Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

גידול זבוב הפירות Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

שיטה לגידול תסיסנית בתנאי axenic ו gnotobiotic מוצגת. עוברי זבובים הם dechorionated ב חומצת נתרן, הועברו בסביבה נקיה מחיידקים לתזונה סטרילי, וגדלו במיכלים סגורים. ייחסתי דיאטה ועובר עם חיידקים מובילים עמותות gnotobiotic, ונוכחות חיידקים אושר על ידי ציפוי homogenates תסיסנית הגוף כולו.

Introduction

רוב בעלי החיים קשורים באופן הדוק עם חיידקים ( "חיידקים ') מלידה ועד מות 1. השוואות של חינם-בקטריה ( 'axenic') ו מיקרואורגניזם קשור ( "קונבנציונליות") בבעלי חיים הראו להשפיע חיידקי היבטים מגוונים של בריאות בעלי חיים, כוללים חילוף חומרים, תזונה, מחלות כלי דם, כבד, נשימה, אימונולוגית, האנדוקרינית, ונוירולוגיות פונקציה 2. זבוב הפרות תסיסנית הוא מודל מפתח להבנת רבים של תהליכים אלה בנוכחות החיידקים 3,4 ו ללימוד השפעת חיידקים על 5,6 הגנריקה. אין מיני חיידקים קיימים בכל אדם ( 'ליבה'), אבל Acetobacter ו לקטובצילוס מינים מספריים להשתלט על החיידקים של שניהם המעבדה-נעמד על רגליו אחוריות ניצוד ד melanogaster. אחרים Acetobacteraceae (כולל Komagataeibacter ו Gluconobacter), Firmicutes (כגון אנטרוקוקוס ו Leuconostoc), ו Enterobacteriaceae הם או בהווה לעתים קרובות אצל פרטים תסיסנית ב שפע נמוך, או בהווה סדיר בבית גבוה שפע 7-12.

החיידקים של תסיסנית ויונקים אינו עקבי בתוך ועל פני דורות 14,19. inconstancy חיידקים יכול לגרום לרעש פנוטיפי כאשר מודדים תכונות תלויות חיידקים. לדוגמא, שומני שפעת Acetobacteraceae (טריגליצרידים) אחסון תסיסנית 15-18. אם Acetobacteraceae הוא עשיר יותר אצל זבובים של בקבוקון אחד מאשר עוד 19, זבובי isogenic יכולים לקבל פנוטיפים שונים 20. פתרון לבעיית inconstancy חיידקים בעכברים 14 כבר בפועל מאז 1960, על ידי החדרת קהילה מוגדרת של 8 מינים של חיידקים דומיננטיים כדי גורי עכבר כל דור חדש (שינה צומח Schaedler),להבטיח כי כל גור חשוף לאותה אנשי מפתח של חיידקי העכבר. פרקטיקה זו שולטת על הרכב החיידקים גם כאשר החיידקים הוא לא המטרה העיקרית של המחקר 32, וקובע תקדים כדי להבטיח נוכחות של חיידקים מפתח במגוון של תנאי הניסוי.

כדי להגדיר את ההשפעה של חיידקים על תזונה תסיסנית, כמה פרוטוקולים לגזירת קווי לטוס axenic פותחו, כולל תת-כלורי dechorionation של עוברים (או נגזרת דה נובו כל דור או מתוחזקים generationally בהעברה דיאטות סטרילי) וטיפול אנטיביוטי 13. ישנם יתרונות לגישות שונות, כגון הקלות המהירות הן של טיפול באנטיביוטיקה והעברת סדרתי, בקרת לעומת יותר של משתנים מבלבלים עם דה נובו dechorionation (למשל, צפיפות ביצה, חיידקים זיהום שיורית, מחוץ היעד תופעות אנטיביוטיקה). ללא קשר לשיטה שלהכנה, הכנסת מינים של חיידקים מסוימים, לקבל axenic עובר מתירה תרבות תסיסנית עם מוגדר ( 'gnotobiotic') קהילות. לחלופין, מחק את השימוש צומח Schaedler, קהילה זו יכולה להיות מחוסנת לביצים כמקובלות הניחו (ביצוע השלבים 6-7 בלבד) על מנת להבטיח את נוכחותם של חיידקים המשפיע על תכונה בכל בקבוקון ולהימנע מסיבוכים של inconstancy חיידקים. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לגיוס תסיסנית axenic ו gnotobiotic ידי דה נובו dechorionation של עוברים, ועבור המאשר את הנוכחות הציגו או זיהום מינים של חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התרבות חיידקים (התחל ~ 1 שבוע לפני בחירת ביצים)

