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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

फल मक्खी पालन Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Axenic और gnotobiotic की शर्तों के तहत ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के पालन के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। भ्रूण उड़ना, सोडियम हाइपोक्लोराइट में dechorionated बाँझ आहार के लिए aseptically का तबादला, और बंद कंटेनर में पाला जाता है। बैक्टीरिया के साथ आहार और भ्रूण inoculating gnotobiotic संघों की ओर जाता है, और बैक्टीरियल उपस्थिति पूरे शरीर ड्रोसोफिला homogenates चढ़ाना द्वारा पुष्टि की है।

Introduction

अधिकांश जानवरों परिचित जन्म से बैक्टीरिया ( 'माइक्रोबायोटा') मृत्यु 1 के साथ जुड़े रहे हैं। सूक्ष्मजीव मुक्त ( 'axenic') और सूक्ष्मजीव जुड़े ( 'पारंपरिक') जानवरों की तुलना से पता चला है रोगाणुओं चयापचय, पोषण, नाड़ी, यकृत, सांस, प्रतिरक्षा, अंत: स्रावी, और तंत्रिका संबंधी समारोह 2 सहित पशुओं के स्वास्थ्य के विभिन्न पहलुओं, प्रभावित करते हैं। फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर रोगाणुओं 3,4 की उपस्थिति में इन प्रक्रियाओं के कई समझने के लिए और पशुओं के स्वास्थ्य पर 5,6 माइक्रोबायोटा प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। कोई बैक्टीरियल प्रजातियों हर व्यक्ति ( 'कोर') में मौजूद है, लेकिन एसीटोबैक्टर और लैक्टोबैसिलस प्रजातियों संख्यानुसार दोनों प्रयोगशाला-पाला और जंगली पकड़ा डी के माइक्रोबायोटा हावी मेलानोगास्टर। अन्य Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter और Gluconobacter सहित)और Enterobacteriaceae (जैसे उदर और Leuconostoc के रूप में) cutes या तो उच्च बहुतायत 7-12 से कम बहुतायत में ड्रोसोफिला व्यक्तियों में अक्सर मौजूद है, या अनियमित मौजूद हैं।

ड्रोसोफिला और स्तनधारियों की माइक्रोबायोटा भीतर और पीढ़ियों 14,19 भर में अस्थिर है। माइक्रोबायोटा चंचलता जब माइक्रोबायोटा निर्भर लक्षण मापने प्ररूपी शोर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला 15-18 में Acetobacteraceae प्रभाव लिपिड (ट्राइग्लिसराइड) भंडारण। Acetobacteraceae एक और 19 में से एक शीशी की मक्खियों में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, तो isogenic मक्खियों अलग phenotypes 20 हो सकती है। चूहों 14 में माइक्रोबायोटा चंचलता की समस्या का समाधान, 1960 के बाद से अभ्यास में किया गया है, माउस पिल्ले के लिए प्रत्येक नई पीढ़ी (बदल Schaedler वनस्पति) 8 प्रमुख माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक परिभाषित समुदाय को शुरू करने सेयह सुनिश्चित करना कि एक पिल्ला माउस माइक्रोबायोटा की एक ही कुंजी के सदस्यों के संपर्क में है। इस अभ्यास माइक्रोबायोटा रचना के लिए नियंत्रित करता है तब भी जब माइक्रोबायोटा अध्ययन 32 का प्राथमिक लक्ष्य नहीं है, और मिसाल सेट प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म में महत्वपूर्ण रोगाणुओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए।

ड्रोसोफिला पोषण पर रोगाणुओं के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, axenic उड़ लाइनों पाने के लिए कई प्रोटोकॉल भ्रूण के हाइपोक्लोराइट dechorionation (या तो नए सिरे से निकाली गई हर पीढ़ी या बाँझ आहार के लिए स्थानांतरण द्वारा बनाए रखा generationally) और एंटीबायोटिक उपचार के 13 सहित विकसित किया गया है। ऐसे एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार और धारावाहिक हस्तांतरण, नए सिरे से dechorionation साथ confounding चर (जैसे, अंडा घनत्व, अवशिष्ट दूषित रोगाणुओं, बंद लक्ष्य एंटीबायोटिक प्रभाव) की तुलना में अधिक से अधिक नियंत्रण दोनों के लिए आसानी और तेज़ी के रूप में अलग अलग दृष्टिकोण करने के लिए लाभ कर रहे हैं। की विधि के बावजूदतैयारी, निर्दिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों की शुरूआत भ्रूण axenic को परिभाषित ( 'gnotobiotic') समुदायों के साथ ड्रोसोफिला की संस्कृति परमिट। वैकल्पिक रूप से, Schaedler वनस्पतियों का उपयोग नकल उतार, इस समुदाय पारंपरिक रखी अंडे प्रत्येक शीशी में विशेषता-प्रभावित रोगाणुओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने और माइक्रोबायोटा चंचलता की जटिलताओं से बचने के लिए (कदम 6-7 केवल निम्न) को टीका किया जा सकता है। यहाँ हम भ्रूण की नए सिरे से dechorionation द्वारा axenic और gnotobiotic ड्रोसोफिला जुटाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, और शुरू या दूषित माइक्रोबियल taxa की मौजूदगी की पुष्टि के लिए।

