち上げる傾向が開けた穴の周りの骨化プロセスによる。後者は技術の実験的な制限をマークし、時間依存性プロセスです。発作の記録と分析がここで記載された技術の適用の唯一のフィールドではないことに留意すべきです。表面及び深部脳EEG記録は、精神神経疾患の動物モデルであり、例えば、睡眠研究のために、例えば 、複雑な時間-周波数解析のために使用することができます。
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図1：Radiotelemetry の住宅条件の異なるマウスまたはラット株におけるin vivoでの研究やヒトの疾患の薬理学的またはトランスジェニック系統は、交絡因子に起因する個体内変動と潜在的なバイアスを最小にするために、高い標準化を必要とします。適切な住宅の条件は、高品質の録音および有効な遠隔測定結果を得るための前提条件です。ラボの棚にオープン住宅事情は記録には適していません。代わりに、動物施設の内部、または換気キャビネット（A）中で実施されるべきである記録。理想的には、換気キャビネットのみ手術前と手術後の住宅や回復のために使用されていませんが、また、このようEEG記録（B）のための環境条件と妨害の欠如の安定性を保証します。記録は、通気孔で行うことができない場合キャビネットをilated、彼らは環境的に制御動物室（C）の内部にファラデーケージ内で行われるべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 標準EEG Radiotelemetryシステムと無線周波数トランスミッタは、自作のシステムに加えて、商業的に利用可能なシステムの数が市場に出ています。このようなシステムの基本的なセットアップは、（A）に示されています。システムは、無線周波数送信機、受信機プレート、マルチプレクサとしてのデータ交換マトリックス、及びデータ収集、処理および分析のコアユニットからなります。周波数解析のために、発作の検出および睡眠分析特定のソフトウェアモジュールが提供されます。送信機の複数の種類があります調査し、科学的疑問に依存していると想定される種に応じて利用できる。B）移植したマウス、レシーバープレートと標準化された記録条件のために換気キャビネットの内部に配置されたマルチプレクサ。C）大人のC57BL / 6Jマウスと2チャンネル無線周波数送信機。D）の4週間電極注入および固定が権限を持つ61および62から再版グラスアイオノマーセメント（）を使用した後の頭蓋骨の背面図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： マウスとラットのための麻酔し、定位のセットアップ。 A）イソフルランを用いて、ガス麻酔システム。高精度、高速歯科用ドリルは畝ですそれぞれマウスおよびラットのための3D定位デバイス上nted。補足暖かさは、加熱パッド。B）ドリル、定位耳バーや権限を持つ62から復刻鼻クランプ（）のクローズアップを使用して与えられている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 定位表面と深部電極移植。 A）マウスおよびラットにおける硬膜外電極配置のスキーム。B）解剖学的構造およびマウス頭蓋骨のランドマーク。 0.3％H 2 O 2で調製されたC57BL / 6Jマウスの頭蓋骨の先端図。注頭蓋骨（前頭骨（の）、頭頂骨（OP）、OSのOCcipitale（OO））および縫合糸（縫合前頭（SF）、縫合矢状（SS）、縫合冠状（SC）、および主要な解剖学的ランドマークのブレグマ（B）及びラムダ（L）を決定縫合のlambdoidea（SL））。C ）C57BL / 6Jマウス頭蓋骨の側面図である。D）One硬膜外、差動電極が運動野（M1）上に配置され、追加の海馬内の差動電極を海馬のCA1領域に配置されています。どちらの擬似参照電極は、小脳に局在化している。E）冠状セクション（スキーム）electrohippocampogramを記録するための深い、頭蓋内電極の局在を示す。F）深いEEG電極のクローズアップ、無線周波数送信機の検知リードそして、（61,62許可を得てから得て転載）は、マウスの頭蓋骨の上にそれらの配置。 クリックしてください。ここで、この図の拡大版を表示します。
図5：4-アミノピリジン（4 AP、10mg / kgの）の腹腔内投与後に発作放電を表示てんかん放電の薬理学的誘導 A）表面脳波記録。散発的なスパイク（*）EEGうつ病で、その結果、連続スパイク（1）の一時的なエピソードに進化（2-3、振幅の減少）。まもなく、この期間の後に野生のランニングやジャンプと全身性強直間代発作の開発への第2のスパイク列の付随は、最終的に後肢（4）と死の強直性伸展をもたらす明らかになります。脳死以下の残りの小さな信号は、IP administrati後ECG（R-スパイク）汚染。B）を表し、 （BMB、10mg / kgの）bicucullinemethobromideの上にマウスが特徴的なスパイクとスパイク波。C）。D）海馬内脳波（EEG）録音活動をスパイクIPを次の散発的な発生が生じバクロフェンの投与（20 mgの/キログラム）の列車を表示しますKA（30ミリグラム/ kg）を投与します。 