  1. כן השונה MRS 20 (mMRS) צלחות וצינורות מרק (טבלה 1). יוצקים 20 מ"ל mMRS אגר לתוך כל צלחת פטרי 100 מ"מ להתקרר / לילה יבש, או 5 מ"ל mMRS מרק לתוך 18 צינורות מ"מ הבדיקה.
  2. Streak Acetobacter pomorum, א tropicalis, brevis לקטובצילוס, ול ' Plantarum על mMRS צלחות אגר. דגירה Acetobacter לילה בשעה 30 ° C. דגירה לקטובצילוס אנארובי על ידי הנחת לוחות במיכל והצפות אטום עם פחמן דו חמצני לפני איטום. לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: L. מושבות brevis לא יכולות להיות גלויות עד 24-48 שעות. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C ומושבות יכולות לשמש עד 3 שבועות.
  3. שניים עד שלושה ימים לפני העברת ביצי dechorionated לתזונת סטרילי (סעיף 5), פיק מושבה אחת מצלחת mMRS לתוך con מבחנהמרק mMRS Taining. לגדול Acetobacter עם רעד ולגדול לקטובצילוס סטטי למשך 24 שעות או עד עכור, הוא על 30 מעלות צלזיוס.

2. כן דיאט סטרילי

  1. הכן דיאטה סטרילי (טבלה 2) בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. מיקרוגל הדיאטה עד שהוא מבושל 3 פעמים סדרתי; לערבב בין כל לרתיחה.
  2. מניח את הבקבוק על צלחת ומערבבים כדי לשמור על הערבוב בעת העברת דיאטה לצינורות צנטריפוגות חרוטים. העבר 7.5 מ"ל של דיאטה עד 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות. רופף מכסה את הצינורות, ומניח מתל פוליפרופילן מכוסה, autoclavable.
  3. לעקר דיאטה לטוס באמצעות חיטוי ב 121 ° C ו -15 psi במשך 25 דקות. הסר מתלים מ החיטוי, ומיד ללחוץ כל מתלה אופקית כדי להבטיח דיאטה אינה מפרידה במהלך הקירור. היזהר שלא ללחוץ את המדפים אנכיים כדי למנוע העברה של דיאטה כדי המכסה או המסגרות של הצינורות. אפשר הדיאטה להתקרר על שייקר בדיוק 45 דקות ולנער את הדיאטה שוב אופקי ביד.
    הערה: הדיאטה ניתן לאחסן ב 4-15 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  4. כחלופה באמצעות מתלי autoclavable מכוסים (שלבי 2.1-2.3), או להעלות זבובים על דיאטות המכילות חומר משמר חומצה, בצע את הפעולות הבאות:
    1. הכן דיאטת נוזלים 1 L בבקבוק 2 ליטר עם בר ומערבבים בבקבוק. חיטוי הדיאטה.
    2. לאחר מעוקר, להוסיף 10 מ"ל משמר ומערבבים ברציפות על צלחת ומערבבים מחומם. כאשר אגר מתקרר 50-60 מעלות צלזיוס, להזיז את הבקבוק על צלחת ומערבבים מחומם בתוך ארון בטיחות ביולוגית ו לשמור על טמפרטורת בקבוק ידי חימום על 50-60 מעלות צלזיוס.
    3. בארון הבטיחות הביולוגי, pipet ~ 7.5 מיליליטר בנפרד לתוך צינורות חרוטים.