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Protocol

1. संस्कृति बैक्टीरिया (प्रारंभ ~ 1 सप्ताह अंडे उठा से पहले)

  1. संशोधित मिसेज 20 (mmrs) प्लेटें और शोरबा ट्यूब (तालिका 1) तैयार करें। 20 मिलीलीटर mmrs प्रत्येक 100 मिमी पेट्री थाली में अगर डालो और शांत करने के लिए / ड्राई रात भर अनुमति देते हैं, या 5 मिलीलीटर mmrs 18 मिमी टेस्ट ट्यूब में शोरबा।
  2. स्ट्रीक एसीटोबैक्टर pomorum, ए tropicalis, लैक्टोबैसिलस ब्रेविस, और एल प्लेटों अगर mmrs पर plantarum। 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एसीटोबैक्टर सेते हैं। सीलिंग से पहले कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक कंटेनर और बाढ़ में प्लेटें रखकर anaerobically लैक्टोबैसिलस सेते हैं। रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: एल ब्रेविस कालोनियों 24-48 घंटा तक दिखाई नहीं हो सकता। प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और कालोनियों के ऊपर से 3 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. दो से तीन दिन बाँझ आहार (धारा 5) को dechorionated अंडे स्थानांतरित करने से पहले, एक टेस्ट ट्यूब में चोर mmrs थाली से एक भी कॉलोनी उठाओTaining mmrs शोरबा। झटकों के साथ एसीटोबैक्टर बढ़ो और 24 घंटे के लिए या जब तक परेशान स्थिर रुप से लैक्टोबैसिलस हो जाना, दोनों 30 डिग्री सेल्सियस पर।

2. बाँझ आहार तैयार

  1. एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क में बाँझ आहार (तालिका 2) तैयार करें। आहार माइक्रोवेव जब तक यह 3 अनुक्रमिक बार उबला हुआ है; प्रत्येक उबाल के बीच में मिश्रण।
  2. जबकि शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए आहार स्थानांतरित सरगर्मी बनाए रखने के लिए एक हलचल प्लेट पर कुप्पी रखें। 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए आहार के 7.5 मिलीलीटर स्थानांतरण। शिथिल नलियों टोपी, और एक कवर किया, autoclavable polypropylene रैक में जगह।
  3. 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव और 25 मिनट के लिए 15 साई का उपयोग कर मक्खी आहार जीवाणुरहित। आटोक्लेव से रैक निकालें, और तुरंत क्षैतिज प्रत्येक रैक हिला आहार ठंडा करने के दौरान अलग नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए। सावधान खड़ी रैक हिला ढक्कन या ट्यूबों के रिम्स के लिए आहार के हस्तांतरण को रोकने के लिए नहीं हो सकता है। आहार वास्तव में 45 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर शांत करने के लिए अनुमति दें औरफिर हाथ से क्षैतिज आहार हिला।
    नोट: आहार एक सप्ताह तक के लिए 4-15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. कवर autoclavable रैक का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में (2.1-2.3 कदम), या एसिड परिरक्षक युक्त आहार पर मक्खियों को बढ़ाने के लिए, निम्न चरणों का पालन:
    1. फ्लास्क में हलचल पट्टी के साथ एक एल 2 फ्लास्क में 1 एल तरल आहार तैयार करें। आहार आटोक्लेव।
    2. autoclaving के बाद, 10 मिलीलीटर परिरक्षक जोड़ने के लिए और एक गर्म हलचल प्लेट पर लगातार हलचल। अगर 50-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है, कुप्पी एक गर्म हलचल थाली के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में हीटिंग द्वारा 50-60 डिग्री सेल्सियस पर ले जाते हैं और कुप्पी का तापमान बनाए रखने।
    3. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, pipet ~ 7.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में व्यक्तिगत रूप से।