I：KA投与後すぐに2時間C57BL / 6Jマウスから深いCA1記録。 30時ミリグラム/キログラムKA連続した海馬の発作活動は、時折発作後うつ病（矢印）によって中断が観察されます。発作放電がデルタとシータ波帯（4-8 Hz）で（挿入図を参照）、スパイクおよび/またはスパイク波活性を特徴としています。 II-IV：日1、3、5、注射後1時間CA1 EEG記録では減少したが、まだ（許可を得て61と62から再版）神経興奮毒性変性に関連する連続発作放電示しています。JPG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：Radiotelemetric EEG録音近心側頭葉てんかんのラットモデルにおける大脳辺縁発作は薬理学的にピロカルピン注入政権を経て誘導されます。この図は、3ヶ月歳の時、ラットから一次運動野（M1）からの同期記録だけでなく、海馬CA1領域を示しています。昇順および降順スパイク/ポリスパイク列は（許可を得て62から再版）の両方の偏向に存在している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
それは、実験動物が行動1,3の彼らの完全なレパートリーを実行することを可能にする非拘束技術であるとして、植込み型脳波radiotelemetryは、中央の関連性があります。遠隔測定アプローチは自発的なEEG記録だけでなく、認知課題の下での録音や、T-迷路のような概日分析のセットアップ、放射状迷路、水迷路、睡眠不足のタスクまたはたびEEG記録が必要または有用であるだけでなく、可能にするのでこれは大きな関心事であります複雑な認知や運動活動中。
このプロトコルは、硬膜外表面と、マウスおよびラットの深い脳内EEG電極注入と埋め込み可能なEEGの無線周波数送信機との接続について説明します。プロシージャ内の重要なステップは、術前の問題、 すなわち、種及び株の選択、住宅事情、麻酔および疼痛管理を含みます。重要な文献の画面には、後者はCOなどの交絡因子を果たすことができることが明らかになりました様々な研究アプローチで発散結果にntribute。例えば、実験的な種、 例えば、ラット対マウス、さらには株の選択は完全に実験結果を変更することができます。同じことが性別にも当てはまります。一般的には、性別、特定のグループ化と分析を強くお勧めします。これが不可能な場合は、性別は、少なくともバランスされるべきです。実験条件は厳密に調和または制御されていない場合は、データが匹敵するか、単に無効ではありません取得。
ここで説明する定位移植手順は、表面と深部脳内構造の両方から高品質の脳波を記録する信頼性の高いツールを提供します。移植手順の重要なステップは、掘削工程が含まれます。これは、最小圧力と最大速度（RPM）で実行されなければなりません。高掘削速度が発熱しているが、最小圧力は、皮質下構造が熱的に損傷がないことを保証します。最小圧力は回避することが不可欠です頭蓋骨と下にある皮質のその後の損傷の突然のブレークスルー。また、特別なケアは、髄膜動脈または硬膜静脈洞を損傷しないよう注意しなければなりません。マウスでは、頭蓋骨は、その小さな厚さにむしろ透明です。したがって、髄膜動脈および洞は、損傷を避けるために識別することができます。初期および後期の予後を出血の場合には、一般的に悪いです、そのような動物は、信頼性の高い研究のために選択基準を満たしているかどうかは疑問です。私たちは、このような動物を犠牲にすることをお勧めします。
我々の経験では、説明した手法を用いて高品質のEEG記録は4週まで行うことができます。頭蓋冠内のドリル穴由来骨化プロセスに起因し、電極は、ECGおよびEMG汚染を生じる持ち上げされる傾向があります。さらに、特定の表面または深い、脳内構造を標的にすることは、脳のアトラスからの定位座標に依存していることを考慮すべきです。これらの定位脳マップ通常、特定の年齢の特定のマウスまたはラット系統に関連しています。これは、異なるマウスおよびラット株は年齢特定体の大きさや頭蓋骨の違いを示すことが決定的に留意しなければなりません。基本craniometricsのランドマークのブレグマとラムダに関してこのように、インター株と株内違いがあります。 1はまだ、 すなわち 、表示頭蓋骨と脳の成長を開発している若いマウスとラットから表面と深部電極の録音を実行したい場合、この問題は、特定の課題を提起します。この場合には、任意の位置からの信頼できる長期記録はほとんど不可能です。
頭蓋のランドマークの可視漂白手順を行うために推奨されます。ケアは、それがそうでない場合は頭蓋骨を貫通し、皮質への酸化的損傷を行うことができますように、H 2 O 2のインキュベーション時間を制限するように注意する必要があります。
最後に、その商業脳波radiotelemetryに注意することが重要ですシステムは、他の電気生理学的な設定と組み合わせることができます。我々は最近、マウスでは潜在的なセットアップを誘発聴覚でradiotelemetric EEG記録の組み合わせを確立しました。この洗練されたアプローチは、P50 / N100電位のダブルクリックのパラダイムと分析を適用することにより、例えば 、endophenotyping実行し、統合失調症のトランスジェニックマウスモデルを識別し、特徴付けるために、例えば、可能にします。一般的には、脳波radiotelemetryと誘発-電位の間の技術的なリンクは、将来的に有望なアプローチである可能性が高いです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - InjektionA2:D43slösung) | Pfizer | PZN 0110208 | 20 ml |
| Binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Bulldog serrefine | F.S.T. | 18051-28 | 28 mm |
| Cages (Macrolon) | Techniplast | 1264C, 1290D | |
| Cold light source | Schott KL2500 LCD | 9.705 202 | ordered at Th.Geyer |
| Cotton tip applicators (sterile) | Carl Roth | EH12.1 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| Drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3%/3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| Gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| Dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| 2% glutaraldehyde solution | Sigma | G6257 | |
| Graefe Forceps-curved, serrated | F.S.T. | 11052-10 | |
| Halsey Micro Needle Holder-Tungsten Carbide | F.S.T. | 12500-12 | 12.5 cm |
| Heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| Heating pad | AEG HK5510 | 520010 | ordered at myToolStore |
| High-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Iris scissors extra thin | F.S.T. | 14058-09 | 9 cm |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer’s solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Lexar-Baby Scissors-straight, 10 cm | F.S.T. | 14078-10 | 10 cm |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| Non-absorbable suture material 5-0/6-0 (sterile) | SABANA (Sabafil) | N-63123-45 | |
| Covidien (Sofsilk) | S1172, S1173 | ||
| Halsey Needle Holder | F.S.T. | 12001-13 | 13 cm |
| Pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| 0.9% saline (NaCl, sterile) | Braun | PZN:8609255 | |
| Scalpel blades with handle (sterile) | propraxis | 2029/10 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12, 11000-14 | 12 cm and 14.5 cm length |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA) | UEWLGESEANND | |
| Stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| Tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm | F.S.T. | 11021-12 | 12 cm length |
| Tungsten carbide iris scissors | F.S.T. | 14558-11 | 11.5 cm |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 |
References
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