3. להכין כלובי הטלה

  1. הפוך צלחות אגר ענבים מיץ ידי במיקרוגל 100 מ"ל מים, 10 גרם שמרים של בירה, 10 גלוקוז גרם, ו -1 גרם של אגר. מביאים לרתיחה 3 פעמים בשלב 1.1 ולהוסיף 10 גרם של שיתוף מיץ ענבים קפואיםncentrate כדי להגדיל את הנראות של ביצים על הצלחת אגרה.
  2. כאשר אגר מתקרר ל -55 מעלות צלזיוס, יוצקים 20 מ"ל לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי ולאפשר כדי לחזק.
  3. מכסים את פני השטח של צלחות אגר עם רסק שמרים ידי ערבוב שמרי בירה 1 גרם מים 15 גרם. יוצקי רסק שמרים לצלחת אגרה מוודא פני השטח מכוסה, ואז לשפוך את העודף, ומשאירים אחריו משקע שמרים דק מאחור. אם הצלחות מרובות משמשים, את העיסה ניתן שפכו ברצף כדי הצלחות מרובות.
  4. עבר צלחות אגרו לתוך החלק התחתון של כלוב.
    הערה: מיכל מעדנייה 32 גר 'הוא תחליף טוב עבור כלובי זבוב אקריליק.
    1. הפוך מכסה מכולות מעדניית 32 גר 'על ידי חיתוך חור בראש ואת הדבקת רשת לנשימה מעל החור עם דבק רעיל. אם הדבק הוא מסיסים במים למנוע חשיפה מים את המכסה.
  5. העברת 200-300 טס לתוך המיכל ומכסים במכסה. מכסה את חור הרשת המוגנת עם מכסת צלחת ריקה פטרי מונעת וטיפולאידוי t מפני השטח אגר ולהוסיף נייר טישו לח בתוך המכסה אם ירצה בכך. דגירת זבובים לנים C 25 מעלות במשך 16-20 שעות.

4. איסוף ביצים

  1. כן מסנן לאיסוף ביצה ידי הצבת רשת ניילון לתוך תותב פלסטיק.
  2. לאחזור צלחת עם ביצים עליו, להסיר את הזבובים מן הכלוב באמצעות העברתם כלי קיבול ריק. אם זבובים באותו ישמש למחרת, ומעבירים מיד כלוב חדש המכיל צלחת אגר מיץ ענבים yeasted טרי. זבובים יכולים לשמש למשך 3-5 ימים רציפים
  3. הסר זבובים מתים מן אגר עם מכחול נקי, נזהרים שלא לשבור את אגר.
  4. איסוף ביצים על ידי שטיפת הצלחת אגרה עם מים מזוקקים, צחצוח ביצים בעדינות מפני השטח אגר, ושופך את התערובת הדלילה מעל הרשת. חזור על 3-4 פעמים עד שכל או רוב הביצים הוסרו מהצלחת אגרה.

ביצים 5. העברת dechorionate כדי סטרילי DIET

  1. הכן את ארון biosafety ידי ריסוס מבפנים (כולל הצדדים) עם 70% אתנול. נגב את החלק התחתון עם רקמות במעבדה, לעקר את מכסה המנוע עם אור UV במשך ~ 15 דקות. לעקר את כל חומרים מתכלים שאינם מתוצרת ביולוגי (כוסות הדגימה, מכחול, מלקחיים, מיכל פסולת, 400 מ"ל מים מעוקרים, ו -100 מ"ל של תת-כלורי נתרן 0.6%) על ידי ריסוס עם אתנול ומיד הצבת בקבינט בטיחות ביולוגית. לעקר עם אור UV במשך 15 דקות.
  2. הפעל את הראשון של שטיפות חומצת 2 נתרן על ידי צבת את התותב עם הביצים לתוך כוס 120 מיליליטר דגימה או מיכל סטרילי אחר. לאט לשפוך ~ 90 מ"ל של שטיפה בתמיסת סודיום היפוכלוריט 0.6% לתוך התותב עד ממש מתחת לשפה.
  3. לשטוף ביצים עבור 2.5 דקות. מעת לעת מחדש להשעות את הביצים באמצעות מלקחיים להעביר את התותב מעלה ומטה פתרון החומצה.
  4. מעביר את התותב ישירות לתוך כוס דגימה שנייה, טרום מלא עם 90 מיליליטר אקונומיקה, בתוך ארון הבטיחות הביולוגי.
  5. חזורצעד 5.3 בתוך ארון הבטיחות הביולוגי. בסוף טיפול האקונומיקה השני, הביצים צריכות להתחיל לדבוק צידי התותב.
  6. לבצע צעדי 5.7-5.8 בקבינט הבטיחות הביולוגי.
  7. מחק את האקונומיקה ולשטוף את התותב עם מים 3 פעמים סטרילי. Re- להשעות את הביצים מספר פעמים במהלך כל הכביסה על ידי הזזת את התותב עם מלקחיים. עד סוף הכביסה השלישית ביותר הביצים יש לצרף את הצד של התותב.
  8. באמצעות מכחול מעוקרים באתנול, להעביר ביצים מהצד של התותב לדיאטה סטרילי. העברת ביצים בנפרד או בקבוצות קטנות. כוון 30-50 ביצים לכל בקבוקון. השאר את הכמוסות רופפות כדי לאפשר חמצן להיכנס הצינור. אם בקבוקונים הם להישאר axenic, להעביר באינקובטור חרקים; אחרת, להוסיף חיידקים כמו להלן.