3. अंडे बिछाने पिंजरों तैयार

  1. 100 मिलीलीटर पानी, 10 ग्राम शराब बनानेवाला है खमीर, 10 ग्राम ग्लूकोज, और अगर की 1 ग्राम microwaving से अंगूर का रस अगर प्लेट बनाओ। 1.1 चरण में एक उबाल लाने के लिए 3 बार और जमे हुए अंगूर का रस सह के 10 ग्राम जोड़ेंncentrate अगर प्लेट पर अंडे की दृश्यता बढ़ाने के लिए।
  2. अगर 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है, 100 मिमी पेट्री डिश में 20 मिलीलीटर डालना और जमना करने की अनुमति।
  3. 15 ग्राम पानी के साथ 1 ग्राम शराब बनानेवाला है खमीर मिश्रण से एक खमीर पेस्ट के साथ अगर प्लेट की सतह को कवर। एक पतली खमीर छाछ पीछे छोड़ रहा है, अगर थाली यकीन सतह कवर किया जाता है बनाने पर खमीर पेस्ट डालो तो अतिरिक्त टपकना। कई प्लेटें इस्तेमाल कर रहे हैं, पेस्ट क्रमिक रूप से कई प्लेटों के लिए डाला जा सकता है।
  4. एक पिंजरे के तल में अगर प्लेटें स्थानांतरण।
    नोट: एक 32 आउंस डेली कंटेनर एक्रिलिक मक्खी पिंजरों के लिए एक अच्छा विकल्प है।
    1. शीर्ष में एक छेद में कटौती और गैर विषैले गोंद के साथ छेद पर एक सांस जाल gluing द्वारा 32 आउंस डेली कंटेनर के लिए पलकों बनाओ। गोंद है, तो पानी में घुलनशील ढकने के लिए पानी जोखिम को रोकने के।
  5. स्थानांतरण 200-300 कंटेनर में मक्खियों और ढक्कन के साथ कवर किया। कवर एक खाली पेट्री डिश ढक्कन के साथ मेष-संरक्षित छेद preven के लिएअगर सतह से टी वाष्पीकरण और ढक्कन के अंदर एक नम टिशू पेपर जोड़ने अगर वांछित। 16-20 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस रात भर में मक्खियों को सेते हैं।

4. अंडे ले लीजिए

  1. एक प्लास्टिक की झाड़ी में नायलॉन जाल रखकर अंडा संग्रह के लिए एक चलनी तैयार करें।
  2. उस पर अंडे के साथ थाली को पुनः प्राप्त करने के लिए, एक खाली कंटेनर को स्थानांतरित करने से पिंजरे से मक्खियों को हटा दें। एक ही मक्खियों अगले दिन इस्तेमाल किया जाएगा, तो एक हौसले yeasted अंगूर का रस अगर प्लेट युक्त एक नया पिंजरे के लिए तुरंत हस्तांतरण। मक्खियों 3-5 अनुक्रमिक दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता
  3. एक साफ तूलिका के साथ अगर से मृत मक्खियों निकालें, अगर को तोड़ने नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है।
  4. आसुत जल के साथ अगर प्लेट rinsing, धीरे अगर सतह से अंडे brushing, और जाल के ऊपर घोल डालने का कार्य द्वारा अंडे ले लीजिए। 3-4 बार दोहराएँ जब तक सभी या अंडे के सबसे अगर थाली से हटा दिया गया है।

5. Dechorionate अंडे और बाँझ डी के लिए स्थानांतरणआईईटी

  1. 70% इथेनॉल के साथ (पक्षों सहित) के अंदर छिड़काव द्वारा जैव सुरक्षा कैबिनेट तैयार करें। एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ नीचे साफ कर लें, और ~ 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ हुड बाँझ। इथेनॉल के साथ छिड़काव और तुरंत जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखकर सभी गैर जैविक आपूर्ति (नमूना कप, तूलिका, संदंश, अपशिष्ट कंटेनर, 400 मिलीलीटर निष्फल पानी, और 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट की 100 मिलीलीटर) जीवाणुरहित। 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ बाँझ।
  2. एक 120 मिलीलीटर नमूना कप या अन्य बाँझ कंटेनर में अंडे के साथ झाड़ी रखकर 2 सोडियम हाइपोक्लोराइट washes के पहले शुरू करो। धीरे-धीरे सिर्फ रिम नीचे तक झाड़ी में डाल देना ~ 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के 90 मिलीलीटर।
  3. 2.5 मिनट के लिए अंडे कुल्ला। समय समय पर झाड़ी के ऊपर और नीचे हाइपोक्लोराइट समाधान में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करके अंडे फिर से निलंबित।
  4. झाड़ी एक दूसरे नमूना कप में सीधे हस्तांतरण, 90 मिलीलीटर ब्लीच के साथ पहले से भरे, जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर।
  5. दोहराना5.3 चरण जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर। दूसरी ब्लीच उपचार के अंत में, अंडे झाड़ी के पक्ष का पालन करने के लिए शुरू करना चाहिए।
  6. बाहर ले जाने के जैव सुरक्षा कैबिनेट में 5.7-5.8 कदम।
  7. ब्लीच त्यागें और बाँझ पानी के साथ झाड़ी 3 बार धोएं। संदंश के साथ झाड़ी में ले जाकर प्रत्येक धोने के दौरान कई बार पुनः निलंबित अंडे। तीसरे धोने के अंत तक सबसे अंडे झाड़ी की ओर से जुड़ी होनी चाहिए।
  8. एक तूलिका इथेनॉल में निष्फल का प्रयोग, बाँझ आहार के लिए झाड़ी की ओर से अंडे हस्तांतरण। स्थानांतरण अंडे व्यक्तिगत रूप से या छोटे समूहों में। शीशी प्रति 30-50 अंडे के लिए निशाना लगाओ। टोपी ढीला छोड़ दो ऑक्सीजन ट्यूब में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए। शीशियों axenic रहने के लिए कर रहे हैं, एक कीट इनक्यूबेटर पर स्थानांतरण; अन्यथा, बैक्टीरिया के रूप में नीचे जोड़ें।