6. הפוך Gnotobiotic זבובים בעזרת 4 סוגי חיידקים

  1. כן חיידקים
    1. כן קבינט biosafety מעוקר עם ציוד דרוש (עמ 'ipettes, תיבות קצה פיפטה, צינורות צנטריפוגה מעוקרים, מרק MRS, ומדפי מבחנה) כמו בשלב 4.1. נגב את החלק החיצוני של מבחנות עם מעבדה ספוג אתנול לנגב לפני הצבת בארון בטיחות ביולוגית.
    2. גלול חיידקים על ידי ההעברה הראשונה 500 μl של צמיחת הלילה לצינור microfuge סטרילית. אם צפיפות חיידקים נמוכה, מוסיפים עד 1.5 מ"ל על צינור אחד או ברצף להסיר supernatant ולהוסיף תרבות נוספת לאותו צינור. הסר דגימות מקבינט הבטיחות הביולוגית ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב g 10,000 x. השתמש בעצות מסננות כדי למנוע זיהום בין דגימות.
    3. לקבוע את הצפיפות של כל תרבות על ידי מדידת OD 600. אם באמצעות קורא צלחת רב גם, להעביר 200 μl של כל תרבות לצלחת 96-היטב 1-, 2-, ו 4- דילולים לקפל.
    4. לקבוע את כמות mMRS שבו לדלל כל גלולת תא (5.2.2) באמצעות ספקטרופוטומטר קריאת צלחת המשוואות הבאות. מתכננים להוסיף מספיק מרק לחסן 50 &# 956; l בקבוקון אחד זבוב.
      1. אסוף OD 600 קריאות על דילול 1: 4 של כל תרבות חיידקים על ספקטרופוטומטר קריאה-צלחת: 1, 1: 2 ו -1. בחר את הדילול עבור כל זן חיידקים שמייצר ערך OD 600 בין 0.1 ו 0.2 ולהשתמש ערך זה גורם לדילול המקביל שלה כמו 'O' ו 'ד' בנוסחות הנתונות 6.1.4.2 או 6.1.4.3.
      2. אם באמצעות 4 המינים שתוארו כאן, לנרמל תאים ליחידת מושבה להרכיב שווה ערך (CFU) / צפיפויות מיליליטר (OD 600 מרת CFU נקבע בעבר 20) בעזרת משוואה זו:
        E = ((OB) x V x ע) / C
        כאשר E = נפח resuspend גלולה ב (μl), מ = OD חיידקים 600, B = OD 600 מדיה ריקה, D = מתקפלת דילול, V = התרבות חיידקים μl לפני צנטריפוגה, C = OD 600 של קבוע מראש. ראה קוד משלימה הקובץ לדוגמאות של חישובים באמצעות משוואות אלה. לקבלת ספקטרופוטומטרים באופן אוטומטי ריק, להשתמש "O" במקום "OB".
        הערה: קבועים מראש (יחידות OD 600, מנורמל 10 7 CFU מ"ל -1, קבועים נגזר 20) הן כדלקמן: א tropicalis (0.052), א ' pomorum (0.038), ל ' brevis (0.056), ל ' Plantarum (0.077).
      3. אם אתה משתמש מיני חיידקים אחרים (לא CFU / OD 600 קבוע זמין), לנרמל צפיפות OD 600 = 0.1 באמצעות המשוואה הזאת:
        E = ((OB) x V x ע) /0.1 OD 600
        הערה: יחידות זהות בשלב 6.1.4.2. ראה קוד משלימה הקובץ לדוגמאות של חישובים באמצעות משוואות אלה.
    5. בארון בטיחות ביולוגית, הסר supernatant עם טיפ pipet ו resuspend גלולה ב mMRS טריים או PBS כפי שחושב בשלב 6.1.4.2.
  2. לחסן חיידקים
    1. העברה 50 μl של החיידקים אל צינורות חרוטים עם דיאטה סטריליד dechorionated ביצים בארון בטיחות ביולוגית. הוספת חיידקים לאחר העברת הביצה על מנת למנוע זיהום בין בקבוקונים.
    2. מניח צינורות מחוסנים באינקובטור ב 25 ° C.

7. טען מדוד CFU / מבחן עבור עקרות

  1. כדי למדוד את עומס CFU ב homogenates זבוב הגוף כולו, העברת 5 זבובים (eclosion פוסט 5-7 ימים) לצינור 1.7 מ"ל microfuge המכיל 125 μl של חרוזים קרמיקה 125 μl של מרק mMRS. Homogenize זבובים באמצעות homogenizer רקמות במשך 30 שניות 4.0 M / sec.
    1. לחלופין, להשמיט חרוזים יד homogenize צינורות microcentrifuge עם העליים פלסטיק דקות 1.
    2. אם לכימות החיידקים במעיים ומשטחים לעקר הזבובים להסיר חיידקים אקסוגניים 22. העברה טס בצינור microcentrifuge המכיל 100 μl 70% אתנול דקות 1, לשאוב אתנול, ולהעביר צינור microcentrifuge חדש homogenizations. אם תוכן DNA של המעי יימדד, לשטוף fאו 1 דקות עם hypochlorite נתרן 0.6% לפני לשטוף אתנול.
  2. לדלל את homogenate עם 875 mMRS μl, מערבולת במשך 5 שניות, ו pipet 120 μl של homogenate לתוך הבאר הראשונה של צלחת microtiter.
  3. בצע שני רציפי 1: 8 דילולים באמצעות 10 homogenate μl ו 70 μl MRS בשנתי הבארות הבאות.
    1. הסר 10 μl מהבאר הראשונה ולהוסיף אותו אל MRS השני היטב המכיל 70 μl. מערבבים את תכולת הבאר השני ביסודיות, העברת 10 μl מהבאר השני ל -70 המכיל השלישי היטב μl MRS, ומערבבים היטב. זה מוביל 3 ריכוזים כוללים של homogenate המקורי 1,000 μl: חיים, 1: 8, ו 1:64.
  4. העברת 10 μl של דילול כל לצלחת mMRS (באמצעות pipet הרב ערוצית אם רוצים). מעט להטות את המנה להפיץ את הדילול כמה מילימטרים למטה השטח אגר ולאפשר לנוזל להתייבש לפני שעברתי את הצלחת. הנוזל מתייבש על הצלחת דואר במהירות אם הצלחות הם ישנים 2 ימים, הפחתת ערבוב של שתי טיפות השכנות.
  5. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים. סור צלחות מן האינקובטור פעם ברורה, מושבות בודדות גלויות, ולספור מ דילול עם 10-100 מושבות מבודדות.
  6. לחשב CFU לכל לטוס באמצעות המשוואה E = C x D / P x V / F, כאשר E = CFU לכל לטוס, C = מספר מושבות נספר, D = דילול, P = מצופה μl, V = נפח homogenate לטוס, F = מספר הזבובים הומוגני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גידול מוצלח של זבובים axenic אושר על ידי בידוד של לא CFUs מ homogenizations-הגוף של ד מבוגרי melanogaster (איור 1). לחלופין, אם homogenate מצופה מניב מושבות, צלוחיות הם מזוהמים אמור להיות מושלך. עבור זבובי gnotobiotic, כל אחת מהארבעה מבודדות החיידקים בודדו מברכות 5 זכרים בוגרים, הוכחת הבדלי CFUs קיימא הכולל משויך זבובים בוגרים (איור 1). לכל מיני חיידקים מורפולוגיה ייחודית וניתן להבחין חזותית (איור 2). אם סוגי מושבה אחד או יותר אינם מזוהים יש עלול להיות טעויות כבר בהכנת בידוד החיידקים (למשל, כביסה, נרמול, ערבוב) או המין המתאים עשוי שלא לתמוך עם תנאי תרבות (למשל, צפיפות תסיסנית 23 או גנוטיפ 24). כדי לשלול טעויות טכניות אנו recommend ציפוי חלק מתערובת החיידקים מייד לאחר ייחס בקבוקונים לטוס (שלב 6.2).