6. Gnotobiotic 4 बैक्टीरियल प्रजातियों का उपयोग मक्खियों बनाओ

  1. जीवाणु तैयार
    1. आवश्यक आपूर्ति के साथ एक निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट तैयार करें (Pipettes, पिपेट टिप बक्से, निष्फल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, मिसेज शोरबा, और 4.1 चरण में के रूप में टेस्ट ट्यूब रैक)। एक इथेनॉल से लथपथ प्रयोगशाला के साथ टेस्ट ट्यूब के बाहर साफ कर लें जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखने से पहले साफ कर लें।
    2. पहले एक बाँझ microfuge ट्यूब रातोंरात वृद्धि के 500 μl के हस्तांतरण से बैक्टीरिया गोली। तो बैक्टीरियल घनत्व कम है, प्रत्येक ट्यूब 1.5 मिलीलीटर को जोड़ें या क्रमिक रूप से सतह पर तैरनेवाला हटाने और एक ही ट्यूब के लिए अतिरिक्त संस्कृति जोड़ें। पर 10,000 एक्स जी 10 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट और सेंट्रीफ्यूज से नमूने निकालें। नमूने के बीच संक्रमण से बचने के लिए फिल्टर युक्तियों का उपयोग करें।
    3. आयुध डिपो के 600 मापने के द्वारा प्रत्येक संस्कृति के घनत्व का निर्धारण करते हैं। एक बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग करते हैं, तो 1-, 2, और 4 गुना dilutions में एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक संस्कृति के 200 μl हस्तांतरण।
    4. mmrs जिसमें प्रत्येक सेल गोली (5.2.2) एक प्लेट पढ़ने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करता है और निम्नलिखित समीकरणों को कमजोर करने की राशि का निर्धारण करते हैं। 50 टीका लगाना और पर्याप्त शोरबा जोड़ने की योजना# 956; प्रत्येक मक्खी शीशी एल।
      1. 1, 1: 2 और 1: एक थाली-पढ़ने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 4 कमजोर पड़ने आयुध डिपो के लिए एक 1 600 रीडिंग ले लीजिए। प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव है कि 0.1 और 0.2 और यह मान और 6.1.4.2 या 6.1.4.3 में दिए गए फार्मूले में 'ओ' और 'डी' के रूप में अपनी इसी कमजोर पड़ने कारक का उपयोग के बीच एक आयुध डिपो के 600 मूल्य का उत्पादन के लिए कमजोर पड़ने का चयन करें।
      2. तो यहाँ वर्णित 4 प्रजातियों का उपयोग, एमएल घनत्व बराबर कॉलोनी बनाने इकाई के लिए कोशिकाओं (CFU) / (600 आयुध डिपो CFU रूपांतरण करने के लिए निर्धारित पहले 20) इस समीकरण का उपयोग कर मानक के अनुसार:
        ई = ((ओ) एक्स वी एक्स डी) / सी
        जहां ई = मात्रा (μl) में गोली resuspend, हे = 600 आयुध डिपो बैक्टीरिया, बी = 600 आयुध डिपो खाली मीडिया, डी = गुना कमजोर पड़ने, वी = μl जीवाणु संस्कृति centrifugation, सी = 600 आयुध डिपो पूर्व निर्धारित लगातार करने से पहले। पूरक संहिता इन समीकरणों का उपयोग कर की गणना के उदाहरण के लिए फ़ाइल देखें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिएकि स्वचालित रूप से खाली, "ओ बी" के स्थान पर उपयोग करें "ओ"।
        ध्यान दें: पूर्व निर्धारित स्थिरांक (यूनिट 600 आयुध डिपो, 10 7 CFU मिलीलीटर -1 के लिए सामान्यीकृत, 20 में निकाली गई स्थिरांक) इस प्रकार हैं: ए tropicalis (0.052), ए pomorum (0.038), एल ब्रेविस (0.056), एल plantarum (0.077)।
      3. यदि अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों का उपयोग (कोई CFU / 600 आयुध डिपो निरंतर उपलब्ध है), घनत्व को सामान्य इस समीकरण का उपयोग कर 600 = 0.1 ओवर ड्राफ्ट के लिए:
        ई = ((ओ) एक्स वी एक्स डी) /0.1 600 आयुध डिपो
        नोट: इकाइयों कदम 6.1.4.2 के रूप में ही कर रहे हैं। पूरक संहिता इन समीकरणों का उपयोग कर की गणना के उदाहरण के लिए फ़ाइल देखें।
    5. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक pipet टिप के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने और कदम 6.1.4.2 में गणना के रूप में ताजा mmrs या पीबीएस में गोली resuspend।
  2. जीवाणु टीका लगाना
    1. बाँझ आहार एक साथ शंक्वाकार ट्यूबों के लिए बैक्टीरिया के 50 μl स्थानांतरणडी जैव सुरक्षा कैबिनेट में अंडे dechorionated। शीशियों के बीच प्रदूषण को रोकने के अंडे हस्तांतरण के बाद बैक्टीरिया जोड़ें।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में टीका ट्यूबों प्लेस