איור 1
איור 1: יחידות המושבה להרכיב נמצא Axenic ו Gnotobiotic תסיסנית מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) לכל זבוב homogenates כל הגוף של 4-מינים gnotobiotic ו axenic ד. melanogaster. חוסר מושבות homogenates axenic מאשר ד עקרות melanogaster. הערכים מוצגים כממוצע ± SEM של 24 ערכים לשכפל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: התמיינות בקטריאלי מושבות. </ strong> CFUs מתוך המגון מדגם מראה מורפולוגיות שונות עבור כל אחד 4-מינים של ד gnotobiotic melanogaster. מושבות Acetobacter הם בצבע חום בהיר, אור באים בגדלים שונים בהתאם למין. ~ 24-36 שעות לאחר ציפוי, א מושבות tropicalis הן אטומות, ואילו א pomorum הוא שקוף, אם כי לאורך זמן ההבדל הופך פחות מובהק. L. מושבות brevis הם קטנים ולבנים ול ' מושבות Plantarum גדולות וצהובות. במידת צורך, צמיחה מן homogenate ניתן להשוות את צלחות חיידקים המקוריות כדי לעזור להבדיל בין סוגי המושבה 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מתכון mMRS
סכום g הערות
מים מזוקקים 1,000
יוניברסל Peptone 12.5
תמצית שמרים 7.5
גלוקוז 20
Dipotassium פוספט 2
אמוניום ציטראט 2
אצטט נתרן 5
מגנזיום סולפט 0.1
manganous סולפט 0.05
אגר 12 אל תוסיף מרק

טבלה 1: מתכון mMRS.

<tr>
מתכון דיאטה שמרים-גלוקוז
סכום g
מים מזוקקים 500
שמרי בירה 50
גלוקוז 50
אגר 6

טבלה 2: מתכון דיאטה שמרים-גלוקוז.

קובץ קוד משלימה:. חישובים לדוגמא אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן היא אחת כמה גישות עבור העובר dechorionation 8,11,18,25,26,27, יחד עם שיטות חלופיות של גידול זבובים axenic, כולל העברת סדרתי של מבוגרים axenic 18,27 או טיפול אנטיביוטי 13,18. שיטות dechorionation אחרות כוללות שוטף אתנול ולהפחית 11,25,26 או להאריך 8 טיפול תת-כלורי. שלבים לשטוף שונים עשויים לסייע בגידול גנוטיפים זבוב שונה: במחקר קודם רוב ~ 100 גנוטיפים תסיסנית היו axenic כאשר שגדלו כפי שמתואר כאן (ללא שוטף אתנול), אבל כמה שורות היו מזוהמות וזנוח 24. אולי כמה קווים מזוהמים היו axenic אם שגדלו עם שטיפות אתנול או טיפול תת-כלורי יותר. אם השיטה המפורטת כאן לא להוביל לבידוד של זבובי axenic עבור גנוטיפים שורה מסוימים אנו ממליצים שטיפות אתנול או טיפול תת-כלורי עוד כדי לתקן את הבעיה.

אף אוזן גרון "> כאשר העברות סדרתי של תסיסנית משמשים, דור axenic ההורים נעשית axenic ידי dechorionation ביצה כפי שמתואר כאן, ועל הדורות הבאים נשמרות על ידי העברת ספטית בתוך ארון בטיחות ביולוגית, עם או בלי אנטיביוטיקה 18,27. העברת סידורי מהיר מ הנובע זבובי axenic מחדש בכל דור ודור, והועבר זבובים יכולים להישאר axenic עבור מספר דורות. סיבוך אחד העברות סדרתי הוא שמירת צפיפויות מתאימות זבובים קונבנציונליים / gnotobiotic ו axenic מאז זבובי axenic נוטים להטיל ביצים פחות על פני פרק זמן דומה (נתונים לא מוצג). מאז צפיפות תסיסנית משפיעה תכונות מרובות, כולל רכב חיידקים לטוס דיאטת 23,28,29, העברת ביצים מחדש בכל דור עשויה להיות גישה מעולה עבור תכונות צפיפות רגישה זבוב. דה נובו dechorionation גם תמנע את האפשרות של זיהום חיידקים במהלך העברות. וכך, בעוד העברות סדרתי יכול לחסוך זמן, דechorionation מאפשר שליטה רבה יותר של משתנה סיבוך.

אנטיביוטיקה יכולה לשמש גם כדי ליצור זבובי axenic, אם כי בניגוד dechorionation, טיפול אנטיביוטי הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר לחלוטין מיישב חיידקים 13. בנוסף, אנטיביוטיקה יכולה להשפיע על המארח ישירות. לדוגמה, העלאת זבובים בדיאטה עם אנטיביוטיקה מקטין תוכן פריון החלבון שלהם, אבל תופעות אלה לא נצפו אצל זבובי העלה מעוברים dechorionated 13. נציין כי אנטיביוטיקה נחוצה כדי לחסל חיידקי endosymbiotic המועברות במאונך אינם מושפעים עיקור משטח, כגון Wolbachia 33.

צעדים אחדים הם קריטיים להצלחת הכנת זבובי axenic או gnotobiotic dechorionated. ראשית, חשוב מאוד לנער את הדיאטה לעוף כמו בצעדים 2.3. אם המדפים אינם מזועזעים ביד במשך כ -15 שניות כל אחד, לפני ואחרי מדויקמרווח 45 דקות על שייקר, השמרים ואת אגר יישב, צמצום לטוס גישה שמרים ולהפוך את השטח אגר רך מדי לתרבות זבוב. שנית, עובי הדבק שמרים הריכוז אגר צלחות מיץ ענבים משפיעים הסרת ביצה (שלב 3.3). שכבה דקה מיוצרת על ידי שמרים 01:15: דילול במים תמנע ביצים מוטבעות אגר כאשר שטיפה והסרת מהצלחות המזון (שלב 4.4). שלישית, אם צלחות מיץ ענבים רכות מדי ולשבור את במהלך איסוף ביצים, תקיפות של צלחות יכולות להיות מוגברות על ידי הוספת תרכיז מיץ ענבים פחות את המנה הבאה של צלחות. התשואות רביעיות, ביצה גבוהות יותר אם יש זבובים 24 שעות להתאקלם בסביבת הכלוב: זו ניתן לטפל על ידי הצבת זבובים בכלוב ~ 40 שעות מראש של אוסף, לרבות העברת כלוב אוסף חדש עם צלחת אגרה טריה <20 שעות לפני מועד האוסף הרצוי. החמישית, אם את הביצים אינן דבקות בצד את התותב במהלך dechorionation (שלב 5.7), את rinsing תקופה יש הוארכה 15-30 שניות (זהירות: הארכת זמן השטיפה לאורך תקופה ארוכה עלול להרוג את הביצים). כמו כן, אבדן ביצים לתוך השטיפות הנוזליות ניתן למנוע על ידי בדיקת החותם-תותב רשת לסגירתם מוחלטת ולוודא כי ביצים אל תשפוכנה מחוץ המסנן במהלך מחדש השעיה. אם את תותב אטימה טוב, ביצים שנשפכו ניתן לשחזר על ידי המזיגה לשטוף דרך המסננת כמו לשטוף נמחקת. השישית, לאחר הזבובים שבקעו, מבחן משוער לקבוע אם הזבובים axenic הוא לבחון את הצבע של הדיאטה. אם הזבובים axenic, שכבת דיאטה העליונה תהיה בצבע קפה החום כהה ללא בועות אוויר תהיינה נוכחות לאורך כל הדיאטה. בועות אוויר או צבע שחום של שכבת הדיאטה העליונה המצביעות על נוכחות חיידקים. נוכחות חיידקית עדיין חייבת להיות מאושרת על ידי המגון. לחלופין, הגברת PCR של גן 16S rRNA יכולה גם להתבצע כדי לזהות חיידקי unculturable (למשל, אנאירוביים קפדן) 30. לבסוף, לאחר homogenיכולים לעשות בה שימוש חוזר ization, חרוזי קרמיקה ידי נדנדה בתמיסה של 2% חומצה + 0.05 M אשלגן הידרוקסיד למשך 30 דקות, שטיפה בנדיבות (10 פעמים או יותר) ב H 2 O, שטיפת פעם עם 100% אתנול (כדי להקל על ייבוש), ו ייבוש ב 65 מעלות צלזיוס. אם כל הצעדים הם אחריו בקפידה, זבובי axenic יש לבודד בכל פעם הפרוטוקול מבוצע.