बाँझपन के लिए 7. उपाय CFU लोड / टेस्ट

  1. पूरे शरीर मक्खी homogenates, स्थानांतरण 5 मक्खियों (5-7 दिनों के बाद eclosion) सिरेमिक मोतियों की 125 μl और mmrs शोरबा के 125 μl युक्त एक 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में CFU लोड को मापने के लिए। 4.0 मीटर / सेकंड में 30 सेकंड के लिए एक ऊतक homogenizer का उपयोग मक्खियों Homogenize।
    1. वैकल्पिक रूप से, न आना माला और हाथ 1 मिनट के लिए प्लास्टिक मूसल के साथ microcentrifuge ट्यूब में homogenize।
    2. अगर पेट microbiota बढ़ाता, बहिर्जात रोगाणुओं 22 को हटाने के लिए मक्खियों बाँझ सतह। स्थानांतरण 1 मिनट, महाप्राण इथेनॉल, और homogenizations के लिए एक नया microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण के लिए 100 μl 70% इथेनॉल युक्त एक microcentrifuge ट्यूब के लिए मक्खियों। पेट की डीएनए सामग्री मापा जाएगा, तो कुल्ला चया इथेनॉल धोने से पहले 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ 1 मिनट।
  2. 875 μl mmrs, 5 सेकंड के लिए भंवर के साथ homogenate पतला, और एक microtiter प्लेट के पहले अच्छी तरह से में homogenate के 120 μl pipet।
  3. 8 से 10 μl homogenate और अगले दो कुओं में 70 μl मिसेज का उपयोग कर dilutions: दो अनुक्रमिक 1 प्रदर्शन करना।
    1. पहले अच्छी तरह से 10 μl निकालें और दूसरे को अच्छी तरह से युक्त 70 μl मिसेज में जोड़ें। तीसरे अच्छी तरह से युक्त 70 μl मिसेज के लिए दूसरी अच्छी तरह से 10 μl अच्छी तरह से अच्छी तरह से दूसरे की सामग्री मिश्रण, स्थानांतरण, और अच्छी तरह मिला लें। undiluted, 1: 8, और 1:64 यह मूल 1,000 μl homogenate के 3 कुल सांद्रता की ओर जाता है।
  4. स्थानांतरण एक mmrs थाली करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 μl (यदि वांछित एक मल्टी चैनल pipet का उपयोग)। थोड़ा अगर सतह के नीचे कमजोर पड़ने कई मिलीमीटर फैला है और तरल प्लेट जाने से पहले सूखे के लिए अनुमति देने के लिए पकवान लगाओ। तरल वें पर सूख जाता हैई प्लेट जल्दी यदि प्लेटों 2 दिन पुराने हैं, दो पड़ोसी बूंदों के मिश्रण को कम करने।
  5. 1-2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इनक्यूबेटर एक बार अलग, अलग-अलग कालोनियों दिखाई दे रहे हैं प्लेटों से निकालें, और 10-100 पृथक कालोनियों के साथ एक कमजोर पड़ने से गिनती।
  6. का उपयोग कर समीकरण E = सी एक्स डी / पी एक्स वी / एफ, जहां ई = मक्खी प्रति CFU, सी = कालोनियों की संख्या की गिनती, डी = कमजोर पड़ने, पी = μl चढ़ाया, वी = मक्खी homogenate की मात्रा मक्खी प्रति CFU की गणना, और एफ = homogenized मक्खियों की संख्या।

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Representative Results

Axenic मक्खियों के सफल पालन डी के पूरे शरीर homogenizations से कोई CFUs के अलगाव की पुष्टि की है मेलानोगास्टर वयस्कों (चित्रा 1)। वैकल्पिक रूप से, अगर मढ़वाया homogenate कालोनियों पैदावार, शीशियों दूषित कर रहे हैं और खारिज किया जाना चाहिए। Gnotobiotic मक्खियों के लिए, चार बैक्टीरियल आइसोलेट्स के प्रत्येक 5 वयस्क पुरुषों के पूल से अलग थे, कुल व्यवहार्य वयस्क मक्खियों (चित्रा 1) के साथ जुड़े CFUs में मतभेद का प्रदर्शन है। प्रत्येक बैक्टीरियल प्रजातियों एक अलग आकृति विज्ञान है और नेत्रहीन प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा 2)। एक या एक से अधिक कॉलोनी प्रकार पता नहीं कर रहे हैं वहाँ बैक्टीरियल inoculum तैयारी में त्रुटियों गया हो सकता है (उदाहरण के लिए, कपड़े धोने, सामान्य, मिश्रण) या इसी प्रजाति संस्कृति शर्तों के साथ संगत नहीं हो सकता है (उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला घनत्व 23 या जीनोटाइप 24)। तकनीकी त्रुटियों हम आरईसी बाहर शासन करने के लिएommend तुरंत मक्खी शीशियों (6.2 कदम) inoculating के बाद जीवाणु मिश्रण के एक हिस्से को चढ़ाना।

आकृति 1
चित्रा 1: कॉलोनी बनाने इकाइयों axenic और Gnotobiotic ड्रोसोफिला में मिला 4 प्रजातियों gnotobiotic और axenic डी के पूरे शरीर homogenates में कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) मक्खी प्रति की संख्या। मेलानोगास्टर। Axenic homogenates में कालोनियों की कमी की पुष्टि डी मेलानोगास्टर बाँझपन। मान 24 को दोहराने के मूल्यों का ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: बैक्टीरियल कालोनियों का फर्क। </ strong> gnotobiotic डी में 4-प्रजातियों में से प्रत्येक के लिए अलग morphologies दिखा एक नमूना homogenization से CFUs मेलानोगास्टर। एसीटोबैक्टर कालोनियों एक स्पष्ट, हल्के भूरे रंग के होते हैं और प्रजातियों के आधार पर अलग-अलग आकारों में आते हैं। ~ 24-36 चढ़ाना, ए के बाद मानव संसाधन tropicalis कालोनियों, अपारदर्शी हैं जबकि ए pomorum, पारदर्शी है, हालांकि समय के साथ अंतर कम स्पष्ट हो जाता है। एल ब्रेविस कालोनियों छोटे और सफेद और एल हैं plantarum कालोनियों बड़े और पीले कर रहे हैं। आवश्यक हो, homogenate से विकास मूल बैक्टीरिया प्लेटों की तुलना में किया जा सकता है, तो कॉलोनी 20 के प्रत्येक प्रकार के भेद करने में मदद करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

mmrs पकाने की विधि
जी में राशि टिप्पणियाँ
आसुत जल 1,000
यूनिवर्सल Peptone 12.5
खमीर निकालने 7.5
शर्करा 20
Dipotassium फास्फेट 2
अमोनियम साइट्रेट 2
नाजिया 5
मैग्नीशियम सल्फेट 0.1
Manganous सल्फेट 0.05
आगर 12 शोरबा के लिए जोड़ नहीं है

तालिका 1: mmrs नुस्खा।

<टीआर>
खमीर ग्लूकोज आहार नुस्खा
जी में राशि
आसुत जल 500
शराब बनाने वाली सुराभांड 50
शर्करा 50
आगर 6

तालिका 2: खमीर ग्लूकोज आहार नुस्खा।

पूरक संहिता फ़ाइल:। नमूना गणना इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विधि यहाँ वर्णित भ्रूण dechorionation 8,11,18,25,26,27 के लिए कई तरीकों में से एक है, एक साथ axenic वयस्कों 18,27 के धारावाहिक हस्तांतरण या एंटीबायोटिक उपचार 13,18 सहित axenic मक्खियों, पालन करने के वैकल्पिक तरीकों के साथ। अन्य dechorionation तरीकों इथेनॉल washes में शामिल हैं और 11,25,26 को कम या 8 हाइपोक्लोराइट उपचार का विस्तार। विभिन्न धोने कदम अलग मक्खी जीनोटाइप पालन सहायता कर सकते हैं: पिछले एक अध्ययन जब पाला के रूप में यहाँ उल्लिखित (इथेनॉल washes के बिना) ~ के सबसे अधिक 100 ड्रोसोफिला जीनोटाइप axenic थे, लेकिन कुछ लाइनों दूषित और 24 से खारिज कर रहे थे। शायद कुछ दूषित लाइनों axenic किया गया है, तो इथेनॉल washes या उससे अधिक समय हाइपोक्लोराइट उपचार के साथ पाला जाएगा। विधि यहाँ उल्लिखित विशेष मेजबान जीनोटाइप के लिए axenic मक्खियों के अलगाव के लिए नेतृत्व नहीं करता है तो हम इस समस्या का उपाय करने इथेनॉल rinses या उससे अधिक समय हाइपोक्लोराइट उपचार सलाह देते हैं।

ईएनटी "> जब ड्रोसोफिला के धारावाहिक स्थानान्तरण इस्तेमाल कर रहे हैं, एक माता पिता का axenic पीढ़ी के रूप में यहाँ वर्णित अंडा dechorionation द्वारा axenic बना है, और बाद की पीढ़ियों के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सड़न रोकनेवाला हस्तांतरण के साथ या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 18,27 द्वारा रखा जाता है। सीरियल हस्तांतरण तेजी से होता है axenic मक्खियों पाने हर पीढ़ी नए सिरे से, और की तुलना में स्थानांतरित कर मक्खियों कई पीढ़ियों के लिए axenic रह सकते हैं। सीरियल स्थानान्तरण की एक उलझन पारंपरिक / gnotobiotic और axenic मक्खियों का मिलान घनत्व को बनाए रखते है के बाद से axenic मक्खियों एक तुलनीय समय अंतराल पर कम अंडे (डेटा नहीं रखना करने के लिए करते हैं दिखाया गया है)। ड्रोसोफिला घनत्व मक्खी आहार 23,28,29 में बैक्टीरिया की संरचना सहित कई लक्षण, प्रभाव के बाद से, हर पीढ़ी के लिए नए सिरे से अंडे स्थानांतरित मक्खी घनत्व के प्रति संवेदनशील लक्षण के लिए एक बेहतर तरीका हो सकता है। नए सिरे से dechorionation के दौरान भी जीवाणु संक्रमण की संभावना से बचा जाता है स्थानान्तरण। इस प्रकार, सीरियल स्थानान्तरण समय बचा सकते हैं, जबकि, डीechorionation उलझी चर के अधिक नियंत्रण की अनुमति देता है।

एंटीबायोटिक्स भी axenic मक्खियों बनाने के लिए है, हालांकि dechorionation के विपरीत, एंटीबायोटिक उपचार आम तौर पर पूरी तरह से रोगाणुओं 13 बस्तियां हटाने के लिए अपर्याप्त है इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एंटीबायोटिक दवाओं सीधे मेजबान को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक आहार पर मक्खियों की परवरिश उनकी उपजाऊपन और प्रोटीन की मात्रा घट जाती है, लेकिन इन प्रभावों dechorionated भ्रूण 13 से उठाया मक्खियों में नहीं मनाया गया। हम ध्यान दें कि एंटीबायोटिक दवाओं एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरिया है कि खड़ी प्रेषित कर रहे हैं और इस तरह के Wolbachia 33 के रूप में सतह नसबंदी, से प्रभावित नहीं हैं समाप्त करने के लिए आवश्यक हैं।

कई कदम dechorionated axenic या gnotobiotic मक्खियों की तैयारी की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, यह कदम 2.3 में के रूप में मक्खी आहार मिलाने के लिए महत्वपूर्ण है। रैक प्रत्येक से पहले और एक सटीक बाद के बारे में 15 सेकंड के लिए हाथ से हिल नहीं कर रहे हैंप्रकार के बरतन पर 45 मिनट के अंतराल, खमीर और अगर बसा, खमीर के लिए उपयोग के लिए उड़ान भरने को कम करने और अगर सतह भी उड़ संस्कृति के लिए नरम बनाने होंगे। दूसरा, खमीर पेस्ट की मोटाई और अंगूर का रस प्लेटों की अगर एकाग्रता अंडा हटाने (3.3 कदम) को प्रभावित करती है। एक पतली परत एक 1:15 खमीर द्वारा उत्पादित: जल कमजोर पड़ने अगर में embedding जब rinsing और खाद्य प्लेट (कदम 4.4) से हटाने से अंडे पाएगा। तीसरा, अगर अंगूर का रस प्लेटें भी नरम हैं और अंडे संग्रह के दौरान टूटने, प्लेटों की दृढ़ता प्लेटों के अगले बैच के लिए कम अंगूर का रस ध्यान जोड़कर बढ़ाया जा सकता है। चौथा, अंडा पैदावार यदि मक्खियों 24 घंटा पिंजरे में पर्यावरण के लिए जलवायु के अनुकूल बनाना करने की जरूरत अधिक कर रहे हैं: इस मक्खियों पिंजरे में संग्रह के अग्रिम में ~ 40 घंटे रखने, एक ताजा अगर प्लेट के साथ एक नया संग्रह पिंजरे में हस्तांतरण <20 सहित द्वारा संबोधित किया जा सकता पहले वांछित संग्रह तारीख घंटा। पांचवां, अंडे dechorionation (कदम 5.7), rins दौरान झाड़ी की ओर का पालन नहीं करते हैं तोआईएनजी अवधि 15-30 सेकंड तक बढ़ाया जाना चाहिए (सावधानी: कुल्ला समय देने भी लंबे समय से अंडे को मार सकता है)। इसके अलावा, तरल rinses में अंडे का नुकसान पूरा बंद करने के लिए जाल झाड़ी मुहर जाँच और सत्यापित करें कि अंडे को फिर से निलंबन के दौरान चलनी के बाहर गिराना नहीं करने से रोका जा सकता है। झाड़ी में अच्छी तरह से सील कर दिया जाता है तो गिरा अंडे चलनी के माध्यम से धो डालने का कार्य के रूप में धोने खारिज कर दिया है द्वारा ठीक किया जा सकता है। छठी, के बाद मक्खियों रची है, एक प्रकल्पित परीक्षण निर्धारित करने के लिए मक्खियों हैं, तो axenic आहार के रंग जांच करने के लिए है। मक्खियों axenic हैं, आहार के ऊपर परत एक काले-भूरे रंग कॉफी रंग हो जाएगा और कोई हवा के बुलबुले आहार भर में उपस्थित रहेंगे। हवाई बुलबुले या शीर्ष आहार परत के तन रंग बैक्टीरियल उपस्थिति का संकेत। बैक्टीरियल मौजूदगी अभी भी homogenization द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, -16 rRNA जीन की पीसीआर प्रवर्धन भी unculturable रोगाणुओं (जैसे, सख्त anaerobes), 30 का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। अंत में, homogen के बादization, चीनी मिट्टी के मोतियों एच 2 ओ (10 बार या उससे अधिक), 30 मिनट के लिए 2% हाइपोक्लोराइट + 0.05 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के समाधान में कमाल की उदारता से rinsing द्वारा पुन: उपयोग कर सकते हैं, 100% इथेनॉल के साथ एक बार धोने (सुखाने की सुविधा के लिए), और 65 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने। सभी चरणों का सावधानी से पालन कर रहे हैं, axenic मक्खियों हर बार प्रोटोकॉल किया जाता है अलग किया जाना चाहिए।

इस काम को फिर से जोड़ के एक 4 प्रजातियों माइक्रोबायोटा एक खमीर ग्लूकोज आहार पर उठाया प्रयोगशाला मक्खियों के जीवाणु समुदायों के प्रतिनिधि है कि साथ बाँझ ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए एक विधि की रूपरेखा। पिछला काम 4-प्रजाति यहाँ और लैक्टोबैसिलस fructivorans है, जो कई मक्खी सर्वेक्षणों 9,19 में संख्यानुसार प्रचुर मात्रा में किया गया है सहित 5 प्रजातियों समुदाय इस्तेमाल किया गया है। हम एल छोड़ते हुए सिफारिश कई कारणों से fructivorans, कि डी में phenotypes सहित एल के साथ monoassociated मेलानोगास्टर fructivorans काफी हद तक axenic पीएच के साथ अनुकूल हैं31 और एल enotypes fructivorans अधिक दुराराध्य के अलावा अन्य मक्खी को अलग कर रहा है। अगर एल fructivorans शामिल किया गया है, यह के रूप में एल के लिए वर्णित सभ्य होना चाहिए plantarum और एल ब्रेविस: स्थिर तरल संस्कृति; और ठोस संस्कृति के लिए सीओ 2 के साथ पानी भर गया एक कंटेनर में (उत्तरार्द्ध कदम परिवेश ऑक्सीजन का स्तर लैक्टोबैसिलस विकास का समर्थन करने को कम करता है)।

यहाँ उल्लिखित दृष्टिकोण आसानी से विविध gnotobiotic की शर्तों के तहत ड्रोसोफिला बढ़ाने के लिए अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, monoassociated मक्खियों एक समय 15,25,31 में एक माइक्रोबियल प्रजातियों के साथ बाँझ ड्रोसोफिला भ्रूण inoculating द्वारा पाला जा सकता है। बहु प्रजातियों संघों बराबर अनुपात 20,24 में कई प्रजातियों inoculating से बनते हैं। हालांकि हम सामान्य बनाने की सुविधा के लिए 4-प्रजातियों में से प्रत्येक के लिए CFU / 600 आयुध डिपो स्थिरांक प्रदान की है, यह सबसे अधिक प्रजातियों के मिश्रण के लिए एक निरंतर प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं हो सकता। मैंटी पहले से दिखाया गया था कि 5-7 डीपीई वयस्कों में रोगाणुओं की बहुतायत जब बैक्टीरिया के शुरुआती घनत्व परिमाण 20 के तीन आदेश पर विविध किया गया था नहीं काफी 2-प्रजातियों संघों में अलग था। इसके अलावा, ड्रोसोफिला पेट अत्यधिक अनुमोदक है, और कई प्रजातियों कि मक्खी आहार पर आसानी से सुसंस्कृत हैं उच्च घनत्व में monoassociation में (जैसे, ई कोलाई, बी subtilis 25) व्यापक साथ रोगाणुओं द्वारा माइक्रोबियल प्रभाव के आनुवंशिक विच्छेदन को सक्षम करने ड्रोसोफिला के साथ संबद्ध कर सकते हैं आनुवंशिक और जीनोमिक संसाधनों। अंत में, ड्रोसोफिला phenotypes के अध्ययन है कि माइक्रोबायोटा से प्रभावित हैं एक परिभाषित माइक्रोबियल समुदाय के साथ पारंपरिक अंडे स्वाभाविक रूप से रखी inoculating प्रत्येक शीशी रोगाणुओं का एक विशिष्ट सेट करने के लिए उपयोग किया है यह सुनिश्चित करने के द्वारा चूहों में बदल Schaedler फ्लोरा के दृष्टिकोण अनुकूलित कर सकता।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल के कुछ विवरण डॉ एडम Dobson, जो भी पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान की सहायता के साथ अनुकूलित किया गया। (FNIH) अनुदान संख्या R01GM095372 (जेएमसी, ए (सीएन) डब्ल्यू, AJD, और एईडी) इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। FNIH अनुदान संख्या 1F32GM099374-01 (पी डी एन), और ब्रिघम यंग विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (जेएमसी, MLK, एमवी)। प्रकाशन लागत ब्रिघम यंग यूनिवर्सिटी कॉलेज लाइफ साइंसेज के और संयंत्र और वन्य जीव विज्ञान विभाग द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 113 axenic gnotobiotic, Microbiome माइक्रोबायोटा,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

फल मक्खी पालन<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; Axenic और Gnotobiotic शर्तों के तहत
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Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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