עבודה זה מתארת ​​שיטה מחדש שיוך עוברת תסיסנית סטרילי עם חיידקי 4-מינים כי הוא נציג של קהילות חיידקים של זבובי מעבדה העלו בדיאטה שמר-גלוקוז. מחקרים קודמים השתמשו קהילת 5 מינים כולל 4 המינים פה fructivorans לקטובצילוס, אשר כבר בשפע מספרי בסקרים כמה זבוב 9,19. אנו ממליצים השמטת L. fructivorans מכמה סיבות, כולל פנוטיפים כי ד melanogaster monoassociated עם L. fructivorans הם חופפים במידה רבה עם ph axenicenotypes 31 ול ' fructivorans יותר אנין מאשר לטוס אחרים מבודדים. אם ל fructivorans כלול, צריך להיות מתורבת זה כפי שתואר עבור L. Plantarum ול ' brevis: תרבות נוזלית סטטי; ו בכלי אטום מוצף CO 2 לתרבות מוצקה (הצעד האחרון מפחית את רמות חמצן סביבה כדי לתמוך בצמיחת Lactobacillus).

הגישות המתוארות כאן יכולים להיות מגוונים בקלות להעלות תסיסנית בתנאים gnotobiotic מגוונים. לדוגמה, monoassociated זבובים ניתן שגדלו על ידי יחסנו עוברים תסיסנית סטרילי עם אחד מינים של חיידקים בכל פעם 15,25,31. עמותות מרובים מינים נוצרות על ידי ייחס מינים רבים ביחסים המקבילה 20,24. למרות שסיפקנו CFU / OD 600 קבועים עבור כל אחד 4-מינים כדי להקל נורמליזציה, זה לא ייתכן שיהיה צורך לגזור קבוע לתערובות מינים ביותר. אניt הוצגה בעבר כי שפע של חיידקים 5-7 מבוגרים DPE לא היה שונה משמעותית באגודות 2-מינים כאשר צפיפות המוצא של חיידקים היתה מגוונת מעל שלושה סדרי גודל 20. כמו כן, במעיים תסיסנית מאוד מתירני, ומינים רבים כי הם מתורבתים בקלות על דיאטת זבוב יכולים לשייך תסיסנית בצפיפויות גבוהות monoassociation (למשל, E. coli, 'subtilis 25) המאפשר לנתיחה גנטית של השפעת חיידקים על ידי חיידקים עם נרחב משאבים גנטיים הגנומי. לבסוף, מחקרים של פנוטיפים תסיסנית שמושפעים החיידקים יכולים להתאים את הגישה של שבוצעה בם שינוי Schaedler פלורה בעכברים על ידי ייחס ביצים קונבנציונליות הניחו באופן טבעי עם קהילת חיידקים מוגדרת על מנת להבטיח בקבוקון אחד יש גישת קבוצה מסוימת של חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

פרטים מסוימים של פרוטוקול זה היו אופטימיזציה בסיוע ד"ר אדם דובסון, שסיפק גם הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן עבור ה- National Institutes of Health (FNIH) מספר מענק R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, ו AED). FNIH מספר מענק 1F32GM099374-01 (PDN), ואת בריגהם קרנות ההפעלה יאנג אוניברסיטת (JMC, MLK, MV). עלויות פרסום נתמכו על ידי מכללת אוניברסיטת בריגהם יאנג למדעי החיים והמחלקה למדעי הצמח בטבע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

ביולוגיה התפתחותית 113 גליון axenic gnotobiotic, Microbiome חיידקים,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter